CN108635391A - 一种返魂草酚酸成分及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种返魂草酚酸成分及其制备方法与应用。所述返魂草提取物是返魂草水提物经D101大孔树脂分离得到的醇洗部分，其总酚酸纯度为70.42‑76.43％。通过化学与生物学方法评价返魂草酚酸成分的抗氧化、抗炎、抗菌能力，结果显示，返魂草酚酸成分在人支气管上皮细胞的氧化损伤模型中治疗作用显著。该返魂草酚酸成分可用于人或动物的各种细菌性疾病、肺内感染、癌症以及各种原因引起的机体炎症、氧化应激等多种疾病的治疗或辅助治疗，具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种返魂草酚酸成分，并提供其在机体抗氧化、抗炎、抗菌领域的用途，属于生物医药领域。
背景技术
返魂草(Senecionis Cannabifolii Herba，SCH)又名青菀、紫倩等，为菊科千里光属多年生草本植物。返魂草中主要包括黄酮类化合物、酚酸类化合物、生物碱类化合物、挥发油类化合物及微量元素等，其中，酚酸具有抗氧化，抗肿瘤，抗炎和杀菌等生物功能。返魂草已被报道具有抗病毒、抗菌、抗急性肺损伤、抗炎、调节免疫、解热抗胃溃疡等活性，因此被广泛应用于止咳平喘、肺部急性炎症、慢性炎症的治疗。
返魂草颗粒是由返魂草为原料经水提得到的的单方制剂，如中国发明专利(CN200810051281.8)所公开的方法得到的提取物成分复杂且酚酸浓度低，其水溶液具有一定粘稠性，影响对抗氧化活性成分及部位和其作用机理的探讨。而利用D101大孔树脂分离返魂草水提物中的醇洗部分可以达到富集酚酸类物质的目的，并去除返魂草水提物中分子量较大且水溶性较强的物质，为返魂草酚酸成分抗氧化、抗炎和抗菌活性研究提供可行性。
支气管炎、肺损伤和肺内感染是临床上最常见的呼吸系统疾病，可由细菌、病毒、真菌、寄生虫等致病微生物，以及放射线、吸入性异物等理化因素引起，如果不及时治疗会呈现反复加重的现象甚至会转变成肺结核、呼吸衰竭或肺坏死，并且肺内炎症、支气管炎症中往往伴随着氧化应激现象的发生，并且二者互相促进从而加重病情。目前，在临床上治疗肺内感染主要采用阿奇霉素和头孢左氧氟沙星等抗生素进行消炎治疗，长期使用会引起机体耐药性增加并过敏反应、机体菌群失调和继发性感染等副作用，打破机体的免疫系统和抗氧化系统平衡。因此，筛选和研究具有抗氧化、抗炎和抗菌功能的天然提取物，在支气管炎症和肺内感染等疾病的治疗中具有重要的意义。
另外，氧化应激参与细胞及机体的炎症、凋亡、免疫调节等一些类生理活动，特别是免疫系统细胞更易因氧化应激遭受损伤，导致机体稳态平衡的破坏，氧化应激反应是炎症反应的一部分，其会导致中性粒细胞炎性浸润，进而诱导局部炎症。因此筛选和研究同时具有抗氧化、抗炎功能的天然植物提取物在炎症治疗中具有重要的意义。
发明内容
本发明提供了一种返魂草酚酸成分及在抗氧化、抗炎和抗菌中的应用。所述的返魂草提取物是返魂草水提物经D101大孔树脂分离得到的醇洗部分，其总酚酸纯度为70.42-76.43％，可以达到分离并富集返魂草中的酚酸类成分的效果。并且通过化学与生物学方法评价返魂草酚酸成分的抗氧化、抗炎、抗菌能力。
本发明技术方案如下：
一种返魂草酚酸成分，是将返魂草水提液用截流分子量为5000-30000的膜滤过滤后所得滤液上D101大孔树脂，采用50-80％乙醇(优选55-65％乙醇，更优选60％乙醇)洗脱所得的醇洗部分。
进一步地，所述返魂草酚酸成分其总酚酸纯度为70.42-76.43％。
进一步地，对返魂草酚酸成分进行成分分析，鉴定出21种酚酸类成分，分别为：没食子酸、同型原儿茶酸、原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯乙酸、尿苷、咖啡酸、(异)柠檬酸、2-(1,4-二羟基环己烯)乙酸、咖啡酰奎宁酸甲酯、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、异绿原酸A、丁烯二酸、单羟基琥珀酸、5-亚乙基-2-羟基-2-羟甲基-3-甲基-己稀二酸水杨酸、2-(4-羟苯基)乙酸甲酯、芥子酸、4,4-二甲基-1,7-庚二酸、4-(吡咯烷-2-酮基)-苯基乙酸。
本发明还提供上述返魂草酚酸成分的制备方法，包括：
返魂草加水煎煮得煎煮液，将煎煮液用截流分子量为5000-30000的膜滤过滤，再将滤液(例如用纳滤)浓缩成稠膏，最后将稠膏干燥并粉碎，得返魂草水提物(药用干粉)；取上述返魂草水提物，加蒸馏水适量溶解，注入稀释液至装有大孔树脂D101的柱子中，先用蒸馏水洗脱至溶液澄清，得到返魂草D101-水洗部分，再用50-80％乙醇洗脱(优选采用55-65％乙醇，更优选采用60％乙醇)大孔树脂柱，至溶液澄清得到返魂草D101-醇洗部分(50-80％乙醇)；或者进一步地，再用95％乙醇洗脱大孔树脂柱，至溶液澄清得到返魂草D101-95％醇洗部分，将上述洗脱液浓缩，冻干。
其中，返魂草D101-60％醇洗部分收率为20.4-25.2％，返魂草原料中酚酸含量为6.46-10.25％，D101-60％醇洗部分中酚酸含量为70.42-76.43％。
本发明还包括上述返魂草酚酸成分在制备抗氧化、抗炎、抗菌药物中的应用；进一步地，所述菌包括肺炎链球菌、化脓性链球菌、表皮葡萄球菌、肠球菌。
以本发明所述返魂草酚酸成分为活性成分，可制成药物学上的任何制剂。
本发明提供了一种返魂草酚酸成分，它是由返魂草水提物通过D101大孔树脂去掉提取物中水溶性部分，得到溶于50-80％乙醇(优选55-65％乙醇，更优选60％乙醇)的酚酸类成分，采用LC-MS分析了酚酸部分的物质基础，研究了该返魂草酚酸成分对人支气管上皮氧化损伤治疗作用、对炎性巨噬细胞的治疗作用和对感染性细菌的抑制作用。
本发明的有益效果在于：
1、分离并富集返魂草提取物中酚酸类组分，大幅度降低杂质含量，其纯度提升到70.42-76.43％。
2、对返魂草酚酸成分进行成分分析，鉴定出21种酚酸类成分，分别为：没食子酸、同型原儿茶酸、原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯乙酸、尿苷、咖啡酸、(异)柠檬酸、2-(1,4-二羟基环己烯)乙酸、咖啡酰奎宁酸甲酯、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、异绿原酸A、丁烯二酸、单羟基琥珀酸、5-亚乙基-2-羟基-2-羟甲基-3-甲基-己稀二酸水杨酸、2-(4-羟苯基)乙酸甲酯、芥子酸、4,4-二甲基-1,7-庚二酸、4-(吡咯烷-2-酮基)-苯基乙酸。
3、研究返魂草酚酸成分的抗氧化能力，结果证明其DPPH自由基清除作用较强，并在人支气管上皮细胞的氧化损伤治疗中作用显著，在同等剂量下，其自由基清除率的IC50和SOD活力分别是返魂草水提物的70.7％和2.98倍。
4、研究返魂草酚酸成分的抗炎活性，结果证明该酚酸成分在体外可以抑制由LPS诱导的小鼠巨噬细胞的炎性转变，在体内可以缓解角叉菜胶引起的足趾肿胀程度。返魂草酚酸主要通过抑制促炎性因子如NO、iNOS、IL-1β、NF-κB和TNF-α等释放来发挥抗炎作用
5、研究返魂草酚酸成分的抗菌活性，结果显示返魂草酚酸能抑制院外感染性细菌如肺炎链球菌、化脓性链球菌及院内感染性细菌如表皮葡萄球菌、肠球菌的菌落形成及生长。
附图说明
图1返魂草酚酸成分粒子流图。
图2为21种酚酸类物质LC-MS图。
图3没食子酸标准曲线图。
图4表示返魂草酚酸成分对高温诱导的16HBE细胞活力的影响。
图5表示返魂草酚酸成分角叉菜胶致炎小鼠足肿胀度的影响。
图6表示返魂草酚酸成分体外抑菌作用。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
下述实验用于进一步说明本发明。
1.返魂草酚酸的提取
返魂草加水煎煮，得煎煮液，将煎煮液用截流分子量为5000-30000的膜滤过，再将滤液用纳滤浓缩成稠膏，最后将稠膏干燥并粉碎，得返魂草水提物(药用干粉)，取上述返魂草水提物，加蒸馏水适量溶解，注入稀释液至装有大孔树脂D101的柱子(2.5cm×20cm)中，分别蒸馏水、60％乙醇和95％乙醇洗脱大孔树脂柱，至溶液澄清，洗脱液浓缩，冻干，即得D101水洗部分、D101-60％醇洗部分和D101-95％醇洗部分。
2.返魂草水提取有效部位筛选
采用DPPH自由基清除率为指标考察返魂草提取物不同部位的抗氧化活性。
2.1DPPH乙醇溶液的配制
取0.01gDPPH用无水乙醇定容到100ml。
2.2对照液及样品溶液的配制
配制浓度为10-50μg/ml的Vc溶液以及样品溶液。以Vc为对照液。
2.3实验方法
取各対照液和样品溶液2ml与2mlDPPH乙醇溶液混合摇匀，室温下放置30min后测517nm处的吸光值，记为A1；取各对照液和样品溶液2ml与2ml无水乙醇混合摇匀，室温下放置30min后测定吸光度值，记为A2；以2ml无水乙醇加入2ml水混合摇匀作为空白调零，2ml无水乙醇加2ml DPPH乙醇溶液混合摇匀测定吸光度值，记为A0。
2.4清除率计算
根据清除率公式计算清除率。
清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]*100％
以浓度(μg/ml)为横坐标，清除率SA(％)为纵坐标作图，计算IC50值。
表1返还草酚酸成分清除DPPH自由基的效果
实验结果如表1所示：与返魂草水提物抗氧化相比，酚酸成分具有较强的抗氧化性，其浓度为50ug/mL时清除率就已达到68.91％，说明其抗氧化能力较强。并且，在同等剂量下，返魂草酚酸成分对DPPH自由基清除率的IC50是水提物的70.7％，说明返魂草酚酸成分较水提物具有更强的自由基清除能力。
另外，从返魂草D101水洗部分和95％乙醇部分没有显示出清除自由基的活性，并且95％乙醇洗脱成分的收率极低为0.8％，因此筛选出D101-60％醇洗部分在返魂草水提物中起到抗氧化作用。
3.返魂草D101-60％醇洗部分成分的定性分析
3.1样品制备
称取返魂草各类提取物50mg，用10ml 70％甲醇溶解，摇匀，超声20min，过滤膜后备用。
3.2液相条件
色谱柱Agilent Zorbax SB-C18色谱柱(9.4mm×250mm，5μm)，流动相乙腈(A)-0.1％三氟乙酸溶液(B)梯度洗脱(0～25min，8％～18％A，25～50min，18％～22％A)，流速3.0mL·min-1，检测波长254nm，柱温30℃，进样量2mL。
3.3质谱分析条件
采用电喷雾正负离子检测的电离模式，雾化气体为高纯度氮气，碰撞气体为高纯度氦气，采用全扫描质谱和二级质谱，质谱扫描范围m/z 100-1500，锥孔电压40V，毛细管电压3.0kV，离子源温度120℃，脱溶剂气体温度300℃，脱溶剂气体积流量600L/h，锥孔气体积流量50L/h，碰撞能量(CE)50-80V。
3.4分析结果
通过LC-MS数据分析返魂草D101-60％醇洗部分，鉴定出21中酚酸类物质，具体如下：没食子酸、同型原儿茶酸、原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯乙酸、尿苷、咖啡酸、(异)柠檬酸、2-(1,4-二羟基环己烯)乙酸、咖啡酰奎宁酸甲酯、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、异绿原酸A、丁烯二酸、单羟基琥珀酸、5-亚乙基-2-羟基-2-羟甲基-3-甲基-己稀二酸水杨酸、2-(4-羟苯基)乙酸甲酯、芥子酸、4,4-二甲基-1,7-庚二酸、4-(吡咯烷-2-酮基)-苯基乙酸。
结果见图1和图2。
4.总酚酸含量测定
4.1对照品溶液的制备取没食子酸对照品适量，精密成定，加50％乙醇制成每毫升含50μg的对照品溶液。
4.2供试品的制备
4.2.1返魂草水提取的制备精密称取样品粉末1.0g，置100ml具塞三角瓶中，精密加入50％乙醇25ml，超声法提取60min，放冷，用50％乙醇补足减失重量，摇匀，过滤。精密量取续滤液2ml置50ml容量瓶中加50％乙醇稀释至刻度，备用。
4.2.2D101-60％醇洗部分的制备供试品的制备精密称取样品粉末0.13g，置100ml具塞三角瓶中，精密加入50％乙醇25ml，超声法提取60min，放冷，用50％乙醇补足减失重量，摇匀，过滤。精密量取续滤液2ml置100ml容量瓶中加50％乙醇稀释至刻度，备用。
4.3标准曲线的制备精密量取47.80μg/ml没食子酸对照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml，分别置10ml容量瓶中，各加水5ml，混匀，放置1min，加20％碳酸钠溶液1.5ml，加水至刻度，摇匀，置75℃水浴中保温10min，取出，迅速冷却至室温，备用。
4.4供试品溶液的测定精密量取供试品溶液0.3ml和0.5ml，分别置10ml容量瓶中，参照标准曲线的制备方法，自“各加水5ml”起，依法测定样品溶液的吸光度。
4.5测定法以相应空白试剂做空白，于763nm波长处测定吸光度(A)以A值为纵坐标，分别以没食子酸对照品溶液和样品溶液的质量为横坐标，绘制标准曲线如图3所示，并计算样品含量，测定结果见表2、表3。
4.6测定结果
表2标准品没食子酸的吸光度值结果
如图3所示，没食子酸标准曲线呈线性，方程为Y＝0.0124x+0.00075，R2＝0.996。
表3总酚酸含量的结果
如表3可知，返魂草水提物中酚酸含量为6.46-10.25％，经过D101柱子分离得到的60％醇洗部分中酚酸含量达到70.42-76.43％，达到富集酚酸的效果，因此该部分提取物为返魂草酚酸成分。
5.返魂草酚酸成分抗氧化活性研究
5.1 16HBE细胞氧化应激模型的建立与评价
16HBE细胞系为永生的人支气管上皮细胞，具有正常人呼吸道上皮细胞的功能，同时具有良好的遗传稳定性，被广泛应用于急性肺损伤、肺部炎症、氧化应激等方面的研究，因此本实验采用16HBE细胞系来研究返魂草酚酸成分的抗氧化活性及作用机制。
取处于对数生长期的细胞接种于96孔细胞培养板上，细胞密度为5-7×104个/ml，每孔100μL，高温可以诱导细胞氧化应激和细胞凋亡，而48.3℃可以可以引起支气管受损，将其分为空白组和高温组(分别设50℃、54℃、58℃、62℃)，每个温度设6个复孔，分别培养24h、48h。以细胞活力为指标通过MTT实验考察高温对16HBE的影响，并根据试剂盒说明书测定细胞上清液中SOD活力。
表4高温对16HBE细胞活力及SOD活力的影响(n＝6，)
注：与空白对照组(37℃)比较，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
由表4可知，高温建模温度在50-62℃范围内对细胞活力和超氧化物歧化酶(SOD)活力呈温度依赖性下降趋势。其中，50℃处理细胞后，16HBE细胞活力在48h恢复到与37℃相当，而54℃、58℃和62℃均可以引起16HBE在48h内细胞活力显著下降，为了避免过高温度引起细胞凋亡，故采用54℃为建模温度。
5.2返魂草酚酸成分对高温诱导的16HBE细胞活力的影响
分为空白组、模型组和返魂草酚酸成分低、中、高剂量组，采用54℃处理模型组和给药组5min后分别用37℃的完全培养基和含有返魂草酚酸成分浓度为0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml和1mg/ml的完全培养基继续培养细胞24h后测定细胞活力。
实验结果如图4所示，采用MTT实验测定返魂草酚酸成分对高温损伤后的16HBE细胞活力的影响，经过高温处理后，模型组细胞活力较空白组显著下降(P<0.01)，经过返魂草酚酸成分治疗后，细胞活力较模型组发生显著提升：其中，提取物浓度为1mg/ml和0.1mg/ml时细胞活力较模型组没有显著变化；提取物浓度在0.75-0.25mg/ml范围内可以有效恢复由高温诱导的16HBE细胞活力下降的问题。根据细胞活力测定结果，确定返魂草酚酸成分作用浓度为0.25mg/ml，0.5mg/ml和0.75mg/ml。
5.3样本制备和抗氧化指标测定
取处于对数生长期的细胞接种于12孔细胞培养板上，细胞密度为5-7×104个/ml，每孔1000μL，将其分为空白组和模型组、返魂草水提物组和返魂草酚酸成分组，每组设3个复孔，培养24h后，4℃高速3000rpm离心10min，取上清保存于-20℃，待测。根据试剂盒说明书测定细胞上清液中总抗氧化能力(T-AOC)水平、SOD活力、过氧化氢酶(CAT)活力和谷胱甘肽(GSH)水平。
表5返魂草酚酸成分对16HBE中抗氧化酶和GSH的影响(n＝3，)
注：与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
根据表5可知，16HBE经过54℃高温培养基孵育5min后，细胞的总抗氧化能力(T-AOC)、抗氧化酶SOD和CAT以及抗氧化物还原型谷胱甘肽(GSH)较空白组均有明显下降(P<0.05)，说明高温可以诱导16HBE细胞氧化水平增加。与模型组相比，16HBE细胞经过返魂草酚酸成分孵育24h后，各项抗氧化指标均以剂量依赖性方式显著提升，对SOD活力作用最显著，可以将SOD活力提升至空白组的5倍以上。同剂量的返魂草酚酸成分的T-AOC水平、SOD和CAT活力以及GSH水平分别为返魂草水提物的128.9％、288.0％、125.2％和127.7％，有显著提升。
6.返魂草酚酸成分抗炎活性分析
6.1返魂草酚酸成分体外抗炎活性分析
6.1.1小鼠巨噬细胞炎症模型的建立与评价
RAW264.7是小鼠来源白血病毒诱导肿瘤细胞，属于巨噬细胞，被广泛用于机体免疫调节和炎症等方面的研究。目前，脂多糖(LPS)诱发的RAW264.7炎症模型已经被广泛应用于药物抗炎活性的研究。因此本实验采用LPS为建模药物考察返魂草酚酸成分对RAW264.7细胞炎症的治疗作用。
取处于对数生长期的细胞接种于96孔细胞培养板上，细胞密度为1×105个/ml，每孔100μL，将其分为空白组和LPS组(分别设0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml和50μg/ml)，每个温度设6个复孔，培养24h。以细胞活力为指标通过MTT实验考察LPS对RAW264.7细胞活力的影响，并根据ELISA试剂盒说明书测定细胞上清液中一氧化氮(NO)水平。
表6 LPS对RAW264.7细胞活力及SOD活力的影响(n＝6，)
注：与空白对照组(37℃)比较，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。
由表6可知，LPS浓度低于1μg/ml时，细胞活力和NO释放没有显著改变，而高于10μg/ml时，LPS引起细胞活力及NO水平显著下降，综合细胞活力及炎症因子NO释放量，采用LPS建模浓度为1μg/ml。
6.1.2样本制备和炎症因子水平测定
取处于对数生长期的细胞接种于12孔细胞培养板上，细胞密度为1×105个/ml，每孔1000μL，将其分为空白组和模型组和返魂草酚酸成分组，每组设3个复孔，培养24h后，4℃高速3000rpm离心10min，取上清保存于-20℃，待测。根据试剂盒说明书测定细胞上清液中NO水平、一氧化氮合酶(iNOS)活力、白介素1β(IL-1β)、核转录因子-κB(NF-κB)。
表7返魂草酚酸成分对RAW264.7中炎性因子的影响(n＝3，)
注：与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
根据表7可知，LPS可以显著增加RAW264.7细胞释放NO、iNOS、IL-1β和NF-κB水平(P<0.05)，而上述四种促炎性因子的增加证明LPS可以诱导RAW264.7细胞发生炎性转变。经过返魂草酚酸部分治疗后，NO、iNOS、IL-1β和NF-κB水平显著下降至空白组水平，说明返魂草酚酸成分对LPS诱导的细胞炎症有良好的治疗作用。
6.2返魂草酚酸成分体内抗炎活性分析
6.2.1实验动物
Balb/c小鼠，雌性，体重20-22g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物质量合格证号:SYXK(京)2017-0013。正常饲养温度(22±1)℃，相对湿度55％-65％，12h光照周期，自由进食、进水。
6.2.2动物分组及给药方案
动物购买后适应性饲养3d后随机分组:正常对照组、模型对照组、阿司匹林阳性对照组(100mg·kg)和返魂草酚酸成分治疗组(剂量为1.5mg/Kg、4.5mg/Kg和13.5mg/Kg)，每组10只。动物连续给药3d。末次给药后，除正常对照组外，其他各组动物自足跖中部皮下注射1％的角叉菜胶30μl。
6.2.3小鼠足肿胀度测定
于注射角叉菜胶4h后，用足趾容积测量仪测定小鼠的足趾体积。通过比较各组足肿胀程度，评价药物抗炎作用。结果见图5。
由图5可知，角叉菜胶可以导致小鼠足趾体积显著增加至正常组水平的1.62倍。阿司匹林(100mg/Kg)和返魂草酚酸成分的中、高剂量均可以显著降低小鼠足趾肿胀程度。
6.2.4炎症因子水平测定
根据ELISA试剂盒说明书测定小鼠足跖组织中IL-1β、NF-κB和TNFα水平，实验结果见表8。
表8返魂草酚酸成分对小鼠足趾中炎性因子的影响(n＝3，)
注：与空白对照组比较，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001；与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
根据表8可以看出，角叉菜胶可以引起小鼠足趾中促炎症因子IL-β、NF-κB和TNFα水平显著增加，说明小鼠的足趾中发生炎症。采用返魂草酚酸灌胃治疗3天后，小鼠的抗炎即抗小鼠足趾肿胀能力呈现剂量依赖性增强的趋势。并且，返魂草酚酸成分较阿司匹林具有更强的抗炎效果。
7.返魂草酚酸成分抗菌活性分析
细菌引起的感染包括医院外感染和医院内感染两个方面，本发明选择院外感染性细菌中的肺炎链球菌、化脓性链球菌和院内感染细菌中的表皮葡萄球菌、肠球菌为研究对象，考察返魂草酚酸成分的抑菌效果。
7.1菌种
肺炎链球菌、化脓性链球菌、表皮葡萄球菌、肠球菌均购自中国食品药品检定研究院。
7.2最低抑菌浓度测定
将菌粉用相应液体培养基复苏24h，再接种到相应的琼脂培养基上活化24h，最后从琼脂培养基上再接种到液体培养基上，培养24h备用。
用2倍稀释法配制药物的6个梯度浓度药液，再将不同浓度的药液与相应的培养基1∶9混合制成含返魂草酚酸成分浓度为10、5、1、0.5、0.1、和0.01mg/ml，。用接种环将肺炎链球菌、化脓性链球菌和表皮葡萄球菌、肠球菌接种于对应的平皿中，同时制备3个菌的阳性对照(用生理盐水替代受试药)，于37℃，5％CO2中的培养箱中培养18～24h。每个药物浓度进行一次重复实验。结果见图6。
由图6可知返魂草对肺炎链球菌、化脓性链球菌和表皮葡萄球菌、肠球菌生长均具有抑制效果，其对应的最低抑菌浓度分别为0.5mg/ml、0.1mg/ml、0.05mg/ml和1mg/ml。7.3抑菌活性测定
采用生长速率法测定返魂草酚酸成分对4种细菌的抑菌活性，使返魂草酚酸成分浓度为1mg/ml。以加稀释酚酸的灭菌培养基为对照。平板冷却后选取生长一致、直径为4mm的菌饼，菌丝面朝下接入平板。25℃培养箱中培养，待对照菌落几乎长满全皿，用十字交叉法测量菌落直径，按下式计算抑制率，平行测定三次。
抑菌直径＝测量直径-4.0(菌饼直径)
表9返魂草酚酸成分对感染性细菌的抑制率(n＝3，)
由表9可知，返魂草酚酸提取物对肺炎链球菌、化脓性链球菌和表皮葡萄球菌、肠球菌的生长速率起到负调节作用，其对以上四种细菌的抑制率分别为67.2％、74.1％、56.5％和36.8％。该结果提示，返魂草酚酸成分对院外感染的细菌治疗效果优于院内感染细菌。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (8)
1.一种返魂草酚酸成分，是将返魂草水提液用截流分子量为5000-30000的膜滤过滤后所得滤液上D101大孔树脂，采用50-80％乙醇洗脱所得的醇洗部分。
2.根据权利要求1所述的返魂草酚酸成分，其特征在于，采用55-65％乙醇洗脱，更优选采用60％乙醇洗脱。
3.根据权利要求1或2所述的返魂草酚酸成分，其特征在于，所述返魂草酚酸成分其总酚酸纯度为70.42-76.43％。
4.根据权利要求1-3任一项所述的返魂草酚酸成分，其特征在于，所述返魂草酚酸成分含有21种酚酸类成分，分别为：没食子酸、同型原儿茶酸、原儿茶酸、绿原酸、对羟基苯乙酸、尿苷、咖啡酸、(异)柠檬酸、2-(1,4-二羟基环己烯)乙酸、咖啡酰奎宁酸甲酯、芦丁、金丝桃苷、紫云英苷、异绿原酸A、丁烯二酸、单羟基琥珀酸、5-亚乙基-2-羟基-2-羟甲基-3-甲基-己稀二酸水杨酸、2-(4-羟苯基)乙酸甲酯、芥子酸、4,4-二甲基-1,7-庚二酸、4-(吡咯烷-2-酮基)-苯基乙酸。
5.权利要求1-4任一项所述返魂草酚酸成分的制备方法。
6.一种返魂草酚酸成分的制备方法，其特征在于，包括：将返魂草加水煎煮得煎煮液，将煎煮液用截流分子量为5000-30000的膜滤过滤，再将滤液浓缩成稠膏，最后将稠膏干燥并粉碎，得返魂草水提物；取上述返魂草水提物，加蒸馏水适量溶解，注入稀释液至装有大孔树脂D101的柱子中，先用蒸馏水洗脱至溶液澄清，得到返魂草D101-水洗部分，采用50-80％乙醇洗脱大孔树脂柱，至溶液澄清得到返魂草D101-醇洗部分，将上述洗脱液浓缩，冻干，即可。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，采用55-65％乙醇洗脱，优选采用60％乙醇洗脱。
8.权利要求1-4任一项所述返魂草酚酸成分或权利要求5-7任一项所述返魂草酚酸成分在制备抗氧化、抗炎或抗菌药物中的应用；
优选地，所述菌包括肺炎链球菌、化脓性链球菌、表皮葡萄球菌、肠球菌。
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