CN1879688B - 风热清制剂及其制备方法和检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种风热清制剂及其制备方法和质量控制方法，按照重量组分计算：它是由金银花425-1700份、熊胆粉2.5-10份、青黛25-100份、桔梗250-1000份、瓜蒌皮200-800份和甘草100-400份制成的。与现有技术相比，本发明制剂清宣并用，组方严谨，具有清热解毒、宣肺、透表、利咽、化痰之效，对感冒风热证及上呼吸道感染的疗效确切，无毒副作用，且其制备工艺和质量控制方法科学合理，可有效控制产品质量，从而确保其临床疗效。

Description

风热清制剂及其制备方法和检测方法

技术领域：本发明涉及一种风热清制剂及其制备方法和质量控制方法，属于中药的技术领域。

背景技术：中医外感发热证(风热型)与西医的急性上呼吸道感染相似，是临床常见病、多发病。由于感受风热邪毒，其病邪为阳邪，故发热重，恶寒轻；风热上受故头痛、咽痛、鼻塞；风热犯肺，肺失清肃，则咳嗽咯痰；舌红苔薄黄或薄白，脉浮数为风热之象。如病情蔓延可继发或并发急性中耳炎、鼻炎、鼻窦炎、喉炎、气管炎、支气管炎，甚至肺炎，严重危害人们的健康。根据外感发热证(风热型)的病因病机和发病特点，治法为清热解毒，宣肺达表，利咽化痰。目前，市售治疗该类疾病的中西药虽然繁多，但具有确切疗效的甚少。为了更有效地防治该类疾病，本申请人研制出一种安全、有效的新药。

此外，为了全面有效地控制药品质量，以确保其临床疗效，必须制定科学合理的质量控制方法。

发明内容：

本发明的目的在于：提供一种风热清制剂及其制备方法和质量控制方法，所提供的制剂用于外感风热所致的发热、微恶风寒、头痛、咳嗽、流涕、口渴、咽痛，以及急性上呼吸道感染见上述症状者，其疗效确切，无毒副作用，而且制备方法合理，产品质量易控。

本发明是这样构成的：按照重量组分计算：它是由金银花425-1700份、熊胆粉2.5-10份、青黛25-100份、桔梗250-1000份、瓜蒌皮200-800份和甘草100-400份制成的。

具体的说，按照重量组分计算：它是由金银花850份、熊胆粉5份、青黛50份、桔梗500份、瓜蒌皮400份和甘草200份制成的。

所述的制剂为口服液、片剂或胶囊剂。

本发明风热清制剂的制备方法为：青黛用50％-90％乙醇浸渍12-48小时后，渗漉，收集渗漉液，药渣备用；金银花重蒸馏，收集浓芳香水100-600ml，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣备用；桔梗、瓜蒌皮、甘草加水浸泡0.2-2小时，煎煮0.52小时，滤过，滤液备用；药渣与上述两种药渣合并，煎煮1-3次，每次20-90分钟，滤过，合并各次滤液及蒸馏后的水溶液，滤过，滤液浓缩至90℃相对密度为1.05-1.35，加乙醇使含醇量达50-90％，放置，滤过，滤液与渗漉液合并，回收乙醇，加入芳香水及熊胆粉，然后按常规方法制成不同的制剂。

优选的制备方法为：青黛用80％乙醇浸渍24小时后，渗漉，收集渗漉液，药渣备用；金银花重蒸馏，收集浓芳香水300ml，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣备用；桔梗、瓜蒌皮、甘草加水浸泡0.5小时，煎煮1小时，滤过，滤液备用；药渣与上述两种药渣合并，煎煮2次，每次40分钟，滤过，合并各次滤液及蒸馏后的水溶液，滤过，滤液浓缩至90℃相对密度为1.10，加乙醇使含醇量达80％，放置，滤过，滤液与渗漉液合并，回收乙醇，加入芳香水及熊胆粉，然后按常规方法制成不同的制剂。

所述的口服液这样制备：青黛用80％乙醇浸渍24小时后，渗漉，收集渗漉液，药渣备用；金银花重蒸馏，收集浓芳香水300ml，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣备用；桔梗、瓜蒌皮、甘草加水浸泡0.5小时，煎煮1小时，滤过，滤液备用；药渣与上述两种药渣合并，煎煮2次，每次40分钟，滤过，合并各次滤液及蒸馏后的水溶液，滤过，滤液浓缩至90℃相对密度为1.10，加乙醇使含醇量达80％，放置，滤过，滤液与渗漉液合并，回收乙醇，加入芳香水及熊胆粉，用10％氢氧化钠溶液调PH值至6.0-6.5，静置，滤过；滤液加适量甜菊甙、尼泊金乙酯和香蕉香精，加水至1000mL，灭菌，灌封，即得。

所述的片剂这样制备：青黛用80％乙醇浸渍24小时后，渗漉，收集渗漉液，药渣备用；金银花重蒸馏，收集浓芳香水300ml，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣备用；桔梗、瓜蒌皮、甘草加水浸泡0.5小时，煎煮1小时，滤过，滤液备用；药渣与上述两种药渣合并，煎煮2次，每次40分钟，滤过，合并各次滤液及蒸馏后的水溶液，滤过，滤液浓缩至90℃相对密度为1.10，加乙醇使含醇量达80％，放置，滤过，滤液与渗漉液合并，回收乙醇并浓缩至稠膏，加入熊胆粉，混匀，干燥，粉碎，过筛，加入芳香水及适当辅料，制粒，干燥，压片，包衣，即得。

所述的胶囊剂这样制备：青黛用80％乙醇浸渍24小时后，渗漉，收集渗漉液，药渣备用；金银花重蒸馏，收集浓芳香水300ml，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣备用；桔梗、瓜蒌皮、甘草加水浸泡0.5小时，煎煮1小时，滤过，滤液备用；药渣与上述两种药渣合并，煎煮2次，每次40分钟，滤过，合并各次滤液及蒸馏后的水溶液，滤过，滤液浓缩至90℃相对密度为1.10，加乙醇使含醇量达80％，放置，滤过，滤液与渗漉液合并，回收乙醇并浓缩至稠膏，加入熊胆粉，混匀，干燥，粉碎，过筛，加入芳香水及适当辅料，制粒，装入胶囊，即得。

本发明风热清制剂(口服液)的质量控制方法为：所述质量控制方法主要包括性状、鉴别、检查以及含量测定项目中的部分或全部；其中鉴别包括对制剂中青黛、熊胆粉和甘草的薄层色谱鉴别，含量测定是对制剂中金银花和熊胆粉的含量测定。

所述质量控制方法包括：

性状：产品为深棕色液体，久贮有极少量振摇即分散的沉淀；气微腥，味苦。

鉴别：(1)取本制剂20ml，用氯仿提取二次，每次20ml，合并氯仿液，浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取靛玉红对照品，加氯仿制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以苯∶氯仿∶丙酮＝5∶4∶1为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点。

(2)取本制剂20ml，水浴蒸干，加甲醇10ml使溶解，滤过，滤液置硬质试管中，水浴蒸至近干，加5％氢氧化钠溶液5ml，水浴加热6-8小时，随时补充失去的水分，放冷，加盐酸调节PH至1-2，用醋酸乙酯提取二次，每次5ml，合并醋酸乙酯液，浓缩至2ml，作为供试品溶液；另取熊去氧胆酸对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2-3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异辛烷∶乙醚∶冰乙酸∶正丁醇∶水＝10∶5∶5∶3∶1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％硫酸乙醇溶液，于105℃烘5分钟，取出，10分钟后置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(3)取本制剂20ml，加盐酸1ml与氯仿20ml，加热回流1小时，放冷，分取氯仿液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草次酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以30-60℃石油醚∶苯∶醋酸乙酯∶冰醋酸＝10∶20∶7∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸乙醇溶液，于105℃烘5分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

检查：相对密度照中国药典2005年版一部附录VII A检测，应不低于1.04；

pH值：照中国药典2005年版一部附录VIIG检测，应为4.0～6.0；

其他应符合中国药典2005年版一部附录IJ合剂项下有关的各项规定。

含量测定：

(1)金银花照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定：

系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.2％三乙胺∶甲醇∶磷酸＝800∶200∶1为流动相，检测波长为328nm，理论塔板数按绿原酸峰计算，应不低于4000；

对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.03mg的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备精密量取本制剂1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1ml，加流动相稀释成10ml，作为供试品溶液；

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每1ml含金银花以绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)计，不得少于2.5mg。

(2)熊胆粉照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基键合硅胶为填料；甲醇∶0.03mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值至4.4)＝65∶35为流动相，检测波长为210nm；理论板数按牛磺熊去氧胆酸峰计算应不低于2500；

对照品溶液的制备取经五氧化二磷容器中减压干燥至恒重的牛磺熊去氧胆酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释至每1ml含1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备精密量取本制剂1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以0.45μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1ml，加流动相稀释成10ml，作为供试品溶液；

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每1ml含熊胆粉以牛磺熊去氧胆酸(C₂₆H₄₅NO₈S)计，不得少于1.2mg。

本发明的方解：本方由金银花、青黛、瓜蒌皮、桔梗及熊胆粉六味药物组成。方中金银花“既有辛凉透邪清热之效，又具芳香辟秽解毒之功”，于清热解毒中寓轻宣疏散，清宣并用，透邪出表，无冰伏邪气之弊，针对风热毒邪引起的主症及病机，为君药。再辅以熊胆粉与青黛二药为臣药。熊胆粉苦寒无毒，清热解毒。青黛清热解毒，凉血，定惊。甘草长于清热解毒，配桔梗有宣肺祛痰之效。瓜蒌皮善清热宽胸，涤痰散结，均为祛痰要药，共为方中佐使，如此配伍，君臣佐使配合精当，清热解毒，宣肺达表，利咽化痰功效皆具，药味少而疗效好。

本发明制剂的功能主治：清热解毒，宣肺透表，利咽化痰。用于外感风热所致的发热、微恶风寒、头痛、咳嗽、流涕、口渴、咽痛，以及急性上呼吸道感染见上述症状者。

与现有技术相比，本发明制剂清宣并用，组方严谨，具有清热解毒、宣肺、透表、利咽、化痰之效，对感冒风热证及上呼吸道感染的疗效确切，无毒副作用，且其制备工艺和质量控制方法科学合理，可有效控制产品质量，从而确保其临床疗效。

为了验证本发明制剂具有良好的治疗效果，申请人进行了一系列试验研究，具体如下：

一、制剂处方筛选

金银花，青黛，瓜蒌皮，甘草四味药材组成“青黛饮”，来源于清代刘奎《松峰说疫》；桔梗、甘草二味组成“桔梗汤”，出自张仲景《伤寒论》。故本方为“青黛饮”与“桔梗汤”二方相合加熊胆粉及辅料组成。

(一)材料

1、受试药物

风热清口服液(简称风热清，金银花850g、熊胆粉5g、青黛50g、桔梗500g、瓜蒌皮400g、甘草200g制备而成)，由成都中医药大学附属医院药剂科制备，批号911228。相当于生药2g/ml。

青黛饮(青黛50g、甘草200g、金银花850g、瓜蒌皮400g)，由成都中医药大学附属医院药剂科制备，相当于生药1.5g/ml。

桔梗汤(桔梗500g、甘草200g)，由成都中医药大学附属医院药剂科制备，相当于生药0.7g/ml。

青黛饮+桔梗汤(青黛50g、甘草200g、金银花850g、瓜蒌皮400g、桔梗500g)，由成都中医药大学附属医院药剂科制备，相当于生药2g/ml。

2、实验动物

昆明种小鼠，NIH小鼠(体重18～22g)，SD大鼠，由华西医科大学实验动物中心、四川省医科院实验动物中心提供，均符合健康一级标准。日本大耳白兔由农业部成都生物药品厂提供。

(二)方法与结果

1、解热作用

1.1对菌苗致家兔发热的影响家兔，雌雄均有，体重2.5±0.2kg，实验前禁水15h。用温度指示仪间隔1h测量正常体温(肛温)2次，选取2次温差不超过0.3℃，平均体温在38.4～39.6℃的家兔，自耳缘静脉注入伤寒副伤寒甲乙三联菌苗0.5ml/kg，1h后再测量体温，取升温0.8℃以上的发热家兔，按升温高低均匀分为6组，风热清组灌服风热清20ml/kg(相当于40g/kg)；青黛饮组灌服青黛饮20ml/kg(相当于生药30g/kg)；桔梗汤组灌服桔梗汤20ml/kg(相当于生药14g/kg)；青黛饮+桔梗汤组灌服青黛饮+桔梗汤20ml/kg(相当于生药40g/kg)；阳性对照组灌服0.75％阿司匹林20ml/kg(0.15g/kg)，空白对照灌服等容积生理盐水，给药后每隔1h同法测量体温1次，共测5次，计算其体温变化，结果见表1。

表1对家兔菌苗发热的影响(X±S)

表1结果表明，家兔注射菌苗后1h体温已明显升高，3h(给药后1h)达高峰。风热清40g/kg组在致热后各时间体温升高均显著低于对照组、青黛饮组、桔梗汤组和青黛饮+桔梗汤。

1.2对角叉菜胶致大鼠发热的影响雄性大鼠，体重164±20g，实验前禁水15h，用温度指示间隔1h测量正常体温(肛温)3次，选择平均体温38～39℃，温差不超过0.2℃的大鼠32只，按正常体温随机分为6组。于每鼠两后肢足跖部皮下分别注入1％角叉菜胶0.1ml致热，随后按表2所示剂量灌胃给药，于致热后4～8h，每隔1h同法测量各鼠体温1次，共测5次。

表2对大鼠角叉菜胶发热的影响(X±S)

结论：由上述试验结果可知，风热清处方较其他组方更具明显的退热效果。

二、稳定性考察

本发明质量控制中增加了牛磺熊去氧胆酸含量测定，为了考察风热清口服液中的牛磺熊去氧胆酸的含量变化情况，依据本发明的风热清口服液质量控制方法，我们做了如下的稳定性试验：

(一)室温稳定性试验

将2003年本申请人生产包装(药用PVC/PE瓶，10ml×6支/盒)的三批(批号为031001、031002、031003)产品室温稳定性试验数据收录如下(试验条件：室温留样观察；考察项目：性状、鉴别、相对密度、PH值、装量差异、微生物限度、含量；试验原则：于0个月、3个月、6个月、12个月、18个月分别取样一次进行考察，然后每年取样一次进行考察)。结果见表3～表7。

表3长期稳定性试验(0个月)  试验日期：2003年10月20日

表4  长期稳定性试验(3个月)  试验日期：2004年1月22日

表5  长期稳定性试验(6个月)  试验日期：2004年04月20日

表6  长期稳定性试验(12个月)  试验日期：2004年10月22日

表7  长期稳定性试验(18个月) 试验日期：2005年04月21日

(二)加速稳定性试验

将2003年本申请人生产包装(药用PVC/PE瓶，10ml×6支/盒)的三批(批号为031001、031002、031003)产品加速稳定性试验数据收录如下(试验条件：温度37℃～40℃、相对湿度75％；考察项目：性状、鉴别、相对密度、PH值、装量差异、微生物限度、含量；试验原则：于0个月、1个月、2个月、3个月分别取样一次进行考察)。结果见表8～表11。

表8  加速稳定性试验(0个月)  试验日期：2003年10月20日

表9  加速稳定性试验(1个月)  试验日期：2003年11月21日

表10  加速稳定性试验(2个月)  试验日期：2003年12月20日

表11 加速稳定性试验(3个月)  试验日期：2004年01月22日

结论：本品2003年三批(批号为031001、031002、031003)产品的室温长期稳定性试验18月与加速稳定性试验3月结果表明：三批样品各项检测指标未见大幅度改变，各项考核项目均符合规定。证明本发明制剂的生产工艺能有效保证药品的质量，故将本品的有效期定为一年半是合理、可行的。

三、主要药效学研究

根据该方功能主治，申请人研究了风热清口服液的药理活性，现总结如下：

(一)材料

1、受试药物

风热清口服液(简称风热清)，由成都中医药大学附属医院药剂科制备，批号911228，相当于生药2g/ml(文中所列剂量均为生药量)。

2、实验动物

昆明种小鼠，NIH小鼠(体重18～22g)，SD大鼠，由华西医科大学实验动物中心、四川省医科院实验动物中心提供，均符合健康一级标准。日本大耳白兔由农业部成都生物药品厂提供。

(二)方法与结果

1、解热作用

1.1对菌苗致家兔发热的影响家兔，雌雄均有，体重2.5±0.2kg，实验前禁水15h。用温度指示仪间隔1h测量正常体温(肛温)2次，选取2次温差不超过0.3℃，平均体温在38.4～39.6℃的家兔，自耳缘静脉注入伤寒副伤寒甲乙三联菌苗0.5ml/kg，1h后再测量体温，取升温0.8℃以上的发热家兔，按升温高低均匀分为4组，两给药组分别灌服200％与50％的风热清20ml/kg(相当于生药40g/kg与10g/kg)，阳性对照组灌服0.75％阿司匹林20ml/kg(0.15g/kg)，空白对照灌服等容积生理盐水，给药后每隔1h同法测量体温1次，共测5次，计算其体温变化，结果见表12。

表12  对家兔菌苗发热的影响(X±S)

与同期对照组比较：a：P＜0.05；b：P＜0.01；c：P＜0.001(下表同)。

表12结果表明，家兔注射菌苗后1h体温已明显升高，3h(给药后1h)达高峰。风热清40g/kg组在致热后各时间体温升高均显著低于对照组，10g/kg组的体温增高仅在给药后2h与对照组比较有显著性差异。

1.2对角叉菜胶致大鼠发热的影响  雄性大鼠，体重164±20g，实验前禁水15h，用温度指示间隔1h测量正常体温(肛温)3次，选择平均体温38～39℃，温差不超过0.2℃的大鼠32只，按正常体温随机分为4组。于每鼠两后肢足跖部皮下分别注入1％角叉菜胶0.1ml致热，随后按表13所示剂量灌胃给药，于致热后4～8h，每隔1h同法测量各鼠体温1次，共测5次。

表13  对大鼠角叉菜胶发热的影响(X±S)

表13结果表明，大鼠注射角叉菜胶后4h体温已升高，6h达高峰，风热清给药组在发热各时期体温升高均低于对照组，具有退热趋势。

2、抗炎作用

2.1对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响  雄性大鼠60只，体重(178±20)g，按体重随机分为5组，于每鼠右后足踝关节上方划一线作为标志，用毛细管放大法测量该足爪体积(排水毫升数)，然后每鼠右后肢足跖部皮下注射1％角叉菜胶0.1ml致炎，致炎后0.5h与4h按表14所示剂量各灌胃给药1次，同法测量给药后1、2、3、4、6、7、24h该足爪体积，以其体积的改变(给药前后排水量之差)表示炎症肿胀程度，结果见表14。

表14  对角叉菜胶大鼠足肿胀的影响(X±S)

注：()内为肿胀抑制百分率。

表14结果表明，风热清40、20与10g/kg对角叉菜胶引起的大鼠足炎性水肿均具有明显抑制作用，尤其是大剂量，在致炎后24h抑制作用仍然显著。

2.2对二甲苯致小鼠耳肿胀的影响  雄性小鼠75只，随机分为5组，连续灌胃给药3d，以二甲苯为致炎剂测定各组耳肿胀度。结果对照组，风热清高(40g/kg)、中(20g/kg)、低(10g/kg)剂量组，泼尼松20mg/kg给药(阳性对照)耳肿胀度分别为(11.2±1.7)，(9.3±2.6)，(8.6±2.5)，(10.7±1.9)，(7.6±2.4)mg。风热清高、中剂量与20mg/kg泼尼松具有显著抗炎作用，与对照组比较分别为P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001。

2.3对小鼠皮肤毛细血管通透性增高的影响雄性小鼠75只，随机分为5组，连续灌胃给药3d，末次给药后1h，每鼠尾静脉注射1％伊文思兰0.1ml/10g，立即于下腹部皮内注入0.1％磷酸组胺0.1ml，上腹部脱毛区滴二甲苯20μl，20min后处死小鼠，剪下二甲苯致炎部位兰斑皮肤，剪碎后浸入2.5ml丙酮生理盐水中，室温放置24h，离心，取上清液置721分光光度计610nm比色，直接以OD值进行比较；剥离并翻转下腹部皮肤，分级法比较各鼠组胺皮丘周围兰染程度(兰染程度分为4级)。结果见表15。

表15  对小鼠皮肤毛细血管通透性增高的影响(X±S)

由表15可知，对于二甲苯所引起的小鼠皮肤毛细血管通透性增高，风热清大、中、小剂量均具有显著抑制作用，对于组胺所致皮肤毛细血管通透性增高，仅大剂量有明显抑制效果。

3、抗菌作用

3.1体外抗菌试验采用“试管二倍稀释法”测定风热清对8种常见致病菌的最低抑菌浓度(M IC)。结果表明，风热清对金葡菌、甲型与乙型链球菌、肺炎球菌、大肠杆菌、福氏痢疾杆菌、变形杆菌、绿脓杆菌均具有一定抑菌作用，MIC分别为0.062，0.062，0.031，0.062，0.500，0.5000，0.125，0.25g/ml。

3.2对小鼠金葡菌感染的保护作用小鼠100只，雌雄各半，按性别、体重随机分为5组，连续灌胃给药3d。金葡菌接种于肉汤培养基中，置37℃培养箱中培养15h，用无菌肉汤作1∶4稀释(预试对小鼠的死亡率为90％)。于末次给药后1h，每鼠腹腔注射上述金葡菌悬液0.5ml，染菌后2h再给药1次(剂量减半)，观察24h内各组小鼠死亡情况。结果对照组，风热清40，20，10g/kg组，乙酰螺旋霉素1g/kg组(阳性对照)动物死亡数分别为19/20，14/20，18/20，18/20，4/20，提示风热清可以降低小鼠感染金葡菌的死亡率，但保护作用不显著(与对照组比较P＞0.05)。

3.3小鼠肺炎球菌感染的保护作用

动物、分组及给药同“3.2”。肺炎球菌接种于含10％小牛血清的肉汤培养基中，置培养箱37℃培养18h，用无菌肉汤作1∶7稀释(预试时对感染小鼠的死亡率为100％)，于末次给药后1h，每鼠腹腔注射上述菌液0.5ml，观察24h内小鼠死亡情况。结果对照组，风热清40，20，10g/kg组，乙酰螺旋霉素组动物死亡数分别为20/20，14/20，16/20，19/20，6/20，表明风热清能够提高小鼠对肺炎球菌的抵抗能力，以高剂量组为显著，感染小鼠死亡数与对照组比较P＜0.05。

4、抗病毒作用  流感病毒甲1型、甲3型，腺病毒3型、7型均作10^-1与10^-2稀释，分别与不同浓度的药液等量混合，接种于人胚肾细胞中(各两管)吸附40min，加入2％小牛血清乳白蛋白细胞维持液，置37℃培养1周，逐日观察细胞病变，流感病毒7d后作豚鼠血球吸附试验，以吸附试验阴性(一)为灭活指标。腺病毒以细胞不出现腺病毒变(一)为灭活指标。结果见表16、17。

表16  对腺病毒的灭活作用

“-”表示细胞无病变，“+++”表示典型腺病毒病变。

表17  对流感病毒的灭活作用

“-”表示血球吸附阴性，“+++”表示血球吸附阳性。

以上结果表明，风热清1∶10浓度对上述各型腺病毒及流感病毒均具有灭活作用，1∶20浓度对腺病毒3型、7型与流感病毒甲1型可灭活；1∶40浓度仅对较低浓度(10^-2)腺病毒7型具有灭活作用。以相同药物稀释浓度比较，风热清对腺病毒与流感病毒甲1型的灭活作用强于抗病毒口服液，对流感病毒3型的灭活作用不如抗病毒口服液。

5、对免疫功能的影响

5.1对小鼠单核巨噬细胞系统吞噬功能的影响  雄性小鼠40只，随机分为4组，连续灌胃给药7d。末次给药后24h，尾静脉注射墨汁(西德产，chroma)0.1ml/10g，于注射后30s与5min分别自眼眶血管丛取血25μl，加入0.1％Na₂CO₃2ml中，置721分光光度计675nm比色测定OD值，计算吞噬指数K。结果对照组，风热清40，20g/kg组，左旋咪唑15mg/kg组的吞噬指数分别为0.033±0.008，0.042±0.009，0.036±0.007，0.046±0.011，其中高剂量组吞噬指数较对照组明显增大(P＜0.05)，表明该药物具有促进小鼠单核巨噬细胞非特异性吞噬功能的作用，与15mg/kg左旋咪唑无显著性差异。

5.2对小鼠迟发型皮肤超敏反应(DCH)的影响  雄性NIH小鼠50只，随机分为5组，连续灌胃给药10d，用二硝基氯苯(DNCB)对小鼠进行致敏与攻击，测定各组小鼠的DCH反应程度，以腹部兰染皮伊文思兰浸出液的OD值表示。结果对照组为0.073±0.017；风热清40g/kg组与20g/kg组分别为0.099±0.014(P＜0.01)与0.100±0.015(P＜0.01)；环磷酰胺20mg/kg(ip)组为0.044±0.019(P＜0.01)，环磷酰胺+风热清40g/kg组0.086±0.016(与环磷酰胺组比较P＜0.001)。表明风热清可以提高DNCB诱导的正常小鼠的DCH反应与免疫低下(被环磷酰胺所抑制)的小鼠的细胞免疫功能。

6、止咳作用  雄性小鼠60只，随机分为4组，采用氨水引咳法小鼠灌胃给药后1h进行实验，接受氨水刺激1min后取出，观察记录2min内的咳嗽次数。结果对照组，风热清40，20g/kg组和可待因30mg/kg组小鼠的平均咳嗽次数分别为45.1±21.5，32.5±21.0，40.5±24.4和20.6±21.0(P＜0.01)，表明风热清对氨水刺激引起的小鼠咳嗽无明显止咳作用。

7、祛痰作用小鼠60只，雌雄均有，随机分为4组，灌胃给药后40min，用酚红法测定各组小鼠呼吸道灌洗液的酚红浓度(以OD值表示)。结果对照组为0.037±0.019；风热清40g/kg组与20g/kg组分别为0.064±0.019(P＜0.01)与0.051±0.014(P＜0.05)；氯化铵1g/kg组为0.060±0.021(P＜0.01)，表明风热清能使小鼠呼吸道粘膜的分泌量明显增加，具有祛痰作用，40g/kg风热清的作用与1g/kg氯化铵接近(P＜0.05)。

讨论：

以上实验结果表明，风热清口服液对伤寒副伤寒菌苗所引起的家兔发热有显著退热作用，对角叉菜胶引起的大鼠发热具有一定退热作用，可以明显抑制角叉菜胶所致大鼠足肿胀，二甲苯所致小鼠耳肿胀，降低组胺或二甲苯引起的小鼠皮肤毛细血管通透性增高，即通过多种途径抑制以渗出水肿为主的急性炎症。另外，酚红试验显示本制剂可以增加呼吸道粘膜的分泌，发挥祛痰作用。这些作用是临床治疗外感发热症(急性上呼吸道感染)的药理学基础之一。它可显著增强单核巨噬细胞系统对血中惰性碳粒的廓清能力，刺激正常与免疫功能低下小鼠的细胞免疫功能；本制剂对肺炎双球菌及金葡菌感染小鼠引起的死亡具有一定保护作用，体外较高浓度能灭活流感病毒与腺病毒，抑制金葡菌、链球菌、肺炎双球菌等G⁺球菌及部分G^-杆菌的生长，提示本制剂临床疗效与其提高机体免疫功能及直接杀抑病原微生物有关。

四、毒理学研究

3.1急性毒性试验

3.1.1材料

风热清口服液：成都中医学院附院药剂科制备，批号911228，浓度200％(每毫升相当于原生药2g)，PH4.5。浓缩至最大浓度供最大剂量组用(浓缩方法：减压蒸馏，收集约10％芳香水，重蒸馏的约2％芳香水，余药液继续浓缩为较稠的药液，合并芳香水与浓缩药液，计算其浓缩药液浓度。

实验动物：昆明种小白鼠，雌雄各半，体重20±2g，华西医科大学实验动物中心提供，符合健康一级标准，生产合格证：川医动管第007号。

3.1.2实验条件

实验过程种，动物自由饮水，进食，观察室室温保持18～21℃，相对湿度70～80℃，自然光照明，换气风扇通风，饲料为小鼠颗粒料，四川省医科院实验动物中心提供。

3.1.3方法与结果

取小鼠60只，按性别、体重随机分成六组，每组10只，最高剂量组灌服上述浓缩药液，其余各组用药采用低比稀释法稀释，剂量比值为1∶0.85，灌胃体积为0.4ml/10g，给药一次，观察一周内动物的毒性反应与死亡情况。给药后小鼠活动减少或匐伏不动，上睑下垂，部分小鼠竖毛，呼吸困难，随剂量增加毒性反应加重，严重者痉厥死亡，死亡时间在给药后4～20小时内，死亡小鼠立即尸检，肉眼观察主要脏器，未见异常，存活小鼠7日后处死观察主要脏器，亦未见异常。

简化机率单位法计算风热清口服液对小鼠口服给药的LD₅₀及95％可信限，结果见表18：

表18急性毒性研究结果

结论：

风热清口服液对小鼠口服给药的LD₅₀为422.16±28.69g生药/kg(为临床一日用量的211倍)。

3.2长期毒性试验

3.2.1材料

风热清口服液，浓度200％(每毫升相当原生药2g)，PH4.5，浓缩为800％与400％分别供大，中剂量组用(浓缩方法：先蒸馏搜集约5％的芳香水，余药液继续水浴浓缩至一定体积，使浓缩药液与芳香水合并后达到所需浓度)，用蒸馏水稀释为80％的浓度供小剂量组用。

实验动物：健康SD大白鼠，雌雄各半，体重150±20g，符合健康一级标准。

饲料：大鼠颗粒料。

3.2.2方法

取大鼠104只，按体重、性别分为四组，各给药组分别灌服不同剂量的风热清口服液，对照组灌服容积饮用水(见表19)，每日给药一次，连续给药60天(根据体重变换每周调整给药剂量一次)，停药后继续观察20天，整个实验过程中，各组大鼠均自由进食、饮水，饲养室室温保持17～23℃，相对温度70～80％，自然光照明，换气风扇通风。

观察指标及检测时间见表20，于实验结束时全部大鼠自眼睑血管丛取血作血常规与肝肾功能检测，各组抽杀15只大鼠作病理检查；停药20天，对照组与大剂量组各余下的15只大鼠，同样取血，处死作血常规、肝肾功能及病理检查。

血液学和血液生化学检测指标及方法：

红细胞计数器(R.B.C.)、白细胞计数器(W.B.C.)及血红蛋白(Hb)：日本东亚公司CC-180型电子血球仪测定。

白细胞分类计数：常规方法。

血小板计数：尿素法。

血清谷丙转氨酶(GPT)：赖氏法。

血清硷性磷酸酶(AKP)：对硝基苯磷酸二钠法。

血清肌酐(Cr)：硷性苦味酸法。

血清尿素氨(uN)：二乙酰一月亏法。

病理观察内容：解剖肉眼观察主要脏器，取脑、心、肝、脾、肺、肾、肾上腺、胸腺、胃、十二指肠、睾丸或卵巢、子宫等脏器，石蜡包埋切片，HE染色，进行病理组织学检查。

表19  实验动物分组与处理

组别	动物数(只)	药物	给药体积(ml/kg)	剂量(g生药/kg)	相当临床用量的倍数
						1对照组	30	饮用水	12.5
2大剂量组	30	800％风热清口服液	12.5	100	50

组别	动物数(只)	药物	给药体积(ml/kg)	剂量(g生药/kg)	相当临床用量的倍数
						3中剂量组	22	400％风热清口服液	12.5	50	25
4小剂量组	22	80％风热清口服液	12.5	10	5

表20  观察指标及检测时间(√)

3.2.3结果：见表21～表24。

(1)体重增长及行为活动：

表21  风热清口服液对大鼠体重增长的影响(gx±SD)

注：()内为动物数。

由上表可见，风热清口服液大、中、小剂量组给药期间及停药后20天，体重增长正常，与对照组比较无显著性差异(P＞0.05)，其中小剂量组于给药20天后，体重增长略大于对照组，各组动物进食，排便及行为活动正常。

(2)血液学指标：

表22  风热清口服液对大鼠血液学指标的影响(x±SD)

注：()内为动物数

由上表可见，风热清口服液大、中、小剂量组在给药60天后，红细胞、白细胞、血小板计数及血红蛋白含量与对照组相比，均无显著性差异(P＞0.05)，停药20天，大剂量组的以上指标与对照组比较无明显差异(P＞0.05)。

表23  风热清口服液对大鼠白细胞分类计数的影响(x±SD)

注：()内为动物数

由上表可见，风热清口服液中、小剂量组在给药60天，大剂量组在给药60天与停药后20天，白细胞分类计数与对照组相比均无显著性差异(P＞0.05)。

(3)肝、肾功能：

表24  风热清口服液对大鼠肝、肾功能的影响(x±SD)

注：()内为动物数

上表结果表明：风热清口服液中、小剂量组在给药60天，大剂量组在给药60天与停药后20天血中谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、尿素氮、肌酐浓度与对照组比较，均无显著性差异(P＞0.05)。

(4)肉眼尸检可见各组均有少数动物的肺有不同程度的瘀血(片状)，病理切片检查，各给药组与对照组比较，未见明显病理改变；胃肠粘膜完整，无充血水肿及损伤；肝小叶结构清楚，肝细胞无浊肿变性；肾皮质内肾小球与肾小管也无浊肿变性；脑膜完整，无充血水肿，各类细胞的排列及细胞形态正常；肾上腺、脾脏、睾丸与卵巢均未发现异常；各组均有个别动物的肺有沉积瘀血及炎细胞团快，但无统计学意义，可能是灌胃时药物呛入肺所致。

3.2.4结论

风热清口服液以每日100g生药/Kg，50g生药/Kg及10g生药/Kg(相当临床成人日用量的50倍、25倍及5倍)给大鼠连续灌服60天，对体重增长，行为活动，血常规及肝肾功能均无明显影响，主要脏器亦无明显组织病理损伤，停药后20天无迟缓性毒性反应，说明该药物临床试验用剂量安全。

五、临床资料

本发明制剂经中国中医研究院西苑医院卫生部临床药理基地组织4家医院进行了临床研究，与感冒口服液作对照观察，结果如下：

(一)一般资料

1.病例来源

根据风热清口服液II期临床试验计划的要求，分别选择了住院和门诊患者，在452例患者中，住院病人316例，占病人总数的69.9％；门诊病人135例，占30.1％。

2.性别：452例病人中男性222人，女性230人，男∶女＝0.97∶1。两组患者性别构成比较如表25所示：

表25两组患者性别构成比较

两组患者性别比较，经统计学处理P＞0.05，无显著性差异，具有可比性。

3.年龄：年龄分布如表26所示：

表26两组患者年龄分布比较

组别	例数	16-20	21-60	＞60	平均年龄(X±S)
						治疗组	322	27	252	43	39.56±15.83
对照组	130	14	104	12	36.54±15.34

两组患者年龄比较，经统计学处理P＞0.05，无显著性差异，说明组间年龄相似，具有可比性。

4.病情：病情分级(轻、中、重)如表27所示：

表27  两组患者病情比较

两组患者病情比较，经统计学处理P＞0.05，无显著性差异，说明组间病情相似，具有可比性。

5.病程：本病程是指此次上呼吸道感染的发病天数，如表28所示：

表28  两组患者病程比较

组别	例数	平均病程(X±S)
			治疗组	322	1.69±0.71
对照组	130	1.74±0.75

两组患者病程比较，经统计学处理P＞0.05，无显著性差异，具有可比性。

6.两组病人中医症状比较，如表29所示：

表29  两组病人中医症状比较

治疗前两组病人中医症状比较，经统计学处理P＞0.05，无显著性差异，具有可比性。

7.两组病人体征的比较，如表30所示：

表30 两组病人体征比较

治疗前两组病人的体征比较，经统计学处理P＞0.05，无显著性差异，具有可比性。

8.两组病人理化检查：咽拭培养、中性粒细胞碱性磷酸酶(NAP)活性测定，白细胞总数(WBC)、中性粒细胞(N)的比较，如表31所示：

表31  两组病人理化检查比较

9.病原学比较，如表32所示：(病原学的判断系根据各项检测指标综合判断)

表32  两组病人病原学比较

(二)治疗结果：

1.两组总疗效，如表33所示：

表33  两组总疗效比较

两组显效率比较：X²＝27.28，P＜0.01。

两组总疗效比较：治疗组总有效率为94.1％，显效率为79.19％，明显高于对照组，经统计学处理，P＜0.01，有非常显著性差异。

2.两组症状疗效比较，如表34所示：

表34  两组症状疗效比较

从表34中看出：风热清口服液对发热恶寒、流涕、鼻塞、咳嗽、咯痰、头痛、全身不适、汗出、口干渴、精神差、舍脉象等症状疗效较好，与对照组相比，经统计学处理P＜0.01，有非常显著性差异。对食减症状的疗效，与对照组相比，p＞0.05，有显著性差异。两组病人治疗后的证候积分和的均值相比，t＝6.81，P＜0.01，说明风热清口服液对症状的疗效明显优于对照组。

3.两组体征疗效的比较，如表35所示：

表35  两组体征疗效的比较

从表35中看出：风热清口服液对扁桃体肿大，咽、扁桃体渗出物，咽腔疱疹溃疡等体征疗效较好，与对照组相比，经统计学处理，差异有显著性或极显著性(P＜0.05或P＜0.01)。

4.两组平均退热时间的比较，如表36所示：

表36  两组平均退热时间的比较

两组病例平均退热时间的比较，经统计学处理，P＜0.01，有非常显著性差异，说明风热清口服液的退热效果明显优于对照组。

5.两组患者治疗前后白细胞的变化，如表37所示：

表37两组患者治疗前后白细胞变化比较

两组病人治疗前后白细胞的变化比较，X²＝22.97，P＜0.01。

两组病人治疗前后中性粒细胞的变化比较，X²＝26.00，P＜0.01，均有非常显著性差异。说明风热清口服液对白细胞总数升高及中性粒细胞升高的治疗作用明显优于对照组。

6.总疗效比较，结果如表38所示：

表38  两组总疗效比较

组别	n	痊愈	显效	有效	无效	有效率(％)	显效率(％)
								治疗组	220	44(20.00)	130(59.09)	35(15.91)	11(5.00)	95.00	79.09<sup>a</sup>
对照组	130	8(6.15)	63(48.46)	30(23.08)	29(22.31)	77.69	54.62

a：两组显效率比较p＜0.01。

7.病原学与疗效关系，见表39。

表39病原学与疗效的关系

a：治疗组内病毒感染与细菌感染的显效率比较P＞0.05；b：对照组内病毒感染与细菌感染的显效率比较P＞0.05；c：与对照组病毒感染的显效率比较P＜0.01；d：与对照组细菌感染的显效率比较P＜0.01。

病原学与疗效的关系表明风热清口服液对病毒和细菌所致的急性上呼吸道感染，均有较好的疗效。与对照组相比，经统计学处理P＜0.01，有非常显著性差异。说明本发明制剂对病毒感染和细菌感染的效果均优于对照组。

为了保证本发明质量控制方法科学、合理、可行，申请人还进行了以下试验研究：

一、性状风热清口服液为深棕色液体，久贮有极少量振摇即分散的沉淀；气微腥，味苦。三批风热清口服液的性状检查结果和前述一致。

二、鉴别(1)取本品20ml，用氯仿提取二次，每次20ml，合并氯仿液，浓缩至1ml，作为供试品溶液。另取靛玉红对照品，加氯仿制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以苯-氯仿-丙酮(5∶4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点。

(2)取本品20ml，水浴蒸干，加甲醇10ml使溶解，滤过，滤液置硬质试管中，水浴蒸至近干，加氢氧化钠溶液(1-5)5ml，水浴加热6-8小时，随时补充失去的水分，放冷，加盐酸调节PH至1-2，用醋酸乙酯提取二次，每次5ml，合并醋酸乙酯液，浓缩至2ml，作为供试品溶液。另取熊去氧胆酸对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各2-3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异辛烷-乙醚-冰乙酸-正丁醇-水(10∶5∶5∶3∶1)的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％硫酸乙醇溶液，于105℃烘5分钟，取出，10分钟后置紫外光灯(365nm)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(3)取本品20ml，加盐酸1ml与氯仿20ml，加热回流1小时，放冷，分取氯仿液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液。另取甘草次酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(中国药典2005年版一部附录VIB)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以石油醚(30-60℃)-苯-醋酸乙酯-冰醋酸(10∶20∶7∶0.5)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸乙醇溶液，于105℃烘5分钟。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

三批风热清口服液样品的鉴别结果见表40：

表40  三批样品鉴别结果

三、检查  相对密度  应不低于1.04(中国药典2005年版一部附录VII A)。pH值应为4.0～6.0(中国药典2005年版一部附录VIIG)。

其他应符合合剂项下有关的各项规定(中国药典2005年版一部附录IJ)。三批风热清口服液检查结果见表41。

表41  三批样品检查结果

批号	030801	030802	030803
				PH值	5.0	4.9	4.9
相对密度	1.07	1.07	1.08
				装量差异	符合规定	符合规定	符合规定
微生物限度	符合规定	符合规定	符合规定

四、含量测定

1.绿原酸含量测定：

金银花照高效液相色谱法(中国药典2005年版一部附录VID)测定。

系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.2％三乙胺-甲醇-磷酸(800∶200∶1)为流动相，检测波长为328nm，理论塔板数按绿原酸峰计算，应不低于4000。

对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.03mg的溶液，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备精密量取本品1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1ml，加流动相稀释成10ml，作为供试品溶液。

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

本制剂每1ml含绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)不得少于2.5mg。

三批风热清口服液绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)含量测定结果见表42。

表42  三批样品绿原酸含量测定结果

批号	030801	030802	030803
				绿原酸(C16H18O9)含量(mg/ml)	5.7	5.5	6.1

2.牛磺熊去氧胆酸含量测定：

熊胆粉为方中的臣药，属贵重药材，具清热、平肝、明目的功效，与成品功能主治密切相关，熊胆粉含量高低直接影响到药品的疗效。在原标准基础上，参照中国药典2005年版，以牛磺熊去氧胆酸为指标，建立了熊胆粉的含量测定，并作了一系列详细的方法学考察；结果表明该含量测定方法是科学、合理的，从而确定了适宜的含量限度，以达到更有效保证制剂质量的目的。

(1)仪器与试药

Waters-2695-2487高效液相色谱仪系统。流动相中的甲醇为色谱纯，其他试剂试药均为分析纯。牛黄熊去氧胆酸对照品购自中国药品生物制品检定所(批号为110816-200305)。

(2)色谱条件与系统适应性实验

色谱柱选用了钻石(200*4.6)柱，岛津(150*4.6)柱，二者峰形均较佳。

流动相选用了甲醇-0.03mol/L磷酸二氢钠溶液(65∶35)(用磷酸调节pH值至4.4)；乙腈-0.03mol/L磷酸二氢钠溶液(65∶35)系统。结果前者峰形好，保留时间适中，确定为本方法的流动相。

牛磺熊去氧胆酸在紫外区为末端吸收，参照中国药典2005年版选用210nm为测定波长。

理论板数与分离度：牛磺熊去氧胆酸理论板数在3000以上，主峰周围没有其他杂质峰，能达到测定分离的要求。

(3)对照品溶液的制备

通过对不同进样量的考察(0.606μg～4.04μg)，结果牛磺熊去氧胆酸一次进样量2.0μg，峰高适中，柱效高，峰形好。以进样10μl计，则对照品溶液浓度为0.2mg/ml。以甲醇作溶剂与样品溶剂保持一致。

(4)供试品溶液的制备

牛磺熊去氧胆酸能溶于水，本制法中将熊胆粉直接加入。根据牛磺熊去氧胆酸的性质，取样品加甲醇稀释溶解，既可溶出牛磺熊去氧胆酸，又可排除大部分水溶性杂质。经实验摸索，取样品1ml，加甲醇稀释至10ml，浓度与对照品溶液浓度匹配。

(5)阴性样品溶液的制备

取缺熊胆粉的阴性样品1ml，同法制成阴性样品溶液，测定。结果在牛磺熊去氧胆酸色谱峰相应的位置上，阴性无干扰。

(6)线性关系考察

精密吸取牛黄熊去氧胆酸对照品溶液(浓度为0.202mg/ml，)3μl、5μl、10μl、15μl、20μl，注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，结果见表43。

表43  牛磺熊去氧胆酸标准曲线测定结果表

由方程可知，进样量在0.606μg～4.04μg间，进样量和积分面积间倍数关系和线性关系良好。

(7)供试品溶液稳定性实验

取样品(030801)，按照上述方法配制供试品溶液，每隔2小时进样测定一次，考查6小时，结果见表44。

表44  稳定性实验结果表

实验证明，供试品溶液稳定性较好，能满足测定要求。

(8)重现性试验

取同一批样品(030802)6份，按本发明中的测定方法平行实验6次，结果见表45。实验证明，测定结果重现性好。

表45重现性实验结果表

测定次数	1	2	3	4	5	6	平均值	RSD％
									牛黄熊去氧胆酸积分值	431193	435607	431621	436660	425507	430825	432118	/
牛黄熊去氧胆酸含量(mg/ml)	2.06	2.08	2.06	2.08	2.03	2.05	2.06	0.99

(9)精密度试验

对同一份对照品溶液，重复进样测定5次，结果见表46，相对标准偏差小于1％，精密度较好。

表46  精密度实验结果表

测定次数	1	2	3	4	5	RSD％
							牛黄熊去氧胆酸峰面积	432867	431965	432281	432713	432456	0.10

(10)加样回收试验

精密量取已知含量的供试品(批号030803，含牛黄熊去氧胆酸2.06mg/ml)0.5ml，共9份，置10ml量瓶中，分别精密加入精密配制的牛黄熊去氧胆酸对照品溶液(浓度为1.026mg/ml)0.8ml、0.8ml、0.8ml、1.0ml、1.0ml、1.0ml、1.2ml、1.2ml、1.2ml，加甲醇稀释至刻度，按上述方法测定含量。以下式计算回收率，结果见表47。由表可见，本方法具有较好的回收率，测定方法可靠。

表47  牛黄熊去氧胆酸回收率测定结果表(n＝2)

(11)样品的含量测定

取本品3批样品，按本发明方法测定，结果见表48。

表48  三批样品含量测定结果表(n＝2)

本品三批样品牛黄熊去氧胆酸含量平均值为2.07mg/ml。工艺研究中熊胆粉以原生药入药，由于测定批数有限，暂将本制剂熊胆粉含量限度定为：本制剂每1ml含熊胆粉以牛磺熊去氧胆酸(C₂₆H₄₅NO₈S)计，不得少于1.2mg。

具体实施方式：

本发明的实施例1：金银花850g、熊胆粉5g、青黛50g、桔梗500g、瓜蒌皮400g、甘草200g

以上六味，青黛用80％乙醇浸渍24小时后，渗漉，收集渗漉液，药渣备用；金银花重蒸馏，收集浓芳香水300ml，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣备用；桔梗、瓜蒌皮、甘草加水浸泡0.5小时，煎煮1小时，滤过，滤液备用；药渣与上述两种药渣合并，煎煮2次，每次40分钟，滤过，合并各次滤液及蒸馏后的水溶液，滤过，滤液浓缩至90℃相对密度为1.10，加乙醇使含醇量达80％，放置，滤过，滤液与渗漉液合并，回收乙醇，加入芳香水及熊胆粉，用10％氢氧化钠溶液调PH值至6.0-6.5，静置，滤过；滤液加0.3％甜菊甙、0.1％尼泊金乙酯、0.05％香蕉香精，加水至1000mL，灭菌，灌封，即得口服液。

本发明的实施例2：金银花425g、熊胆粉2.5g、青黛25g、桔梗250g、瓜蒌皮200g、甘草100g

以上六味，青黛用50％乙醇浸渍48小时后，渗漉，收集渗漉液，药渣备用；金银花重蒸馏，收集浓芳香水100ml，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣备用；桔梗、瓜蒌皮、甘草加水浸泡0.2小时，煎煮0.5小时，滤过，滤液备用；药渣与上述两种药渣合并，煎煮1次，每次90分钟，滤过，合并各次滤液及蒸馏后的水溶液，滤过，滤液浓缩至90℃相对密度为1.05，加乙醇使含醇量达50％，放置，滤过，滤液与渗漉液合并，回收乙醇并浓缩至稠膏，加入熊胆粉，混匀，干燥，粉碎，过筛，加入芳香水及3％磷酸氢钙、2％微晶纤维素，制粒，干燥，压片，包衣，即得片剂。

本发明的实施例3：金银花1700g、熊胆粉10g、青黛100g、桔梗1000g、瓜蒌皮800g、甘草400g

以上六味，青黛用90％乙醇浸渍12小时后，渗漉，收集渗漉液，药渣备用；金银花重蒸馏，收集浓芳香水600ml，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣备用；桔梗、瓜蒌皮、甘草加水浸泡2小时，煎煮2小时，滤过，滤液备用；药渣与上述两种药渣合并，煎煮3次，每次20分钟，滤过，合并各次滤液及蒸馏后的水溶液，滤过，滤液浓缩至90℃相对密度为1.35，加乙醇使含醇量达90％，放置，滤过，滤液与渗漉液合并，回收乙醇并浓缩至稠膏，加入熊胆粉，混匀，干燥，粉碎，过筛，加入芳香水及淀粉适量，制粒，装入胶囊，即得胶囊剂。

本发明的实施例4：所述质量控制方法包括：

性状：产品为深棕色液体，久贮有极少量振摇即分散的沉淀；气微腥，味苦。

鉴别：(1)取本制剂20ml，用氯仿提取二次，每次20ml，合并氯仿液，浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取靛玉红对照品，加氯仿制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以苯∶氯仿∶丙酮＝5∶4∶1为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点。

(2)取本制剂20ml，水浴蒸干，加甲醇10ml使溶解，滤过，滤液置硬质试管中，水浴蒸至近干，加5％氢氧化钠溶液5ml，水浴加热6-8小时，随时补充失去的水分，放冷，加盐酸调节PH至1-2，用醋酸乙酯提取二次，每次5ml，合并醋酸乙酯液，浓缩至2ml，作为供试品溶液；另取熊去氧胆酸对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2-3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异辛烷∶乙醚∶冰乙酸∶正丁醇∶水＝10∶5∶5∶3∶1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％硫酸乙醇溶液，于105℃烘5分钟，取出，10分钟后置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(3)取本制剂20ml，加盐酸1ml与氯仿20ml，加热回流1小时，放冷，分取氯仿液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草次酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以30-60℃石油醚∶苯∶醋酸乙酯∶冰醋酸＝10∶20∶7∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸乙醇溶液，于105℃烘5分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

检查：相对密度照中国药典2005年版一部附录VIIA检测，应不低于1.04；

pH值：照中国药典2005年版一部附录VIIG检测，应为4.0～6.0；

其他应符合中国药典2005年版一部附录I J合剂项下有关的各项规定。

含量测定：

(1)金银花照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定：

系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.2％三乙胺∶甲醇∶磷酸＝800∶200∶1为流动相，检测波长为328nm，理论塔板数按绿原酸峰计算，应不低于4000；

对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.03mg的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备精密量取本制剂1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1ml，加流动相稀释成10ml，作为供试品溶液；

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每1ml含金银花以绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)计，不得少于2.5mg。

(2)熊胆粉照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基键合硅胶为填料；甲醇∶0.03mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值至4.4)＝65∶35为流动相，检测波长为210nm；理论板数按牛磺熊去氧胆酸峰计算应不低于2500；

对照品溶液的制备取经五氧化二磷容器中减压干燥至恒重的牛磺熊去氧胆酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释至每1ml含1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备精密量取本制剂1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以0.45μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1ml，加流动相稀释成10ml，作为供试品溶液；

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每1ml含熊胆粉以牛磺熊去氧胆酸(C₂₆H₄₅NO₈S)计，不得少于1.2mg。

本发明的实施例5：所述质量控制方法可以包括：

性状：产品为深棕色液体，久贮有极少量振摇即分散的沉淀；气微腥，味苦。

鉴别：(1)取本制剂20ml，用氯仿提取二次，每次20ml，合并氯仿液，浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取靛玉红对照品，加氯仿制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以苯∶氯仿∶丙酮＝5∶4∶1为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点。

(2)取本制剂20ml，加盐酸1ml与氯仿20ml，加热回流1小时，放冷，分取氯仿液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草次酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以30-60℃石油醚∶苯∶醋酸乙酯∶冰醋酸＝10∶20∶7∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸乙醇溶液，于105℃烘5分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

含量测定：

熊胆粉照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基键合硅胶为填料；甲醇∶0.03mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值至4.4)＝65∶35为流动相，检测波长为210nm；理论板数按牛磺熊去氧胆酸峰计算应不低于2500；

对照品溶液的制备  取经五氧化二磷容器中减压干燥至恒重的牛磺熊去氧胆酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释至每1ml含1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  精密量取本制剂1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以0.45μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1ml，加流动相稀释成10ml，作为供试品溶液；

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每1ml含熊胆粉以牛磺熊去氧胆酸(C₂₆H₄₅NO₈S)计，不得少于1.2mg。

本发明的实施例6：所述质量控制方法可以包括：

性状：产品为深棕色液体，久贮有极少量振摇即分散的沉淀；气微腥，味苦。

鉴别：取本制剂20ml，水浴蒸干，加甲醇10ml使溶解，滤过，滤液置硬质试管中，水浴蒸至近干，加5％氢氧化钠溶液5ml，水浴加热6-8小时，随时补充失去的水分，放冷，加盐酸调节PH至1-2，用醋酸乙酯提取二次，每次5ml，合并醋酸乙酯液，浓缩至2ml，作为供试品溶液；另取熊去氧胆酸对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2-3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异辛烷∶乙醚∶冰乙酸∶正丁醇∶水＝10∶5∶5∶3∶1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％硫酸乙醇溶液，于105℃烘5分钟，取出，10分钟后置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

检查：相对密度  照中国药典2005年版一部附录VIIA检测，应不低于1.04；

pH值：照中国药典2005年版一部附录VIIG检测，应为4.0～6.0；

其他  应符合中国药典2005年版一部附录IJ合剂项下有关的各项规定。

含量测定：

金银花  照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定：

系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.2％三乙胺∶甲醇∶磷酸＝800∶200∶1为流动相，检测波长为328nm，理论塔板数按绿原酸峰计算，应不低于4000；

对照品溶液的制备  精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.03mg的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备  精密量取本制剂1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1ml，加流动相稀释成10ml，作为供试品溶液；

测定法  分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每1ml含金银花以绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)计，不得少于2.5mg。

本发明的实施例7：所述质量控制方法可以包括：

性状：产品为深棕色液体，久贮有极少量振摇即分散的沉淀；气微腥，味苦。

鉴别：(1)取本制剂20ml，用氯仿提取二次，每次20ml，合并氯仿液，浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取靛玉红对照品，加氯仿制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以苯∶氯仿∶丙酮＝5∶4∶1为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点。

(2)取本制剂20ml，水浴蒸干，加甲醇10ml使溶解，滤过，滤液置硬质试管中，水浴蒸至近干，加5％氢氧化钠溶液5ml，水浴加热6-8小时，随时补充失去的水分，放冷，加盐酸调节PH至1-2，用醋酸乙酯提取二次，每次5ml，合并醋酸乙酯液，浓缩至2ml，作为供试品溶液；另取熊去氧胆酸对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2-3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异辛烷∶乙醚∶冰乙酸∶正丁醇∶水＝10∶5∶5∶3∶1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％硫酸乙醇溶液，于105℃烘5分钟，取出，10分钟后置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

(3)取本制剂20ml，加盐酸1ml与氯仿20ml，加热回流1小时，放冷，分取氯仿液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草次酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以30-60℃石油醚∶苯∶醋酸乙酯∶冰醋酸＝10∶20∶7∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸乙醇溶液，于105℃烘5分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

检查：相对密度  照中国药典2005年版一部附录VIIA检测，应不低于1.04；

pH值：照中国药典2005年版一部附录VIIG检测，应为4.0～6.0；

其他应符合中国药典2005年版一部附录IJ合剂项下有关的各项规定。

本发明的实施例8：所述质量控制方法可以包括：

性状：产品为深棕色液体，久贮有极少量振摇即分散的沉淀；气微腥，味苦。

检查：相对密度照中国药典2005年版一部附录VIIA检测，应不低于1.04；

pH值：照中国药典2005年版一部附录VIIG检测，应为4.0～6.0；

其他应符合中国药典2005年版一部附录IJ合剂项下有关的各项规定。

含量测定：

(1)金银花照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定：

系统适用性试验  以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.2％三乙胺∶甲醇∶磷酸＝800∶200∶1为流动相，检测波长为328nm，理论塔板数按绿原酸峰计算，应不低于4000；

对照品溶液的制备  精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.03mg的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备  精密量取本制剂1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1ml，加流动相稀释成10ml，作为供试品溶液；

测定法  分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每1ml含金银花以绿原酸(C₁₆H₁₈O₉)计，不得少于2.5mg。

(2)熊胆粉  照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基键合硅胶为填料；甲醇∶0.03mol/L磷酸二氢钠溶液(用磷酸调节pH值至4.4)＝65∶35为流动相，检测波长为210nm；理论板数按牛磺熊去氧胆酸峰计算应不低于2500；

对照品溶液的制备  取经五氧化二磷容器中减压干燥至恒重的牛磺熊去氧胆酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释至每1ml含1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备  精密量取本制剂1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以0.45μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1ml，加流动相稀释成10ml，作为供试品溶液；

测定法  分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每1ml含熊胆粉以牛磺熊去氧胆酸(C₂₆H₄₅NO₈S)计，不得少于1.2mg。

Claims (9)

1.一种风热清制剂，其特征在于：按照重量组分计算：它是由金银花425-1700份、熊胆粉2.5-10份、青黛25-100份、桔梗250-1000份、瓜蒌皮200-800份和甘草100-400份制成的。

2.按照权利要求1所述的风热清制剂，其特征在于：按照重量组分计算：它是由金银花850份、熊胆粉5份、青黛50份、桔梗500份、瓜蒌皮400份和甘草200份制成的。

3.按照权利要求1或2所述的风热清制剂，其特征在于：所述的制剂为口服液、片剂或胶囊剂。

4.如权利要求1-3中任一项所述的风热清制剂的制备方法，其特征在于：青黛用50％-90％乙醇浸渍12-48小时后，渗漉，收集渗漉液，药渣备用；金银花重蒸馏，收集浓芳香水100-600ml，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣备用；桔梗、瓜蒌皮、甘草加水浸泡0.2-2小时，煎煮0.5-2小时，滤过，滤液备用；药渣与上述两种药渣合并，煎煮卜3次，每次20-90分钟，滤过，合并各次滤液及蒸馏后的水溶液，滤过，滤液浓缩至90℃相对密度为1.05-1.35，加乙醇使含醇量达50-90％，放置，滤过，滤液与渗漉液合并，回收乙醇，加入芳香水及熊胆粉，然后按常规方法制成不同的制剂。

5.按照权利要求4所述的风热清制剂的制备方法，其特征在于：青黛用80％乙醇浸渍24小时后，渗漉，收集渗漉液，药渣备用；金银花重蒸馏，收集浓芳香水300ml，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣备用；桔梗、瓜蒌皮、甘草加水浸泡0.5小时，煎煮1小时，滤过，滤液备用；药渣与上述两种药渣合并，煎煮2次，每次40分钟，滤过，合并各次滤液及蒸馏后的水溶液，滤过，滤液浓缩至90℃相对密度为1.10，加乙醇使含醇量达80％，放置，滤过，滤液与渗漉液合并，回收乙醇，加入芳香水及熊胆粉，然后按常规方法制成不同的制剂。

6.按照权利要求4或5所述的风热清制剂的制备方法，其特征在于：口服液这样制备：青黛用80％乙醇浸渍24小时后，渗漉，收集渗漉液，药渣备用；金银花重蒸馏，收集浓芳香水300ml，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣备用；桔梗、瓜萎皮、甘草加水浸泡0.5小时，煎煮1小时，滤过，滤液备用；药渣与上述两种药渣合并，煎煮2次，每次40分钟，滤过，合并各次滤液及蒸馏后的水溶液，滤过，滤液浓缩至90℃相对密度为1.10，加乙醇使含醇量达80％，放置，滤过，滤液与渗漉液合并，回收乙醇，加入芳香水及熊胆粉，用10％氢氧化钠溶液调PH值至6.0-6.5，静置，滤过；滤液加适量甜菊甙、尼泊金乙酯和香蕉香精，加水至1000mL，灭菌，灌封，即得。

7.按照权利要求4或5所述的风热清制剂的制备方法，其特征在于：片剂这样制备：青黛用80％乙醇浸渍24小时后，渗漉，收集渗漉液，药渣备用；金银花重蒸馏，收集浓芳香水300ml，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣备用；桔梗、瓜蒌皮、甘草加水浸泡0.5小时，煎煮1小时，滤过，滤液备用；药渣与上述两种药渣合并，煎煮2次，每次40分钟，滤过，合并各次滤液及蒸馏后的水溶液，滤过，滤液浓缩至90℃相对密度为1.10，加乙醇使含醇量达80％，放置，滤过，滤液与渗漉液合并，回收乙醇并浓缩至稠膏，加入熊胆粉，混匀，干燥，粉碎，过筛，加入芳香水及适当辅料，制粒，干燥，压片，包衣，即得。

8.按照权利要求4或5所述的风热清制剂的制备方法，其特征在于：胶囊剂这样制备：青黛用80％乙醇浸渍24小时后，渗漉，收集渗漉液，药渣备用；金银花重蒸馏，收集浓芳香水300ml，蒸馏后的水溶液另器保存，药渣备用；桔梗、瓜蒌皮、甘草加水浸泡0.5小时，煎煮1小时，滤过，滤液备用；药渣与上述两种药渣合并，煎煮2次，每次40分钟，滤过，合并各次滤液及蒸馏后的水溶液，滤过，滤液浓缩至90℃相对密度为1.10，加乙醇使含醇量达80％，放置，滤过，滤液与渗漉液合并，回收乙醇并浓缩至稠膏，加入熊胆粉，混匀，干燥，粉碎，过筛，加入芳香水及适当辅料，制粒，装入胶囊，即得。

9.如权利要求1-3中任一项所述的风热清制剂的检测方法，所述制剂为口服液，其特征在于：所述检测方法包括性状、鉴别、检查以及含量测定项目；其中鉴别包括对制剂中青黛、熊胆粉和甘草的薄层色谱鉴别，含量测定是对制剂中金银花和熊胆粉的含量测定；该检测方法具体包括以下项目：

性状：产品为深棕色液体，久贮有极少量振摇即分散的沉淀；气微腥，味苦；

鉴别：(1)取本制剂20ml，用氯仿提取二次，每次20m1，合并氯仿液，浓缩至1ml，作为供试品溶液；另取靛玉红对照品，加氯仿制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各6μl，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为粘合剂的硅胶G薄层板上，以苯∶氯仿∶丙酮＝5∶4∶1为展开剂，展开，取出，晾干；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的红色斑点；

(2)取本制剂20ml，水浴蒸干，加甲醇10ml使溶解，滤过，滤液置硬质试管中，水浴蒸至近干，加5％氢氧化钠溶液5ml，水浴加热6-8小时，随时补充失去的水分，放冷，加盐酸调节PH至1-2，用醋酸乙酯提取二次，每次5ml，合并醋酸乙酯液，浓缩至2ml，作为供试品溶液；另取熊去氧胆酸对照品，加醋酸乙酯制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各2-3μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异辛烷∶乙醚∶冰乙酸∶正丁醇∶水＝10∶5∶5∶3∶1的上层溶液为展开剂，展开，取出，晾干，喷以5％硫酸乙醇溶液，于105℃烘5分钟，取出，10分钟后置365nm紫外光灯下检视；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

(3)取本制剂20ml，加盐酸1ml与氯仿20ml，加热回流1小时，放冷，分取氯仿液，蒸干，残渣加乙醇1ml使溶解，作为供试品溶液；另取甘草次酸对照品，加无水乙醇制成每1ml含1mg的溶液，作为对照品溶液；照中国药典2005年版一部附录VIB薄层色谱法试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以30-60℃石油醚∶苯∶醋酸乙酯∶冰醋酸＝10∶20∶7∶0.5为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10％磷钼酸乙醇溶液，于105℃烘5分钟；供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点；

检查：相对密度照中国药典2005年版一部附录VII A检测，应不低于1.04；

pH值：照中国药典2005年版一部附录VIIG检测，应为4.0～6.0；

其他应符合中国药典2005年版一部附录I J合剂项下有关的各项规定；

含量测定：

(1)金银花照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定：

系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，0.2％三乙胺∶甲醇∶磷酸＝800∶200∶1为流动相，检测波长为328nm，理论塔板数按绿原酸峰计算，应不低于4000；

对照品溶液的制备精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇制成每1ml含0.03mg的溶液，作为对照品溶液；

供试品溶液的制备精密量取本制剂1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1ml，加流动相稀释成10ml，作为供试品溶液；

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每1ml含金银花以绿原酸计，不得少于2.5mg；

(2)熊胆粉照中国药典2005年版一部附录VID高效液相色谱法测定：

色谱条件与系统适用性试验  以十八烷基键合硅胶为填料；甲醇：0.03mol/L、pH为4.4的磷酸二氢钠溶液＝65∶35为流动相，检测波长为210nm；理论板数按牛磺熊去氧胆酸峰计算应不低于2500；

对照品溶液的制备取经五氧化二磷容器中减压干燥至恒重的牛磺熊去氧胆酸对照品适量，精密称定，加甲醇溶解并定量稀释至每1ml含1mg的溶液，即得；

供试品溶液的制备精密量取本制剂1ml，置10ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，以0.45μm微孔滤膜滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液1ml，加流动相稀释成10ml，作为供试品溶液；

测定法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得；

本制剂每1ml含熊胆粉以牛磺熊去氧胆酸计，不得少于1.2mg。