CN109725102B - 高效液相色谱法检测ep9.0版螺旋霉素杂质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高效液相色谱法检测EP9.0版螺旋霉素杂质的方法，具体包括：采用高氯酸、氢氧化钠溶液和磷酸制得缓冲溶液，然后将该缓冲溶液与乙腈混合制得流动相，采用辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱为填充柱，对含有EP9.0版螺旋霉素及其杂质的样品溶液进行检测。该检测过程中色谱柱的温度为30℃，远低于EP9.0版螺旋霉素高效液相检验方法要求的70℃，降低了色谱柱的损耗，单样品检测时间由80分钟缩短至40分钟，检测时间减少；该方法能够检测螺旋霉素产品中杂质A、杂质B、杂质D、杂质F的含量，可应用在螺旋霉素生产过程的中间检验中，控制中间环节中的产品质量。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析检测技术领域，特别涉及高效液相色谱法检测EP9.0版螺旋霉素杂质的方法。
背景技术
螺旋霉素(Spiramycin，简称SPM)是16元大环内酯类抗生素，化学名是：(4R,5S,6S,7R,9R,10R,16R)-(11E,13E)-6-[(0-2,6-双脱氧基-3-C-甲基-α-L-核黄素-已吡喃)-(1,4)-(3,6-双脱氧基-3-二甲氨基-β-D-吡喃葡萄糖基)氧基]-7-甲酰基-4-羟基-5-甲氧基-9,16-二甲基-10-[(2,3,4,6-四氧基-4-二甲基氨基-D-红-己吡喃)氧基]-含氧环十六酮-11,13-二烯基-2酮，其化学结构式为：
具有较强的体内抗菌作用和持续的抗生素后效，能提高吞噬细胞的吞噬作用，可用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染。螺旋霉素在临床应用40余年后的今天，还有着广泛的用途，对于感染性疾病治疗仍具有临床应用和推广价值，可用作动物饲料添加剂，在个别领域，也具有进一步拓展的空间。
目前螺旋霉素主要使用欧盟范围，遵循欧盟质量检验标准。在日常检验中使用EP9.0版欧洲药典中关于螺旋霉素相关物质检测方法。该检测方法的色谱条件是：色谱柱型号：长度＝0.25m，直径＝4.6mm；固定相：液相色谱用十八烷基硅烷键合硅胶(5μm)(极性填充的十八烷基硅烷甲基键合硅胶)，孔径12.5nm，碳填充物15％；柱温：70℃；流动相：将事先用27.2g/l磷酸二氢钾溶液调节pH值为6.5的34.8g/l磷酸氢二钾溶液、乙腈和水混合(体积比：5：40：55)；流速：1.0ml/min；检测波长：232nm。
该方法使用C18色谱柱，柱温为70℃，柱温远高于一般产品的检测温度，对C18色谱柱损害较大，影响C18色谱柱的使用寿命；该方法中单样品的走样时间在60-80分钟左右，检验时间较长，不利于螺旋霉素生产过程中间产品质量的日常检验及监控。
发明内容
为了解决现有技术存在的螺旋霉素生产过程中的中间产品检测中柱温过高、检测时间过长的问题，本发明提供了采用高效液相色谱法检测EP9.0版螺旋霉素杂质的方法。
本发明提供了一种采用高效液相色谱法检测EP9.0版螺旋霉素杂质的方法，步骤包括：采用高氯酸、氢氧化钠溶液和磷酸制得缓冲溶液，然后将所述缓冲溶液与乙腈混合制得流动相；采用辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱即C8色谱柱为填充柱，对含有EP版螺旋霉素及其杂质的样品溶液进行检测；
其中，所述杂质结构如下：
杂质A为新螺旋霉素I(R1＝H，R2＝OH，R3＝CH2-CHO)，分子式：
(4R,5S,6S,7R,9R,10R,11E,13E,16R)-6-[[3,6-双脱氧基-3-二甲氨基-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基]-4-羟基-5-甲氧基-9,16-二甲基-7-[2-氧乙基]-10-[[2,3,4,6-四氧基-4-二甲基氨基-β-D-红-已吡喃]氧基]-含氧环十六酮-11,13-二烯基-2-酮；
杂质B为螺旋霉素IV(R1＝H，R2＝osyl，R3＝CH2-CH2OH)，分子式：
(4R,5S,6S,7R,9R,10R,11E,13E,16R)-6-[[3,6-双脱氧基-4-O-(2,6-双脱氧基-3-C-甲基-α-L-核黄素-已吡喃)-3-(二甲氨基)-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基]-4-羟基-7-[2-羟乙基]-5-甲氧基-9,16-二甲基-10-[[2,3,4,6-四氧基-4-(二甲基氨基)-β-D-红-已吡喃]氧基]-含氧环十六酮-11,13-二烯基-2-酮；
杂质D为螺旋霉素V的结构式是：
螺旋霉素V的分子式是：(4R,5S,6S,7R,9R,10R,11E,13E,16R)-6-[[3,6-双脱氧基-4-O-(2,6-双脱氧基-3-C-甲基-α-L-核黄素-已吡喃)-3-二甲氨基-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基]-10-[(2,6-双脱氧基-3-C-甲基-α-L-核黄素-已吡喃)氧基]-4-羟基-5-甲氧基-9,16-二甲基-7-[2-氧乙基]-含氧环十六酮-11,13-二烯基-2-酮；
杂质F为螺旋霉素二聚体，结构式如下：
所述辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱的柱温为28～32℃，可选的，所述辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱的柱温为30℃。
所述高氯酸的用量为9.0～10.0g；可选的，所述高氯酸的用量为9.3g。
所述氢氧化钠溶液的浓度为3％～5％；可选的，所述氢氧化钠溶液的浓度为4％。
所述氢氧化钠溶液的用量为40～65ml；可选的，所述氢氧化钠溶液用量为50ml。
所述缓冲溶液的pH＝2～4；可选的，所述缓冲溶液的pH＝2.2；
所述缓冲溶液与乙腈按体积比为4～8∶6～2；可选的，所述缓冲溶液与乙腈按体积比为7∶3。
所述磷酸溶液浓度为85％。
所述磷酸的用量为6～8ml；可选的，所述磷酸的用量为6.7ml。
所述样品溶液的配制过程包括：将乙腈和水按体积比为2～4∶8～6进行混合，配制成极性溶剂，采用该极性溶剂溶解螺旋霉素，配制成浓度为1～2mg/ml含螺旋霉素及其杂质的样品溶液；可选的，所述乙腈和水按的体积比为3∶7。
所述辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8。
所述辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱的尺寸为250mm(柱长)×4.6mm(柱内径)。
所述流动相的流速为0.8～1.3ml/min；可选的，所述流动相的流速为0.98ml/min。
所述检测的检测波长为220～240nm；可选的，所述检测的检测波长为232nm。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用C8色谱柱作为填充柱，检测过程中色谱柱的温度为30℃，远低于EP9.0版螺旋霉素高效液相色谱检验方法要求的柱温70℃，降低了对色谱柱的损耗，延长了色谱柱的使用寿命。
(2)本发明采用的检测方法将单样品检测时间由80分钟缩短至40分钟，检测时间减少，检测成本降低。
(3)本发明采用的检测方法使得杂质D、杂质B、杂质F、杂质A与相邻峰的分离度计算结果均≥1.5，能够检测螺旋霉素产品中杂质A、杂质B、杂质D、杂质F的含量；与EP9.0检测结果相比，本检测方法峰面积比值的误差结果在5％以内。
总之，使用C8色谱柱作为填充柱检测螺旋霉素产品，可在较短的时间内得到检测结果，能够有效提高螺旋霉素生产过程的中间产品的控制效率，可控制生产中间环节的产品质量，有利于指导螺旋霉素的生产工艺，控制生产过程，方便快捷，适合于工业化生产中对螺旋霉素的日常检测，从而保证了螺旋霉素产品质量。
附图说明
图1是第一次检测得到的螺旋霉素供试样品的色谱图。
图2是第二次检测得到的螺旋霉素供试样品的色谱图。
图3是第三次检测得到的螺旋霉素供试样品的色谱图。
具体实施方式
下面结合附图，对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
以下实施例采用的高效液相色谱仪均为岛津LC-20A。
实施例1
高效液相色谱法检测螺旋霉素的方法，步骤包括：
(1)标准样品溶液(标准液)的配制：
将乙腈和水按体积比为3∶7进行混合，配制成极性溶剂；取25.0mg的螺旋霉素颗粒样品，用该极性溶剂溶解，并定容至25ml，得到标准样品溶液a；然后取2.0ml的标准样品溶液a，用溶剂定容至100ml，得到标准样品溶液b。
(2)供试样品溶液(待测液)的配制：
供试样品来源：中国医药天方药业有限公司
取25.0mg的螺旋霉素供试样品，用体积比为3∶7的乙腈和水的混合溶剂溶解，并定容至25ml。
(3)色谱条件：
色谱柱：C8色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8，尺寸：250mm(柱长)×4.6mm(柱内径)；
流动相：采用9.3g的高氯酸、50ml浓度为4％的氢氧化钠溶液和6.7ml浓度为85％的磷酸制得的缓冲溶液，将该缓冲溶液与乙腈按体积比为7∶3混合，制得流动相；
流动相的流速：0.98mL/min；
检测波长：232nm；
色谱柱的温度：30℃；
检测时间：39min；
理论塔板数：6388；
分离度：螺旋霉素颗粒I峰与最先洗脱的杂质峰之间的分离度为10.1，在螺旋霉素颗粒I峰保留时间的1.1倍出没有明显的峰。
(4)检测：
注入20μL的标准样品溶液b，调整检测系统的灵敏度，使主峰高至少为满量程的50％；
注入20μL的供试样品溶液，采用上述色谱条件进行进样检测，供试样品溶液的运行时间为螺旋霉素I峰保留时间的3倍，即39min，量取供试样品溶液个杂质峰的面积。
(5)图谱分析
采用以上相同检测条件分别检测3次，第一次得到图1所示检测结果，第二次得到图2所示检测结果，第三次得到图3所示检测结果。
由图1和表1可知，螺旋霉素I峰的保留时间为12.853min；杂质D的保留时间为7.989min，峰的位置出现在螺旋霉素I峰的保留时间约为0.7倍以前；杂质B的保留时间为11.269min，峰的位置出现在螺旋霉素I峰的保留时间约为0.7倍以后0.9倍以前；杂质F的保留时间为12.138min，峰的位置出现在螺旋霉素I峰的保留时间约为0.9倍以后1.0倍以前；螺旋霉素II峰的保留时间为18.638min，螺旋霉素III峰的保留时间为29.310min，杂质A的保留时间为24.980min，在螺旋霉素II峰和螺旋霉素III峰的保留时间之间。
本方法检测结果：杂质D、杂质B、杂质F、杂质A与相邻峰的分离度计算结果均≥1.5，杂质D、杂质B、杂质F、杂质A的峰面积比值％分别为0.817、1.189、1.612、1.158，杂质D、杂质B、杂质F、杂质A的相应的EP9.0检测结果分别为0.8007、1.1494、1.6247、1.2081，本检测方法峰面积比值的误差结果在5％以内，能够满足日常生产过程中的结果检测分析。
表1待检测的样品中螺旋霉素及其杂质相对应的检测数据(第一次检测)
由图2和表2可知，螺旋霉素I峰的保留时间为12.839min；杂质D的保留时间为7.989min，峰的位置出现在螺旋霉素I峰的保留时间约为0.7倍以前；杂质B的保留时间为11.265min，峰的位置出现在螺旋霉素I峰的保留时间约为0.7倍以后0.9倍以前；杂质F的保留时间为12.151min，峰的位置出现在螺旋霉素I峰的保留时间约为0.9倍以后1.0倍以前；螺旋霉素II峰的保留时间为18.601min，螺旋霉素III峰的保留时间为29.248min，杂质A的保留时间为24.966min，在螺旋霉素II峰和螺旋霉素III峰的保留时间之间。
本方法检测结果：杂质D、杂质B、杂质F、杂质A与相邻峰的分离度计算结果均≥1.5，杂质D、杂质B、杂质F、杂质A的峰面积比值％分别为0.562、0.951、1.407、0.960，杂质D、杂质B、杂质F、杂质A的相应的EP9.0检测结果分别为0.5383、1.0005、1.4288、1.0050，本检测方法峰面积比值的误差结果在5％以内，能够满足日常生产过程中的结果检测分析。
表2待检测的样品中螺旋霉素及其杂质相对应的检测数据(第二次检测)
由图3和表3可知，螺旋霉素I峰的保留时间为12.890min；杂质D的保留时间为8.018min，峰的位置出现在螺旋霉素I峰的保留时间约为0.7倍以前；杂质B的保留时间为11.297min，峰的位置出现在螺旋霉素I峰的保留时间约为0.7倍以后0.9倍以前；杂质F的保留时间为12.172min，峰的位置出现在螺旋霉素I峰的保留时间约为0.9倍以后1.0倍以前；螺旋霉素II峰的保留时间为18.635min，螺旋霉素III峰的保留时间为29.265min，杂质A的保留时间为24.792min，在螺旋霉素II峰和螺旋霉素III峰的保留时间之间。
本方法检测结果：杂质D、杂质B、杂质F、杂质A与相邻峰的分离度计算结果均≥1.5，杂质D、杂质B、杂质F、杂质A的峰面积比值％分别为0.744、0.931、1.805、1.124，杂质D、杂质B、杂质F、杂质A的相应的EP9.0检测结果分别为0.7675、0.9702、1.7426、1.0968，本检测方法峰面积比值的误差结果在5％以内，能够满足日常生产过程中的结果检测分析。
表3待检测的样品中螺旋霉素及其杂质相对应的检测数据(第三次检测)
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (5)
1.一种采用高效液相色谱法检测EP9.0版螺旋霉素杂质的方法，其特征在于：采用高氯酸、氢氧化钠溶液和磷酸制得缓冲溶液，然后将所述缓冲溶液与乙腈混合制得流动相；采用辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱为填充柱，对含有EP9.0版螺旋霉素及其杂质的样品溶液进行检测；
所述高氯酸的用量为9.0～10.0g；所述氢氧化钠溶液的浓度为3％～5％，用量为40～65ml；磷酸溶液浓度为85％，用量为6～8ml；所述缓冲溶液的pH＝2～4，所述缓冲溶液与乙腈按体积比为4～8∶6～2；
所述辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱的柱温为28～32℃；
其中，所述杂质结构如下：
杂质A为新螺旋霉素I R1＝H，R2＝OH，R3＝CH2-CHO，分子式是：
(4R,5S,6S,7R,9R,10R,11E,13E,16R)-6-[[3,6-双脱氧基-3-二甲氨基-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基]-4-羟基-5-甲氧基-9,16-二甲基-7-[2-氧乙基]-10-[[2,3,4,6-四氧基-4-二甲基氨基-β-D-红-已吡喃]氧基]-含氧环十六酮-11,13-二烯基-2-酮；
杂质B为螺旋霉素IV R1＝H，R2＝osyl，R3＝CH2-CH2OH，分子式是：
(4R,5S,6S,7R,9R,10R,11E,13E,16R)-6-[[3,6-双脱氧基-4-O-(2,6-双脱氧基-3-C-甲基-α-L-核黄素-已吡喃)-3-(二甲氨基)-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基]-4-羟基-7-[2-羟乙基]-5-甲氧基-9,16-二甲基-10-[[2,3,4,6-四氧基-4-(二甲基氨基)-β-D-红-已吡喃]氧基]-含氧环十六酮-11,13-二烯基-2-酮；
杂质D为螺旋霉素V的结构式是：
螺旋霉素V的分子式是：(4R,5S,6S,7R,9R,10R,11E,13E,16R)-6-[[3,6-双脱氧基-4-O-(2,6-双脱氧基-3-C-甲基-α-L-核黄素-已吡喃)-3-二甲氨基-β-D-吡喃葡萄糖基]氧基]-10-[(2,6-双脱氧基-3-C-甲基-α-L-核黄素-已吡喃)氧基]-4-羟基-5-甲氧基-9,16-二甲基-7-[2-氧乙基]-含氧环十六酮-11,13-二烯基-2-酮；
杂质F为螺旋霉素二聚体，结构式如下：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述样品溶液的配制过程包括：将乙腈和水按体积比为2～4∶8～6进行混合，配制成极性溶剂，采用该极性溶剂溶解螺旋霉素，配制成浓度为1～2mg/ml含螺旋霉素及其杂质的样品溶液。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱为Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C8；所述辛烷基硅烷键合硅胶色谱柱的尺寸为250mm柱长×4.6mm柱内径。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述流动相的流速为0.8～1.3ml/min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测的检测波长为220～240nm。
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