CN111060606A - 一种地红霉素有关物质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效液相色谱法分离测定地红霉素有关物质的方法，色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为填料,以磷酸盐缓冲液、乙腈和甲醇溶液为流动相。并且在样品溶液配制中加入碱性试剂维持稳定性。与现有技术相比，本发明提供的方法分离地红霉素有关物质效果好，且样品溶液稳定性好，增加了操作便利性。本方法适用于地红霉素原料药及其制剂的有关物质检测和质量控制。
Description
技术领域
本发明属于分析化学领域，涉及一种地红霉素有关物质的检测方法。
背景技术
地红霉素是一种大环内酯类抗生素,主要用于治疗咽炎、支气管炎、扁桃体炎、肺炎、皮肤和皮肤结构感染。该药抗菌谱与红霉素类似，在安全性方面与其它常用大环内脂类抗生素相似，但是由于地红霉素可以每天给药一次，改善了患者的依从性，具有良好的市场前景。
地红霉素原料和制剂制备过程中产生一些有关物质，16S地红霉素和9S-红霉胺因
为与地红霉素结构相似，在分离检测时难度大。因此对16S地红霉素和9S-红霉胺的分析检
测在控制地红霉素药品质量当中非常关键。地红霉素、16S地红霉素、9S-红霉胺结构式如
下：
| 编号 | 名称 | 化学名称 | 结构式 | 来源 |
| 1 | 地红霉素 | (9S,16R)-9，11-二脱氧-9,11-[亚氨基[(lR)-2-(2-甲氧基乙氧基)亚乙基]氧]红霉素 |  | 主成分 |
| 2 | 9S红霉胺 | (9S)-9-氨基-9-脱氧红霉素 |  | 工艺中间体 |
| 3 | 16S地红霉素 | (9S,16S)-9，11-二脱氧-9,11-[亚氨基[(lR)-2-(2-甲氧基乙氧基)亚乙基]氧]红霉素 |  | 异构体 |
现有技术对这两种杂质的检测方法主要来自药典规定的地红霉素有关物质检测方法，但使用药典方法杂质9S-红霉胺与相邻杂质分离度均小于1.5，达不到分离要求。而且样品溶液不稳定，随着时间的延长，样品溶液中杂质16S地红霉素含量增加，因此样品溶液需要配置后立即使用。有以下：
现有技术地红霉素有关物质测定方法
发明内容
本发明通过多种实验条件的摸索，提供一种能够有效分离地红霉素有关物质，特别是9S-红霉胺与16S地红霉素杂质的高效液相色谱分析方法，同时在样品溶液的配制过程中，通过加入碱的方式增加样品稳定性，提高分析的准确性。
本发明的技术方案为：
一种高效液相色谱法分离测定地红霉素及其有关物质的方法，为反相液相色谱法，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，用含磷酸缓冲液、乙腈和甲醇的流动相对样品溶液进行洗脱后采用紫外检测器进行检测。流动相磷酸缓冲液：乙腈：甲醇的体积比为47:37:16。
所述磷酸缓冲液的配制为取磷酸二氢钾1.41g与磷酸氢二钾6.91g，加水1000ml使溶解；
所述十八烷基硅烷键合硅胶颗粒粒径为5μm，柱长优选为4.6*250mm
所述样品溶液中的溶剂为加入氢氧化钠的乙腈溶液
其他分析条件：
色谱柱使用的柱温范围为30-40℃，优选为40℃。
流动相的流速为1.0-2.0ml/min，优选为1.5ml/min。
紫外检测器的检测波长为205nm，检测器的型号不限，如可使用DAD或VWD检测器。
色谱柱进样量为10-20ul。
本发明一个具体实施方式中，色谱柱为十八烷基硅烷键合硅胶（菲罗门 GeminiC18 250×4.6mm，5μm）。磷酸缓冲液：乙腈：甲醇=47:37:16（v/v/v）；
操作方法为：取地红霉素100mg，置10ml量瓶中，加入1ml 0.2mol/l氢氧化钠及适量乙腈超声溶解，再用乙腈定容至刻度，配制成样品溶液；
注入液相色谱仪，按本发明色谱条件（色谱柱填料为十八烷基键合硅胶，柱长为250mm，检测波长为205nm，以磷酸缓冲液：乙腈：甲醇=47:37:16（v/v/v））进行洗脱，流动相的流速为1.5ml/min，色谱柱柱温箱温度为40℃，进样体积为20μl进行测定。
本发明方法可用于地红霉素原料药及地红霉素肠溶片、地红霉素肠溶胶囊、地红霉素肠溶微丸胶囊和地红霉素片中有关物质的检测和质量控制。本发明地红霉素有关物质分离效果较好，专属性强，结果准确。样品溶液2小时内稳定，不需现配现用，方便操作。
附图说明
图1：对比实施例1方法测定地红霉素有关物质的色谱图，保留时间11.206min为地红霉素、保留时间6.312min的是9S-红霉胺、保留时间12.772min的是16S地红霉素
图2：对比实施例2方法测定地红霉素有关物质的色谱图，保留时间8.344min为地红霉素、保留时间4.917min的是9S-红霉胺、保留时间9.645min的是16S地红霉素
图3：对比实施例3方法测定地红霉素肠溶片有关物质的色谱图，保留时间16.288min为地红霉素、保留时间14.907min的是9S-红霉胺、保留时间18.885min的是16S地红霉素
图4：为采用本发明实施例8方法检测地红霉素肠溶片有关物质的色谱图，保留时间19.324min为地红霉素、保留时间8.391min的是9S-红霉胺、保留时间23.960min的是16S地红霉素
图5：为采用本发明实施例7方法检测地红霉素肠溶片有关物质的色谱图，保留时间16.145min为地红霉素、保留时间6.903min的是9S-红霉胺、保留时间19.950min的是16S地红霉素
图6：样品溶液稳定性研究美国药典方法2h后检测地红霉素肠溶片有关物质的色谱图,保留时间16.325min为地红霉素、保留时间14.935min的是9S-红霉胺、保留时间18.910min的是16S地红霉素
图7：样品溶液稳定性研究本发明方法2h后检测地红霉素肠溶片有关物质的色谱图，保留时间16.052min为地红霉素、保留时间6.838min的是9S-红霉胺、保留时间19.826min的是16S地红霉素
图8：为采用本发明实施例10方法检测地红霉素有关物质的色谱图，保留时间14.352为地红霉素、保留时间6.161min的是9S-红霉胺、保留时间17.771min的是16S地红霉素
具体实施方式
以下所举实施例是为了更清楚地对本发明的内容进行说明，但本发明的内容并不仅限于实施例中所举。所以，熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
除特别说明，以下实施例和对比例采用的仪器及色谱柱等条件如下：
液相色谱仪（岛津LC-20AT），检测器：UV；色谱工作站:岛津LabSolution：色谱柱：十八烷基键合硅胶（C18 4.6*250mm，5μm）；检测波长为205nm；色谱柱柱温箱温度为40℃。
对比实施例1中国药典2015版标准方法检测地红霉素有关物质
取地红霉素对照品溶解于流动相制成每ml含地红霉素2.5mg/ml的溶液，放置24小时得系统适用性溶液，该溶液含9S-红霉胺和16S地红霉素，室温下可使用1个月。
临用新制。取地红霉素适量，精密称定，加乙腈-甲醇（70:30）溶解并定量稀释制成每1ml中约含10mg的溶液，作为样品溶液；
取20ul注入液相色谱仪；
色谱条件：以磷酸缓冲液：乙腈：甲醇=37:44:19（v/v/v）为流动相进行洗脱，磷酸缓冲液的配制为取磷酸二氢钾1.41g与磷酸氢二钾6.91g，加水1000ml使溶解，流速为1.0ml/min，记录色谱图，得图1。
对比实施例2英国药典2017标准方法检测地红霉素有关物质
临用新制。取地红霉素适量，精密称定，加乙腈-甲醇（70:30）溶解并定量稀释制成每1ml中约含10mg的溶液，作为样品溶液；
取20ul注入液相色谱仪；
色谱条件：以水：甲醇：缓冲液：乙腈=9:19:28:44（v/v/v/v）为流动相进行洗脱，缓冲液的配制为取1.9g/L磷酸二氢钾与9.1g/L磷酸氢二钾，如有必要用100g/L氢氧化钾调pH至7.5，流速为2.0ml/min，记录色谱图，得图2。
对比实施例3：美国药典4.0版标准方法检测地红霉素肠溶片有关物质
临用新制。取地红霉素适量，精密称定，加乙腈-磷酸缓冲液（60:40）溶解并定量稀释制成每1ml中约含10mg的溶液，作为样品溶液；磷酸缓冲液的配制为取磷酸氢二钾4.35g，加水至1L，溶解后用磷酸调pH至8.0。
取20ul注入液相色谱仪；
色谱条件：以磷酸缓冲液：乙腈：甲醇=37:44:19（v/v/v）为流动相进行洗脱，磷酸缓冲液的配制为取磷酸二氢钾1.41g与磷酸氢二钾6.91g，加水1000ml使溶解，流速为1.0ml/min，记录色谱图，得图3。
实施例1-8：不同色谱条件下检测地红霉素肠溶片有关物质
按照以上对比实施例方法杂质9S-红霉胺的分离达不到要求，因此在现有方法基础上对流动相、流速等因素进行了筛选。实施例7和8的条件下9S-红霉胺和16S地红霉素能与前后杂质有效分离，实施例7得图4和实施例8得图5。具体试验结果如下：
流动相、流速筛选试验及结果
| 实施例 | 色谱柱 | 流动相 | 流速（ml/min） | 9S-红霉胺与前后杂质分离度 |
| 1 | C18 | 磷酸盐缓冲液-乙腈-甲醇（39:42:19） | 1.0 | 10.485,0.992 |
| 2 | C18 | 磷酸盐缓冲液-乙腈-甲醇（32:44:24） | 1.0 | 0.741 |
| 3 | C18 | 磷酸盐缓冲液-乙腈-甲醇（35:46:19） | 1.0 | 1.326,1.965 |
| 4 | C18 | 磷酸缓冲液：乙腈：甲醇=37:44:19 | 1.0 | 1.150，2.032 |
| 5 | C18 | 磷酸缓冲液(pH7.7)：乙腈：甲醇=37:44:19 | 1.0 | 0.565 |
| 6 | C18 | 磷酸缓冲液：乙腈：甲醇=42:40:18 | 1.0 | 1.163,1.191 |
| 7 | C18 | 磷酸缓冲液：乙腈：甲醇=47:37:16 | 1.0 | 4.481,3.379 |
| 8 | C18 | 磷酸缓冲液：乙腈：甲醇=47:37:16 | 1.5 | 3.061,3.120 |
注：实施例1-4,6-8磷酸盐缓冲液配置方法为：取磷酸二氢钾1.41g与磷酸氢二钾6.91g，加水1000ml溶解。实施例5磷酸盐缓冲液为取磷酸二氢钾1.41g与磷酸氢二钾6.91g，加水1000ml溶解,加氢氧化钾调pH至7.7。
实施例1-8样品溶液配制为取地红霉素肠溶片细粉（约相当于地红霉素约100mg），置10ml量瓶中，加0.2mol/L氢氧化钠加1ml，加乙腈超声使地红霉素溶解并稀释至刻度。摇匀过滤，取续滤液即得。
结论：从上表试验数据可知，流动相为磷酸缓冲液：乙腈：甲醇=47:37:16（v/v/v），检测波长205nm，流速1.0-1.5ml/min，柱温40℃的条件下， 9S-红霉胺与前后杂质的分离度均大于2，能有效分离。
实施例9：样品溶液稳定性研究
美国药典方法样品稳定性研究
样品溶液配制、色谱条件和流动相均与对比实施例3中一致。
本发明方法样品稳定性研究
样品溶液配制、色谱条件和流动相与实施例8中的一致。
分别于0、2小时量取上述供试品各10μl注入液相色谱仪，记录色谱图。得图3、图6、图5和图7。
有关物质检测供试品、对照品溶液稳定性结果
结论：从上表试验数据可知，供试品溶液（美国药典）在2小时内9-(S)-红霉胺和总杂质增加，而本发明方法配制的供试品溶液在2h内稳定。
实施例10：本发明方法检测地红霉素有关物质
取地红霉素100mg，置10ml量瓶中，加入1ml0.2mol/l氢氧化钠及适量乙腈超声溶解，再用乙腈定容至刻度，作为样品溶液。
取20ul注入液相色谱仪；
色谱条件：以磷酸缓冲液：乙腈：甲醇=47:37:16（v/v/v）为流动相进行洗脱，磷酸缓冲液的配制为取磷酸二氢钾1.41g与磷酸氢二钾6.91g，加水1000ml使溶解，流速为1.7ml/min，记录色谱图，得图8。
Claims (10)
1.一种高效液相色谱法分离地红霉素有关物质的方法，色谱柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，用含磷酸缓冲液、甲醇和乙腈的混合液为流动相对样品溶液进行洗脱后采用紫外检测器进行检测；
所述地红霉素与有关物质具体结构如下：
地红霉素 9S-红霉胺 16S地红霉素
其特征是：流动相磷酸缓冲液、乙腈和甲醇的体积比为47:37:16。
2.根据权利要求1 所述的方法，所述分离，包括分离测定地红霉素原料药和地红霉素制剂中的有关物质。
3.根据权利要求2所述的方法，所述地红霉素制剂，包括地红霉素肠溶片、地红霉素肠溶胶囊、地红霉素肠溶微丸胶囊和地红霉素片。
4.根据权利要求1所述的方法，所述样品溶液的溶剂为加入碱性试剂的乙腈溶液。
5.根据权利要求4所述的方法，所述碱性试剂为氢氧化钠。
6.根据权利要求1所述的方法，所述样品溶液的制备方法为：取地红霉素适量配置成10mg/ml溶液，加入氢氧化钠调pH至11以上。
7.根据权利要求1所述的方法，所述十八烷基硅烷键合硅胶颗粒粒径为 5um，柱长为4.6×250mm。
8.根据权利要求1所述的方法，分析条件为：色谱柱适用的温度为30-40℃；流动相的流速为1.0-2.0ml/min；紫外检测器的检测波长为205nm。
9.根据权利要求8所述方法，所述色谱柱适用的温度为40℃；流动相的流速为1.5ml/min。
10.根据权利要求1所述方法，操作步骤包括：
1）适应性溶液配制：取地红霉素对照品适量，用流动相配置成2.5mg/ml的溶液，室温条件下放置24小时；
2）样品溶液配制：取地红霉素100mg，精密称定，置10ml量瓶中，加0.2mol/L氢氧化钠加1ml，加乙腈超声使地红霉素溶解并定容至刻度，摇匀过滤，取续滤液即得供试品溶液，精密量取上述供试品溶液1ml置100ml量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀即得对照溶液；3）检测：分别取上述溶液各20μl检测。
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