CN109946398B

CN109946398B - 一种检测达巴万星及其杂质的方法

Info

Publication number: CN109946398B
Application number: CN201910240875.1A
Authority: CN
Inventors: 陈月嫦; 谢伟健; 冯绮晴; 姜桥; 卢增杰
Original assignee: Livzon New North River Pharmaceutical Co ltd
Current assignee: Livzon New North River Pharmaceutical Co ltd
Priority date: 2019-03-28
Filing date: 2019-03-28
Publication date: 2022-05-24
Anticipated expiration: 2039-03-28
Also published as: CN109946398A

Abstract

本发明公开了一种检测达巴万星及其杂质的方法。该方法包括如下步骤：1)配制达巴万星及其杂质的标准对照品溶液；2)配制供试样品溶液；3)使用反相高效液相色谱仪测定标准品溶液中的达巴万星及其杂质的色谱图，使得任意相邻物质间的分离度≥1.5；4)使用反相高效液相色谱仪测定供试样品溶液的色谱图，按照面积归一法，确定供试样品溶液中达巴万星及其各杂质的含量。本发明提供常规的反相高效液相色谱法，能将巴万星B₀及其杂质以及杂质与杂质间进行有效的分离，从而能够准确地检测达巴万星B₀的含量，且稳定性、可靠性高，同时操作相对简单，易于实现。

Description

一种检测达巴万星及其杂质的方法

技术领域

本发明涉及药物分析领域，尤其涉及一种检测达巴万星及其杂质的方法。

背景技术

达巴万星(Dalbavancin)，也称作道古霉素，是一种新型半合成糖肽抗生素，为替考拉宁类似物A40926的衍生物，由美国Vicuron Pharmaceuticals公司发现，开发并进入临床实验，后被辉瑞公司收购。

达巴万星作用机制与万古霉素和替考拉宁相同，抑制G+菌细胞壁的生物合成，被广泛用作治疗皮肤和软组织感染的药物。体内、外试验表明：达巴万星对于G+菌包括耐甲氧西林金葡球菌(MRSA)、甲氧西林敏感金葡球菌(MSSA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)、链球菌等具有抗菌活性。对耐G+病原菌包括耐青霉素和头孢曲松肺炎链球菌、替考拉宁不敏感CoNS、非vanA型肠球菌具有活性；对G+厌氧菌也具有活性。达巴万星具有独特的药动学性质，可每周间隔用药。目前，达巴万星在治疗导管相关的血源性感染以及皮肤和软组织感染已取得了良好的效果，其具有优良的体内抗菌活性和安全性，是理想的第二代糖肽抗生素。

达巴万星由结构相近的A₀、A₁、B₀、B₁和B₂五种成分组成，其中B₀是其主要成分，这五种成分具有相同的母核结构，其结构式如下，各成分的化学式及分子量见表1：

表1

目前国内外专利、文献等对达巴万星的含量及其杂质的检测方法鲜有报道。CN107121505A、文献《A40926混合物中B₀组分的分离纯化》分别报道了针对达巴万星杂质3-二甲氨基丙胺及其成品的检测方法，均没有对达巴万星的含量及合成过程中产生的相关杂质的分离的研究报道。

因此，为了保证达巴万星的生产质量，有必要针对达巴万星的含量及其各杂质的分离开发一种灵敏稳定的检测方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种检测达巴万星及其杂质的检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的目的之一在于提供一种检测达巴万星及其杂质的方法，包括如下步骤：

1)配制达巴万星及其杂质的标准对照品溶液；

2)配制供试样品溶液；

3)使用反相高效液相色谱仪测定标准品溶液中的达巴万星及其杂质的色谱图，使得任意相邻物质间的分离度≥1.5；

4)使用反相高效液相色谱仪测定供试样品溶液的色谱图，确定供试样品溶液中达巴万星及其各杂质的含量；

其中，步骤3)和步骤4)利用流动相为：乙腈：二水合磷酸二氢钠溶液＝28～30：70～72(v/v)进行等梯度洗脱，所述二水合磷酸二氢钠溶液的浓度为0.06mol/L，pH＝6.0。

优选地，上述杂质选自C₈₂H₈₆Cl₂N₈O₂₉、C₈₃H₈₈Cl₂N₈O₂₉、C₈₄H₉₀Cl₂N₈O₂₉中的至少一种。

优选地，上述二水合磷酸二氢钠溶液的pH调节剂为NaOH、三乙胺或其组合。

优选地，上述供试样品溶液的浓度为0.8～1.2mg/mL。

优选地，上述反相高效液相色谱中的流速为1.0～1.1mL/min。

更优选地，上述反相高效液相色谱中的流速为1.0mL/min。

优选地，上述反相高效液相色谱中的色谱柱温为30～40℃。

更优选地，上述反相高效液相色谱中的色谱柱温为40℃。

优选地，上述反相高效液相色谱中的进样量为15～20μL。

更优选地，上述反相高效液相色谱中的进样量为20μL。

优选地，上述标准对照品溶液和供试样品溶液的溶剂均为乙腈和水的混合溶液。

优选地，上述乙腈和水的体积比为(2～3)：(7～8)。

更优选地，上述乙腈和水的体积比为2：8或3：7。

优选地，上述反相高效液相色谱的色谱柱选自Xtimate C18色谱柱：4.6mm×250mm，5μm、Agilent SB-Aq色谱柱：4.6mm×250mm，5μm、Purospher RP-18色谱柱：4.6mm×250mm，5μm中的任意一种。

更优选地，上述反相高效液相色谱的色谱柱选自Purospher RP-18色谱柱：4.6mm×250mm，5μm。

优选地，上述反相高效液相色谱的检测波长为200～220nm。

更优选地，上述反相高效液相色谱的检测波长为208nm。

本发明的有益效果是：

达巴万星的组合物较多，且结构类似，本发明提供常规的反相高效液相色谱法，能将巴万星B₀及其杂质以及杂质与杂质间进行有效的分离，从而能够准确地检测达巴万星B₀的含量，且稳定性、可靠性高，同时操作相对简单，易于实现。

附图说明

图1为实施例1标准对照品溶液的色谱图；

图2为实施例1供试样品溶液的色谱图；

图3为实施例2标准对照品溶液的色谱图；

图4为实施例2供试样品溶液的色谱图；

图5为实施例3标准对照品溶液的色谱图；

图6为实施例3供试样品溶液的色谱图；

图7为实施例4标准对照品溶液的色谱图；

图8为实施例4供试样品溶液的色谱图；

图9为实施例5标准对照品溶液的色谱图；

图10为实施例5供试样品溶液的色谱图；

图11为实施例6标准对照品溶液的色谱图；

图12为实施例6供试样品溶液的色谱图。

具体实施方式

下面进一步列举实施例以详细说明本发明。同样应理解，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，本领域技术人员根据本发明阐述的原理做出的一些非本质的改进和调整均属于本发明的保护范围。下述示例具体的工艺参数等也仅是合适范围中的一个示例，即本领域技术人员可以通过本文的说明做合适范围内的选择，而并非要限定于下文示例的具体数据。

下述实施例和对比例的杂质A、杂质B、杂质C分别为C₈₂H₈₆Cl₂N₈O₂₉、C₈₃H₈₈Cl₂N₈O₂₉、C₈₄H₉₀Cl₂N₈O₂₉。

下述实施例和对比例所使用的高效液相色谱仪为：U3000(赛默飞)。

实施例1

1)标准对照品溶液的配制：准确称取达巴万星标准品、杂质A、B、C，加入乙腈和水的混合溶液(体积比3：7，下简称乙腈水溶液)溶解，配制成每mL含达巴万星标准品1mg、杂质A、B、C各0.25mg的溶液，作为标准对照品溶；

2)供试样品溶液的配制：准确称取20mg达巴万星供试品于20mL容量瓶中，加入乙腈水溶液溶解并稀释至刻度线，作为供试样品溶液；

3)高效液相色谱测定：色谱试验条件如下：色谱柱：Purospher RP-18，4.6mm×250mm，5μm；流动相：乙腈：NaH₂PO₄·2H₂O(0.06mol/L，pH＝6.0)＝30：70(v/v)，进行等梯度洗脱，洗脱时间60min；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；紫外检测器检测波长：208nm；进样量：20μL；

将步骤1)中的标准对照品溶液(20μL)注入反相高效液相色谱仪中，记录色谱图(图1)；

将步骤2)中的供试样品溶液(20μL)注入反相高效液相色谱仪中，记录色谱图(图2)；

由图1可知：达巴万星B₀保留时间为17.073min，杂质A保留时间为12.293min，杂质B保留时间为22.573min，杂质C保留时间为20.153min，任意相邻峰之间的分离度均大于2.0，这说明达巴万星与杂质及杂质与杂质间实现了很好的分离，为准确测试达巴万星及各杂质的含量提供了非常有利的前提条件；

供试样品溶液的结果见图2：由面积归一化法计算得到供试样品溶液中达巴万星B₀的含量为97.85％，杂质A的含量为0.02％，杂质B的含量为0.05％，杂质C的含量为0.07％，各杂质的含量均小于0.2％。

实施例2

实施例2的检测方法和实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件：

3)高效液相色谱测定：色谱试验条件如下：色谱柱：Purospher RP-18，4.6mm×250mm，5μm；流动相：乙腈：NaH₂PO₄(0.06mol/L，pH＝6.0)＝28：72(v/v)，进行等梯度洗脱，洗脱时间60min；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；紫外检测器检测波长：208nm；进样量：20μL，标准对照品溶液的色谱图见图3，供试样品溶液的色谱见图4：

由图3可知：达巴万星B₀保留时间为25.450min，杂质A保留时间为21.750min，杂质B保留时间为34.900min，杂质C保留时间为30.467min，任意相邻峰之间的分离度均大于2.0，这说明达巴万星与杂质及杂质与杂质间实现了很好的分离，为准确测试达巴万星及各杂质的含量提供了非常有利的前提条件；

供试样品溶液的结果见图4：由面积归一化法计算得到供试样品溶液中达巴万星B₀的含量为97.42％，杂质A的含量为0.03％，杂质B的含量为0.02％，杂质C的含量为0.05％，各杂质含量均小于0.2％。

实施例3

实施例3的检测方法和实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件：

3)高效液相色谱测定：色谱试验条件如下：色谱柱：Purospher RP-18，4.6mm×250mm，5μm；流动相：乙腈：NaH₂PO₄(0.06mol/L，pH＝6.0)＝30：70(v/v)，进行等梯度洗脱，洗脱时间60min；流速：1.1mL/min；柱温：40℃；紫外检测器检测波长：208nm；进样量：20μL，标准对照品溶液的色谱图见图5，供试样品溶液的色谱见图6：

由图5可知：达巴万星B₀保留时间为17.237min，杂质A保留时间为12.293min，杂质B保留时间为22.637min，杂质C保留时间为20.210min，任意相邻峰之间的分离度均大于2.0，这说明达巴万星与杂质及杂质与杂质间实现了很好的分离，为准确测试达巴万星及各杂质的含量提供了非常有利的前提条件；

供试样品溶液的结果见图6：由面积归一化法计算得到供试样品溶液中达巴万星B₀的含量为97.35％，杂质A的含量为0.01％，杂质B的含量为0.05％，杂质C的含量为0.02％，各杂质含量均小于0.2％。

实施例4

实施例4的检测方法和实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件：

3)高效液相色谱测定：色谱试验条件如下：色谱柱：Purospher RP-18，4.6mm×250mm，5μm；流动相：乙腈：NaH₂PO₄(0.06mol/L，pH＝6.0)＝30：70(v/v)，进行等梯度洗脱，洗脱时间60min；流速：1.0mL/min；柱温：35℃；紫外检测器检测波长：208nm；进样量：20μL，标准对照品溶液的色谱图见图7，供试样品溶液的色谱见图8：

由图7可知：达巴万星B₀保留时间为18.783min，杂质A保留时间为13.603min，杂质B保留时间为25.147min，杂质C保留时间为22.407min，任意相邻峰之间的分离度均大于2.0，这说明达巴万星与杂质及杂质与杂质间实现了很好的分离，为准确测试达巴万星及各杂质的含量提供了非常有利的前提条件；

供试样品溶液的结果见图8：由面积归一化法计算得到供试样品溶液中达巴万星B₀的含量为97.74％，杂质A的含量为0.03％，杂质B的含量为0.01％，杂质C的含量为0.02％，各杂质含量均小于0.2％。

实施例5

实施例5的检测方法和实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件：

3)高效液相色谱测定：色谱试验条件如下：色谱柱：Xtimate C18，4.6mm×250mm，5μm；流动相：乙腈：NaH₂PO₄(0.06mol/L，pH＝6.0)＝30：70(v/v)，进行等梯度洗脱，洗脱时间60min；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；紫外检测器检测波长：208nm；进样量：20μL，标准对照品溶液的色谱图见图9，供试样品溶液的色谱见图10：

由图9可知：达巴万星B₀保留时间为7.497min，杂质A保留时间为6.727min，杂质B保留时间为10.087min，杂质C保留时间为9.023min，任意相邻峰之间的分离度均大于2.0，这说明达巴万星与杂质及杂质与杂质间实现了很好的分离，为准确测试达巴万星及各杂质的含量提供了非常有利的前提条件；

供试样品溶液的结果见图10：由面积归一化法计算得到供试样品溶液中达巴万星B₀的含量为96.78％，杂质A的含量为0.03％，杂质B的含量为0.02％，杂质C的含量为0.08％，各杂质含量均小于0.2％。

实施例6

实施例6的检测方法和实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件：

3)高效液相色谱测定：色谱试验条件如下：色谱柱：Purospher RP-18，4.6mm×250mm，5μm；流动相：乙腈：NaH₂PO₄(0.06mol/L，pH＝6.0)＝30：70(v/v)，进行等梯度洗脱，洗脱时间60min；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；紫外检测器检测波长：220nm；进样量：20μL，标准对照品溶液的色谱图见图11，供试样品溶液的色谱见图12：

由图11可知：达巴万星B₀保留时间为17.073min，杂质A保留时间为12.293min，杂质B保留时间为22.577min，杂质C保留时间为20.160min，任意相邻峰之间的分离度均大于2.0，这说明达巴万星与杂质及杂质与杂质间实现了很好的分离，为准确测试达巴万星及各杂质的含量提供了非常有利的前提条件；

供试样品溶液的结果见图12：由面积归一化法计算得到供试样品溶液中达巴万星B₀的含量为97.85％，杂质A的含量为0.02％，杂质B的含量为0.04％，杂质C的含量为0.07％，各杂质含量均小于0.2％。

对比例1

对比例1的检测方法同实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件中流动相为：乙腈：NaH₂PO₄(0.02mol/L，pH＝6)＝30：70(v/v)；

测试结果为：主峰峰形不佳，影响达巴万星含量检测，且与相邻峰的分离度小于1.5，导致达巴万星与杂质不能进行有效分离，无法对达巴万星的含量进行准确检测。

对比例2

对比例2的检测方法同实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件中流动相为：乙腈：NaH₂PO₄(0.05mol/L，pH＝6)＝30：70(v/v)；

测试结果为：成品以及部分杂质未检出，理论塔板数小于5000。

对比例3

对比例3的检测方法同实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件中流动相为：乙腈：NaH₂PO₄(0.07mol/L，pH＝6)＝30：70(v/v)；

测试结果为：主峰严重拖尾，拖尾因子达到2.0以上，影响与相邻峰的分离。

对比例4

对比例4的检测方法同实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件中流动相为：乙腈：0.1％磷酸水溶液(pH＝2)＝30：70(v/v)；

测试结果为：主峰与相邻峰无法达到基线分离。

对比例5

对比例5的检测方法同实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件中流动相为：乙腈：NaH₂PO₄(0.06mol/L，pH＝5.5)＝30：70(v/v)；

测试结果为：主峰变形，影响判断。

对比例6

对比例6的检测方法同实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件中流动相为：乙腈：NaH₂PO₄(0.06mol/L，pH＝6.5)＝30：70(v/v)；

测试结果为：主峰拖尾严重，响应偏低。

对比例7

对比例7的检测方法同实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件中流动相为：乙腈：NaH₂PO₄(0.06mol/L，pH＝6)＝35：65(v/v)；

测试结果为：主峰和各杂质峰出峰时间小，主峰与相邻峰分离度＜1.5。

对比例8

对比例8的检测方法同实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件中流动相为：乙腈：NaH₂PO₄(0.06mol/L，pH＝6)＝25：75(v/v)；

测试结果为：主峰拖尾严重，拖尾因子大于1.5，各峰出峰时间过晚，且响应偏低。

对比例9

对比例9的检测方法同实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件中的流速为1.2mL/min；

测试结果为：主峰与相邻峰重叠，杂质之间分离度＜1.5，不符合药典规定。

对比例10

对比例10的检测方法同实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件中的流速为0.9mL/min；

测试结果为：主峰出现变形，且与相邻峰的分离度＜1.5。

对比例11

对比例11的检测方法同实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件中的进样量为10μL；

测试结果为：主峰峰形较差，与相邻峰无法分离。

对比例12

对比例12的检测方法同实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件中的进样量为25μL；

测试结果为：主峰出现分叉，影响含量检测。

对比例13

对比例13的检测方法同实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件中柱温为25℃；

测试结果为：基线漂移严重，各峰之间的分离度小于1.5，不符合药典规定。

对比例14

对比例14的检测方法同实施例1一致，不同之处在于步骤3)的色谱条件中利用流动相进行梯度洗脱，洗脱程序如下表1：

表1

测试结果为：主峰拖尾严重，拖尾因子大于1.5，基线漂移，各杂质峰形较差，无法达到基线分离。

重复性试验

溶液配制：

分别称取达巴万星原料药样品6份：(9.92mg、10.11mg、10.09mg、10.05mg、9.98mg、9.94mg)，置于20mL容量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，混匀，获得不同浓度的达巴万星溶液(0.4960mg/mL、0.5055mg/mL、0.5045mg/mL、0.5025mg/mL、0.4990mg/mL、0.4970mg/mL)，作为供试样品溶液；

高效液相色谱测定：色谱试验条件如下：色谱柱：Purospher RP-18，4.6mm×250mm，5μm；流动相：乙腈：NaH₂PO₄(0.06mol/L，pH＝6.0)＝30：70(v/v)，进行等梯度洗脱，洗脱时间60min；流速：1.0mL/min；柱温：40℃；紫外检测器检测波长：208nm；进样量：20μL，结果见下表2：

表2

根据表2可以看出，样品达巴万星平均含量为99.98％，含量RSD％为0.44％，符合药典规定(含量在98.0％～102.0％，RSD％不大于2.0％)，说明本发明的方法重现性良好。

Claims

1.一种检测达巴万星及其杂质的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）配制达巴万星及其杂质的标准对照品溶液；

2）配制供试样品溶液；

3）使用反相高效液相色谱仪测定标准品溶液中的达巴万星及其杂质的色谱图，使得任意相邻物质间的分离度≥1.5；

4）使用反相高效液相色谱仪测定供试样品溶液的色谱图，按照面积归一法，确定供试样品溶液中达巴万星及其各杂质的含量；

其中，步骤3）和步骤4）利用流动相：乙腈：二水合磷酸二氢钠溶液体积比为28～30：70～72进行等梯度洗脱，所述二水合磷酸二氢钠溶液的浓度为0.06mol/L，pH=6.0；

所述反相高效液相色谱中的流速为1.0～1.1mL/min；

所述反相高效液相色谱中的色谱柱温为30～40℃；

所述反相高效液相色谱中的进样量为15～20μL；

所述反相高效液相色谱的色谱柱选自Xtimate C18色谱柱：4.6mm×250mm，5μm、Agilent SB-Aq色谱柱：4.6mm×250mm，5μm、Purospher RP-18色谱柱：4.6mm×250mm，5μm中的任意一种；

所述杂质选自C₈₂H₈₆Cl₂N₈O₂₉、C₈₃H₈₈Cl₂N₈O₂₉、C₈₄H₉₀Cl₂N₈O₂₉中的至少一种；

所述反相高效液相色谱的检测波长为200～220nm。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述二水合磷酸二氢钠溶液的pH调节剂为NaOH、三乙胺或其组合。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述供试样品溶液的浓度为0.8～1.2mg/mL。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述标准对照品溶液和供试样品溶液的溶剂均为乙腈和水的混合溶液。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述乙腈和水的体积比为2～3：7～8。