CN113030356B - 利巴韦林原料或制剂中有关物质的分离分析检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了利巴韦林原料或制剂中有关物质的分离分析检测方法，该方法具有分离度高、高效性、灵敏性、专属性和准确性的特点，采用本发明所述的方法进行有关物质的测定时其工艺过程中产生的杂质能被有效的检出。本发明所述的方法可很好的用于分离分析利巴韦林及各杂质，可用于利巴韦林原料药或制剂的质量控制，可有效控制利巴韦林原料药或制剂药品的质量。
Description
技术领域
本发明涉及药物分析技术领域，具体地，本发明涉及利巴韦林原料或制剂中有关物质的分离分析检测方法。
背景技术
利巴韦林在临床上用于呼吸道合胞病毒引起的病毒性肺炎与支气管炎、皮肤疱疹病毒感染的治疗，其在临床上有片剂、颗粒剂、胶囊、眼膏、滴鼻剂、注射液等剂型。
利巴韦林原料或制剂的质量标准在ChP2015、USP42中均有收载，USP42中收载了有关物质检项，采用液相色谱法测定有关物质。
然而，利巴韦林原料或制剂的中有关物质的分离分析检测方法仍有待改进。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
参考各国药典标准对比、原料药工艺路线以及杂质研究情况，确定利巴韦林潜在的已知杂质主要有：杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、尿嘧啶、尿嘧啶核苷。各杂质信息见下表1所述。
表1：利巴韦林杂质信息列表
在杂质混合液或杂质定位溶液的色谱分析中，采用ChP2015利巴韦林有关物质分析方法对已知杂质混合溶液进行分析时，各杂质的分离效果较差，且基线不稳定(见附图1)。
采用USP42利巴韦林片有关物质方法1时，已知杂质均能洗脱出来，但是USP42利巴韦林片有关物质方法1对杂质A、杂质B、杂质D、杂质F、杂质G、杂质J、杂质K都有较好的分离效果，但是杂质C与3.0min处溶剂峰重叠，分离效果不能满足要求。采用USP42利巴韦林片有关物质方法2时，杂质F未出峰，分离效果也不能满足测试要求。采用USP42利巴韦林片有关物质分析方法1对杂质混合溶液进行分析时，除了溶剂峰对杂质C的检测有影响，其他杂质分离效果较好。
基于上述问题，发明人提出了一种利巴韦林原料或制剂中有关物质的分离分析检测方法，本发明所述利巴韦林原料或制剂中的有关物质是指在利巴韦林合成过程中可能引入的各个杂质如杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质J、杂质K。根据本发明的实施例，本发明提出的方法流动相稳定，有关物质峰与主峰分离良好不干扰主成分检测，并且能够有效分离出利巴韦林与其合成过程中可能引入的各个杂质如杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质J、杂质K
在本发明中，本发明提出了一种利巴韦林原料或制剂中有关物质的分离分析检测方法。根据本发明的实施例，包括以下步骤：通过液相色谱法对利巴韦林进行分析，以便获得色谱图；以及基于色谱图，确定利巴韦林中有关物质的分析方法。根据本发明的实施例，发明人对上述测定方法进行了一系列的验证实验，实验结果强有力地证明了上述测定利巴韦林中有关物质的方法具有高效性、灵敏性、专属性和准确性的特点，能够有效分离并测定出利巴韦林片中与其合成过程中可能引入的各杂质。
根据本发明的实施例，本发明所述的方法包括：
(1)色谱条件：
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ 250×4.6mml.D.S-5μm，12nm；
流动相A：称取1.0g无水硫酸钠溶于1000g水中，用5％磷酸水溶液调节pH至2.8±0.1；
流动相B：乙腈：流动相A＝25：75(V/V)；
稀释剂：流动相A；
检测波长：220nm；
柱温：25℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：10μl；
洗脱梯度：
(2)溶液的配制：
杂质定位储备液：分别精密称取杂质A、B、C、D、E、F、G、尿嘧啶、尿嘧啶核苷对照品适量，用水溶解并稀释制成每1ml约含杂质0.5mg的溶液，即得各杂质定位储备液。
杂质定位溶液：取杂质对照品储备液适量，用流动相A稀释制成每1ml约含杂质10μg的溶液，即得各杂质定位液。
杂质混合溶液：取各杂质定位储备液与利巴韦林原料药适量，置于容量瓶中，用流动相A溶解并稀释配制成约含利巴韦林1mg/ml和各杂质溶液0.005mg/ml的混合溶液，作为杂质混合溶液。
(3)测定步骤：(a)将所述系统试用性溶液，注入液相色谱仪；(b)将10微升空白水溶液进行色谱分析，得到空白色谱图；(c)将10微升所述对照溶液进行色谱分析，以调节检测灵敏度；以及(d)将10微升所述供试品溶液进行色谱分析，以便获得色谱图，所述色谱图用于确定所述利巴韦林原料药或制剂中有关物质的含量。
(4)检测结果：色谱图分离效果可满足要求，基线平稳。其中，理论塔板数按利巴韦林峰计算不低于2000，未知单杂≤0.1％；杂质总量≤0.5％。
根据本发明的具体实施例，本发明所述的方法包括：
(1)色谱条件：
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ 250×4.6mml.D.S-5μm，12nm；
流动相A：称取1.0g无水硫酸钠溶于1000g水中，用5％磷酸水溶液调节pH至2.8±0.1；
流动相B：乙腈：流动相A＝25：75(V/V)；
稀释剂：流动相A；
检测波长：220nm；
柱温：25℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：10μl；
洗脱梯度：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 100 | 0 |
| 15 | 100 | 0 |
| 25 | 80 | 20 |
| 30 | 80 | 20 |
| 35 | 0 | 100 |
| 40 | 0 | 100 |
| 41 | 100 | 0 |
| 50 | 100 | 0 |
(2)溶液的配制：
杂质定位储备液：分别精密称取杂质A、B、C、D、E、F、G、尿嘧啶、尿嘧啶核苷对照品适量，用水溶解并稀释制成每1ml约含杂质0.5mg的溶液，即得各杂质定位储备液。
杂质定位溶液：取杂质对照品储备液适量，用流动相A稀释制成每1ml约含杂质10μg的溶液，即得各杂质定位液。
杂质混合溶液：取各杂质定位储备液与利巴韦林原料药适量，置于容量瓶中，用流动相A溶解并稀释配制成约含利巴韦林1mg/ml和各杂质溶液0.005mg/ml的混合溶液，作为杂质混合溶液。
(3)测定步骤：(a)将所述系统试用性溶液，注入液相色谱仪；(b)将10微升空白水溶液进行色谱分析，得到空白色谱图；(c)将10微升所述对照溶液进行色谱分析，以调节检测灵敏度；以及(d)将10微升所述供试品溶液进行色谱分析，以便获得色谱图，所述色谱图用于确定所述利巴韦林原料药或制剂中有关物质的含量。
(4)检测结果：色谱图分离效果可满足要求，基线平稳。其中，理论塔板数按利巴韦林峰计算不低于2000，未知单杂≤0.1％；杂质总量≤0.5％。
根据本发明的具体实施例，本发明所述的方法包括：
(1)色谱条件：
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ 250×4.6mml.D.S-5μm，12nm；
流动相A：称取1.0g无水硫酸钠溶于1000g水中，用5％磷酸水溶液调节pH至2.8±0.1；
流动相B：乙腈：流动相A＝25：75(V/V)；
稀释剂：流动相A；
检测波长：220nm；
柱温：25℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：10μl；
洗脱梯度：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 95 | 5 |
| 15 | 95 | 5 |
| 25 | 85 | 15 |
| 30 | 85 | 15 |
| 35 | 5 | 95 |
| 40 | 5 | 95 |
| 41 | 95 | 5 |
| 50 | 95 | 5 |
(2)溶液的配制：
杂质定位储备液：分别精密称取杂质A、B、C、D、E、F、G、尿嘧啶、尿嘧啶核苷对照品适量，用水溶解并稀释制成每1ml约含杂质0.5mg的溶液，即得各杂质定位储备液。
杂质定位溶液：取杂质对照品储备液适量，用流动相A稀释制成每1ml约含杂质10μg的溶液，即得各杂质定位液。
杂质混合溶液：取各杂质定位储备液与利巴韦林原料药适量，置于容量瓶中，用流动相A溶解并稀释配制成约含利巴韦林1mg/ml和各杂质溶液0.005mg/ml的混合溶液，作为杂质混合溶液。
(3)测定步骤：(a)将所述系统试用性溶液，注入液相色谱仪；(b)将10微升空白水溶液进行色谱分析，得到空白色谱图；(c)将10微升所述对照溶液进行色谱分析，以调节检测灵敏度；以及(d)将10微升所述供试品溶液进行色谱分析，以便获得色谱图，所述色谱图用于确定所述利巴韦林原料药或制剂中有关物质的含量。
(4)检测结果：色谱图分离效果可满足要求，基线平稳。其中，理论塔板数按利巴韦林峰计算不低于2000，未知单杂≤0.1％；杂质总量≤0.5％。
根据本发明的具体实施例，本发明所述的方法包括：
(1)色谱条件：
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ 250×4.6mml.D.S-5μm，12nm；
流动相A：称取1.0g无水硫酸钠溶于1000g水中，用5％磷酸水溶液调节pH至2.8±0.1；
流动相B：乙腈：流动相A＝25：75(V/V)；
稀释剂：流动相A；
检测波长：220nm；
柱温：25℃；
流速：1.0ml/min；
进样体积：10μl；
洗脱梯度：
| 时间(min) | 流动相A(％) | 流动相B(％) |
| 0 | 90 | 10 |
| 15 | 90 | 10 |
| 25 | 70 | 30 |
| 30 | 70 | 30 |
| 35 | 10 | 90 |
| 40 | 10 | 90 |
| 41 | 90 | 10 |
(2)溶液的配制：
杂质定位储备液：分别精密称取杂质A、B、C、D、E、F、G、尿嘧啶、尿嘧啶核苷对照品适量，用水溶解并稀释制成每1ml约含杂质0.5mg的溶液，即得各杂质定位储备液。
杂质定位溶液：取杂质对照品储备液适量，用流动相A稀释制成每1ml约含杂质10μg的溶液，即得各杂质定位液。
杂质混合溶液：取各杂质定位储备液与利巴韦林原料药适量，置于容量瓶中，用流动相A溶解并稀释配制成约含利巴韦林1mg/ml和各杂质溶液0.005mg/ml的混合溶液，作为杂质混合溶液。
(3)测定步骤：(a)将所述系统试用性溶液，注入液相色谱仪；(b)将10微升空白水溶液进行色谱分析，得到空白色谱图；(c)将10微升所述对照溶液进行色谱分析，以调节检测灵敏度；以及(d)将10微升所述供试品溶液进行色谱分析，以便获得色谱图，所述色谱图用于确定所述利巴韦林原料药或制剂中有关物质的含量。
(4)检测结果：色谱图分离效果可满足要求，基线平稳。其中，理论塔板数按利巴韦林峰计算不低于2000，未知单杂≤0.1％；杂质总量≤0.5％。
本发明的发明人发现，根据本发明的实施例，上述方法能够有效测定出利巴韦林与其合成过程中可能引入的各个杂质如杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质J、杂质K。该方法具有分离度高、高效性、灵敏性、专属性和准确性的特点，而且采用本发明所述的方法进行有关物质的测定时其工艺过程中产生的杂质能被有效的检出，其方法相对于ChP2015及USP42的方法更准确、有效，更有利于药品中间体的质量控制。本发明所述的方法可作为利巴韦林原料或制剂的有关物质分离分析检测方法，可很好的用于分离分析利巴韦林及各杂质，本发明所述的方法可用于利巴韦林片的质量控制，可有效控制利巴韦林原料药或制剂药品的质量。
附图说明
图1是根据本发明实施例3的本发明所述利巴韦林有关物质优化方法1所得到的利巴韦林杂质混合溶液色谱图，其中各峰的保留时间为：1、杂质C(4.386min)，2、杂质D(5.463min)，3、尿嘧啶(7.252min)，4、杂质A(7.884min)，5、利巴韦林(9.758min)，6、杂质B(11.451min)，7、杂质G(17.701min)，8、尿嘧啶核苷(19.881min)，9、杂质F(32.202min)；
图2是根据本发明实施例3的本发明所述利巴韦林有关物质优化方法2所得到的利巴韦林杂质混合溶液色谱图，其中各峰的保留时间为：1、杂质C(4.400min)，2、杂质D(5.540min)，3、尿嘧啶(7.333min)，4、杂质A(7.703min)，5、利巴韦林(9.758min)，6、杂质B(11.470min)，7、杂质G(17.613min)，8、尿嘧啶核苷(19.813min)，9、杂质F(27.317min)，10、杂质E(40.813min)；
图3是根据本发明实施例3的本发明所述利巴韦林有关物质优化方法3所得到的利巴韦林杂质混合溶液色谱图，其中各峰的保留时间为：1、杂质C(4.427min)，2、杂质D(5.600min)，3、尿嘧啶(7.450min)，4、杂质A(7.993min)，5、利巴韦林(9.950min)，6、杂质B(11.750min)，7、杂质G(17.977min)，8、尿嘧啶核苷(20.467min)，9、杂质F(25.197min)，10、杂质E(33.880min)；
图4是根据本发明实施例3的本发明所述利巴韦林有关物质优化方法4所得到的利巴韦林杂质混合溶液色谱图，其中各峰的保留时间为：1、杂质C(4.480min)，2、杂质D(5.607min)，3、尿嘧啶(7.457min)，4、杂质A(8.020min)，5、利巴韦林(9.970min)，6、杂质B(11.753min)，7、杂质G(18.073min)，8、尿嘧啶核苷(20.490min)，9、杂质F(25.270min)，10、杂质E(34.053min)；
图5是根据本发明实施例3的本发明所述利巴韦林有关物质优化方法5所得到的利巴韦林供试品溶液色谱图，其中利巴韦林的保留时间：9.973min；
图6是根据本发明实施例3的本发明所述利巴韦林有关物质优化方法5所得到的利巴韦林杂质混合溶液色谱图，其中各峰的保留时间为：1、杂质C(4.497min)，2、杂质D(5.610min)，3、杂质A(8.046min)，4、利巴韦林(9.977min)，5、杂质B(11.740min)，6、杂质G(18.090min)，7、杂质H(29.463min)，8、杂质F(32.323min)，9、杂质E(40.570min)。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1按照ChP2015利巴韦林有关物质分析方法重现
(1)色谱条件
色谱柱：磺化交联的苯乙烯-二乙烯基共聚物的氢型阳离子交换树脂(
Suger-H，7.8×300mm，5μm)
流动相：用稀硫酸调节水的pH值至2.5±0.1
柱温：50℃
流速：0.6ml/min
运行时间：60min
检测波长：207nm/220nm
进样体积：20μl
(2)溶液配制
供试品溶液：取利巴韦林原料药适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制成每1ml约含利巴韦林0.4mg的溶液，作为供试品溶液。
杂质定位储备溶液：分别精密称取杂质A、B、C、D、F、G、尿嘧啶、尿嘧啶核苷对照品适量，用水溶解并稀释制成每1ml约含杂质0.5mg的溶液，即得各杂质定位储备液。
杂质定位溶液：分别精密量各杂质储备液适量，用流动相稀释成约10μg/ml的溶液，即得各杂质定位溶液。
杂质混合溶液：分别精密量取各杂质储备液适量至同一量瓶中，用供试品溶液稀释，配制成约含利巴韦林0.4mg/ml和各杂质溶液10μg/ml的混合溶液。
(3)检测结果
照ChP2015版利巴韦林有关物质分析方法，采用磺化交联的苯乙烯-二乙烯基共聚物的氢型阳离子交换树脂(
Suger-H，7.8×300mm，5μm)色谱柱对供试品溶液、自身对照溶液、杂质混合溶液及杂质定位溶液进行检测，结果显示该方法对杂质的检出能力及分离效果较差，且基线不稳。
实施例2按照USP42利巴韦林片质量标准有关物质分析方法(方法1和方法2)重现
(1)色谱条件
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ 250×4.6mml.D.S-5μm，12nm
方法1：
流动相A：取3.4g磷酸二氢钾溶于1000g水中，用5％氢氧化钾调节pH至5.0±0.05，0.45μm滤膜过滤。
流动相B：乙腈
检测波长：220nm，207nm
柱温：30℃
流速：1.0ml/min
进样体积：20μl
洗脱程序：
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 100 | 0 |
| 30 | 90 | 10 |
| 40 | 75 | 25 |
| 50 | 50 | 50 |
| 55 | 50 | 50 |
| 56 | 100 | 0 |
| 70 | 100 | 0 |
方法2：
缓冲液：称取3.0g磷酸氢二钾溶于1000g水中，用磷酸调节pH至6.0±0.1，用0.45μm滤膜滤过。
流动相：甲醇-缓冲液(1:39)
检测波长：207nm
柱温：30℃
流速：1.0ml/min
进样体积：10μl
运行时间：30min
(2)溶液配制
杂质定位溶液：分别精密称取杂质A、B、C、D、F、G、尿嘧啶、尿嘧啶核苷对照品适量，用水溶解并稀释制成每1ml约含杂质0.5mg的溶液，即得各杂质定位液。
方法1-供试品溶液：取利巴韦林原料药适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制成每1ml约含利巴韦林0.5mg的溶液，作为方法1-供试品溶液。
方法2-供试品溶液：取利巴韦林原料药适量，精密称定，用水溶解并稀释制成每1ml约含利巴韦林1.0mg的溶液，作为方法2-供试品溶液。
杂质混合溶液：取各杂质溶液与利巴韦林原料药适量，置于容量瓶中，用流动相A(方法1)配制成约含利巴韦林1mg/ml和各杂质溶液0.005mg/ml的混合溶液，作为杂质混合溶液。
(3)检测结果
由检测结果可知，采用USP42利巴韦林片有关物质方法1时，已知杂质均能洗脱出来；采用USP42利巴韦林片有关物质方法2时杂质F未出峰；通过对比两个方法的各杂质定位溶液色谱图对比可知，方法1对杂质的分离效果略优于方法2。
其中，应用USP42利巴韦林片有关物质方法1得到的杂质定位溶液色谱图叠图，其中各峰的保留时间为：1、杂质C(3.215min)，2、杂质A(3.581min)，3、杂质D(5.171min)，4、尿嘧啶(6.632min)，5、利巴韦林(8.550min)，6、杂质B(9.678min)，7、杂质G(12.240min)，8、尿嘧啶核苷(12.555min)，9、杂质F(21.408min)；
应用USP42利巴韦林片有关物质方法2得到的杂质定位溶液色谱图叠图，其中各峰的保留时间为：1、杂质C(3.104min)，2、杂质A(3.296min)，3、杂质D(4.460min)，4、尿嘧啶(5.241min)，5、利巴韦林(6.096min)，6、杂质B(6.738min)，7、杂质G(9.914min)，8、尿嘧啶核苷(10.487min)，9、杂质F(未洗脱出来)。
采用USP42利巴韦林片有关物质方法1对杂质混合溶液进行检测，由杂质混合溶液色谱图可知，USP42利巴韦林片有关物质方法1对杂质A、B、D、F、G、尿嘧啶、尿嘧啶核苷都有较好的分离效果，但是杂质C与3.0min处溶剂峰重叠，分离效果不能满足要求。其中各峰的保留时间为：1、杂质C(3.130min)(此处有溶剂峰与杂质C重叠)，2、杂质A(3.541min)，3、杂质D(5.204min)，4、尿嘧啶(6.747min)，5、利巴韦林(8.757min)，6、杂质B(10.101min)，7、杂质G(13.746min)，8、尿嘧啶核苷(14.238min)，9、杂质F(23.568min)。
实施例3：利巴韦林有关物质的分析检测方法及优化
(1)波长的确定
对利巴韦林、杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、尿嘧啶、尿嘧啶核苷使用二极管阵列检测器进行了吸收波长测定，在190nm～800nm范围内测定吸收度。各杂质最大吸收波长见表2，由表可知各已知杂质最大吸收波长均在190～204nm范围内，此范围内波长较接近流动相末端吸收波长，因此选择220nm作为本方法中有关物质的检测波长。
表2:有关物质测定检测波长的确认试验结果
| 样品名称 | 最大吸收波长(nm) |
| 利巴韦林 | 204 |
| 杂质A | 198 |
| 杂质B | 206 |
| 杂质C | 190 |
| 杂质D | 200 |
| 杂质E | 192和226 |
| 杂质F | 205 |
| 杂质G | 214 |
| 杂质H | 209 |
| 尿嘧啶 | 200和259 |
| 尿嘧啶核苷 | 192和261 |
(2)柱温、流速的确定
在不改变其他色谱条件的情况下，考察柱温设置为23℃、25℃、27℃时，对杂质混合溶液中各杂质及主成分的分离情况。检测结果显示，各杂质及主成分与相邻峰的分离度均大于1.5，杂质A与主峰的分离度均大于4.0，柱温在23～27℃范围内均能满足要求，故本发明所述利巴韦林有关物质分析方法将柱温设置为25℃。
在不改变其他色谱条件的情况下，考察流速设置为0.9ml/min、1.0ml/min、1.1ml/min时，对杂质混合溶液中各杂质及主成分的分离情况，检测结果显示，各杂质及主成分与相邻峰的分离度均大于1.5，杂质A与主峰的分离度均大于4.0，流速在0.9～1.1ml/min范围内均能满足要求，故本发明所述利巴韦林有关物质分析方法将流速设置为1.0ml/min。
(3)流动相A、稀释剂、供试品浓度及进样体积的确定
流动相A：称取1.0g无水硫酸钠溶于1000ml水中，用5％磷酸水溶液调节pH至2.8±0.1。
稀释剂：使用水作稀释剂时，空白溶剂色谱图2～3min出现倒峰；使用流动相A作稀释剂时，空白溶剂色谱图2～3min无倒峰。为减小空白溶剂的干扰，因此本发明将稀释剂确定为流动相A。
供试品浓度及进样体积：由于样品中杂质含量较低，部分杂质峰较难积分，为提高对杂质的检出能力，故增大供试品浓度和进样体积，将供试品浓度确定为1.0mg/ml，进样体积确定为10μl。
(4)洗脱梯度的确定
①本发明的优化方法1
色谱条件：
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ 250×4.6mml.D.S-5μm，12nm
流动相A：称取1.0g无水硫酸钠溶于1000g水中，用5％磷酸水溶液调节pH至2.8±0.1。
流动相B：乙腈：流动相A＝5：95(V/V)
稀释剂：流动相A
检测波长：220nm
柱温：25℃
流速：1.0ml/min
进样体积：10μl
洗脱梯度：
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 100 | 0 |
| 15 | 100 | 0 |
| 25 | 0 | 100 |
| 35 | 0 | 100 |
| 36 | 100 | 0 |
| 45 | 100 | 0 |
溶液的配制：
杂质定位储备液：分别精密称取杂质A、B、C、D、E、F、G、尿嘧啶、尿嘧啶核苷对照品适量，用水溶解并稀释制成每1ml约含杂质0.5mg的溶液，即得各杂质定位储备液。
杂质定位溶液：取杂质对照品储备液适量，用流动相A稀释制成每1ml约含杂质10μg的溶液，即得各杂质定位液。
杂质混合溶液：取各杂质定位储备液与利巴韦林原料药适量，置于容量瓶中，用流动相A溶解并稀释配制成约含利巴韦林1mg/ml和各杂质溶液0.005mg/ml的混合溶液，作为杂质混合溶液。
检测结果：杂质混合溶液色谱图可知(见附图1)，除杂质E以外的各杂质及主成分间的分离效果可满足要求，且基线平稳，但杂质E未洗脱出来，故后续将对洗脱程序进行优化。
②本发明的优化方法2
由杂质E的化学结构可判断，杂质E极性较小，洗脱时间较长；参考USP42利巴韦林片有关物质方法1中给出的杂质E的相对保留时间，可知杂质E的保留时间较长，需要较高比例的乙腈进行洗脱，而本方法中乙腈的最大比例为5％。结合USP42有关物质方法1中乙腈的变化梯度，本发明将流动相B设置为乙腈，并设计洗脱程序，如下。
其他色谱条件：同本发明的优化方法1
| 时间(min) | 流动相A | 乙腈 |
| 0 | 100 | 0 |
| 15 | 100 | 0 |
| 25 | 90 | 10 |
| 40 | 75 | 25 |
| 50 | 75 | 25 |
| 56 | 100 | 0 |
| 80 | 100 | 0 |
检测结果：由色谱图(见附图2)可知，调整后的方法可将杂质E洗脱出来，各杂质仅能较好的分离，但是梯度峰的影响较大。
③本发明的优化方法3
根据方法2检测结果可知，流动相中添加25％的乙腈即可将杂质E洗脱出来，为减少流动相A与乙腈混合时产生的溶剂效应，故将流动相B设置为乙腈：流动相A＝25：75，设计洗脱梯度如下。
其他色谱条件：同本发明的优化方法1。
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 100 | 0 |
| 15 | 100 | 0 |
| 30 | 0 | 100 |
| 38 | 0 | 100 |
| 40 | 100 | 0 |
| 55 | 100 | 0 |
检测结果：由色谱图(见附图3)可知，调整后的方法可将杂质E洗脱出来，各杂质都能较好的分离，但是20～30min梯度峰影响此处杂质的检测，且此方法时间较长。
④本发明的优化方法4
使用本发明的优化方法3进行分析时，保留时间最长的杂质E出峰时间为33.88min，为缩短分析时间，在本发明的优化方法3的基础上，设计洗脱梯度如下，流动相B为乙腈：流动相A＝25：75。
其他色谱条件：同本发明的优化方法1
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 100 | 0 |
| 15 | 100 | 0 |
| 30 | 0 | 100 |
| 35 | 0 | 100 |
| 36 | 100 | 0 |
| 50 | 100 | 0 |
检测结果：由色谱图(见附图4)可知，各杂质都能较好的分离，但是20～30min处梯度峰影响此处杂质的检测。
④本发明的优化方法5
用本发明的优化方法1分析杂质混合溶液时，大部分杂质在30min前出峰，杂质F的保留时间约为32min；由本发明的优化方法4色谱图(附图4)可知，洗脱梯度中100％流动相B(乙腈：流动相A＝25：75)连续洗脱5min即可把杂质E洗脱出来；后平衡时间9min基线即可平稳，压力达到稳定，可将后平衡时间缩短，以缩短分析时间。本发明的优化方法1基线较为平稳，且梯度峰对杂质的检测基本无影响，故在本发明的优化方法1基础上，不改变前30min洗脱梯度中乙腈变化比例，结合本发明的优化方法4，设计方法如下，流动相B为:乙腈：流动相A＝25：75(V/V)。
由于杂质H到货期比较晚，在本发明的优化有关物质方法5开发时，系统适用性试验溶液中加入杂质H，结果显示，杂质H峰与其他峰分离度也达到要求。
其他色谱条件：同本发明的优化方法1
*：梯度变化说明
i：0～30min，流动相中乙腈比例变化；
ii：30～35min，缓慢增加流动相中乙腈比例，防止因梯度变化较快产生梯度峰；
iii：35～40min，极性较小杂质的洗脱阶段；
iv：40～50min，梯度后平衡阶段。
溶液的配制：
杂质定位储备液：分别精密称取杂质A、B、C、D、E、F、G、H对照品适量，用水溶解并稀释制成每1ml约含杂质0.5mg的溶液，即得各杂质定位储备液。(注：由于尿嘧啶和尿嘧啶核苷不属于我公司所用利巴韦林原料药合成路线产生的工艺杂质，故不再对其进行研究。)
杂质混合溶液：取各杂质定位储备液与利巴韦林原料药适量，置于容量瓶中，用流动相A溶解并稀释配制成约含利巴韦林1mg/ml和各杂质溶液0.025mg/ml的混合溶液，作为杂质混合溶液。
检测结果：由色谱图(见附图5～6)分离效果可满足要求，基线平稳，0min至30min各已知杂质保留时间与本发明的优化方法1前30min保持一致，可将杂质E洗脱出来，故本发明确定将本发明的优化方法5作为利巴韦林片有关物质分析方法。
(5)各杂质相对保留时间确认
表8.4-01：各杂质相对保留时间对比表
实施例4测定利巴韦林中的有关物质
色谱条件：
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ 250×4.6mml.D.S-5μm，12nm；流动相A：称取1.0g无水硫酸钠溶于1000g水中，用5％磷酸水溶液调节pH至2.8±0.1；流动相B：乙腈：流动相A＝25：75(V/V)；稀释剂：流动相A；检测波长：220nm；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；进样体积：10μl；洗脱梯度条件为：
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 100 | 0 |
| 15 | 100 | 0 |
| 25 | 80 | 20 |
| 30 | 80 | 20 |
| 35 | 0 | 100 |
| 40 | 0 | 100 |
| 41 | 100 | 0 |
| 50 | 100 | 0 |
溶液的配制：
杂质定位储备液：分别精密称取杂质A、B、C、D、E、F、G、尿嘧啶、尿嘧啶核苷对照品适量，用水溶解并稀释制成每1ml约含杂质0.5mg的溶液，即得各杂质定位储备液。
杂质定位溶液：取杂质对照品储备液适量，用流动相A稀释制成每1ml约含杂质10μg的溶液，即得各杂质定位液。
杂质混合溶液：取各杂质定位储备液与利巴韦林原料药适量，置于容量瓶中，用流动相A溶解并稀释配制成约含利巴韦林1mg/ml和各杂质溶液0.005mg/ml的混合溶液，作为杂质混合溶液。
检测结果：色谱图分离效果可满足要求，基线平稳。其中，理论塔板数按利巴韦林峰计算不低于2000，未知单杂≤0.1％；杂质总量≤0.5％。
实施例5测定利巴韦林片中的有关物质
色谱条件：色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ 250×4.6mml.D.S-5μm，12nm；流动相A：称取1.0g无水硫酸钠溶于1000g水中，用5％磷酸水溶液调节pH至2.8±0.1；流动相B：乙腈：流动相A＝25：75(V/V)；稀释剂：流动相A；检测波长：220nm；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；进样体积：10μl；洗脱梯度条件为：
溶液的配制：
杂质定位储备液：分别精密称取杂质A、B、C、D、E、F、G、尿嘧啶、尿嘧啶核苷对照品适量，用水溶解并稀释制成每1ml约含杂质0.5mg的溶液，即得各杂质定位储备液。
杂质定位溶液：取杂质对照品储备液适量，用流动相A稀释制成每1ml约含杂质10μg的溶液，即得各杂质定位液。
杂质混合溶液：取各杂质定位储备液与利巴韦林原料药适量，置于容量瓶中，用流动相A溶解并稀释配制成约含利巴韦林1mg/ml和各杂质溶液0.005mg/ml的混合溶液，作为杂质混合溶液。
检测结果：色谱图分离效果可满足要求，基线平稳。其中，理论塔板数按利巴韦林峰计算不低于2000，未知单杂≤0.1％；杂质总量≤0.5％。
实施例6测定利巴韦林片中的有关物质
色谱条件：色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ 250×4.6mml.D.S-5μm，12nm；流动相A：称取1.0g无水硫酸钠溶于1000g水中，用5％磷酸水溶液调节pH至2.8±0.1；流动相B：乙腈：流动相A＝25：75(V/V)；稀释剂：流动相A；检测波长：220nm；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；进样体积：10μl；洗脱梯度条件为：
| 时间(min) | 流动相A | 流动相B |
| 0 | 90 | 10 |
| 15 | 90 | 10 |
| 25 | 70 | 30 |
| 30 | 70 | 30 |
| 35 | 10 | 90 |
| 40 | 10 | 90 |
| 41 | 90 | 10 |
| 50 | 90 | 10 |
溶液的配制：
杂质定位储备液：分别精密称取杂质A、B、C、D、E、F、G、尿嘧啶、尿嘧啶核苷对照品适量，用水溶解并稀释制成每1ml约含杂质0.5mg的溶液，即得各杂质定位储备液。
杂质定位溶液：取杂质对照品储备液适量，用流动相A稀释制成每1ml约含杂质10μg的溶液，即得各杂质定位液。
杂质混合溶液：取各杂质定位储备液与利巴韦林原料药适量，置于容量瓶中，用流动相A溶解并稀释配制成约含利巴韦林1mg/ml和各杂质溶液0.005mg/ml的混合溶液，作为杂质混合溶液。
检测结果：色谱图分离效果可满足要求，基线平稳。其中，理论塔板数按利巴韦林峰计算不低于2000，未知单杂≤0.1％；杂质总量≤0.5％。本发明所述的优化方法5可作为利巴韦林片有关物质分析方法，可很好的用于分离分析利巴韦林及各杂质，本发明所述的方法可用于利巴韦林片的质量控制。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (3)
1.一种利巴韦林原料药或制剂中有关物质的分离分析检测方法，其特征在于，所述有关物质是杂质A、杂质B、杂质C、杂质D、杂质E、杂质F、杂质G、杂质H、杂质J和杂质K的化合物，
所述方法是液相色谱法，包括：
(1)色谱条件：
色谱柱：YMC-Pack ODS-AQ 250×4.6mml.D.S-5μm，12nm；流动相A：称取1.0g无水硫酸钠溶于1000g水中，用5％磷酸水溶液调节pH至2.8±0.1；流动相B：乙腈：流动相A＝25：75，V/V；稀释剂：流动相A；检测波长：220nm；柱温：25℃；流速：1.0ml/min；进样体积：10μl；洗脱梯度条件为：
(2)溶液的配制：
杂质定位储备液：分别精密称取杂质A、B、C、D、E、F、G、尿嘧啶、尿嘧啶核苷对照品适量，用水溶解并稀释制成每1ml约含杂质0.5mg的溶液，即得各杂质定位储备液；
杂质定位溶液：取杂质对照品储备液适量，用流动相A稀释制成每1ml约含杂质10μg的溶液，即得各杂质定位液，为对照溶液；
杂质混合溶液：取各杂质定位储备液与利巴韦林原料药适量，置于容量瓶中，用流动相A溶解并稀释配制成约含利巴韦林1mg/ml和各杂质溶液0.005mg/ml的混合溶液，作为杂质混合溶液，为系统适用性溶液；
供试品溶液：取利巴韦林原料药适量，精密称定，用水溶解并稀释制成每1ml约含利巴韦林1.0mg的溶液，作为供试品溶液；
(3)测定步骤：(a)将所述系统适用性溶液，注入液相色谱仪；(b)将10微升空白水溶液进行色谱分析，得到空白色谱图；(c)将10微升所述对照溶液进行色谱分析，以调节检测灵敏度；以及(d)将10微升所述供试品溶液进行色谱分析，以便获得色谱图，所述色谱图用于确定所述利巴韦林原料药或制剂中有关物质的含量；
通过液相色谱法对所述利巴韦林原料药或制剂进行分析，以便获得色谱图；以及
基于所述色谱图，确定所述利巴韦林原料药或制剂中有关物质的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述各杂质相对保留时间为：
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，用于利巴韦林原料药或制剂药品的质量控制。
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