CN113970612B - 一种高效液相色谱法测定丙酚替诺福韦有关物质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高效液相法测定丙酚替诺福韦有关物质的方法，所述高效液相色谱条件为：使用C18硅胶色谱柱，检测波长为260nm，流速为1.0ml/min，柱温为25‑30℃，进样量为10‑50μl，流动相由A相和B相组成，其中，A相中弱酸性缓冲盐溶液:有机溶剂的体积比为80.0‑99.9:1，B相中弱酸性缓冲盐溶液:有机溶剂的体积比为40‑60:60‑40，并进行梯度洗脱。本发明选择了普适性强的C18硅胶柱对丙酚替诺福韦有关物质进行高效液相色谱检测，并优化了洗脱条件，可检测多种有关物质，具有操作简便、显著缩短洗脱时间、检测灵敏度高，分离度好、通用性高、成本低廉等优点，用于控制丙酚替诺福韦及其制剂的药品质量，保障安全用药。

Description

一种高效液相色谱法测定丙酚替诺福韦有关物质的方法
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种高效液相色谱法(HPLC法)测定丙酚替诺福韦(TAF)及其有关物质的方法。
背景技术
丙酚替诺福韦(简称TAF)是一种核苷类逆转录酶抑制剂，替诺福韦的前药，用于治疗伴有代偿性肝病的慢性乙肝感染。与替诺福韦二吡呋酯相比，本品具有更强的抗病毒活性，能更有效的进入淋巴组织。
CHAPMAN等(Nucleosides and Nucleic Acids，20(4-7):621-628,20010401)公开了丙酚替诺福韦的合成方法，步骤如下：
该路线反应过程中产生的非对应异构体等副产物难以分离，需要建立适用性良好的检测方法对丙酚替诺福韦原料药及其制剂中的有关物质进行质量控制。
CN111189947A公开了一种分离检测丙酚替诺福韦杂质的方法，以甲醇和酸性水溶液作为流动相梯度洗脱，分离并检测特定的异构体杂质，但并未检测潜在杂质，如降解杂质、工艺杂质等。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高效液相法测定丙酚替诺福韦有关物质的方法，所述高效液相色谱条件为：使用C18硅胶色谱柱，检测波长为260nm，流速为0.8-1.5ml/min，柱温为25-30℃，进样量为10-50μl，流动相由A相和B相组成，其中，A相中弱酸性缓冲盐溶液:有机溶剂的体积比为80.0-99.9:1，B相中弱酸性缓冲盐溶液:有机溶剂的体积比为40-60:60-40，梯度洗脱条件为：
时间/分钟 0-2 5 30 50
A％ 100 60-80 65-85 0
B％ 0 20-40 15-35 100
本发明优选技术方案中，梯度洗脱条件如下：
本发明优选技术方案中，所述C18色谱柱的柱长为250mm×4.6mm，填料粒径为5μm。
本发明优选技术方案中，A相中弱酸性缓冲盐溶液:有机溶剂的体积比为99:1。
本发明优选技术方案中，B相中弱酸性缓冲盐溶液:有机溶剂的体积比为50:50。
本发明优选技术方案中，所述弱酸性缓冲盐溶液的pH 5.5-6.5，优选为pH 5.8-6.2，更优选为pH 6.0。
本发明优选技术方案中，所述弱酸性缓冲盐选自磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠中的一种或其组合。
本发明优选技术方案中，A相或B相中的有机溶剂选自乙腈、四氢呋喃、甲醇中的任一种或其组合，优选为四氢呋喃：乙腈的体积比为6-9：2-4的混合溶液。
本发明优选技术方案中，所述洗脱条件如下：
本发明优选技术方案中，所述柱温为26-28℃，优选为27℃。
本发明优选技术方案中，所述进样量为10-30μl，优选为20μl。
本发明优选技术方案中，所述流速为0.9-1.2ml/min，优选为1ml/min。
本发明优选技术方案中，所述有关物质选自表1中杂质1-6中的任一种或其组合。
本发明优选技术方案中，所述有关物质选自表1中杂质1-11中的任一种或其组合。
表1
本发明的另一目的在于提供所述杂质1-6中的任一种或其组合用于在丙酚替诺福韦质量控制和/或安全用药中的应用。
本发明的另一目的在于提供所述杂质1-11中的任一种或其组合用于在丙酚替诺福韦质量控制和/或安全用药中的应用。
本发明的另一目的在于提供所述测定丙酚替诺福韦有关物质的方法用于在丙酚替诺福韦药品质量控制和/或安全用药中的应用。
除非另有说明，本发明涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本发明涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量百分比；本发明涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积百分比；其余为重量/重量百分比。
与现有技术相比，本发明具有下述有益技术效果：
本发明选择了普适性强的C18硅胶柱对丙酚替诺福韦有关物质进行高效液相色谱检测，并优化了洗脱条件，可检测多种有关物质，具有操作简便、显著缩短洗脱时间、检测灵敏度高，分离度好、通用性高、成本低廉等优点，用于控制丙酚替诺福韦及其制剂的药品质量，保障安全用药。
附图说明
图1实施例3样品1采用色谱条件1的HPLC色谱图
图2实施例3样品1采用色谱条件2的HPLC色谱图
具体实施方式
下面列举一部分具体实施例对本发明进行说明，有必要在此指出的是以下具体实施例只用于对本发明作进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
本发明实施例所用HPLC检测设备为：岛津LC-20A高效液相色谱仪，SPD-20A UV检测器。
实验例1系统适用性考察
取杂质1-11对照品和富马酸丙酚替诺福韦(TAF)对照品适量，加A相溶解并定量稀释成混合溶液，其中，杂质1-7和丙酚替诺福韦的终浓度为2μg/ml，杂质8-11的终浓度为1μg/ml，作为系统适应性溶液。
取系统适用性溶液，注入液相色谱仪，色谱条件如下：
色谱柱：Thermo Hypersil BDS C18(250mm×4.6mm,5μm)
A相：[四氢呋喃-乙腈(7:3)]-0.02mol/L磷酸氢二钾缓冲液(pH6.0)(1:99)
B相：[四氢呋喃-乙腈(7:3)]-0.02mol/L磷酸氢二钾缓冲液(pH6.0)(50:50)
检测波长260nm，流速：1.0ml/min，柱温：27℃，进样量：20μl洗脱梯度条件见表2，结果见表3。
表2
表3系统适用性测定结果
实施例2其他方法学考察
(1)定量限与检测限
TAF及各杂质的定量限及检测灵敏度均符合要求(见表4)。
表4
(2)线性与范围
在规定的测定范围(杂质1-3、5、8-11:1-30μg/ml，杂质4：1-32μg/ml，杂质6-7：0.8-24μg/ml，TAF：0.9-27μg/ml)内，TAF及各杂质的峰面积与浓度呈良好的线性关系，r均大于0.99。
(3)精密度与重复性
由2名不同实验员分别平行配制6份样品进行检测，杂质含量＞0.1％的RSD均小于20％，杂质含量≤0.1％的RSD均小于50％，本发明的检测方法精密度及重复性良好。
(4)回收率与准确度
11种杂质在各个浓度水平的回收率良好，本方法检测准确度高(见表5)。
表5
成分 限度范围(％) 平均回收率(％) RSD(％)
杂质1 0.3-1.0 100.7 3.9
杂质2 0.1-1.0 97.3 2.9
杂质3 0.1-0.3 111.1 9.3
杂质4 0.3-1.0 99.8 1.4
杂质5 0.3-1.0 102.9 4.3
杂质6 0.1-0.4 96.5 4.4
杂质7 0.1-0.4 100.9 5.7
杂质8 0.08-0.28 96.4 3.0
杂质9 0.06-0.2 112.8 6.4
杂质10 0.06-0.2 104.8 5.4
杂质11 0.06-0.2 101.6 3.6
(5)溶液稳定性
供试品溶液(含0.2％的光学异构体)在室温条件下分别于0h、1.5h、3h、6h、9h、12h、15h、21h、27h进样检测，各考察时间点测得的峰面积和面积归一化含量无显著变化，且未检出新的杂质，表明供试品溶液室温放置27小时，溶液稳定性良好。
(6)耐用性
供试品溶液耐用性考察表明，流速和流动相的pH值的微小变化对测定结果无显著影响，各个杂质在不同条件下测定结果基本一致。
实施例3TAF样品中有关物质的检测
采用CHAPMAN等(Nucleosides and Nucleic Acids，20(4-7):621-628,20010401)中的合成方法合成3批TAF样品，作为待测样品。
精密称取待测样品适量，加A相溶解并定量稀释制成1mg/ml的溶液，作为供试品溶液。精密量取供试品溶液适量，用A相定量稀释制成1μg/ml的溶液，作为对照溶液。
精密量取对照溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，分别采用表6中的色谱条件1和色谱条件2进行检测，结果见表7。
表6色谱条件
表7

Claims (2)

1.一种测定丙酚替诺福韦有关物质的高效液相色谱方法，其特征在于，所述高效液相色谱条件为：色谱柱为Thermo Hypersil BDS C18，250mm×4.6mm,5μm，检测波长为260nm，流速为1.0ml/min，柱温为27℃，进样量为20μl，流动相由A相和B相组成，A相为体积比为99:1的0.02mol/L磷酸氢二钾缓冲液:[四氢呋喃-乙腈]，B相为体积比为50:50的0.02mol/L磷酸氢二钾缓冲液:[四氢呋喃-乙腈]，其中所述A相和B相中的磷酸氢二钾缓冲液的pH均为6.0，A相和B相中的四氢呋喃-乙腈的体积比均为7:3，梯度洗脱条件为：
所述有关物质包括如下结构的杂质1-11：
2.权利要求1所述方法用于丙酚替诺福韦药品质量控制和/或安全用药中的应用。
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