CN101105478A - 一种测定人血浆中抗病毒药物浓度的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种可同时测定人血浆中抗病毒药物阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦浓度的方法。本发明方法对待测样品经预处理后，利用阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦在酸性条件下有强的荧光吸收的特征，经酸性流动相在色谱柱分离后，用荧光检测器检测。该法使检测药物浓度的灵敏度明显提高。本方法样品取样少，预处理简单、快速、灵敏，无需昂贵的设备和试剂，分析周期短，成本低，适合于所述药物的临床常规血药浓度的监测。
Description
技术领域
本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定人血浆中抗病毒药物浓度的方法。
背景技术
目前，临床用于治疗病毒性疾病的抗病毒药物若干，阿昔洛韦(Acyclovir，ACV)、更昔洛韦(Ganciclovir，GCV)和喷昔洛韦(Penciclovir，PCV)是目前临床上常用的核苷类抗病毒药物。其中ACV与GCV是最重要的抗巨细胞病毒药物。PCV主要对I、II型单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒和乙型肝炎病毒等具有强效抑制作用。当PCV与ACV或GCV合用，临床疗效明显增强。由于三种药物的药动学个体间差异大、合并用药普遍、肝肾功能异常会导致药物血浆浓度和药效变化，因此通过检测血浆中上述药物的浓度来调整给药剂量，对保证用药的安全和有效有重要的临床意义。
目前医学检验中，国内有分别测定人血浆中有关抗病毒药物浓度的方法的报道，但所述方法存在灵敏度低、操作繁琐费时、效率低、分析成本高等种种缺陷，不适合常规治疗药物浓度监测；国外尚未见相关的同时测定人血浆中ACV、GCV和PCV的浓度的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种简便、快速、灵敏、可同时测定体内阿昔洛韦(Acyclovir，ACV)、更昔洛韦(Ganciclovir，GCV)和喷昔洛韦(Penciclovir，PCV)的血药浓度的方法。
本方法无需昂贵的设备和试剂，具有操作简便、快速、血浆用量少、成本低等优点，适合常规血药浓度监测。
本发明方法的技术方案是：待测样品预处理后，经酸性流动相在色谱柱分离，用荧光检测器检测，包括下述步骤：
1)样品预处理
取待测样品，加入定量的蛋白沉淀剂进行蛋白沉淀、离心、取上清液进样，
所述的蛋白沉淀剂为7～20％的高氯酸溶液；
2)样品分离
采用通用型的液相色谱柱，其填料为Diamonsil C18，高效液相系统采用通用型高压泵和进样器，采用0.08～0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液(pH＝2.1～2.5)和甲醇的混合液作为流动相，梯度洗脱；
梯度洗脱模式优选0～7min为0.08～0.1％TFA水溶液-甲醇(96∶4，V/V)，7.01～10.0min为0.08～0.1％TFA水溶液-甲醇(40∶60，V/V)，10.01～12.5min为0.08～0.1％TFA水溶液-甲醇(96∶4，V/V)；
3)样品检测
采用通用型荧光检测器检测ACV、GCV和PCV的峰面积，荧光激发波长为260±1nm，发射波长为380±1nm，用标准曲线方程换算成浓度。
本方法具有以下优点：
1.采样量少：测定一份样品只需0.2ml血浆样本；
2.预处理简便：一步高氯酸溶液蛋白沉淀，简便易行，适用于常规检测；
3.灵敏度高：根据ACV、GCV和PCV在酸性条件下具有强荧光吸收的特性，采用酸性流动相和荧光检测，明显提高检测灵敏度，ACV、GCV和PCV的最低定量限均为20μg·L-1，显著优于现有技术公开的GCV 100μg·L-1、ACV100μg·L-1和PCV的40μg·L-1；
测定时间短：整个色谱分析测定过程为12.5min。
本方法所述的ACV、GCV和PCV测定的线性范围均为20～2000μg·L-1，方法回收率均大于91％，日内和日间的精密度(相对标准差，RSD)均小于8％。本发明方法快速准确、操作简便、灵敏度高、成本低，适合临床常规监测。
附图说明
图1：典型色谱图：
其中，A：未服用阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦受试者的空白血浆；B：空白血浆+阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦标准品(阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦三者的浓度均为20μg·L-1)；
1：内标(鸟苷酸)；2：更昔洛韦；3：阿昔洛韦；4：喷昔洛韦。
图2：服用阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦受试者的色谱图，
其中，1：内标(鸟苷酸)；2：更昔洛韦(浓度为692.6μg·L-1)；3：阿昔洛韦(浓度为760.3μg·L-1)；4：喷昔洛韦(浓度为910.5μg·L-1)。
图3为受试者服用所述三种抗病毒，
图3：同时服用阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦药物后的受试者的分析色谱图，
其中，1：内标(鸟苷酸)；2：更昔洛韦(浓度为692.6μg·L-1)；3：阿昔洛韦(浓度为760.3μg·L-1)；4：喷昔洛韦(浓度为910.5μg·L-1)。
具体实施方式
实施例1
色谱条件：
HPLC系统：色谱柱Diamonsil C18(200mm×4.6mm，5μm)，流动相采用梯度洗脱，0～7min为0.08％TFA-甲醇(96∶4，V/V)，7.01～10.0min为0.08％TFA-甲醇(40∶60，V/V)，10.01～12.5min为0.08％TFA-甲醇(96∶4，V/V)，流速1.5mL·min-1；柱温25℃；荧光激发波长260±1nm，发射波长380±1nm。
血浆样品预处理：
精密吸取200μL血浆置1.5mL离心管中，加含内标鸟苷酸的7％高氯酸溶液50μL，涡旋振荡提取30s，离心15min(10000×g，4℃)，取上清液40μL进样，内标法以峰面积定量。
专属性：
取不同来源的10名未服用ACV、GCV和PCV的受试者的空白血浆，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，结果显示，未发现血浆内源性物质对上述测定组分有干扰；此外，常见合并用药缬更昔洛韦、伐昔洛韦、更昔洛韦、喷昔洛韦、利巴韦林、阿西美辛、吲哚美辛、阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、环孢素、他克莫司、西罗莫司、强的松、咪唑立宾、麦考酚酸、阿司匹林、对乙酰氨基酚等对测定没有干扰。内标鸟苷酸、ACV、GCV和PCV的典型色谱保留时间分别为3.9、6.8、5.1和7.8min，整个色谱分析过程时间为12.5min。
线性试验：
精密称取ACV、GCV和PCV标准物质适量，用50％甲醇溶解，稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含ACV 20、100、500、1000、1500、2000μg·L-1，GCV 20、100、500、1000、1500、2000μg·L-1和PCV 20、100、500、1000、1500、2000μg·L-1的标准血样。取血浆200μL，按”血浆样品预处理”方法操作。内标法以待测组分与内标的峰面积比(A)和待测组分浓度(C)作加权(1/C2)线性回归，线性范围均为20～2000μg·L-1，最低定量限均为20μg·L-1，三者的标准曲线回归方程分别为：ACV A＝0.00117C-0.00373，r＝0.9996：GCVA＝0.00135 C-0.000682，r＝0.9997；PCVA＝0.00345 C-0.0117，r＝0.9996。
准确度和精密度：
精密称取ACV、GCV和PCV标准物质适量，50％甲醇溶解并稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含ACV 40、800、1600μg·L-1，GCV 40、800、1600μg·L-1和PCV 40、800、1600μg·L-1的系列血样，各取血浆200μL，按”血浆样品预处理”方法操作，考察日内和日间的精密度和准确度。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差(RSD)，其中(C实测-C理论)/C理论×100％为偏差。结果表明三种待测物的日内和日间精密度均小于8％，相对偏差小于10％。
表1显示了ACV、GCV和PCV的日内、日间精密度和准确度。
本方法用于同时服用阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦受试者的测定，结果显示，阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦三者的浓度分别为692.6、760.3和910.5μg·L-1。
实施例2：
色谱条件：
HPLC系统：色谱柱Diamonsil C18(200mm×4.6mm，5μm)，流动相采用梯度洗脱，0～7min为0.1％TFA-甲醇(96∶4，V/V)，7.01～10.0min为0.1％TFA-甲醇(40∶60，V/V)，10.01～12.5min为0.1％TFA-甲醇(96∶4，V/V)，流速1.5mL·min-1；柱温25℃；荧光激发波长260±1nm，发射波长380±1nm。
血浆样品预处理：
精密吸取200μL血浆置1.5mL离心管中，加含内标鸟苷酸的20％高氯酸溶液25μL，涡旋振荡30s，离心10min(12000×g，4℃)，取上清液40μL进样，内标法以峰面积定量。
专属性：
取不同来源的10名未服用ACV、GCV和PCV的受试者的空白血浆，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，未发现血浆内源性物质对上述测定组分有干扰。此外，常见合并用药、免疫抑制剂和非处方药(实施例1中所述药物)对测定没有干扰。内标鸟苷酸、ACV、GCV和PCV的保留时间分别为3.9、6.8、5.1和7.8min。
线性试验：
精密称取ACV、GCV和PCV标准物质适量，用50％甲醇溶解，稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含ACV 20、100、500、1000、1500、2000μg·L-1，GCV 20、100、500、1000、1500、2000μg·L-1和PCV 20、100、500、1000、1500、2000μg·L-1的标准血样。取血浆200μL，按”血浆样品预处理”方法操作。内标法以待测组分与内标的峰面积比(A)和待测组分浓度(C)作加权(1/C2)线性回归，三者的线性范围均为20～2000μg·L-1，最低定量限均为20μg·L-1，三者的标准曲线回归方程分别为：ACV A＝0.00121C-0.0033，r＝0.9995；GCVA＝0.00133 C-0.00071，r＝0.9997，r＝0.9997；PCVA＝0.00315 C-0.0087，r＝0.9991。
准确度和精密度：
精密称取ACV、GCV和PCV标准物质适量，50％甲醇溶解并稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，制成含ACV 40、800、1600μg·L-1，GCV 40、800、1600μg·L-1和PCV 40、800、1600μg·L-1的系列血样，各取血浆200μL，按”血浆样品预处理”方法操作，考察日内和日间的精密度和准确度。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差(RSD)，其中(C实测-C理论)/C理论×100％为偏差。结果表明三种药物的日内、日间精密和相对偏差均小于11％。
表2显示了三种药物的日内、日间精密度和准确度。
表1
| 理论浓度(μg·L-1) | 测定浓度(μg·L-1)(平均值±标准差) | 精密度RSD(％) | 准确度Bias(％) | |
| 阿昔洛韦 | 日内(n＝6)20408001600日间(n＝6)20408001600 | 19.60±1.0338.85±1.30850.65±8.611621.04±23.7319.60±1.4340.01±1.83867.39±21.001644.93±21.28 | 5.243.341.011.467.304.582.421.29 | -2.01-2.886.331.31-2.000.028.422.81 |
| 更昔洛韦 | 日内(n＝6)20408001600日间(n＝6)20408001600 | 21.32±1.0940.72±1.37858.93±6.481638.19±15.2020.34±1.1240.78±2.04868.80±10.141655.67±16.52 | 5.123.360.750.935.535.011.171.00 | 6.621.817.372.391.691.948.603.48 |
| 喷昔洛韦 | 日内(n＝6)20408001600日间(n＝6)20408001600 | 20.69±1.6541.36±1.07855.24±10.471622.64±20.4021.84±0.7742.10±0.50862.27±17.691638.75±28.35 | 7.992.581.221.263.541.192.051.73 | 3.433.406.911.429.205.257.782.42 |
表2
| 理论浓度(μg·L-1) | 测定浓度(μg·L-1)(平均值±标准差) | 精密度RSD(％) | 准确度Bias(％) | |
| 阿昔洛韦 | 日内(n＝6)20408001600日间(n＝6)20408001600 | 18.16±1.3342.04±2.00834.56±14.961579.04±26.2418.55±1.6638.97±2.60842.48±17.041648.48±30.08 | 6.675.011.871.648.286.512.131.88 | -9.215.114.32-1.31-7.26-2.575.313.03 |
| 更昔洛韦 | 日内(n＝6)20408001600日间(n＝6)20408001600 | 21.20±1.3141.28±2.16766.32±10.001654.56±36.9619.52±2.1541.30±2.22849.92±17.041637.92±15.68 | 6.535.411.252.3110.765.562.130.98 | 6.023.21-4.213.41-2.413.246.242.37 |
| 喷昔洛韦 | 日内(n＝6)20408001600日间(n＝6)20408001600 | 21.05±1.1738.93±1.47845.92±23.761634.08±37.4421.74±1.4842.14±0.99839.84±25.681621.60±33.76 | 5.873.682.972.347.382.473.212.11 | 5.27-2.685.742.138.715.364.981.35 |
Claims (3)
1.一种测定人血浆中抗病毒药物浓度的方法，其特征是待测样品预处理后，在酸性流动相下，经色谱柱分离后，用荧光检测器检测，包括以下步骤：
1)样品预处理
测定血浆浓度：取待测样品，加入7～20％高氯酸溶液，进行蛋白沉淀，离心后，取上清液进样；
2)样品分离
采用通用型的液相色谱柱，其填料为Dikma Diamonsil C18，高效液相系统采用通用型的荧光检测器以及高压泵，流动相为酸性，梯度洗脱；
3)荧光检测器检测
荧光激发波长260±1nm，发射波长380±1nm，测定峰面积，用标准曲线方程换算成浓度。
2.根据权利要求1所述的测定人血浆中抗病毒药物浓度的方法，其特征是所述的抗病毒药物是阿昔洛韦、更昔洛韦和喷昔洛韦。
3.根据权利要求1所述的测定人血浆中抗病毒药物浓度的方法，其特征是所述的步骤2)中色谱条件是，色谱柱采用Dikma Diamonsil C18：200mm×4.6mm，5μm；柱温：25℃，流动相为酸性流动相：0.08～0.1％三氟乙酸(TFA)-甲醇混合液，梯度洗脱：其条件为0～7min为0.08～0.1％TFA-甲醇96∶4，V/V，7.01～10.0min为0.08～0.1％TFA-甲醇40∶60，V/V，10.01～12.5min为0.08～0.1％TFA-甲醇96∶4，V/V。
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