CN100580448C

CN100580448C - 一种测定人血浆中苯妥英及其前体药物和代谢物的方法

Info

Publication number: CN100580448C
Application number: CN200710044799A
Authority: CN
Inventors: 马春来; 焦正; 赵倩华; 洪震
Original assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Current assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2007-08-10
Filing date: 2007-08-10
Publication date: 2010-01-13
Anticipated expiration: 2027-08-10
Also published as: CN101105479A

Abstract

本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种可同时测定人血浆中磷苯妥英、苯妥英及其主要代谢产物4′-羟苯妥英浓度的方法。本发明方法对待测样品经预处理后，待测样品预处理后，经酸性流动相在色谱柱分离，用紫外检测器检测。本发明方法样品取样少，操作简便，快速、灵敏，无需昂贵的设备和试剂，分析周期短，适合临床常规监测，对用以调整给药剂量，保证用药安全并有效，具有重要临实践意义。

Description

一种测定人血浆中苯妥英及其前体药物和代谢物的方法

技术领域

本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种测定人血浆中磷苯妥英、苯妥英及其代谢产物4′-羟苯妥英的方法。

背景技术

苯妥英(phenytoin，PHT)是治疗急性癫痫发作或癫痫持续状态的高效药物。因其水溶性差、和碱性强，使其使用价值受到影响。新近研究开发的非胃肠道给药的抗癫痫药物(antiepileptic drugs，AEDs)磷苯妥英(fosphenytoin，FOS)是PHT的磷酸酯前药。由于其高极性和适宜的pH，可以通过静脉滴注或肌肉注射给药。FOS本身没有明显的药理活性，给药后经血液和组织中的磷酸酯酶代谢为苯妥英后发挥抗癫痫作用。苯妥英主要通过4′-羟化代谢成4′-羟苯妥英(4′-hydroxyphenytoin，4′-HPPH)，进而生成葡萄糖醛酸化物排出体外。FOS对免疫学方法测定PHT有干扰，常使PHT测定值高于实际浓度。目前国内外尚未见关于同时测定人血浆中FOS、PHT和4′-HPPH的浓度的相关报道。因此研究开发高效、灵敏、准确的检测血浆中上述药物浓度的方法，对用以调整给药剂量，保证用药安全、有效具有重要临实践意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种简便、快速、灵敏、可同时测定体内磷苯妥英(fosphenytoin，FOS)、苯妥英(phenytoin，PHT)和4′-羟苯妥英(4′-hydroxyphenytoin，4′-HPPH)血药浓度的方法。

本方法无需昂贵的设备和试剂，具有操作简便、快速、血浆用量少、成本低等优点，适合常规血药浓度监测。

本方法的技术方案是：待测样品预处理后，经酸性流动相在色谱柱分离，用紫外检测器检测。

包括下述步骤：

1)样品预处理

取待测样品，经磷酸酸化后，加入定量的有机溶媒进行萃取、离心后，取上层有机层溶液氮气吹干、流动相复溶，取上清液进样；

所述的磷酸酸化溶液为20～-40％磷酸溶液，所述的有机溶媒为乙酸乙酯溶液；

2)样品分离

采用通用型的液相色谱柱，其填料为Agilent RX-C₈，高效液相系统采用通用型紫外检测器以及高压泵，流动相为酸性，等度洗脱；

所述的流动相采用0.08～0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液(pH＝2.1～2.5)、乙腈和甲醇的混合液；

所述的等度洗脱模式优选0.08～0.1％TFA水溶液∶乙腈∶甲醇为60∶17∶23，V/V/V；

3)样品检测

采用通用型紫外检测器检测FOS、PHT和4′-HPPH的峰面积，紫外检测波长为210±1nm，用标准曲线方程换算成浓度。

本方法具有以下优点：

1.采样量少：测定一份样品只需0.1ml血浆样本；

2.预处理简便：一步乙酸乙酯萃取，简便易行，适用于常规检测；

3.选择性强：内源性物质、常用抗癫痫药物和非处方药物对测定不干扰；

4.测定时间短：整个色谱分析测定过程仅为12min。

所述FOS、PHT和4′-HPPH测定的线性范围分别为1～400、0.5～50和0.5～10mg·L^-1，方法回收率均在100±12％，日内和日间的精密度(相对标准差，RSD)均小于11％。

本发明方法快速准确、操作简便、成本低，适合临床常规监测，对用以调整给药剂量，保证用药安全并有效，具有重要临实践意义。

附图说明

图1：空白血浆色谱图

图2：静脉注射磷苯妥英18mg/kg受试者0.5h的色谱图，

其中，1：4′-羟苯妥英(浓度为2.87mg·L^-1)；2：磷苯妥英(浓度为44.8mg·L^-1)；

3：内标(盐酸普萘洛尔)；4：苯妥英(浓度为16.2mg·L^-1)。

图3：静脉注射磷苯妥英16mg/kg受试者0.5h的色谱图，

其中，1：4′-羟苯妥英(浓度为3.23mg·L^-1)；2：磷苯妥英(浓度为39.8mg·L^-1)；

3：内标(盐酸普萘洛尔)；4：苯妥英(浓度为18.7mg·L^-1)。

具体实施方式

实施例1：

色谱条件

HPLC系统：色谱柱Agilent RX-C₈(250mm×4.6mm，5μm)，流动相采用0.08％TFA水溶液-乙腈-甲醇(60∶17∶23，V/V/V)，流速：1.5mL·min^-1；柱温：40℃；紫外检测波长：210±1nm。

血浆样品预处理

精密吸取血浆样品100μL置1.5mL离心管中，加入50μL 20％磷酸酸化，涡旋0.5min，加入1mL含10mg·L^-1盐酸普萘洛尔的乙酸乙酯溶液萃取，涡旋5min，离心(15,000×g，4℃)10min，取上层提取液800μL，转移到5mL离心管中，置于40℃水浴中，氮气吹干，加入流动相100μL，取上清液20μL进样分析，内标法以峰面积定量。

专属性

取不同来源的10名未服用磷苯妥英、苯妥英和4′-羟苯妥英的受试者的空白血浆，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，未发现血浆内源性物质对上述测定组分有干扰，(见图1)。此外，常见合并用药丙戊酸、苯巴比妥、卡马西平、多虑平、硝基安定、安定、氯硝安定、氟哌啶醇、甲硝唑、对乙酰氨基酚、硝苯地平、布洛芬、阿昔洛韦等对测定没有干扰。内标普萘洛尔、磷苯妥英、苯妥英和4′-羟苯妥英的典型色谱保留时间分别为9.1、5.4、10.7和4.6min，峰形良好，分离完全。整个色谱分析过程时间为12min。

线性试验

精密称取FOS、PHT和4′-HPPH标准物质适量，用50％甲醇溶解，稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含FOS 1，10，100，200，300、400mg·L^-1，PHT 0.5，2.5，12.5，25，37.5，50mg·L^-1和4′-HPPH 0.5，1.25，2.5，5.0，7.5，10.0mg·L^-1的标准血样。取血浆100μL，按“血浆样品预处理”方法操作。内标法以待测组分与内标的峰面积比(A)和待测组分浓度(C)作加权(1/C)线性回归，FOS、PHT和4′-HPPH线性范围分别为1～400、0.5～50和0.5～10mg·L^-1，FOS、PHT和4′-HPPT的最低定量限为1.0、0.5和0.5mg·L^-1，三者的标准曲线回归方程分别为：FOS A＝0.02241C-0.01326，r＝0.9991；PHTA＝0.03397C-0.00298，r＝0.9994；HPPT A＝0.04400C+0.00083，r＝0.9992。

准确度和精密度

精密称取FOS、PHT和4′-HPPH标准物质适量，50％甲醇溶解并稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含FOS 2.5，180，360mg·L^-1，PHT 1，20，40mg·L^-1和4′-HPPT 1.0，4.0，8.0mg·L^-1的系列血样，各取血浆100μL，按“血浆样品预处理”方法操作，考察日内和日间的精密度和准确度。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差(RSD)，其中(C_实测-C_理论)/C_理论×100％为偏差，标准差/平均值×100％为相对标准差。结果表明，三种待测物的日内和日间精密度均小于11.6％，偏差小于10.8％。

表1显示了FOS、PHT和4′-HPPH的日内、日间精密度和准确度。

本方法用于静脉注射磷苯妥英的受试者检测，同时测定磷苯妥英、苯妥英及其代谢产物4′-羟苯妥英的浓度，图2为某受试者的分析色谱图，三者浓度分别为44.8、16.2和2.87mg·L^-1。

实施例2：

色谱条件

HPLC系统：色谱柱Agilent RX-C₈(250mm×4.6mm，5μm)，流动相采用0.1％TFA水溶液-乙腈-甲醇(60∶17∶23，V/V)，流速：1.5mL·min^-1；柱温：40℃；紫外检测波长：210±1nm；进样量：20μL。

血浆样品预处理

精密吸取血浆样品100μL置5mL离心管中，加入25μL40％磷酸酸化，涡旋0.5min，加入2mL含10mg·L^-1盐酸普萘洛尔的乙酸乙酯溶液萃取，涡旋5min，离心15,000×g，4℃)10min，取上层提取液1.8mL，转移到5mL离心管中，置于40℃水浴中，氮气吹于，加入流动相100μL混旋复溶，取上清液20μL进样分析，内标法以峰面积定量。

专属性

取不同来源的10名未服用磷苯妥英、苯妥英和4′-羟苯妥英的受试者的空白血浆，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，未发现血浆内源性物质对上述测定组分有干扰。此外，常见合并用药和非处方药(同实施例1中所列药物)对测定没有干扰。内标普萘洛尔、磷苯妥英、苯妥英和4′-羟苯妥英的典型色谱保留时间分别为9.1、5.4、10.8和4.6min，峰形良好，分离完全。整个色谱分析过程时间为12min。

线性试验

精密称取FOS、PHT和4′-HPPH标准物质适量，用50％甲醇溶解，稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含FOS 1，10，100，200，300，400mg·L^-1，PHT 0.5，2.5，12.5，25，37.5，50mg·L^-1和4′-HPPH 0.5，1.25，2.5，5.0，7.5，10.0mg·L^-1的标准血样。取血浆100μL，按“血浆样品预处理”方法操作。内标法以待测组分与内标的峰面积比(A)和待测组分浓度(C)作加权(1/C)线性回归，FOS、PHT和4′-HPPH线性范围分别为1～400、0.5～50和0.5～10mg·L^-1，FOS、PHT和4′-HPPT的最低定量限为1.0、0.5和0.5mg·L^-1，三者的标准曲线回归方程分别为：FOSA＝0.01926C-0.01427，r＝0.9993；PHTA＝0.04523C-0.00135，r＝0.9995；HPPTA＝0.03568C+0.00079，r＝0.9995。

准确度和精密度

精密称取FOS、PHT和4′-HPPH标准物质适量，50％甲醇溶解并稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含FOS 2.5，180，360mg·L^-1，PHT 1，20，40mg·L^-1和4′-HPPT 1，4.0，8.0mg·L^-1的系列血样，各取血浆100μL，按“血浆样品预处理”方法操作，考察日内和日间的精密度和准确度。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差(RSD)，其中(C_实测-C_理论)/C_理论×100％为偏差，标准差/平均值×100％为相对标准差。结果表明，三种待测物的日内和日间精密度均小于8％，相对偏差小于9％。

表2显示了FOS、PHT和4′-HPPH的日内、日间精密度和准确度。

本方法用于静脉注射磷苯妥英的受试者，同时测定磷苯妥英、苯妥英及其代谢产物4′-羟苯妥英的浓度，图3为某受试者的分析色谱图，三者浓度分别为39.8、18.7和3.23mg·L^-1。

表1

表2

Claims

1、一种测定人血浆中苯妥英及其前体药物和代谢物的方法，其特征是待测样品预处理后，经色谱柱分离后，用紫外检测器检测，包括以下步骤：

1)样品预处理

所述的磷酸酸化溶液为20～40％磷酸溶液，所述的有机溶媒为乙酸乙酯溶液；

2)样品分离

高效液相系统采用通用型紫外检测器以及高压泵，采用通用型的液相色谱柱，其填料为Agilent RX-C₈ 250mm×4.6mm，5μm；流动相为酸性，等度洗脱；所述的流动相采用0.08～0.1％三氟乙酸(TFA)水溶液pH＝2.1～2.5、乙腈和甲醇的混合液；流速：1.5mL·min^-1；柱温：40℃；

所述的等度洗脱模式为0.08～0.1％ TFA水溶液∶乙腈∶甲醇为60∶17∶23，V/V/V；

3)样品检测

采用通用型紫外检测器检测苯妥英及其前体药物和代谢物的峰面积，紫外检测波长为210±1nm，用标准曲线方程换算成浓度；

所述的苯妥英其前体药物是磷苯妥英；苯妥英其代谢物是4′-羟苯妥英。