CN101393196B

CN101393196B - 一种同时测定人血浆中多种局部麻醉药物浓度的方法

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Publication number: CN101393196B
Application number: CN2008102013814A
Authority: CN
Inventors: 覃韦苇; 焦正; 钟明康; 施孝金; 李中东; 崔学艳
Original assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Current assignee: Huashan Hospital of Fudan University
Priority date: 2008-10-17
Filing date: 2008-10-17
Publication date: 2013-06-05
Anticipated expiration: 2028-10-17
Also published as: CN101393196A

Abstract

本发明属医学检验领域，涉及一种可同时测定人血浆中多种局部麻醉药物浓度的方法。本方法采用血浆胆碱酯酶抑制剂抑制在3℃以下冰浴条件抑制血浆胆碱酯酶活性，控制丁卡因水解，保证了方法的准确度；利用利多卡因、罗哌卡因和布比卡因，普鲁卡因和丁卡因分别在在210和290nm下有较强紫外吸收的特征，经酸性流动相在色谱柱分离后，用紫外双波长法检测，该法能使上述局部麻醉药物同时测定的灵敏度大为提高。本法样品取样少，预处理简单、快速、灵敏，无需昂贵的设备和试剂，分析周期短，成本低，适合多种药物临床常规血药浓度的监测。

Description

一种同时测定人血浆中多种局部麻醉药物浓度的方法

技术领域

本发明属医学检验领域，涉及体内药物的分析测定方法，具体涉及一种同时测定人血浆中多种局部麻醉药物浓度的方法。

背景技术

普鲁卡因(PRO)、利多卡因(LID)、罗哌卡因(ROP)、丁卡因(TET)和布比卡因(BUP)是目前临床上常用的局部麻醉药物。其中ROP与BUP属于起效慢但作用时间长的长效局部麻醉药物，而PRO、TET、LID属于起效快但作用时间短的短效局部麻醉药物。临床上常合并使用长效和短效局部麻醉药物以便于手术顺利实施。PRO、LID、ROP、TET和BUP五种药物的药动学个体间差异大、合并用药普遍、肝肾功能异常会导致药物血浆浓度和药效变化，以及药动学特性与药物的中枢神经系统毒性和心脏毒性直接相关，因此通过检测血浆中上述药物的浓度来调整给药剂量，对保证用药的安全和有效有重要意义。

TET易被血浆中胆碱酯酶水解，提高TET在分析过程中的稳定性是保证其血浆浓度测定方法准确度的关键，也是建立同时测定人血浆中PRO、LID、ROP、TET和BUP五种局部麻醉药物浓度的分析方法的关键。迄今，国内外未见同时测定上述五种药物的相关分析方法的文献报道。

发明内容

本发明的目的是克服已有技术的缺陷，提供一种测定人血浆中多种局部麻醉药物浓度的方法。尤其涉及一种简便、快速、灵敏、可同时测定人体普鲁卡因(PRO)、利多卡因(LID)、罗哌卡因(ROP)、丁卡因(TET)和布比卡因(BUP)血药浓度的方法。

本方法无需昂贵的设备和试剂，具有操作简便、快速、血浆用量少、成本低等优点，适合常规血药浓度监测。

本方法通过下述技术方案实现：待测样品预处理后，经酸性流动相在色谱柱分离，用紫外检测器检测。

本方法包括下述步骤：

1)样品预处理

取待测样品，加入血浆胆碱酯酶抑制剂新斯的明抑制样品水解，经氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液碱化，加入定量的有机溶媒，上述操作均在3℃以下冰浴条件下进行；进行常温萃取、离心后，取上层有机溶液氮气吹干、流动相复溶，取上清液进样；

所述的新斯的明溶液为0.5~2mg/mL，氢氧化钠或氢氧化钾溶液为0.5~2mol/L，所述的有机溶媒优选乙醚溶液；

2)样品分离

采用通用型的液相色谱柱，其填料为Kromasil C₁₈，高效液相系统采用通用型高压泵和进样器，采用30mmol/L的磷酸二氢钾水溶液(含0.14~0.18％三乙胺溶液，磷酸溶液调pH＝4.8~5.1)和乙腈的混合液作为流动相，等度洗脱；所述的磷酸二氢钾水溶液：乙腈为63±2：37±2，优选磷酸二氢钾水溶液：乙腈为63：37，V/V；

3)样品检测

采用通用型紫外检测器210±1nm检测LID、ROP和BUP的峰面积，290±1nm检测PRO和TET的峰面积，用标准曲线方程换算成浓度。

本方法具有以下优点：

1.同时测定：只需一种方法即可测定人血浆中PRO、LID、ROP、TET和BUP浓度，降低了分析成本，简化了分析步骤，减少了血浆采集量，大大提高了以上五种药物临床血药浓度检测的效率。

2.采样量少：测定一份样品只需0.5ml血浆样本；

3.预处理简便：样品碱化后乙醚萃取，简便易行，适用于常规检测；

4.灵敏度高：通过双波长检测，明显提高同时测定的检测灵敏度，PRO、LID、ROP、TET和BUP的最低定量限均为0.05μg/mL；

5.选择性强：内源性物质、常用麻醉和镇痛药物以及常用抗生素药物等对测定不干扰。

6.测定时间短：整个色谱分析测定过程为13min。

本发明方法快速准确、操作简便、灵敏度高、成本低，适合临床常规监测。所述PRO、LID、ROP、TET和BUP测定的线性良好，浓度范围均为0.05～5μg/mL，方法回收率稳定，日内和日间的精密度(相对标准差，RSD)均小于12％。

附图说明

图1：典型色谱图：未服用PRO、LID、ROP、TET和BUP受试者的空白血浆，其中，A:210nm；B：290nm。

图2：典型色谱图：空白血浆添加PRO、LID、ROP、TET和BUP标准品(PRO、LID、ROP、TET和BUP的浓度均为0.05μg/mL)其中，A:210nm；B：290nm。

图3：使用PRO和BUP受试者的色谱图，其中，A:210nm；B：290nm。

图4：使用TET和ROP受试者的色谱图，其中，A:210nm；B：290nm。

图5：使用LID和ROP受试者的色谱图，其中，A:210nm；B：290nm，其中，1：LID，2：ROP，3：BUP，4：PRO，5：TET，6：内标(卡马西平)。

具体实施方式

实施例1

色谱条件

Waters2690HPLC系统，Waters2487双波长紫外检测器，Millennium32色谱工作站(Version4.0)；色谱柱：KromasilC₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：40℃；流动相：30mmol/L磷酸二氢钾水溶液(含0.14％三乙胺溶液，磷酸溶液调pH＝4.8)：乙腈(61：39，V/V)；流速1.0mL·min^-1；210nm测定LID、ROP和BUP的浓度，290nm测定PRO和TET的浓度。

血浆样品预处理

取0.5mL血样分别加入0.5mg/mL新斯的明溶液50μl、5μg/mL内标溶液100μl和0.5mol/L KaOH溶液100μL，涡旋10Sec，混匀，加入乙醚3mL，上述操作均在3℃以下冰浴条件下进行；涡旋2min，2500g×8min离心，取上清液2.5mL于另一试管中，40℃氮气流吹干，残留物加入100μL50％甲醇/水溶解，涡旋10Sec，12000g×8min离心，分取上清液30μL进行，内标法以峰面积定量。

专属性

取不同来源的10名未服用PRO、LID、ROP、TET和BUP的受试者的空白血浆，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，未发现血浆内源性物质对上述测定组分有干扰。此外，常见合并用药地西泮、咪唑安定、芬太尼、曲马多、吲哚美辛、阿司匹林、对乙酰氨基酚、头孢唑啉、头孢替安、头孢呋辛钠、更昔洛韦、喷昔洛韦、利巴韦林、阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔等对测定没有干扰。PRO、LID、ROP、TET、BUP和内标的典型色谱保留时间分别为3.5、5.6、6.3、8.1、9.0、11.1min，整个色谱分析过程时间为13min。

线性试验

精密称取PRO、LID、ROP、TET和BUP标准物质适量，用50％甲醇溶解，稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含PRO、LID、ROP、TET和BUP血浆浓度分别为0.05，0.1，0.25，1，2.5和5μg/mL的标准血样。取血浆0.5mL，按“血浆样品预处理”方法操作。内标法以待测组分与内标的峰面积比(A)和待测组分浓度(C)作加权(1/C)线性回归，线性范围均为0.05～5μg/mL，最低定量限均为0.05μg/mL，PRO、LID、ROP、TET和BUP的标准曲线回归方程分别为：PRO A＝1.23C+0.0515，r＝0.9993；LID A＝0.318C-0.00252，r＝0.9982；ROP A＝0.401C-0.0130，r＝0.9996；TET A＝0.838C-0.0104，r＝0.9998；BUP A＝0.342C-0.0107，r＝0.9998。

准确度和精密度

精密称取PRO、LID、ROP、TET和BUP标准物质适量，50％甲醇溶解并稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含PRO、LID、ROP、TET和BUP血浆浓度分别为0.15，2和4μg/mL的系列血样，各取血浆0.5mL，按“血浆样品预处理”方法操作，考察日内和日间的精密度和准确度。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差(RSD)，其中(C_实测-C_理论)/C_理论×100％为偏差，结果表明三种待测物的日内和日间精密度均小于12％，相对偏差小于12％。

本方法测定同时使用PRO和BUP受试者，某受试者的分析色谱图显示：二者浓度分别为2.16和1.83μg/mL(图3)。

表1显示了PRO、LID、ROP、TET和BUP的日内、日间精密度和准确度。

表1

实施例2

色谱条件

Waters2690HPLC系统，Waters2487双波长紫外检测器，Millennium32色谱工作站(Version4.0)；色谱柱：Kromasil C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：40℃；流动相：30mmol/L磷酸二氢钾水溶液(含0.18％三乙胺溶液，磷酸溶液调pH＝5.1)：乙腈(65：35，V/V)；流速1.0mL·min^-1；210nm测定LID、ROP和BUP的浓度，290nm测定PRO和TET的浓度。

血浆样品预处理

取0.5mL血样分别加入2mg/mL新斯的明溶液50μl、5μg/mL内标溶液100μl和2mol/L NaOH溶液100μL，涡旋8Sec，混匀，加入乙醚3mL，上述操作均在3℃以下冰浴条件下进行；涡旋2min，2500g×10min离心，取上清液2.5mL于另一试管中，40℃氮气流吹干，残留物加入100μL50％甲醇/水溶解，涡旋10Sec，10000g×10min离心，分取上清液30μL进行，内标法以峰面积定量。

取不同来源的10名未服用PRO、LID、ROP、TET和BUP的受试者的空白血浆，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，未发现血浆内源性物质对上述测定组分有干扰。此外，常见合并用药地西泮、咪唑安定、芬太尼、曲马多、吲哚美辛、阿司匹林、对乙酰氨基酚、头孢唑啉、头孢替安、头孢呋辛钠、更昔洛韦、喷昔洛韦、利巴韦林、阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔等对测定没有干扰。PRO、LID、ROP、TET、BUP和内标的典型色谱保留时间分别为3.7、5.6、6.5、8.7、9.4、12.0min，整个色谱分析过程时间为13min。

线性试验

精密称取PRO、LID、ROP、TET和BUP标准物质适量，用50％甲醇溶解，稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含PRO、LID、ROP、TET和BUP血浆浓度分别为0.05，0.1，0.25，1，2.5和5μg/mL的标准血样。取血浆0.5mL，按“血浆样品预处理”方法操作。内标法以待测组分与内标的峰面积比(A)和待测组分浓度(C)作加权(1/C)线性回归，线性范围均为0.05～5μg/mL，最低定量限均为0.05μg/mL，PRO、LID、ROP、TET和BUP的标准曲线回归方程分别为：PROA＝1.17C+0.0384，r＝0.9996；LIDA＝0.291C-0.00151，r＝0.9991；ROPA＝0.393C+0.00027，r＝0.9993；TETA＝0.820C-0.0108，r＝0.9996；BUPA＝0.344C-0.00328，r＝0.9995。

准确度和精密度

精密称取PRO、LID、ROP、TET和BUP标准物质适量，50％甲醇溶解并稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含PRO、LID、ROP、TET和BUP血浆浓度分别为0.15，2和4μg/mL的系列血样，各取血浆0.5mL，按“血浆样品预处理”方法操作，考察日内和日间的精密度和准确度。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差(RSD)，其中(C_实测-C_理论)/C_理论×100％为偏差。结果表明三种待测物的日内和日间精密度均小于9％，相对偏差小于10％。

本方法测定受试者血浆，使用TET和ROP的受试者的分析色谱图显示：二者浓度分别为1.25和1.28μg/mL(图4)。

表2显示了PRO、LID、ROP、TET和BUP的日内、日间精密度和准确度。

表2

实施例3

色谱条件

Waters2690HPLC系统，Waters2487双波长紫外检测器，Millennium32色谱工作站(Version4.0)；色谱柱：Kromasil C₁₈(250mm×4.6mm，5μm)；柱温：40℃；流动相：30mmol/L磷酸二氢钾水溶液(含0.16％三乙胺溶液，磷酸溶液调pH＝4.9)：乙腈(63：37，V/V)；流速1.0mL·min^-1；210nm测定LID、ROP和BUP的浓度，290nm测定PRO和TET的浓度。

血浆样品预处理

取0.5mL血样分别加入1mg/mL新斯的明溶液50μl、5μg/mL内标溶液100μl和1mol/L NaOH溶液100μL，涡旋12Sec，混匀，加入乙醚3mL，上述操作均在3℃以下冰浴条件下进行；涡旋2min，3000g×9min离心，取上清液2.5mL于另一试管中，40℃氮气流吹干，残留物加入100μL50％甲醇/水溶解，涡旋10Sec，11000g×9min离心，分取上清液30μL进行，内标法以峰面积定量。

取不同来源的10名未服用PRO、LID、ROP、TET和BUP的受试者的空白血浆，按照上述样品预处理和测定方法进行测定，未发现血浆内源性物质对上述测定组分有干扰。此外，常见合并用药地西泮、咪唑安定、芬太尼、曲马多、吲哚美辛、阿司匹林、对乙酰氨基酚、头孢唑啉、头孢替安、头孢呋辛钠、更昔洛韦、喷昔洛韦、利巴韦林、阿替洛尔、美托洛尔、普萘洛尔等对测定没有干扰。PRO、LID、ROP、TET、BUP和内标的典型色谱保留时间分别为3.6、5.4、6.4、8.1、8.8、11.6min，整个色谱分析过程时间为13min。

线性试验

精密称取PRO、LID、ROP、TET和BUP标准物质适量，用50％甲醇溶解，稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含PRO、LID、ROP、TET和BUP血浆浓度分别为0.05，0.1，0.25，1，2.5和5μg/mL的标准血样。取血浆0.5mL，按“血浆样品预处理”方法操作。内标法以待测组分与内标的峰面积比(A)和待测组分浓度(C)作加权(1/C)线性回归，线性范围均为0.05～5μg/mL，最低定量限均为0.05μg/mL，PRO、LID、ROP、TET和BUP的标准曲线回归方程分别为：PROA＝1.18C+0.0323，r＝0.9998；LID A＝0.294C-0.000778，r＝0.9996；ROPA＝0.410C-0.00161，r＝0.9992；TET A＝0.838C-0.0103，r＝0.9997；BUP A＝0.353C-0.00093，r＝0.9992。

准确度和精密度

精密称取PRO、LID、ROP、TET和BUP标准物质适量，50％甲醇溶解并稀释成系列工作液，再加入适量空白人血浆，配制成含PRO、LID、ROP、TET和BUP血浆浓度分别为0.15，2和4μg/mL的系列血样，各取血浆0.5mL，按“血浆样品预处理”方法操作，考察日内和日间的精密度和准确度。根据线性回归方程计算其实测浓度，计算每种浓度的实测平均值、偏差和相对标准差(RSD)，其中(C_实测-C_理论)/C_理论×100％为偏差。结果表明三种待测物的日内和日间精密度均小于8％，相对偏差小于9％。

本方法测定受试者血浆，使用LID和ROP的受试者的分析色谱图显示：二者浓度分别为0.94和1.18μg/mL(图5)。

表3显示了PRO、LID、ROP、TET和BUP的日内、日间精密度和准确度。

表3

Claims

1.一种非诊断和治疗目的的同时测定人血浆中多种局部麻醉药物浓度的方法，其特征是待测样品预处理后，在酸性流动相下，经色谱柱分离后，用紫外检测器检测，包括以下步骤：

1）样品预处理

取待测样品，在3℃以下冰浴条件下，加入血浆胆碱酯酶抑制剂抑制样品水解，经浓度为0.5～2mol/L的氢氧化钠或氢氧化钾碱化，加入定量的乙醚溶液；常温萃取、离心后，取上层有机溶液氮气吹干、流动相复溶，取上清液进样；

所述的血浆胆碱酯酶抑制剂为新斯的明溶液，浓度为0.5～2mg/mL；

所述的局部麻醉药物是普鲁卡因、利多卡因、罗哌卡因、丁卡因和布比卡因；

2）样品分离

采用通用型的液相色谱柱，其填料为Kromasil C18，250mm×4.6mm，5μm，柱温：40℃；高效液相系统采用通用型高压泵和进样器，采用30mmol/L的磷酸二氢钾水溶液和乙腈的混合液作为流动相，等度洗脱；所述的磷酸二氢钾水溶液含0.14～0.18%三乙胺溶液，磷酸溶液调pH=4.8～5.1；所述的磷酸二氢钾水溶液∶乙腈为63∶37，V/V；

3）双波长检测样品

采用通用型紫外检测器：波长210±1nm检测LID、ROP和BUP的峰面积，波长290±1nm检测PRO和TET的峰面积，用标准曲线方程换算成浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征是所述的新斯的明在3℃以下冰浴条件下抑制血浆胆碱酯酶活性，控制丁卡因水解。