CN102072942B - 一种离子对色谱法测定吡咯并喹呤醌含量的分析方法 - Google Patents

Abstract

一种离子对色谱法测定吡咯并喹呤醌含量的分析方法，属于色谱分析技术领域。本发明采用离子对高效液相色谱法对合成或发酵生产的PQQ进行定量分析，所得回归方程为y=4E+06x+627846，R²=0.9995，在2～12μg/mL试验范围内呈线性，最小检出量为2.0ng（S/N≥3）。本发明方法简单，制备过程中有可能产生的杂质得到了有效的分离。

Description

一种离子对色谱法测定吡咯并喹呤醌含量的分析方法

技术领域

一种离子对色谱法测定吡咯并喹呤醌含量的分析方法，属于色谱分析技术领域。

背景技术

吡咯并喹呤醌（pyrroloquinoline quinine PQQ）是一种新的氧化还原酶辅基，其分子量为330，主要分布于原核生物以及部分植物和哺乳动物之中，在牛奶尤其母乳中含量较高。其化学结构中邻位的醌和三个羧基是其重要的功能基团（结构式如下所示）。其作为电子的受体或供体参与酶催化的氧化还原过程，并能影响呼吸链功能与体内自由基水平，被认为是体内必需的维生素之一。具有促进动植物和微生物细胞的生长、促进神经细胞和生长因子合成、降解乙醇防治肝损伤、调解机体自由基水平、保护脑功能、提高毒性和辐射耐受性等多种生理功能。最新研究报道（Mol Neurodegener，2010）PQQ对β淀粉斑块、α-突触核蛋白C端变异引起的毒性具有较强的抑制作用，有望成为帕金森病的强有力的候选治疗药物，具有广泛的开发应用前景。PQQ的制备方法有化学合成法和生物合成法，化学合成法步骤多，产率低；生物合成法大多用细菌发酵；而且其化合物本身具有较活泼的活性基团，容易与各类化合物发生反应，因此，要得到高纯度的药用级的产品，必须采用有效的分析手段，确保产品质量。

PQQ结构式

PQQ的分析方法有气-质联用、免疫法、毛细管电泳法、重组酶法。这些分析方法均需要特殊仪器，而且成本较高，不易于推广应用。较常用的高效液相色谱法，文献报道采用甲醇-水或乙腈-水（0.1%三氟乙酸）梯度洗脱，不能将其中的杂质有效地加以分离，而且PQQ峰拖尾，保留时间16min左右（微生物学报，2007）。本法采用离子对高效液相色谱法对合成和发酵生产的PQQ进行定量分析，方法简单，制备过程中有可能产生的杂质得到了有效的分离。

发明内容

本发明的目的是提供一种离子对色谱法测定吡咯并喹呤醌含量的分析方法。

本发明的技术方案：一种离子对色谱法测定吡咯并喹呤醌PQQ含量的分析方法：

仪器：WATERS 600型高效液相色谱仪，WATERS 2487紫外检测器，色谱柱Amethyst C18-P（5μm, 4.6×250mm）；

流动相：30%-35%乙腈+70%-65%缓冲液，所述缓冲液为pH2.8、含10mM的四丁基溴化铵TABA的20mM磷酸二氢钾溶液；使用前经0.45μm有机滤膜抽滤并脱气，流速：1.0mL/min；样品进样体积：5μL；柱温：室温；检测波长：256nm；

精密称取干燥恒重的PQQ对照品，用二甲亚砜DMSO溶解配制成含PQQ 1.0mg/mL的溶液，记为W_对照，作为对照溶液；精密称取被测样品，用DMSO配制成浓度为1.0mg/mL的溶液，记为W_样品，作为供试品溶液；测定所得峰面积分别为S_对照、S_样品，按外标法计算被测样品中PQQ的含量为：（S_样品/S_对照）×（W_对照/W_样品）×100%，最小检出量为2.0ng，S/N≥3。

本发明的有益效果：本发明采用离子对高效液相色谱法对合成或发酵生产的PQQ进行定量分析，所得回归方程为y = 4E+06x + 627846, R² = 0.9995，R为线性回归方程的相关参数，在2～12μg/mL试验范围内呈线性，最小检出量为2.0ng（S/N≥3）。本发明方法简单，制备过程中有可能产生的杂质得到了有效的分离。

附图说明

图1溶剂和检测波长的选择色谱图。

图2 pH值对保留时间的影响。

图3不同离子对的选择的色谱图。

图4线性关系与检测限测定图。

具体实施方式

色谱条件优化

1、溶剂和检测波长的选择

用甲醇、乙腈、氯仿、乙酸乙酯、二甲亚砜（DMSO）等溶剂溶解，并进行光谱扫描，在乙腈、氯仿、乙酸乙酯等溶剂中，PQQ没有明显的紫外特征吸收峰；在甲醇溶剂中，PQQ在210nm、248nm、365nm处有三个特征吸收峰，在DMSO溶剂中，PQQ在256nm、322nm处有两个明显的特征吸收峰，而且响应值是在甲醇中的2.1倍。选择DMSO作溶剂，选择较高响应值的256nm作为检测波长。

2、流动相的选择

缓冲液为：pH2.8、含10mM的四丁基溴化铵TABA的20mM磷酸二氢钾溶液。

流动相不加离子对，任何比例的乙腈与缓冲液作流动相，保留时间为2.5min左右，峰均发生分叉；乙腈-水体系加离子对不加缓冲液，峰面积较小；乙腈与缓冲液比值30/70~35/65时主峰与杂质分离较好。

3、pH值的影响

在乙腈与缓冲液比值为35/65时，峰对称性较好，主峰与各杂质峰分离较好，能分出4个很小的杂质峰。改变pH值，对色谱峰的保留时间有较大的影响，随着pH值下降，保留时间减小，但峰型也变宽，选择pH2.5~3.0，主峰的保留时间和峰型较合适。

4、色谱柱的选择

分别选择不同基质键合的C18柱（Lichrospher C18、HypersilC18、SepaxHP-C18、AmethystC18-P、Amethyst C18-H 等）试验。与AmethystC18-P柱相比，Amethyst C18-H保留时间稍大，峰较宽。SepaxHP-C18柱的杂质分离比AmethystC18-P柱差很多，HypersilC18保留时间超过10分钟，而且峰很宽，与杂质峰不能有效分离。

5、不同离子对的选择

分别用三乙基戊烷磷酸铵（Q5）、四丁基磷酸铵/四丁基磷酸氢二铵(TABP)、四丁基溴化铵(TABA)、十二烷基硫酸钠（SDS）等不同离子对试剂进行试验，其中Q5峰分叉，tr仅2分钟左右；SDS出现单峰，tr仅1.3分钟；TABP对PQQ的响应值不如TABA。因此，选择TABA作为离子对，能够有效的定量分析PQQ的含量。色谱图见图3。

6、线性关系与检测限测定

精确称取一定量的对照品PQQ适量，用二甲亚砜溶解成1.0mg/mL，稀释成2、4、6、8、10、12μg/mL，分别进样5μL，用积分面积对样品量作图。所得回归方程为y = 4E+06x + 627846, R² = 0.9995。在2～12μg/mL试验范围内呈线性。标准曲线见图4。最小检出量为2.0ng（S/N≥3）。

7、重复性和精确度的测定

在确定的色谱条件下于同一天内连续进样6次测定，根据峰面积计算所得相对标准偏差约为3.7%(n=5)，保留时间的相对标准偏差约为0.66% （n=5）。

8、样品定量分析

取干燥恒重的对照品PQQ适量，精密称定，用DMSO配制成含PQQ1.0mg/mL的溶液，计为W_对照，作为对照溶液。另称取样品适量，用DMSO配制成含被测PQQ样品1.0mg/mL（W_样品）的溶液作为供试品溶液。按上述色谱条件下分别取5μL注入色谱仪，进行测定，所得峰面积分别为S_对照、S_样品，按外标法计算样品中PQQ的含量为：（S_样品/S_对照）×（W_对照/W_样品）×100%。

表2样品测定结果（n=3）

Claims (1)

1.一种离子对色谱法测定吡咯并喹呤醌PQQ含量的分析方法，其特征在于：

仪器：WATERS 600型高效液相色谱仪，WATERS 2487紫外检测器，色谱柱Amethyst C18-P  5μm，4.6×250mm；

流动相：30%-35%乙腈+70%-65%缓冲液，所述缓冲液为pH2.8、含10mM的四丁基溴化铵TABA的20mM磷酸二氢钾溶液；使用前经0.45μm有机滤膜抽滤并脱气，流速：1.0mL/min；样品进样体积：5μL；柱温：室温；检测波长：256nm；

精密称取干燥恒重的PQQ对照品，用二甲亚砜DMSO溶解配制成含PQQ 1.0mg/mL的溶液，记为W_对照，作为对照溶液；精密称取被测样品，用DMSO配制成浓度为1.0mg/mL的溶液，记为W_样品，作为供试品溶液；测定所得峰面积分别为S_对照、S_样品，按外标法计算被测样品中PQQ的含量为：（S_样品/S_对照）×（W_对照/W_样品）×100%，最小检出量为2.0ng，S/N≥3。

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