CN105004831A

CN105004831A - 高效液相色谱法测定金霉素预混剂含量及相关物质的方法

Info

Publication number: CN105004831A
Application number: CN201510431875.1A
Authority: CN
Inventors: 谢昌贤; 秦定宇; 刘运添; 云喜报; 金玲玲; 杨晓亚; 樊二改; 王鹏飞
Original assignee: JINHE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Current assignee: JINHE BIOTECHNOLOGY CO Ltd
Priority date: 2015-07-21
Filing date: 2015-07-21
Publication date: 2015-10-28

Abstract

本发明涉及一种高效液相色谱法测定金霉素预混剂含量及相关物质的方法，采用如下色谱条件：色谱柱：(C18，5um)色谱柱；流动相：以体积比为63～77:1.8～2.2:25～30的水、磷酸、N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液为流动相，所述磷酸浓度为2mol/L；流速：0.8～1.2ml/min；检测波长：270～400nm；柱温：30～40℃；进样量：10～25μL；检测器：紫外检测器；配制金霉素、四环素、差向金霉素标品溶液和金霉素预混剂样品溶液，再按照上述色谱条件进行高效液相色谱分析，并通过峰面积计算出预混剂中相关物质含量。本检测方法色谱条件相对温和(流动相不含易结晶的盐类，也不使用强酸)，有利于仪器的维护保养，并且测试准确度高。

Description

高效液相色谱法测定金霉素预混剂含量及相关物质的方法

技术领域

本发明属于分析测试领域，涉及一种预混剂含量及相关物质的检测方法，特别涉及一种高效液相色谱法测定金霉素预混剂含量及相关物质的方法。

背景技术

金霉素预混剂是金霉素生产菌的全发酵液与适量碳酸钙制成的金霉素钙盐，其中的药物成分主要是金霉素，但是，也含有一些相关的发酵副产物，如四环素，差向金霉素等。其金霉素含量测定一般采用微生物检测法(兽药国家标准收载)。实践表明，采用微生物法测定含量有几个弊端：1)方法繁琐，耗时较长，造成工作效率低；2)方法的影响因素多，对测试的准确度有较大的影响，测试的重复性与再现性也相对较差；3)测试成本较高；4)不能同时测定其中的相关物质。

《中国药典》(2005版)收载了盐酸金霉素，其含量及相关物质检测采用HPLC法，可以用于金霉素预混剂的测定，但是，其色谱条件比较复杂、苛刻，流动相使用草酸铵、磷酸氢二铵及二甲基甲酰胺的混合溶液(用氨试液调PH8.3)。该方法虽然比微生物检测法方便、快捷，但是具有如下缺点：1)流动相PH8.3为碱性条件，金霉素在碱性条件下极不稳定，易氧化降解；2)使用含盐流动相，盐类很容易结晶吸出，造成仪器系统配件磨损，缩短仪器的寿命，对色谱系统的维护保养不利，不适宜长期使用；3)一般色谱柱允许流动相的pH为2.0-7.5，而该方法流动相的pH为8.3，需要配备耐碱性的专用色谱柱，造价较一般色谱柱要高。

《中国药典》(2010版)收载的盐酸金霉素，含量及相关杂质检测仍采用HPLC法，也可以用于金霉素预混剂的检测，该方法虽然克服了2005版的缺点，调整了色谱条件，将流动相改为酸性条件；但是，其流动相仍然比较苛刻，使用高氯酸、水和二甲亚砜混合溶液。高氯酸为强氧化性酸，长期使用会使仪器系统造成腐蚀，缩短色谱柱及仪器的寿命，仍然对仪器的维护保养不利，不适宜长期使用；另外一个缺点就是，二甲亚砜的价格较贵约为二甲基甲酰胺价格的二倍，长期使用，成本也较高。

针对上述情况，需要发明一种既可以进行准确可靠的测试，又能在长期使用中有利于仪器的维护保养，还能够节约成本的经济实惠的检测方法。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测效率高、准确可靠的运用高效液相色谱法检测金霉素预混剂含量及相关物质的方法，本检测方法对仪器磨损、腐蚀较小，实验成本低，适宜于长期使用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

高效液相色谱法测定金霉素预混剂含量及相关物质的方法，采用如下色谱条件：

色谱柱：(C18，5um)色谱柱；

流动相：以体积比为63～77:1.8～2.2:25～30的水、磷酸、N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液为流动相，所述磷酸浓度为2mol/L；

流速：0.8～1.2ml/min；

检测波长：270～400nm；

柱温：30～40℃；

优选的，所述流动相中水、磷酸、N,N-二甲基甲酰胺的体积比为70：2：28。

优选的，检测条件中流速为1mL/min，检测波长为365nm，柱温为35℃。

金霉素预混剂中相关物质包括四环素和差向金霉素。

检测方法通过以下步骤实现：

(1)标品溶液配制：取金霉素标准品、四环素标准品、差向金霉素标准品用0.01mol/L盐酸稀释分别配制成标品溶液，过0.22μm滤膜，备供试标品溶液用；

(2)金霉素预混剂试样品溶液配制：取金霉素预混剂样品用0.01mol/L盐酸稀释配制成试样品溶液，过0.22μm滤膜，备供试样品溶液用；

(3)取相同体积的供试标品和样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照所述的条件进行高效液相色谱分析。

用峰面积外标法计算相关物质含量：

A_样：样品中相应组分的峰面积；

A_标：相应标品的峰面积；

C_标：相应标品溶液的浓度。

优选的，所述金霉素标品溶液浓度为200μg/mL，所述四环素标品溶液浓度为16μg/mL，所述差向金霉素标品溶液浓度为12μg/mL，所述金霉素预混剂试样品溶液溶度为1～2mg/mL。

本发明的有益效果在于：

(1)色谱条件相对温和(流动相不含易结晶的盐类，也不使用强酸)，有利于仪器的维护保养，降低了仪器的长期、连续使用而导致磨损与腐蚀，可以延长仪器的寿命，提高仪器的利用率；

(2)测试准确度高，金霉素含量测定回收率可达到99％～101％，其他物质测定回收率可达98％～102％；

(3)精度高，各组分测试的重复性RSD小于0.5％；含量测定的再现性RSD小于1％，相关物质测定的再现性RSD小于3％；

(4)有较宽的线性测试范围，完全满足各种规格的金霉素预混剂的测定。金霉素在5μg/ml～500μg/ml的浓度范围内，具有很好的线性相关性，相关系数R²可达0.99998，定量限可达1.1μg/ml，检测限可达0.30μg/ml；相关物四环素在4μg/ml～40μg/ml的浓度范围内，具有很好的线性相关性，相关系数R²可达0.99992，定量限可达0.45μg/ml，检测限可达0.13μg/ml；相关物差向金霉素在3μg/ml～30μg/ml的浓度范围内，具有很好的线性相关性，相关系数R²可达0.99945定量限可达1.4μg/ml，检测限可达0.39μg/ml；

(5)专属性强，HPLC分离测试过程主成分金霉素和各相关杂质互不干扰，分离度均大于1.6，对各组分峰进行纯度测定，纯度指数均为正值；

(6)耐用性好，色谱条件的微小变化，不影响测试的准确性，可以使用不同品牌的C₁₈色谱柱，同时调整二甲基甲酰胺的比例以达到组分的最佳分离。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为测定浓度为200ug/mL的金霉素标准液的谱图；

图2为测定浓度为16.00ug/mL的四环素和浓度为12.00ug/mL的差向金霉素混合标准液的谱图；

图3为测定金霉素预混剂样品溶液的谱图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

检测仪器及条件：

岛津LC-20系列高效液相色谱仪，SPD-M20A检测器；

色谱柱：C18，5μ，4.6×150mm；

柱温控制：35℃；

检测波长：紫外365nm；

流动相：水：2mol/L磷酸溶液：N,N-二甲基甲酰胺＝70：2：28(体积比)；

泵流量：1.00ml/min；

定量体积：20μL；

纯化水(HPLC级)、盐酸(优级纯)、磷酸(优级纯)、N,N一二甲基甲酰胺(色谱纯)

流动相溶液的配备：取纯化水700ml，加入2mol/L磷酸溶液20ml混合均匀，然后加入N，N-二甲基甲酰胺280ml，用真空抽滤器经0.45μm膜过滤，备用。

1、检测标准品储备液配制

自冰箱中取出金霉素，四环素，差向金霉素标准品，置于干燥器中，放置到室温后称量使用。

a、金霉素标准品储备液:精密称取金霉素标准品50.0mg至50ml容量瓶，用0.01mol/LHCl溶解，并稀释至刻度制备成浓度为1mg/mL的金霉素标准品储备液，冰箱中2～8℃下保存最多7天；

b、四环素标准品储备液：精密称取四环素标准品20.0mg至50ml容量瓶，用0.01mol/LHCl溶解，并稀释至刻度制备成浓度为0.4mg/mL的四环素标准品储备液，冰箱中2～8℃下保存最多7天；

c、差向金霉素标准品储备液：精密称取差向金霉素标准品15.0mg至50ml容量瓶，用0.01mol/LHCl溶解，并稀释至刻度制备成浓度为0.3mg/mL的差向金霉素标准品储备液，冰箱中2～8℃下保存最多7天；

2、检测液的配制

a、金霉素标准品溶液：精密量取5ml金霉素标准品储备液于25ml容量瓶中，然后用0.01mol/LHCl稀释至刻度制备成浓度为200μg/mL的金霉素标准品溶液，注：金霉素标准品纯度为92.1％。

b、四环素和差向金霉素混合标准品溶液：精密量取1ml四环素标准品储备液和1ml差向金霉素标准品储备液于25ml容量瓶中，然后用0.01mol/l HCl稀释至刻度，得到四环素和差向金霉素混合标准品溶液，所述混合标准品溶液中四环素浓度为16μg/mL，差向金霉素浓度为12μg/mL，注：四环素标准品的纯度97.6％，差向金霉素标准品的纯度89.9％。

c、金霉素预混剂样品溶液：取经研磨后的金霉素预混剂样品适量，精密称定，转移到100mL的容量瓶中，加2mol/L HCl，2ml浸润，然后用0.01mol/L HCl稀释至刻度，于磁力搅拌器上搅拌30分钟。对于本实例样品规格为20％，实际样品称取量为100.6mg。金霉素预混剂样品溶液中金霉素的理论浓度为203.212μg/ml、四环素的理论浓度为11.066μg/ml、差向金霉素理论浓度为4.024μg/ml。

3、用高效液相色谱仪进行检测

开启高效液相色谱仪，按上述色谱条件设定相关参数，使仪器系统运行平衡1小时，将配制好的标品溶液和样品溶液，经0.22μm的尼龙型微孔滤膜过滤到1.5ml的样品瓶中，放入高效液相色谱仪自动进样器中，按照设定好的色谱条件，依次进行测定，记录金霉素标准品溶液、四环素和差向金霉素混合标准品溶液、金霉素预混剂样品溶液的图谱分别如图1、图2和图3所示。

4、结果分析

从图1可得出标准品金霉素保留时间在12.2左右，图3在保留时间12.2左右也出现了很明显的波峰，由此可得出图3图谱中有金霉素，并可以确定样品中金霉素的保留时间位置。

从图2可得出标准品四环素保留时间在5.0左右，差向金霉素保留时间在9.8左右，图3在保留时间5.0、9.8左右也出现了很明显的波峰，由此可得出图3谱图中有四环素和差向金霉素，并可以确定样品中四环素、差向金霉素的保留时间位置。将图1谱图信息记录至表1，图2谱图信息记录至表2，图3谱图信息记录至表3。

表1测定浓度为200ug/mL的金霉素标准品的谱图信息

表2测定浓度为16.00ug/mL的四环素和浓度为12.00ug/mL的差向金霉素混合标准液的谱图信息；

表3测定金霉素预混剂样品溶液的谱图信息

峰号

化合物名

保留时间

面积

高度

浓度

浓度单位

1	四环素	5.120	393616	34339	11.17	μg/ml
							2	杂质A	6.062	112608	9087	─	─
3	差向金霉素	9.861	99582	3806	4.16	μg/ml
							4	金霉素	12.236	5337208	159470	202.82	μg/ml
5	杂质B	14.887	70602	2075	─	─

金霉素预混剂样品溶液中金霉素的理论浓度为203.212μg/ml、四环素的理论浓度为11.066μg/ml、差向金霉素理论浓度为4.024μg/ml，与本检测结果进行偏差计算：

金霉素的相对偏差：(202.82-203.212)/203.212＝-0.19％，相对偏差在±2.0％范围内；

四环素的相对偏差：(11.17-11.066)/11.066＝0.94％，相对偏差在±5.0％范围内；

差向金霉素的相对偏差：(4.16-4.024)/4.024＝3.4％，相对偏差在±5.0％范围内。

由以上可看出，本检测方法在色谱条件相对温和(流动相不含易结晶的盐类，也不使用强酸)的条件下也可实现较高的准确度。

5、与现有技术方法对比

对同一批号的15％规格的金霉素预混剂使用药典方法与本发明方法的重现性测试数据对比结果如表4，表5，表6。

表4：相关物质-金霉素(％)测试结果对比

序号	05版药典方法	10版药典方法	本发明方法
				1	15.23	15.56	15.43
2	15.44	15.42	15.42
				3	15.29	15.47	15.42
4	15.16	15.53	15.47
				5	15.33	15.41	15.51

6	15.36	15.59	15.51
				平均值	15.3	15.5	15.46
s	0.0987	0.0747	0.0429
				RSD	0.65％	0.48％	0.28％

表5：相关物质——四环素(％)测试结果对比

	05版药典方法	10版药典方法	本发明方法
				1	0.862	0.938	0.910
2	0.831	0.922	0.909
				3	0.849	0.918	0.910
4	0.865	0.933	0.900
				5	0.852	0.939	0.901
6	0.863	0.931	0.906
				平均值	0.854	0.930	0.906
s	0.0128	0.0085	0.0045
				RSD	1.5％	0.91％	0.50％

表6：相关物质——差向金霉素(％)测试结果对比

	05版药典方法	10版药典方法	本发明方法
				1	0.395	0.291	0.294
2	0.418	0.312	0.295
				3	0.397	0.296	0.295
4	0.392	0.301	0.312
				5	0.389	0.315	0.303
6	0.421	0.311	0.317
				平均值	0.402	0.304	0.303
s	0.0139	0.0098	0.0099
				RSD	3.5％	3.2％	3.3％

对比测试结果表明，本发明的测试方法对于金霉素预混剂测试的准确度与重现性不低于药典方法，该方法适合于公司日常生产的连续检测，准确可靠且经济实惠。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims

1.高效液相色谱法测定金霉素预混剂含量及相关物质的方法，其特征在于，采用如下色谱条件：

色谱柱：(C18，5um)色谱柱；

流动相：以体积比为63～77:1.8～2.2:25～30的水、磷酸溶液、N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液为流动相，所述磷酸溶液浓度为2mol/L；

流速：0.8～1.2ml/min；

检测波长：270～400nm;

柱温：30～40℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相中水、磷酸、N,N-二甲基甲酰胺的体积比为70：2：28。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流速为1mL/min，检测波长为365nm，柱温为35℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述相关物质包括四环素和差向金霉素。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：

（1）标品溶液配制：取金霉素标准品、四环素标准品、差向金霉素标准品用0.01mol/L盐酸稀释分别配制成标品溶液，过0.22μm滤膜，备供试标品溶液用；

（2）金霉素预混剂试样品溶液配制：取金霉素预混剂样品用0.01mol/L盐酸稀释配制成试样品溶液，过0.22μm滤膜，备供试样品溶液用；

（3）取相同体积的供试标品和样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照权利要求1-3中任一项所述的条件进行高效液相色谱分析；

用峰面积外标法计算相关物质含量：

A_样：样品中相应组分的峰面积；A_标：相应标品的峰面积；C_标：相应标品溶液的浓度。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述金霉素标品溶液浓度为200μg/mL，所述四环素标品溶液浓度为16μg/mL，所述差向金霉素标品溶液浓度为12μg/mL，所述金霉素预混剂试样品溶液溶度为1～2mg/mL。