CN102012408A - 液相色谱分析n-对氨基苯甲酰-l-谷氨酸纯度的方法 - Google Patents

液相色谱分析n-对氨基苯甲酰-l-谷氨酸纯度的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及医药中间体的分析技术，色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法。现有技术没有N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品纯度的分析方法，无法对其纯度和质量进行分析和监控；造成使用该原料合成的叶酸质量无法保证，医疗效果无法保证。本发明采用常见的C18柱，配紫外检测器，以H3PO4-KH2PO4缓冲溶液-甲醇体系作为流动相，流动相流速设定为0.3mL/min；采用对氨基苯磺酸作为内标物，以内标标准曲线法对N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品的纯度进行分析。本发明的优点：分析条件容易实现；样品稳定性强，分析结果重现性好；分析结果准确度高。

Description

液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法
技术领域
本发明涉及医药中间体的分析技术，具体地说是一种液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法。
背景技术
N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸是合成抗贫血药叶酸(folic acid)的重要中间体。N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的纯度对于叶酸的质量和医疗效果具有重要的意义。现有技术中没有对N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品纯度进行分析的方法，经广泛查阅国内外出版物和检索专利文献，均未见有报道。造成国内外企业为叶酸生产提供原料合成该中间体时，一直无法对其纯度和质量进行分析和监控；造成叶酸质量无法保证，药品的医疗效果无法保证。发明一种方法简便、结果准确、适应性强的液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的纯度的方法，对于保证和提高抗贫血药叶酸的质量和医疗效果，是一个十分迫切需要解决的技术问题，也是医药工业的十分重要的任务。
发明内容
本发明的目的是提供一种方法简便、结果准确、适应性强的液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法。
本发明技术方案是：
液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法，步骤如下：
(1)设定色谱操作条件：
I.取H3PO4-KH2PO4缓冲溶液-甲醇体系作为流动相，缓冲溶液/甲醇体积比V缓冲溶液/V甲醇＝75/25-85/15；
II.调节缓冲溶液pH：滴加浓磷酸至50mmol/L的KH2PO4水溶液中，调节pH＝3.4-4.4；
III.流动相流速为0.2-0.5mL/min；
IV.紫外检测器检测波长：200-310nm；
V.色谱柱：Agilent-Hypersil ODS 100×4.6mm，5um；
VI.Waters 515液相色谱仪，配Waters 2487紫外检测器；
VII.进样量：1-20ML；
(2)配制溶液：
I.配制内标液：准确称取无水对氨基苯磺酸50mg，置于容量瓶中，以流动相溶解并定容至刻度；
II.配制标样与样品溶液：
i.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液：准确称取N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样50mg，置于容量瓶中，以流动相溶解并定容至刻度；
ii.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准溶液：
分别移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液，并以流动相定容至10mL；配制成浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL的标准溶液；
分别准确移取2.5、3.5、4.5mL的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液，并以流动相定容至10mL，配制成浓度分别为0.25、0.35、0.45mg/mL的标准溶液；
iii.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品储备液：准确称取N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品50mg，置于50mL容量瓶中，以流动相溶解，并定容至刻度；
iv.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品溶液：准确移取3.0mL的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品储备液，并以流动相定容至10mL；
III.加内标物的混合液的配制：
移取步骤(2)I  配制的内标液0.5mL，加入0.5mL的步骤(2)II配制的各浓度的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准溶液或样品溶液，配制成添加内标物的混合溶液，用于色谱进样使用；
(3)分析方法考察：
I.线性关系考察：以内标物与N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样的峰面积比Y＝Ai/As对标样的质量浓度Ci作图，绘制标准工作曲线，或者进行回归分析，拟合出线性方程式；
II.精密度与回收率试验：以标准加入法进行回收率试验，重复进样3-6次，测定结果的精密度；
(4)N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品测定：
取步骤(2)II.iv配制的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品溶液注入液相色谱仪中，以步骤(3)所述的内标标准曲线法进行定量测定。
步骤(1)I中流动相甲醇-缓冲溶液体系，体积比V甲醇/V缓冲溶液优选为20/80。
步骤(1)II中缓冲溶液的pH值优选为3.7。
步骤(1)III中流动相的流速优选为0.3mL/min。
步骤(1)IV中紫外检测波长优选为254nm 。
本发明采用液相色谱仪配紫外检测器对N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸的纯度进行分析，色谱柱和检测器采用常见的C18柱和紫外检测器，色谱条件容易实现，普适性强。该色谱条件下，样品稳定性强，分析结果的重现性好，经多次实验验证该分析方法的准确度和准确度高。
本发明采用色谱条件容易实现、通用性强的C18色谱柱配紫外检测器，紫外检测波长设定为200-310nm，优选为254nm。由于N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸为易解离化合物，故需配制合适pH值的缓冲溶液作为流动相，以抑制样品组分的解离。本发明采用H3PO4-KH2PO4缓冲溶液-甲醇体系作为流动相，缓冲溶液的pH值为3.4-4.4，优选为3.7，缓冲溶液与甲醇的体积比为75/25-85/15，优选80/20。流动相的流速设定为0.2-0.5mL/min，优选为0.3mL/min。本发明采用对氨基苯磺酸作为内标物，以内标标准曲线法对N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品的纯度进行了分析，经回收率与准确度试验测试，该分析结果准确可靠。
本发明H3PO4-KH2PO4缓冲溶液的组成和配制为公知的已有技术。本发明线性关系考察，以内标物与N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样的峰面积比Y＝Ai/As对标样的质量浓度Ci作图，绘制标准工作曲线，或者进行回归分析，拟合出线性方程式为本领域技术人员的常用方法。
本发明的优点是：
1、世界上首次提出N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的分析方法，填补现有技术中对N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品纯度分析方法的空白。
2、分析条件容易实现，普适性强。
3、样品稳定性强，分析结果重现性好。
4、分析结果准确度和准确度高。
附图说明：
图1为N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样色谱图。
图2为N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样色谱图的局部放大图。
图3为N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品色谱图。
图4为N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品色谱图的局部放大图。
图5为加入内标物对氨基苯磺酸的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品色谱图。
图6为加入内标物对氨基苯磺酸的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品色谱图局部放大图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步阐述。
实施例1：
一、设定HPLC操作条件：
1.流动相：H3PO4-KH2PO4缓冲溶液-甲醇体系，缓冲溶液/甲醇体积比V缓冲溶液/V甲醇＝80/20；
2.缓冲溶液的组成为：滴加浓磷酸至50mmol/L的KH2PO4水溶液中，小心调节至缓冲溶液的pH＝3.7；
3.流速：0.3mL/min；
4.紫外检测器，检测波长：254nm；
5.色谱柱：Agilent-Hypersil ODS(100×4.6mm，5um)；
6.Waters 515液相色谱仪，配Waters 2487紫外检测器；
7.进样量：1-20μL。
二、配制溶液：
1、内标液配制：准确称取无水对氨基苯磺酸50mg，置于50mL容量瓶中，以流动相溶解并定容至刻度。
2、标样与样品溶液的配制：
(1)N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液：
准确称取纯度为97％的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样50mg，置于50mL容量瓶中，以流动相溶解并定容至刻度。
(2)N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准溶液：
分别准确移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的上述N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液，并以流动相定容至10mL，配制成浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL的标准溶液，用于标准工作曲线试验；
分别准确移取2.5、3.5、4.5mL的上述N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液，并以流动相定容至10mL，配制成浓度分别为0.25、0.35、0.45mg/mL的标准溶液，用于精密度与回收率试验；
(3)N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品储备液：
准确称取纯度为97％的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品50mg，置于50mL容量瓶中，以流动相溶解，并定容至刻度。
(4)N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品溶液：
准确移取3.0mL的上述N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品储备液，并以流动相定容至10mL。
3、加内标物的混合液的配制：
分别移取0.5mL的内标液加入0.5mL的上述各浓度的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准溶液或样品溶液，配制成添加了内标物的混合溶液，用于色谱进样使用。
三、分析方法的考察：
1.线性关系考察：
以内标物与N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样的峰面积比(Y＝Ai/As)对标样的质量浓度Ci作图，绘制标准工作曲线，或者进行回归分析，拟合出线性方程式为：Y＝7.27×10-3+3.97Ci，r＝0.9999(n＝5)。
2.精密度与回收率试验：
表1：N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸分析方法的精密度与回收率试验(n＝3)
Figure BDA0000029850320000051
四、N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品纯度测定结果：
标样纯度为97％，故直接测定结果需再×97％进行校正。经测定，采用本方法测得的某N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品的平均纯度为96.15％，相对平均偏差(n＝3)为0.11％。
以上所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法，步骤如下：
(1)设定操作条件：
I.取H3PO4-KH2PO4缓冲溶液-甲醇体系作为流动相，缓冲溶液/甲醇体积此V缓冲溶液/V甲醇＝75/25-85/15；
II.调节缓冲溶液pH：滴加浓磷酸至50mmol/L的KH2PO4水溶液中，调节pH＝3.4-4.4；
III.流动相流速为0.2-0.5mL/min；
IV.紫外检测器检测波长：200-310nm；
V.色谱柱：Agilent-Hypersil ODS 100×4.6mm，5um；
VI.Waters 515液相色谱仪，配Waters 2487紫外检测器；
VII.进样量：1-20ML；
(2)配制溶液：
I.配制内标液：准确称取无水对氨基苯磺酸50mg，置于容量瓶中，以流动相溶解并定容至刻度；
II.配制标样与样品溶液：
i.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液：准确称取N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样50mg，置于容量瓶中，以流动相溶解并定容至刻度；
ii.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准溶液：
分别移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液，并以流动相定容至10mL；配制成浓度分别为0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL的标准溶液；
分别准确移取2.5、3.5、4.5mL的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准储备液，并以流动相定容至10mL，配制成浓度分别为0.25、0.35、0.45mg/mL的标准溶液；
iii.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品储备液：准确称取N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品50mg，置于50mL容量瓶中，以流动相溶解，并定容至刻度；
iv.N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品溶液：准确移取3.0mL的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品储备液，并以流动相定容至10mL；
III.加内标物的混合液的配制：
移取步骤(2)I 配制的内标液0.5mL，加入0.5mL的步骤(2)II 配制的各浓度的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标准溶液或样品溶液，配制成添加内标物的混合溶液；
(3)分析方法考察：
I.线性关系考察：以内标物与N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸标样的峰面积此Y＝Ai/As对标样的质量浓度Ci作图，绘制标准工作曲线，或者进行回归分析，拟合出线性方程式；
II.精密度与回收率试验：以标准加入法进行回收率试验，重复进样3-6次，测定结果的精密度；
(4)N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品测定：
取步骤(2)II.iv配制的N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸样品溶液注入液相色谱仪中，以步骤(3)所述的内标标准曲线法进行定量测定。
2.根据权利要求1所述的液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法，其特征在于：步骤(1)I中流动相缓冲溶液/甲醇体积此优选为80/20。
3.根据权利要求1所述的液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法，其特征在于：步骤(1)II中缓冲溶液的pH值优选为3.7。
4.根据权利要求1所述的液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法，其特征在于：步骤(1)III中流动相的流速优选为0.3mL/min。
5.根据权利要求1所述的液相色谱分析N-对氨基苯甲酰-L-谷氨酸纯度的方法，其特征在于：步骤(1)IV中紫外检测波长优选为254nm。
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