CN103512974B

CN103512974B - 用hplc快速测定饲用金霉素及其杂质含量的方法

Info

Publication number: CN103512974B
Application number: CN201310421665.5A
Authority: CN
Inventors: 季红珍; 骆荣良
Original assignee: PUCHENG CHIA TAI BIOCHEMISTRY CO Ltd
Current assignee: PUCHENG CHIA TAI BIOCHEMISTRY CO Ltd
Priority date: 2013-09-16
Filing date: 2013-09-16
Publication date: 2015-01-21
Anticipated expiration: 2033-09-16
Also published as: CN103512974A

Abstract

本发明公开了一种用HPLC快速测定饲用金霉素及其杂质含量的方法，包括以下步骤：试剂和溶液的配制、色谱条件准备、HPLC系统适用性试验测定、色谱图分析，该方法采用HPLC精密检测仪器进行检测，能同时完成含量，差向金霉素和四环素杂质含量，具有检测结果准确，检测速度快，检测精度高的优点。

Description

用HPLC快速测定饲用金霉素及其杂质含量的方法

技术领域

本发明涉及饲用金霉素（含金霉素抗生素的预混剂）检测领域,特别是一种用HPLC法快速测定饲用金霉素及其杂质含量的方法。

背景技术

饲用金霉素是由金霉素产生菌的全发酵液与适量碳酸钙制成的饲用金霉素钙盐，通过干燥、破碎等工艺制成的饲用金霉素产品。在上述的生产过程中，产品中会伴生有金霉素族杂质生成，其中最主要的两个杂质为四环素和差向金霉素。

目前，饲用金霉素含量检测方法依《兽药地方标准上升国家标准》第二册进行检测，为传统的抗生素微生物检定法-管碟法，此方法为依据量反应平行线原理，利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用，比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小，以测定抗生素活性的方法。针对管碟法客观上存在以下缺陷：（1）检测时间长，手续繁琐（一个样品至少20小时）；（2）试验条件要求高（半无菌室）；（3）检测精度不高（可信限率为5%）；（4）使用指示菌种，易造成生物污染；（5）无法对四环素和差向金霉素杂质进行检测。使用管碟法无法快速准确精密地完成饲用金霉素含量和杂质的检测。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速测定饲用金霉素含量及杂质的方法，以提高饲用金霉素的检测效率、准确度和精度，同时可测定杂质。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

用HPLC快速测定饲用金霉素及其杂质含量的方法，包括以下步骤：

S1.试剂和溶液的配制:配制流动相、样品浸泡剂、金霉素标准溶液、四环素标准溶液、差向金霉素标准溶液、试验标准溶液及样品溶液；

所述的流动相为草酸液加入乙腈及四氢呋喃混匀后溶液，所述的样品浸泡剂为甲醇加入盐配混匀后溶液，所述的金霉素标准溶液、四环素标准溶液、差向金霉素标准溶液分别为金霉素标准品、四环素标准品、差向金霉素标准品用样品浸泡剂溶解稀释后的溶液，所述的试验标准溶液为金霉素标准溶液和差向金霉素标准溶液混匀后所得溶液；

S2.色谱条件准备：色谱柱C8,检测波长365nm,流速0.8～1.0mL/min,进样量20μL；

S3.HPLC系统适用性试验测定：将流动相接入HPLC系统，取试验标准溶液，连续进样5次，通过系统适用性试验指标后进行步骤S4;

S4.色谱图分析：将S1中的金霉素标准溶液、四环素标准溶液、差向金霉素标准溶液、试验标准溶液及样品溶液移入HPLC系统中测定得到各自的色谱图，并进行分析。其中，步骤S4中分析金霉素含量的计算公式为：

金霉素含量 (%) = ××P×100

式中Asam为样品溶液色谱中金霉素峰面积；Astd为金霉素标准溶液色谱中金霉素峰面积；Wstd为标准品重量，Wsam为样品重量，P为盐酸金霉素标准品纯度百分数。其中，步骤S4中分析四环素杂质含量的计算公式为：

四环素杂质含量(%)= A _TC/A _CTC×g ₁×100

式中，g ₁为四环素校正因子；W _TC为四环素标准品重量；P ₁为四环素标准品纯度百分数；W _CTC为金霉素标准品重量；P 为金霉素标准品纯度百分数；为金霉素标准溶液色谱图中金霉素峰面积；为四环素标准溶液色谱图中四环素峰面积；A _TC为样品溶液色谱图中四环素峰面积；A _CTC为样品溶液色谱图中金霉素峰面积。其中，步骤S4中分析差向金霉素杂质含量的计算公式为：

差向金霉素杂质含量= A _Epi/A _CTC×g ₂×100

式中，g2 为差向金霉素校正因子；WEpi 为差向金霉素标准品重量；P2 为差向金霉素标准品纯度百分数；WCTC为金霉素标准品重量；P 为盐酸金霉素标准品纯度百分数；为金霉素标准品溶液色谱图中金霉素峰面积；为差向金霉素标准品溶液色谱图中差向金霉素峰面积。

进一步地，步骤S1中流动相为0.01mol/L的草酸液150mL，加入乙腈50～60mL及四氢呋喃5～15mL,混匀，并置于超声波清洗器上脱气制成。

进一步地，步骤S1中样品浸泡剂中甲醇与盐酸的体积比为110：1～120：1；金霉素标准溶液为金霉素标准品50～55mg用上述样品浸泡剂溶解并稀释至50 mL；四环素标准溶液为四环素标准品10～15mg用上述样品浸泡剂溶解并稀释至50 mL；差向金霉素标准溶液为差向金霉素标准品10～15mg用上述样品浸泡剂溶解并稀释至50 mL。

其中，步骤S3中所述的系统适用性试验指标为：理论塔板数不得低于550；金霉素与差向金霉素的分离度不得小于2.0；金霉素峰的拖尾因子在2.5以内；金霉素峰面积测量值的相对标准偏差不大于2.0%。

采用上述技术方案后，本发明与现有的背景技术相比，具有如下优点：

（1）采用HPLC精密检测仪器进行检测，具有检测结果准确，检测速度快（一个样品仅需约13分钟），检测精度高的优点，并且在一般的试验室条件下即可进行；

(2) 由于管碟法操作繁琐,采用本方法降低了检测技术人员的劳动强度,提高了工作效率，更可有效地避免检定菌的生物污染；

（3）一次检测能同时完成含量，差向金霉素和四环素杂质含量。可以快速向生产企业和客户报告杂质的含量，为企业生产和产品销售提供技术保障。

附图说明

图1为采用本方法所得的典型色谱图。

图2为采用本方法所得的金霉素标准溶液线性相关图。

图3为采用本方法所得的四环素标准溶液线性相关图。

图4为采用本方法所得的差向金霉素标准溶液线性相关图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。

本发明公开了一种用HPLC快速测定饲用金霉素及其杂质含量的方法，HPLC即高效液相色谱法。高效液相色谱是色谱法的一个重要分支，以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。该发明公开的用HPLC测定饲用金霉素及其杂质含量的方法包括以下步骤：

(1) 流动相：取0.01mol/L草酸液150mL（取草酸1.84g, 加入乙二胺0.4mL，用水稀释至2000mL），加入乙腈（50-60）mL及四氢呋喃（5-15）mL，混匀。用前置于超声波清洗器上脱气。

(2)样品浸泡剂：取甲醇1983mL，加入盐酸17mL，混匀。

(3)金霉素标准溶液：精密称取金霉素标准品约50-55mg于50mL 量瓶中，用浸泡剂溶解并稀释至刻度，摇匀。临用前，取此溶液5mL于50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。

(4)四环素标准溶液：精密称取四环素标准品约10-15mg于50mL量瓶中，用浸泡剂溶解并稀释至刻度，摇匀。临用前，取此溶液5mL于50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。

(5)差向金霉素标准溶液：精密称取差向金霉素标准品约10-15mg于50mL量瓶中，用浸泡剂溶解并稀释至刻度，摇匀。临用前，取此溶液5mL于50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。

(6)试验标准溶液：分别取金霉素标准溶液5.0mL和差向金霉素标准溶液5.0mL于50mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀。

(7)样品溶液：准确称取样品适量（约相当于金霉素50mg,）于50mL量瓶中，加入浸泡剂至刻度,用磁力搅拌器高速搅拌20-40分钟后，移入离心管内，离心分离，吸取上清液5mL于50mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀。用前置于超声波清洗器上脱气。

S2.色谱条件准备：测试采用的带UV检测器和色谱检测软件的高效液相色谱仪，其色谱条件为色谱柱C8（采用WATERS公司的色谱柱）,检测波长365nm,流速0.8～1.0mL/min,进样量20μL。

S3.HPLC系统适用性试验测定：将流动相接入HPLC系统，取试验标准溶液，连续进样5次，通过系统适用性试验指标后进行步骤S4;系统适用性试验指标如下：理论塔板数不得低于550；金霉素与差向金霉素的分离度不得小于2.0；金霉素峰的拖尾因子在2.5以内；金霉素峰面积测量值的相对标准偏差不大于2.0%。如表1所示，系统适用性试验是衡量一个色谱方法是否适合药物检验的重要技术指标，系统适用性试验须在每次检测时进行，若有一项指标不符合要求，则必须改变色谱条件或重新配制流动相进行测定直到符合规定为止。

表1：系统适用性试验项目测定

上述表1的数据表明本发明方法的系统适用性试验项目均优于指标要求。

S4.将S1中的金霉素标准溶液、四环素标准溶液、差向金霉素标准溶液、试验标准溶液及样品溶液移入HPLC系统中测定得到各自的色谱图，并进行分析。

金霉素含量的计算公式为：

金霉素含量 (%) =××P×100

式中Asam为样品溶液色谱中金霉素峰面积；Astd为金霉素标准溶液色谱中金霉素峰面积；Wstd为标准品重量，Wsam为样品重量，P为盐酸金霉素标准品纯度百分数。

四环素杂质含量的计算公式为：

四环素杂质含量(%)= A _TC/A _CTC×g ₁×100

式中，g ₁为四环素校正因子；W _TC为四环素标准品重量；P ₁为四环素标准品纯度百分数；W _CTC为金霉素标准品重量；P 为金霉素标准品纯度百分数；为金霉素标准溶液色谱图中金霉素峰面积；为四环素标准溶液色谱图中四环素峰面积；A _TC为样品溶液色谱图中四环素峰面积；A _CTC为样品溶液色谱图中金霉素峰面积。

差向金霉素杂质含量的计算公式为：

差向金霉素杂质含量= A _Epi/A _CTC×g ₂×100

盐酸金霉素、四环素、差向金霉素的检测线性范围参见图2～图4，附图表明三种物质的线性很宽（金霉素浓度在0.20u/mL～162.79u/mL，四环素浓度在0.23u/mL～46.81u/mL，差向金霉素浓度在0.21u/mL～33.07u/mL），即可检测的物质含量范围大，并且检测的最低限接近于0，回归系数R接近于1，呈良好的二元一次回归关系。

如表2所示，盐酸金霉素、四环素、差向金霉素三种物质的检测的相对标准偏差最大为2.67%，最小为0.44%，远小于5%，相对管碟法，检测精度有显著提升，有利于生产的成本控制，保证出厂产品的数据的可靠性。

表2：金霉素、四环素、差向金霉素含量测定

如表3～5所示，盐酸金霉素、四环素、差向金霉素三种物质的准确度（加标回收率）最大值103.08%,最小值95.18%,落在表明准确度很好的90%～110%回收率范围之内。表明本方法的检测结果与真实值接近程度很高，本方法为防范生产方和客户的质量投诉风险提供一种技术保障。

表3：盐酸金霉素准确度测定表

表4：四环素准确度测定表

表5：差向金霉素准确度测定表

通过本方法，参见图1所示：一个样品的分析时间仅为13分钟，与管碟法20小时相比，时间节约了90余倍，降低了分析人员的工作强度，提高了工作效率。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

Claims

1.用HPLC快速测定饲用金霉素及其杂质含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述的流动相为0.01mol/L的草酸液150mL，加入乙腈50～60mL及四氢呋喃5～15mL,混匀，并置于超声波清洗器上脱气制成；所述的样品浸泡剂为甲醇加入盐酸混匀后溶液，甲醇与盐酸的体积比为110：1～120：1；所述的金霉素标准溶液为金霉素标准品50～55mg用上述样品浸泡剂溶解并稀释至50mL；四环素标准溶液为四环素标准品10～15mg用上述样品浸泡剂溶解并稀释至50mL；差向金霉素标准溶液为差向金霉素标准品10～15mg用上述样品浸泡剂溶解并稀释至50mL；所述的试验标准溶液为金霉素标准溶液和差向金霉素标准溶液混匀后所得溶液；

S3.HPLC系统适用性试验测定：将流动相接入HPLC系统，取试验标准溶液，连续进样5次，通过系统适用性试验指标后进行步骤S4；

S4.色谱图分析：将S1中的金霉素标准溶液、四环素标准溶液、差向金霉素标准溶液、试验标准溶液及样品溶液移入HPLC系统中测定得到各自的色谱图，并进行分析。

2.如权利要求1所述的用HPLC快速测定饲用金霉素及其杂质含量的方法，其特征在于，步骤S4中分析金霉素含量的计算公式为：

式中A_sam为样品溶液色谱中金霉素峰面积；A_std为金霉素标准溶液色谱中金霉素峰面积；W_std为标准品重量，W_sam为样品重量，P为盐酸金霉素标准品纯度百分数。

3.如权利要求1所述的用HPLC快速测定饲用金霉素及其杂质含量的方法，其特征在于，步骤S4中分析四环素杂质含量的计算公式为：

四环素杂质含量(％)＝A_TC/A_CTC×g₁×100

式中，g₁为四环素校正因子；W_TC为四环素标准品重量；P₁为四环素标准品纯度百分数； W_CTC为金霉素标准品重量；P为金霉素标准品纯度百分数；为金霉素标准溶液色谱图中金霉素峰面积；为四环素标准溶液色谱图中四环素峰面积；A_TC为样品溶液色谱图中四环素峰面积；A_CTC为样品溶液色谱图中金霉素峰面积。

4.如权利要求1所述的用HPLC快速测定饲用金霉素及其杂质含量的方法，其特征在于，步骤S4中分析差向金霉素杂质含量的计算公式为：

差向金霉素杂质含量＝A_Epi/A_CTC×g₂×100

式中，g2为差向金霉素校正因子；W_Epi为差向金霉素标准品重量；P₂为差向金霉素标准品纯度百分数；W_CTC为金霉素标准品重量；P为盐酸金霉素标准品纯度百分数；为金霉素标准品溶液色谱图中金霉素峰面积；为差向金霉素标准品溶液色谱图中差向金霉素峰面积。

5.如权利要求1所述的用HPLC快速测定饲用金霉素及其杂质含量的方法，其特征在于，步骤S3中所述的系统适用性试验指标为：理论塔板数不得低于550；金霉素与差向金霉素的分离度不得小于2.0；金霉素峰的拖尾因子在2.5以内；金霉素峰面积测量值的相对标准偏差不大于2.0％。