CN105717237B - 一种血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类毒品的检测方法 - Google Patents

一种血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类毒品的检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种血清中GABA、Glu、DA、5‑HT及苯丙胺类毒品的检测方法，包括以下步骤：S1：标准溶液的配制：包括GABA、Glu、DA、5‑TH、和苯丙胺类储备液、标准曲线工作溶液、质控工作溶液的配制以及内标化合物储备液和工作溶液的配制；S2：“空白”血清样本和吸毒人员血清样本的处理：“空白”血清样本中分别加入GABA、DA、5‑TH及苯丙胺类化合物的标准曲线溶液或质控溶液，再依次加入含Glu‑d5三氯乙酸溶液和含DA‑d4和Amp‑d6的乙腈溶液，涡旋震荡、离心，吸取上清液待测；未知生物样本除不添加标准曲线或质控工作溶液外，其它处理方式同上；S3：液相色谱‑质谱联用仪检测：将步骤S2中制得的上清液进行检测；S4：标准曲线的绘制。本发明方法具有操作简便、高效、实用的特点。

Description

一种血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类毒品的检测方法
技术领域
本发明涉及生物医药检测技术领域，具体属于药代动力学、生物样本含量测定领域，尤其涉及一种血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类毒品的检测方法。
背景技术
以甲基苯丙胺(Methamphetamine，简称MA，俗称：冰毒，其它苯丙胺类化合包括Amphetamine:Amp；3,4-Methylenedioxyamphetamine:MDA；3,4-Methylenedioxymethamphetamine:MDMA；3,4-Methylenedioxyethylamphetamine:MDEA)为代表的新型毒品正成为全球范围内滥用最广泛、蔓延最迅速、危害最严重的毒品。研究表明，甲基苯丙胺可损害中枢神经细胞，在一定的大脑区域，使滥用者出现多巴胺和5-羟色胺水平下降、酪氨酸羟化酶及色氨酸羟化酶活性下降、多巴胺和5-羟色胺吸收转运能力下降以及组织学可见的末端损伤，提示多巴胺和5-HT在中枢神经系统中的含量变化与吸毒人员滥用程度具有相关性。此外，研究显示中枢神经系统中GABA、Glu含量变化与苯丙胺类毒品的滥用程度存在关联。通过测定血清中上述四种神经递质和苯丙胺类化合物的含量变化规律，可间接反映神经系统中上述神经递质与苯丙胺类毒品成瘾之间的关系。
GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类均属于小分子极性化合物，DA、5-HT及苯丙胺类为含氨基的碱性化合物，GABA和Glu为即含氨基又含羧基的两性化合物。此外，GABA、Glu、DA及5-HT是血液中内源性存在的化合物，且浓度相差较大，这些特点给同时测定上述化合物造成极大困难。目前，将上述内源性氨基酸、儿茶酚胺与苯丙胺类等九种化合物同时测定的LC-MS/MS方法尚未见报道。
相关技术中测定此三类化合物的方法包括HPLC法、电化学法、离子色谱-质谱联用法、衍生化法、固相微萃取法及GC-MS法等。上述方法存在如下问题：HPLC操作简便，但灵敏度较低，选择性差，常需衍生化或固相萃取等复杂耗时的样品前处理过程；电化学方法灵密度低；离子色谱-质谱联用法需用到缓冲盐离子对，常无法与质谱检测器兼容；GC-MS法样品处理过程繁琐，费时费力，且平均检测时间较长，不适合大样本检测。
发明内容
本发明的目的在于针对吸毒人员血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类含量测定的技术难题，避免现有技术中的上述不足之处而提供一种建立样本处理简便、方法灵敏、及实用性强的同时测定上述化合物的，用于评价吸毒人员血清样本中神经递质含量变化与苯丙胺滥用程度相关性的LC-MS/MS检测方法。
本发明的目的通过以下技术方案实现：
提供了一种血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类毒品的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：标准溶液的配制：包括GABA、Glu、DA、5-TH、和苯丙胺类储备液、标准曲线工作溶液、质控工作溶液的配制以及内标化合物储备液和工作溶液的配制；其中，所述苯丙胺类储备液为商品化的1mg·mL-1的甲醇溶液，所述Glu采用内标一点法测定，无标准曲线工作溶液；
S2：“空白”血清样本和吸毒人员血清样本的处理：吸取“空白”血清样本，分别加入GABA、DA、5-TH及苯丙胺类化合物的标准曲线工作溶液或质控工作溶液，再依次加入含Glu-d5三氯乙酸溶液和含DA-d4和Amp-d6的乙腈溶液，涡旋震荡、离心，吸取上清液待测；未知生物样本除不添加标准曲线或质控工作溶液外，其它处理方式同上，并采用50％的甲醇-水溶液补齐预设体积；
S3：液相色谱-质谱联用仪检测：将步骤S2中获得的上清液进行检测，检测的化合物包括GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类，所述苯丙胺类包括Amp、MA、MDA、MDMA及MDEA；
S4：标准曲线的绘制，其中，所述Glu采用内标一点法测定，无标准曲线。
优选地，所述三氯乙酸溶液、乙腈、“空白”血清样本或吸毒人员血清样本的体积比为1:1:1；所述涡旋设置为4000rpm、5min，离心为4℃14000rpm、10min。
优选地，步骤S2中“空白”血清样本和吸毒人员血清样本的体积为80μL，所述添加的GABA、DA、5-TH及苯丙胺类化合物的标准曲线工作溶液或质控工作溶液的体积为20μL，含Glu-d5三氯乙酸溶液的体积为80μL，含DA-d4和Amp-d6的乙腈溶液体积为80μL；所述三氯乙酸溶液浓度为0.6N，其中，所述Glu采用内标一点法测定，无标准曲线工作溶液，样本的预设体积采用50％的甲醇-水溶液补齐至预定值。
优选地，步骤S1中的所述标准工作溶液的制备方法如下：
(1)GABA标准溶液：称取GABA标准品11.00mg，置10mL容量瓶中，按标准曲线 和质控工作溶液要求，以纯水溶解得GABA 1.10mg·mL-1标准品储备液，以纯水依次稀释得到系列工作溶液和质控溶液；
(2)Glu标准溶液：称取Glu 21.00mg于10mL容量瓶内，以纯水溶解，得到2.10mg·mL-1标准品储备液，依据需要配制相应浓度的Glu质控工作溶液；
(3)DA和5-HT标准溶液：称取DA·HCl 11.37mg和5-HT·HCl 10.37mg标品，置于10mL棕色容量瓶，用甲醇溶解定容至刻度；按照标准曲线及质控工作溶液要求，用甲醇梯度稀释获得DA和5-HT混合标准曲线工作溶液和质控工作溶液；
(4)苯丙胺类标准溶液：苯丙胺类储备液为商品化的1.00mg·mL-1的甲醇溶液，标准曲线工作溶液和质控工作溶液由母液用甲醇进行梯度稀释获得；
(5)内标化合物工作溶液：
①Glu-d5内标工作溶液：每次称取约2mg Glu-d5，使用约1mL纯水溶解，作为Glu-d5内标储备液，Glu-d5储备液用0.6N三氯乙酸水溶液稀释成10000ng·mL-1内标工作溶液；
②DA-d4和Amp-d6混合内标工作溶液：每次称取约1mg DA-d4-HCl样品，使用约1mL甲醇溶解，获得DA-d4含量为1mg·mL-1，作为DA-d4储备液；Amp-d6内标工作溶液为100μg/mL甲醇溶液，混合DA-d4和Amp-d6母液，用乙腈稀释，配制成二者浓度分别为250ng·mL-1和200ng·mL-1的混合内标工作溶液；
上述两组内标化合物工作溶液均作为血清蛋白沉淀剂使用。
优选地，步骤S4中使用的标准曲线样品配制方法如下：
(1)使用“空白”血清配制含药浓度如下述的标准曲线血清样本：
①GABA：25、62.5、125、313、625、及1250ng·mL-1；
②DA、Amp、MA、MDA、MDMA、MDEA：5、10、25、62.5、125、250、及500ng·mL-1；
③5-HT：15、30、75、188、375、750、及1500ng·mL-1；
④Glu采用内标一点法定量，未配制标准曲线血清样本；
在上述各含药血清样本中分别加入80μL含各内标化合物的乙腈和三氯乙酸溶液，涡旋振荡、离心；以各待测物的浓度为横坐标，各待测物的峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归；
(2)配制质控血清样品：质控血清样品的处理方法与步骤S2一致，上述各个化合物的质控样本低浓度和高浓度依次为GABA：71.4、469ng·mL-1；Glu：10000,65600ng·mL-1；DA、Amp、MA、MDA、MDMA、MDEA：15、400ng·mL-1；5-HT：45、1200ng·mL-1。
优选地，所述步骤S3中采用的液相色谱-质谱联用仪为美国Agilent HP1100四元低压高效 液相色谱系统，包括自动进样器、柱温箱；美国API4000QQQ型质谱仪，控制软件为Analyst 1.4版本；所述液相色谱-质谱联用仪检测方法的操作条件如下：
①色谱柱：ES Epic Polar Hydro C18 150mm×4.6mm，5μm，接菲罗门SecurityGuard C18保护柱；
②柱温：室温；
③流动相：甲醇(B相)：0.1％甲酸-水(A相)；
④流速：0.9mL·min-1，梯度洗脱，0～6.00min，B相5％～95％；6.01～6.50min，B相95％～95％；6.51～12.00min B相5％B；
⑤进样量5μL；分流比48:52，48％洗脱液进质谱仪；
⑥质谱条件：ESI离子源，正离子检测模式；碰撞气：4L·h-1；气帘气：20L·h-1；GS1：40L·h-1，GS2：40L·h-1；毛细管电压：5000V；雾化温度：500℃；多级反应监测，各化合物碰撞能均为：16.0V，解簇电压：55.0V。
优选地，采用多级反应监测方式，监测的待测化合物离子对：GABA(104.000→87.000)、Glu(148.000→84.200)、DA(154.200→137.000)、5-HT(177.200→160.000)、Amp(136.000→91.000)、MA(150.000→91.000)、MDA(180.000→105.000)、MDMA(194.000→135.000)、MDEA(208.200→163.200)；内标化合物离子对：Glu-d5(153.200→88.200)、DA–d4(158.400→141.200)及Amp-d6(141.200→93.000)。
优选地，采用所述步骤S1-S3的检测方法，各化合物的线性范围依次为：GABA：25～1250ng·mL-1；DA：5～1000ng·mL-1、Amp、MA、MDA、MDMA、MDEA：5～500ng·mL-1；5-HT：15～1500ng·mL-1(Glu采用内标一点法测定，未考察线性范围)；在上述线性范围内，各化合物线性回归系数r2≥0.98，满足定量要求；各化合物的定量下限依次为(Glu采用内标一点法定量，未考察定量限)：GABA：25ng·mL-1；5-HT：15ng·mL-1；DA、Amp、MA、MDMA、MDEA：5ng·mL-1，且信号强度较大，信噪比均远大于10，具有良好的重现性，重复6个样本，响应值变异RSD≤15％。
优选地，在一定浓度范围内，在纯水中添加相同浓度的Glu和Glu-d5，二者具有相近强度的质谱信号响应，在“空白”血清中(本底含有Glu)添加相同浓度的Glu和Glu-d5，Glu质谱响应强度的增加与Glu-d5质谱信号响应强度相近。
本发明的有益效果：
(1)本发明提供了一种可以同时测定GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类毒品化合物的LC-MS/MS检测方法，且具有样本处理简便，检测迅速，可同时测定上述化合物，为探讨 上述化合物之间的浓度变化与吸毒成瘾关系提供技术依据；建立可同时测定上述化合物的操作简便、灵敏度高的分析方法具有重要应用价值。
(2)本发明的专属性强：本发明检测的化合物包括GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类(含Amp、MA、MDA、MDMA及MDEA)，使用的内标化合物为Glu-d5、DA-d4及Amp-d6。本发明所建立的方法在定量下限浓度(Glu采用内标一点法定量，未考察定量下限)下各化合物在色谱图上无明显基质干扰，色谱峰型良好，专属性强。
(3)本发明中检测到的各化合物的线性范围依次为(Glu采用内标一点法定量，未考察线性范围)：GABA：25～1250ng·mL-1；DA：5～1000ng·mL-1、Amp、MA、MDA、MDMA、MDEA：5～500ng·mL-1；5-HT：15～1500ng·mL-1；质控样本采用低、高两个浓度，依次为：GABA：71.4、469ng·mL-1；Glu:10000、65600ng·mL-1；DA：15、400ng·mL-1；Amp、MA、MDA、MDMA及MDEA：15、400ng·mL-1；5-HT：45、1200ng·mL-1；在考察的线性范围内，各化合物的线性回归系数r2≥0.98，可满足定量的需求；在一定浓度范围内，在水溶液或“空白”血清中(本底含Glu)添加相近浓度的Glu和Glu-d5，质谱响应强度与标品添加量成正相关，且单位质量的Glu和Glu-d5的质谱信号响应强度相似；预实验表明正常人和吸毒人员血浆中Glu的含量在较窄的范围内波动，因此，使用Glu-d5作为内标，通过内标一点法对吸毒人员血清样本中的Glu进行定量。
(4)本发明的定量下限低：各化合物的定量下限依次为(Glu采用内标一点法定量，未考察定量下限)：GABA为25ng·mL-1、5-HT为15ng·mL-1，DA、Amp、MA、MDMA及MDEA的定量下限均为5ng·mL-1，在各化合物定量下限浓度，信号强度较大，信噪比均远大于10，且具有良好的重现性，重复6个样本，响应值变异RSD≤15％。
(5)由于本实验考察的各化合物的性质相差较大，各化合物的基质效应存在一定差异，其中GABA、Glu和DA的基质效应影响较大，且在低、高两个质控浓度下的基质效应影响不同，但均表现出良好的精密度。但本研究使用了氘代内标，可有效降低基质效应对相应待测化合物的测定准确度的不利影响。
(6)本发明的准确度和精密度良好：本研究在准确度和精密度考察中，各化合物的低、高两个浓度质控的准确度均满足测定值与名义值的比值在±15％以内；而各化合物在低、高两个浓度质控的批内和批间精密度在±15％之间，因此可满足检测的准确度和精密度要求。
(7)本发明的稳定性可靠：①GABA测定值与名义值相比，有明显的降低，但表现出良好的精密度；而DA在“空白”血浆样本中具有极大的不稳定性；GABA和DA不稳定性与其化合物性质相符。各化合物的测定结果均表现出良好的准确度和精密度；②反复冻融稳定性：经过3次反复冻融过程，除GABA表现出相对较差的稳定性外，其它化合物测定结果均具有良好的准确度和精密度；③处理后样品室温放置20h稳定性：样本处理后于室温放置20h，除GABA测定值低于名义值外，其它化合的测定值和名义值相比，有较好的准确度和精密度；④长期稳定性：低、高两个浓度的质控样品于-80℃冰箱中保存，GABA和DA表现出较差的稳定性，这与二者的性质是相符的；其它化合物表现出良好的长期保存稳定性。上述稳定性考察结果显示在室温放置、反复冻融、处理后样本在自动进样器放置、及长期冻存等均会造成GABA和DA的降解，避免未知样本的反复冻融、进行快速的样本前处理、控制每个分析批的大小对于这两个化合物的测定很重要，而本发明所提供的检测方法的样品前处理简便，将每个分析批的样本处理时间控制在2小时之内，同时每个分析批的样本数较少，以保证了分析结果的准确性。
附图说明
利用附图对发明作进一步说明，但附图中的实施例不构成对本发明的任何限制，对于本领域的普通技术人员，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据以下附图获得其它的附图。
图1是本发明所使用的GABA标准曲线图。
图2是本发明所使用的DA标准曲线图。
图3是本发明所使用的5-TH标准曲线图。
图4是本发明所使用的Amp标准曲线图。
图5是本发明所使用的MA标准曲线图。
图6是本发明所使用的MDA标准曲线图。
图7是本发明所使用的MDMA标准曲线图。
图8是本发明所使用的MDEA标准曲线图。
具体实施方式
结合以下实施例对本发明作进一步描述。
一种血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类毒品的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：标准溶液的配制：包括GABA、Glu、DA、5-TH、和苯丙胺类储备液、标准曲线工作溶液、质控工作溶液的配制以及内标化合物储备液和工作溶液的配制；其中，所述苯丙胺类储备液为商品化的1mg·mL-1的甲醇溶液，所述Glu采用内标一点法测定，无标准曲线工 作溶液；
S2：“空白”血清样本和吸毒人员血清样本的处理：吸取“空白”血清样本，分别加入GABA、DA、5-TH及苯丙胺类化合物的标准曲线工作溶液或质控工作溶液，再依次加入含Glu-d5三氯乙酸溶液和含DA-d4和Amp-d6的乙腈溶液，涡旋震荡、离心，吸取上清液待测；未知生物样本除不添加标准曲线或质控工作溶液外，其它处理方式同上，并采用50％的甲醇-水溶液补齐预设体积；
S3：液相色谱-质谱联用仪检测：将步骤S2中获得的上清液进行检测，检测的化合物包括GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类，所述苯丙胺类包括Amp、MA、MDA、MDMA及MDEA；
S4：标准曲线的绘制，其中，所述Glu采用内标一点法测定，无标准曲线。
优选地，所述三氯乙酸溶液、乙腈、“空白”血清样本或吸毒人员血清样本的体积比为1:1:1；所述涡旋设置为4000rpm、5min，离心为4℃14000rpm、10min。
优选地，步骤S2中“空白”血清样本和吸毒人员血清样本的体积为80μL，所述添加的GABA、DA、5-TH及苯丙胺类化合物的标准曲线工作溶液或质控工作溶液的体积为20μL，含Glu-d5三氯乙酸溶液的体积为80μL，含DA-d4和Amp-d6的乙腈溶液体积为80μL；所述三氯乙酸溶液浓度为0.6N，其中，所述Glu采用内标一点法测定，无标准曲线工作溶液，样本的预设体积采用50％的甲醇-水溶液补齐至预定值。
优选地，步骤S1中的所述标准工作溶液的制备方法如下：
(1)GABA标准溶液：称取GABA标准品11.00mg，置10mL容量瓶中，按标准曲线和质控工作溶液要求，以纯水溶解得GABA 1.10mg·mL-1标准品储备液，以纯水依次稀释得到系列工作溶液和质控溶液；
(2)Glu标准溶液：称取Glu 21.00mg于10mL容量瓶内，以纯水溶解，得到2.10mg·mL-1标准品储备液，依据需要配制相应浓度的Glu质控工作溶液；
(3)DA和5-HT标准溶液：称取DA·HCl 11.37mg和5-HT·HCl 10.37mg标品，置于10mL棕色容量瓶，用甲醇溶解定容至刻度；按照标准曲线及质控工作溶液要求，用甲醇梯度稀释获得DA和5-HT混合标准曲线工作溶液和质控工作溶液；
(4)苯丙胺类标准溶液：苯丙胺类储备液为商品化的1.00mg·mL-1的甲醇溶液，标准曲线工作溶液和质控工作溶液由母液用甲醇进行梯度稀释获得；
(5)内标化合物工作溶液：
①Glu-d5内标工作溶液：每次称取约2mg Glu-d5，使用约1mL纯水溶解，作为Glu-d5内标储备液，Glu-d5储备液用0.6N三氯乙酸水溶液稀释成10000ng·mL-1内标工作溶液；
②DA-d4和Amp-d6混合内标工作溶液：每次称取约1mg DA-d4-HCl样品，使用约1mL甲醇溶解，获得DA-d4含量为1mg·mL-1，作为DA-d4储备液；Amp-d6内标工作溶液为100μg/mL甲醇溶液，混合DA-d4和Amp-d6母液，用乙腈稀释，配制成二者浓度分别为250ng·mL-1和200ng·mL-1的混合内标工作溶液；
上述两组内标化合物工作溶液均作为血清蛋白沉淀剂使用。
优选地，步骤S4中使用的标准曲线样品配制方法如下：
(1)使用“空白”血清配制含药浓度如下述的标准曲线血清样本：
①GABA：25、62.5、125、313、625、及1250ng·mL-1；
②DA、Amp、MA、MDA、MDMA、MDEA：5、10、25、62.5、125、250、及500ng·mL-1；
③5-HT：15、30、75、188、375、750、及1500ng·mL-1；
④Glu采用内标一点法定量，未配制标准曲线血清样本；
在上述各含药血清样本中分别加入80μL含各内标化合物的乙腈和三氯乙酸溶液，涡旋振荡、离心；以各待测物的浓度为横坐标，各待测物的峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归；
(2)配制质控血清样品：质控血清样品的处理方法与步骤S2一致，上述各个化合物的质控样本低浓度和高浓度依次为GABA：71.4、469ng·mL-1；Glu：10000,65600ng·mL-1；DA、Amp、MA、MDA、MDMA、MDEA：15、400ng·mL-1；5-HT：45、1200ng·mL-1。
优选地，所述步骤S3中采用的液相色谱-质谱联用仪为美国Agilent HP1100四元低压高效液相色谱系统，包括自动进样器、柱温箱；美国API4000QQQ型质谱仪，控制软件为Analyst 1.4版本；所述液相色谱-质谱联用仪检测方法的操作条件如下：
①色谱柱：ES Epic Polar Hydro C18 150mm×4.6mm，5μm，接菲罗门SecurityGuard C18保护柱；
②柱温：室温；
③流动相：甲醇(B相)：0.1％甲酸-水(A相)；
④流速：0.9mL·min-1，梯度洗脱，0～6.00min，B相5％～95％；6.01～6.50min，B相95％～95％；6.51～12.00min B相5％B；
⑤进样量5μL；分流比48:52，48％洗脱液进质谱仪；
⑥质谱条件：ESI离子源，正离子检测模式；碰撞气：4L·h-1；气帘气：20L·h-1；GS1：40L·h-1，GS2：40L·h-1；毛细管电压：5000V；雾化温度：500℃；多级反应监测，各化合物碰撞能均为：16.0V，解簇电压：55.0V。
优选地，采用多级反应监测方式，监测的待测化合物离子对：GABA(104.000→87.000)、Glu(148.000→84.200)、DA(154.200→137.000)、5-HT(177.200→160.000)、Amp(136.000→91.000)、MA(150.000→91.000)、MDA(180.000→105.000)、MDMA(194.000→135.000)、MDEA(208.200→163.200)；内标化合物离子对：Glu-d5(153.200→88.200)、DA–d4(158.400→141.200)及Amp-d6(141.200→93.000)。
优选地，采用所述步骤S1-S3的检测方法，各化合物的线性范围依次为：GABA：25～1250ng·mL-1；DA：5～1000ng·mL-1、Amp、MA、MDA、MDMA、MDEA：5～500ng·mL-1；5-HT：15～1500ng·mL-1(Glu采用内标一点法测定，未考察线性范围)；在上述线性范围内，各化合物线性回归系数r2≥0.98，满足定量要求；各化合物的定量下限依次为(Glu采用内标一点法定量，未考察定量限)：GABA：25ng·mL-1；5-HT：15ng·mL-1；DA、Amp、MA、MDMA、MDEA：5ng·mL-1，且信号强度较大，信噪比均远大于10，具有良好的重现性，重复6个样本，响应值变异RSD≤15％。
优选地，在一定浓度范围内，在纯水中添加相同浓度的Glu和Glu-d5，二者具有相近强度的质谱信号响应，在“空白”血清中(本底含有Glu)添加相同浓度的Glu和Glu-d5，Glu质谱响应强度的增加与Glu-d5质谱信号响应强度相近。
下面结合所提供的实施例进行详细说明：
实例1：
吸毒人员血清样本中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类化合物检测方法的建立，包括以下步骤：
(1)标准溶液的配制：
①GABA：称取GABA标准品11.00mg，置10mL容量瓶中，按标准曲线和质控工作溶液要求，以纯水溶解得GABA 1.10mg·mL-1标准品储备液，以纯水依次稀释得到系列工作溶液和质控工作溶液。
②Glu：称取Glu 21.00mg于10mL容量瓶内，以纯水溶解，得到2.10mg·mL-1，依据需要配制相应浓度的Glu工作溶液。
③DA和5-HT：称取DA·HCl(11.37mg)和5-HT·HCl(10.37mg)标品，置于10mL棕色容量瓶，用甲醇溶解定容至刻度。按照校准曲线及质控工作溶液要求，用甲醇梯度稀释获得DA和5-HT混合工作溶液和质控工作溶液。
④苯丙胺类：苯丙胺类储备液为商品化的1.00mg·mL-1的甲醇溶液，标准曲线工作溶液 和质控工作溶液由母液用甲醇进行梯度稀释获得。
⑤内标化合物工作溶液：Glu-d5：每次准确称取约2mg，用约1mL纯水溶解，作为Glu-d5内标储备液，Glu-d5储备液用0.6mol·L-1三氯乙酸水溶液稀释成10000ng·mL-1工作溶液。
⑥DA-d4：每次称取约1mg DA-d4-HCl样品，使用约1mL甲醇溶解，作为DA-d4储备液。Amp-d6为100μg/mL甲醇溶液，混合DA-d4和Amp-d6母液，用乙腈稀释，配制成浓度分别为250ng·mL-1和200ng·mL-1的溶液。
所有储备液和工作溶液均放置于-80℃冰箱。
(2)血清样本处理：
吸取人“空白”血清样本80μL、分别加入各化合物标准曲线工作溶液或质控工作溶液20μL、再依次加入80μL Glu-d5三氯乙酸溶液和80μL DA-d4和Amp-d6的乙腈溶液，涡旋震荡5min，14000rpm、4℃离心10min。取上清进样，液相色谱-质谱联用仪分析。吸毒人员未知生物样本除不添加各化合物标准曲线工作溶液或质控工作溶液外，处理方式同上，用50％甲醇-水补齐体积。
(3)标准曲线的绘制：
①标准曲线样品配制：使用“空白”血清配制含药浓度如下述样本：
GABA：25、62.5、125、313、625、及1250ng·mL-1；DA、Amp、MA、MDA、MDMA及MDEA：5、10、25、62.5、125、250、及500ng·mL-1；5-HT：15、30、75、188、375、750、及1500ng·mL-1(Glu采用内标一点法测定，无标准曲线)。分别加入80μL含各内标物三氯乙酸和乙腈溶液，涡旋振荡、离心，以各待测物浓度与内标浓度比值为横坐标，待测物峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归，结果如图1至图8所示。
②质控血清样本配制：样品处理方法同上，各化合物质控样本浓度依次为GABA：71.4、469ng·mL-1；Glu：10000、65600ng·mL-1；DA、Amp、MA、MDA、MDMA、MDEA：15、400ng·mL-1；5-HT：45、1200ng·mL-1。
(4)液相色谱质谱联用仪：美国Agilent HP1100四元低压高效液相色谱系统，包括自动进样器、柱温箱；美国API4000QQQ型质谱仪，控制软件为Analyst 1.4版。
(5)液相色谱-质谱运行参数：
①色谱方法：色谱柱ES Epic Polar Hydro C18(150mm×4.6mm，5μm)Column；菲罗门Security Guard C18保护柱；流动相为甲醇(B)：0.1％甲酸-水(A)，流速0.9mL·min-1，梯度洗脱，0～6.00min，B相5％～95％；6.01～6.50min，B相95％～95％；6.51～12.00min B相5％B；柱温为室温；进样量5μL；分流比48:52，48％洗脱液进质谱仪。
②质谱条件：ESI离子源、正离子模式、碰撞气4L·h-1、气帘气20L·h-1、GS140L·h-1、GS240L·h-1、毛细管电压5000V、雾化温度500℃、多级反应监测(MRM)、各化合物碰撞能均为16.0V、解簇电压55.0V。
(6)方法专属性：
按上述样本处理方法，处理6个来源“空白”血清样本和添加定量下限工作溶液的该6个“空白”血清样本，同时，进样各化合物标准品进行分析，通过比较上述三组色谱图，考察内源性化合物的干扰情况，同时确定定量下限浓度。
(7)基质效应和回收率：
基质效应：取“空白”血清80μL，除不添加各化合物质控标准溶液液外，按上述质控血清样品处理方法操作，取上清液，分别加入各化合物质控工作溶液，进样测定，记录峰面积为Am；用水代替血清按上述血清样品处理方法处理，加入各化合物质控样品，进样测定，记录峰面积A0，以Am/A0*100评价方法基质效应。
回收率：按上述血清样本处理方法处理各化合物质控样品，测定并记录峰面积，得色谱峰面积Aq。以Aq/A0*100计算得血清样品处理方法的绝对回收率。
(8)精密度和准确度考察：
以“空白”血清配制各化合物质控样品，按上述血清样本处理方法，低、高质控浓度平行处理及测定六份样本，此为一个分析批，重复三个分析批，分别用随行标准曲线回算浓度，评价该方法的精密度及准确度。
(9)样品稳定性的考察：
配制各化合物质控样品，每个浓度配制若干份。配制的含药质控样品用于下述稳定性考察：
1)室温放置稳定性：每个质控浓度取3份置于室温，放置6h后按质控血清样品处理方法处理并进行检测。
2)反复冻融稳定性：每个浓度取3份置于室温和-80℃，反复冻融3次，按质控血清样品处理方法处理并进行检测。
3)处理后样品稳定性：每个浓度取3份，处理后置于自动进样器，室温放置20h考察处理后样品稳定性。
4)长期稳定性:每个浓度配制9份，放置于-80℃冰箱保存，以20～30d为间隔，每次检测3份样本，考察长期稳定性。
按照上述方法进行检测实验，所得的实验结果如下所示：
1.方法专属性：
本发明采用多级反应监测方式，监测的离子对为GABA(104.000→87.000)、Glu(148.000→84.200)、DA(154.200→137.000)、5-HT(177.200→160.000)、Amp(136.000→91.000)、MA(150.000→91.000)、MDA(180.000→105.000)、MDMA(194.000→135.000)、MDEA(208.200→163.200)、Glu-d5(153.200→88.200)、DA-d4(158.400→141.200)及Amp-d6(141.200→93.000)。在定量下限下，各待测化合物无明显的基质干扰，信噪比均远大于10。
2.线性范围和定量下限：
各化合物的线性范围依次为：GABA：25～1250ng·mL-1；DA、Amp、MA、MDA、MDMA、MDEA：5～500ng·mL-1；5-HT：15～1500ng·mL-1。在上述线性范围内，各化合物线性回归系数r2≥0.98，满足定量要求(Glu采用内标一点法定量，未考察线性范围)。各化合物在定量下限添加浓度下的信噪比均远大于10，重现性良好(Glu采用内标一点法定量，未考察定量下限)。定量下限平行六个样品处理，通过标准曲线回算值RSD≤15％。
3.基质效应和回收率：
本发明测定的化合物均为小分子极性化合物，在色谱柱上不易保留，出峰较早，一般易出现较大的基质干扰和较低的回收率。各化合物在低、高两个浓度的基质效应和绝对回收率见下表1和表2。
表1各化合物低、高浓度质控的基质效应
a)低浓度质控
b)高浓度质控
表1的数据显示，由于本实验考察的各化合物的性质相差较大，各化合物的基质效应存在较大差异，其中，GABA、Glu和DA的基质效应影响最大，并且在低、高两个质控浓度下的基质效应大小稍有不同。但所有化合物低、高两个质控浓度水平的基质效应具有良好的精密度，RSD值均≤15％。本实验使用的内标化合物均为氘代内标，氘代内标的使用能够有效降低基质效应对该氘代内标相应的化合物测定准确度的影响。
表2各化合物低、高浓度质控的回收率
a)低浓度质控
b)高浓度质控
表2的数据显示，由于本研究涉及的各化合物的极性较大，各化合物的绝对回收率相对较低，但各化合物在低、高两个质控浓度下的回收率具有较好的精密度。高回收率能够提高方法的稳定性，在标准曲线线性满足要求的情况下，低回收率不影响测定结果的准确性。
4.精密度和准确度考察：
各化合物在低、高两个浓度水平的精密度和准确度详见表3。
表3各化合物的准确定和精密度考察
a)低浓度质控
b)高浓度质控
表3的数据显示，各化合物的低、高两个质控浓度的准确度，除5-HT高浓度质控外，均满足测定值与名义值的比值在±15％以内。5-HT的高浓度质控的准确度在80％以上，基本满足检测方法的要求。这与其较强的碱性性质容易造成拖尾有关，但5-HT在未知样本中的含量更靠近低浓度质控，因此，对未知样本的测定结果是可信的。而各化合物在低、高两个 浓度下的批内和批间精密度在±15％之间。因此本方法满足检测的准确度和精密度要求。
5.样品稳定性的考察：
各化合物的稳定性考察结果见表4，5，6，7。
表4室温放置稳定性考察
从表4可已看出，GABA测定值与名义值相比，有较大的降低，但表现出良好的精密度；而DA在“空白”血浆样本中具有极大的不稳定性；GABA和DA不稳定性与其化合物性质相符。其它化合物均表现出良好的准确度和精密度。上述数据表明，在样本处理过程中，快速的样本处理对保证检测结果的准确性是至关重要的，尤其对在血清中不稳定的DA和GABA的检测至关重要。关于未知生物样本，尽量加快样本采集、处理、分装的过程，对保证测定结果的稳定性很重要。本实验在未知样本分析过程中，从样本的解冻到处理完成、上机分析，整个过程控制在2个小时以内，以尽可能降低由于化合物降解对检测结果的不利影响。
表5反复冻融稳定性考察
表5的数据显示，经过3次反复冻融过程，GABA表现出相对较差的稳定性，而所有化合物测定结果均具有良好的精密度。关于未知生物样本，避免在转运、保存过程中冻融的发生，以保证测定结果的准确性。本实验中的未知样本，从采集到检测仅经历一次冻融过程，尽可能保证检测结果能够反映未知生物样本中待测化合物的含量。
表6处理后样品稳定性考察
表6的数据显示，样本处理后于室温放置20h，除GABA测定值低于名义值外，其它化合的测定值和名义值比较，有较好的准确度和精密度。所以，一次处理较少数量的样本，缩短分析批时间的长度对准确测定GABA是必要的。
表7长期稳定性考察
表7的数据显示，GABA和DA表现出较差的稳定性，这与二者的性质是相符的。其它化合物表现出良好的长期保存稳定性。未知样本采集后，在尽可能短的时间内检测是必要的，并且尽可能保存着-80℃冰箱，以降低待测化合物在样本保存过程中降解对检测结果的不利影响。
实例2：
吸毒人员血清样本测定
吸毒人员血清样本处理方法同上述实例1“空白”血清样本处理方法，随机取25例吸毒人员血清样本，经样本处理、进样LC-MS/MS采集数据，通过随行标准曲线计算未知吸毒人员血清样本的目标化合物(Glu采用内标一点法定量)，计算结果如表8所示。
表8吸毒人员血清样本的目标化合物计算结果
BLOQ:检出值低于定量下限；ND：未检出；
表8的结果显示，MDA，MDMA及MDEA在吸毒人员血清中未检出，这与目前国内苯丙胺类毒品吸食情况相符，此三种毒品在缴获的毒品中并不常见。GABA的血清含量基本在定量下限处，这是向非空白基质中添加标品作标准曲线，测定内源性化合物过程中的常见的问题和难题。DA在血清中含量极低，降解迅速，本法未能准确测定出DA的含量。5-HT是另一个儿茶酚胺类化合物，也具有易被氧化的特点，从测定结果来看不同个体之间浓度差异较大。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (7)

1.一种血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类毒品的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：标准溶液的配制：包括GABA、Glu、DA、5-TH、和苯丙胺类储备液、标准曲线工作溶液、质控工作溶液的配制以及内标化合物储备液和工作溶液的配制；其中，所述苯丙胺类储备液为商品化的1mg·mL-1的甲醇溶液，所述Glu采用内标一点法测定，无标准曲线工作溶液；其中GABA为Y-氨基丁酸，Glu为谷氨酸，DA为多巴胺，5-TH为羟色胺；
S2：“空白”血清样本和吸毒人员血清样本的处理：吸取“空白”血清样本，分别加入GABA、DA、5-TH及苯丙胺类化合物的标准曲线工作溶液或质控工作溶液，再依次加入含Glu-d5三氯乙酸溶液和含DA-d4和Amp-d6的乙腈溶液，涡旋震荡、离心，吸取上清液待测；未知生物样本除不添加标准曲线或质控工作溶液外，其它处理方式同上，并采用50％的甲醇-水溶液补齐预设体积；
S3：液相色谱-质谱联用仪检测：将步骤S2中获得的上清液进行检测，检测的化合物包括GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类，所述苯丙胺类包括Amp、MA、MDA、MDMA及MDEA；其中Amp为苯丙胺，MA为甲基苯丙胺，MDA为3,4-亚甲基二氧基苯丙胺，MDMA为3,4-亚甲基二氧基-N-甲基苯丙胺，MDEA为N-甲基二乙醇胺；
所述液相色谱-质谱联用仪为美国AgilentHP1100四元低压高效液相色谱系统，包括自动进样器、柱温箱；美国API4000QQQ型质谱仪，控制软件为Analyst1.4版本；所述液相色谱-质谱联用仪检测方法的操作条件如下：
①色谱柱：ESEpicPolarHydroC18150mm×4.6mm，5μm，接菲罗门SecurityGuardC18保护柱；
②柱温：室温；
③流动相：B相为甲醇：A相为0.1％甲酸-水；
④流速：0.9mL·min-1，梯度洗脱，0～6.00min，B相5％～95％；6.01～6.50min，B相95％～95％；6.51～12.00minB相5％B；
⑤进样量5μL；分流比48:52，48％洗脱液进质谱仪；
⑥质谱条件：ESI离子源，正离子检测模式；碰撞气：4L·h-1；气帘气：20L·h-1；GS1：40L·h-1，GS2：40L·h-1；毛细管电压：5000V；雾化温度：500℃；多级反应监测，各化合物碰撞能均为：16.0V，解簇电压：55.0V；
S4：标准曲线的绘制，其中，所述Glu采用内标一点法测定，无标准曲线；
所述三氯乙酸溶液、乙腈、“空白”血清样本或吸毒人员血清样本的体积比为1:1:1；所述涡旋设置为4000rpm、5min，离心为4℃14000rpm、10min。
2.根据权利要求1所述的一种血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类毒品的检测方法，其特征在于：步骤S2中“空白”血清样本和吸毒人员血清样本的体积为80μL，所述添加的GABA、DA、5-TH及苯丙胺类化合物的标准曲线工作溶液或质控工作溶液的体积为20μL，含Glu-d5三氯乙酸溶液的体积为80μL，含DA-d4和Amp-d6的乙腈溶液体积为80μL；所述三氯乙酸溶液浓度为0.6N，其中，所述Glu采用内标一点法测定，无标准曲线工作溶液，样本的预设体积采用50％的甲醇-水溶液补齐至预定值。
3.根据权利要求1所述的一种血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类毒品的检测方法，其特征在于：步骤S1中的所述标准工作溶液的制备方法如下：
(1)GABA标准溶液：称取GABA标准品11.00mg，置10mL容量瓶中，按标准曲线和质控工作溶液要求，以纯水溶解得GABA1.10mg·mL-1标准品储备液，以纯水依次稀释得到系列工作溶液和质控溶液；
(2)Glu标准溶液：称取Glu21.00mg于10mL容量瓶内，以纯水溶解，得到2.10mg·mL-1标准品储备液，依据需要配制相应浓度的Glu质控工作溶液；
(3)DA和5-HT标准溶液：称取DA·HCl11.37mg和5-HT·HCl10.37mg标品，置于10mL棕色容量瓶，用甲醇溶解定容至刻度；按照标准曲线及质控工作溶液要求，用甲醇梯度稀释获得DA和5-HT混合标准曲线工作溶液和质控工作溶液；
(4)苯丙胺类标准溶液：苯丙胺类储备液为商品化的1.00mg·mL-1的甲醇溶液，标准曲线工作溶液和质控工作溶液由母液用甲醇进行梯度稀释获得；
(5)内标化合物工作溶液：
①Glu-d5内标工作溶液：每次称取约2mgGlu-d5，使用约1mL纯水溶解，作为Glu-d5内标储备液，Glu-d5储备液用0.6N三氯乙酸水溶液稀释成10000ng·mL-1内标工作溶液；
②DA-d4和Amp-d6混合内标工作溶液：每次称取约1mgDA-d4-HCl样品，使用约1mL甲醇溶解，获得DA-d4含量为1mg·mL-1，作为DA-d4储备液；Amp-d6内标工作溶液为100μg/mL甲醇溶液，混合DA-d4和Amp-d6母液，用乙腈稀释，配制成二者浓度分别为250ng·mL-1和200ng·mL-1的混合内标工作溶液；
上述两组内标化合物工作溶液均作为血清蛋白沉淀剂使用。
4.根据权利要求1所述的一种血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类毒品的检测方法，其特征在于：步骤S4中使用的标准曲线样品配制方法如下：
(1)使用“空白”血清配制含药浓度如下述的标准曲线血清样本：
①GABA：25、62.5、125、313、625、及1250ng·mL-1；
②DA、Amp、MA、MDA、MDMA、MDEA：5、10、25、62.5、125、250、及500ng·mL-1；
③5-HT：15、30、75、188、375、750、及1500ng·mL-1；
④Glu采用内标一点法定量，未配制标准曲线血清样本；
在上述各含药血清样本中分别加入80μL含各内标化合物的乙腈和三氯乙酸溶液，涡旋振荡、离心；以各待测物的浓度为横坐标，各待测物的峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，采用加权最小二乘法进行线性回归；
(2)配制质控血清样品：质控血清样品的处理方法与步骤S2一致，上述各个化合物的质控样本低浓度和高浓度依次为GABA：71.4、469ng·mL-1；Glu：10000,65600ng·mL-1；DA、Amp、MA、MDA、MDMA、MDEA：15、400ng·mL-1；5-HT：45、1200ng·mL-1。
5.根据权利要求1所述的一种血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类毒品的检测方法，其特征在于：采用多级反应监测方式，监测的待测化合物离子对：GABA为104.000→87.000、Glu为148.000→84.200、DA为154.200→137.000、5-HT为177.200→160.000、Amp为136.000→91.000、MA为150.000→91.000、MDA为180.000→105.000、MDMA为194.000→135.000、MDEA为208.200→163.200；内标化合物离子对：Glu-d5为153.200→88.200、DA–d4为158.400→141.200及Amp-d6为141.200→93.000。
6.根据权利要求1所述的一种血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类毒品的检测方法，其特征在于：采用所述步骤S1-S3的检测方法，各化合物的线性范围依次为：GABA：25～1250ng·mL-1；DA：5～1000ng·mL-1、Amp、MA、MDA、MDMA、MDEA：5～500ng·mL-1；5-HT：15～1500ng·mL-1，Glu采用内标一点法测定，未考察线性范围；在上述线性范围内，各化合物线性回归系数r2≥0.98，满足定量要求；各化合物的定量下限依次为：GABA：25ng·mL-1；5-HT：15ng·mL-1；DA、Amp、MA、MDMA、MDEA：5ng·mL-1，Glu采用内标一点法定量，未考察定量限，且信号强度大，信噪比均大于10，具有良好的重现性，重复6个样本，响应值变异RSD≤15％。
7.根据权利要求1所述的一种血清中GABA、Glu、DA、5-HT及苯丙胺类毒品的检测方法，其特征在于：在纯水中添加相同浓度的Glu和Glu-d5，二者具有相近强度的质谱信号响应，本底含有Glu，在“空白”血清中添加相同浓度的Glu和Glu-d5，Glu质谱响应强度的增加与Glu-d5质谱信号响应强度相近。
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