CN112824889A - 基于液相色谱-质谱分析毒品对单胺类转运体作用的方法 - Google Patents

基于液相色谱-质谱分析毒品对单胺类转运体作用的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属生物分析技术领域，涉及毒品对单胺类转运体作用的分析方法，具体涉及一种基于液相色谱‑质谱分析毒品对单胺类转运体作用的方法，本方法可用于研究毒品对多巴胺转运体和5‑羟色胺转运体作用机制。该方法灵敏度高、特异性强、安全性高，可用于替代传统的放射性同位素检测法。

Description

基于液相色谱-质谱分析毒品对单胺类转运体作用的方法
技术领域
本发明属生物分析技术领域，涉及毒品对单胺类转运体作用的分析方法，具体涉及一种基于液相色谱-质谱分析毒品对单胺类转运体作用的方法，本方法可用于研究毒品对多巴胺转运体和5-羟色胺转运体作用机制。该方法灵敏度高、特异性强、安全性高，可用于替代传统的放射性同位素检测法。
背景技术
现有技术公开了神经系统中的单胺类转运体是若干毒品的主要作用靶点。单胺类转运体是SLC6溶质转运蛋白的一类，包括多巴胺转运体(dopamine transporter，DAT)、5-羟色胺转运体(serotonin transporter，SERT)等。研究显示，毒品与单胺类转运体的作用主要分为两类，一类是作为单胺类转运体的底物，能促进单胺类神经递质的释放，如甲基苯丙胺；另一类是作为单胺类转运体的抑制剂，能抑制单胺类神经递质的重摄取，如可卡因；这两类作用均会导致细胞外的单胺类神经递质浓度上升。
研究实践中，为了研究毒品与单胺类转运体的作用机制，使用高表达单胺类转运体的HEK293细胞模型是较为常用的方法。在通过转染技术使HEK293细胞特异性地高表达单胺类转运体后，传统的研究方法是采用[3H]标记的转运体的作用底物，通过液体闪烁计数器(liquid scintillation counter)进行检测，但这种放射性同位素检测方法，除了[3H]标记的底物价格昂贵外，还存在放射性安全隐患，需要经严格培训的特定人员进行操作，并涉及所使用样品及剩余[3H]标记底物的后续处理等问题。
基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种分析毒品对单胺类转运体作用的方法，具体涉及一种基于液相色谱-质谱分析毒品对单胺类转运体作用的方法，本发明方法可用于研究分析毒品对多巴胺转运体和5-羟色胺转运体作用机制；通过经典的毒品(苯丙胺与可卡因)验证，本方法所得结果与采用放射性同位素检测方法一致，且操作更加简便、快捷、安全，可替代传统的放射性同位素检测方法。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状，提供一种分析毒品对单胺类转运体作用的方法，具体涉及一种基于液相色谱-质谱分析毒品对单胺类转运体作用的方法，本发明方法可用于研究分析毒品对多巴胺转运体和5-羟色胺转运体作用机制；通过经典的毒品(苯丙胺与可卡因)验证，本方法所得结果与采用放射性同位素检测方法一致，且操作更加简便、快捷、安全，可替代传统的放射性同位素检测方法。
本发明的基于液相色谱-质谱分析毒品对单胺类转运体作用的方法，其包括，构建特异性高表达DAT和SERT的HEK293细胞，制订促释放实验和重摄取抑制实验的操作流程，建立采用LC-MS/MS测定细胞模型中多巴胺(DA)和5-羟色胺(5-HT)浓度水平的分析技术，该方法可用于毒品与单胺类转运体的作用机制的研究。
更具体的，本发明的基于液相色谱-质谱分析毒品对单胺类转运体作用的方法，其包括步骤，
(1)构建DAT和SERT过表达HEK293细胞系；
(2)建立检测HEK293细胞中DA和5-HT的LC-MS/MS检测分析技术；
(3)制订毒品对DAT和SERT的重摄取抑制作用实验的操作流程；
(4)制订毒品对DAT和SERT的促释放作用实验的操作流程。
本发明通过经典的毒品(苯丙胺与可卡因)验证，本方法所得结果与采用放射性同位素检测方法一致，并且具有更高的可操作性和安全性，可用于替代传统的放射性同位素检测方法。
本发明方法可用于毒品与多巴胺转运体(DAT)、5-羟色胺转运体(SERT)作用机制的研究，能替代传统的放射性同位素标记检测方法。
本发明方法与传统的放射性同位素检测方法相比，具有以下明显优势：
(1)建立了一种可以应用于HEK293细胞中DA和5-HT检测的LC-MS/MS分析技术，可以用于HEK293细胞中DA和5-HT的同时定性及定量分析，具有较高的灵敏度和较宽的线性范围。
(2)本方法可以替代传统的放射性同位素检测法用于分析研究毒品与转运体的作用机制，具有更高的可操作性和安全性。
(3)本方法适用范围广，既可以应用于分析作为单胺类转运体底物的毒品，也可应用于分析作为单胺类转运体抑制剂的毒品。
附图说明
图1是质粒图谱，其中，(A)pcDNA3.1-DAT，(B)pcDNA3.1-SERT质粒图谱。
图2是DA和5-HT提取离子流图，其中，A，空白样品；B，标准添加样品；C，实际样品。
具体实施方式
实施例1
1，DAT和SERT过表达细胞系的构建
1.1细胞培养
HEK293细胞培养于含10％标准胎牛血清、60U/mL-1青霉素、100μmol/L链霉素的DMEM培养基中，培养环境为37℃、5％CO2、湿度饱和，培养液每72h更换1次。待HEK293细胞融合达80％以上后按1:4的比例传代。
1.2DAT和SERT质粒
质粒pcDNA3.1-DAT及pcDNA3.1-SERT质粒图谱如图1所示，在HindIII和Xhol酶切位点之间分别将基因DAT及SERT的cDNA全长插入pcDNA3.1载体中。
1.3DAT和SERT过表达HEK293细胞的转染
HEK293细胞提前一天按照0.25-1x106 cells的密度铺于6孔板中，隔夜贴壁培养，使其转染时细胞密度保持在70％-90％。
Lipofectamine2000试剂及质粒中用Opti-MEM培养液按照试剂盒推荐配比预混，预混后形成质粒脂质体转染实验，将转染后的细胞置于37℃，5％CO2培养箱培养24小时；转染后24小时将贴壁的细胞传代至15cm培养皿，加入15～20ml培养基(DMEM，含血清)进行培养；再过24小时，抗性表达，用最佳筛选浓度的G418进行筛选(200μg/ml)，隔天换液。G418维持至空白无质粒转染组细胞大部分死亡时，将细胞培养液G418浓度降至200μg/ml维持培养，并挑取单克隆扩大培养。
1.4实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR，qPCR)法检测转染细胞系DAT和SERT的RNA表达；
为了验证转染细胞中DAT及SERT基因的表达情况，取转染后1、5、10、15代细胞进行定量qPCR方法鉴定。
1.4.1总RNA提取
取培养好的细胞离心去掉上清，加入350μLRLT(含DTT)裂解液，12,000rpm离心3min，取上清备用；在上清液中加入350μL 70％乙醇溶液，用枪吹打混匀；将上清液转至RNeasy Mini spin柱子中，并将吸附柱置于2ml收集管中，12,000rpm离心30s，去除收集液；往吸附柱加入700μL Buffer RW1，12,000rpm离心30s，去除收集液；往吸附柱加入500μLBuffer RPE，12,000rpm离心30s，去除收集液；
重复加入500μL Buffer RPE，12,000rpm离心2min，去除收集液；将吸附柱置于RNA酶处理过的1.5ml收集管，加入50μL RNase-Free水到吸附膜中，静置1min，12,000rpm离心1min洗脱RNA。检测RNA浓度并用1％凝胶电泳鉴定RNA是否存在降解。
1.4.2mRNA逆转录获取cDNA
按照逆转录试剂盒操作方法制备20μL反应体系，体系中加入10x RT buffer2μL，25x dNTP 0.8μL，10x RT随机引物2μL，反转录酶1μL，按照测得RNA浓度计算加入体系2ug的总RNA，不足体积用RNase-Free水补齐；
在PCR仪中按照25℃10min，37℃120min，65℃5min，4℃进行逆转录实验，实验结束后cDNA产物置于4℃备用，-20℃保存。
1.4.3实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR)实验
以GADPH管家基因为内参，设计DAT及SERT引物用于鉴定转染细胞中DAT及SERT基因的表达状态；
GADPH管家基因上游引物F：5’-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3’；下游引物R：5’-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3’
DAT基因上游引物F：5’-CCAGCGTGTGGATTGATG-3’；下游引物R：5’-AAGGAGAAGACCACGAAGC-3’
SERT基因上游引物F：5’-TGGACTTCCTGCTGTCCGTGATCGG-3’；下游引物R：5’-AACAGAGGGATTCCGCCAAAGAT-3’
按照SYRB Green染料法配制10μL反应体系，SYBR Green染料5μL，上下游引物各0.5μL(10uM工作液浓度)，加入cDNA 0.5μL，不足体积用RNase-Free水补齐；
按照程序进行扩增：50℃2min，95℃2min，95℃15s、60℃1min(40次循环)实时收集荧光信号，添加溶解曲线步骤。
收集每组细胞中GADPH及DAT或SERT扩增Ct值，
计算△Ct＝Ct DAT或SERT-Ct GADPH。
实施例2建立检测HEK293细胞中DA和5-HT的LC-MS/MS分析技术
2.1样品前处理
将分别转染表达DAT和SERT的HEK293细胞用500μL KHB缓冲溶液轻轻清洗2遍，加入0.2M HOAc溶液200μL，4℃过夜，第二天收取裂解液转移至离心管中，4℃，12000rpm离心取上清，将同一药物浓度下DAT和SERT的裂解液合并，取350μL待测样品与50μL IS工作溶液，50μL 7％氨水溶液及250μL0.2％的PBA缓冲溶液(pH 8.5)充分混匀后，将混合溶液缓慢上样至预先分别采用200μL MeOH活化和200μL0.2M NH4Cl溶液(pH 8.5)平衡好的OasisHLB 96-wellμElution微萃取板上，然后分别用200μL0.2M NH4Cl溶液冲洗三次后，真空抽滤至全干，再用100μL 5％MeOH的0.2M HOAc溶液进行洗脱，并收集洗脱液用于LC-MS/MS分析检测。
2.2DA和5-HT LC-MS/MS检测方法，
2.2.1色谱条件
流动相：A相：0.01％甲酸水溶液；B相：0.01％甲酸乙腈溶液；
流速：0.25mL/min；
柱温：45℃；
进样量：10μL；
进样盘温度：5℃；
梯度洗脱条件：如表1所示。
表1.LC-MS/MS梯度洗脱条件
Figure BDA0002281331460000061
2.2.2质谱条件
电喷雾离子源(Electrospray ion source，ESI)；喷雾电压(Spray voltage)：正离子扫描(ESI+)3.0kV。鞘气(Sheath gas)：55Arb；辅助气(Aux gas)：5Arb。离子传输管温度(Ion transfer tube temperature)：350℃；雾化温度(Vaporizer temperature)：250℃。采用选择反应检测(Selective Reaction Monitoring，SRM)扫描分析。使用定性、定量两种离子对待分析对化合物进行定性确证，使用定量离子对进行定量分析，各分析物的质谱优化参数如表2所示。
表2.DA和5-HT及其内标LC-MS/MS质谱参数
Figure BDA0002281331460000062
其中：粗体为定量离子对。
2.2.3定量分析方法
将样品中DA和5-HT的峰面积与其各自对应氘代内标的峰面积比值，代入各自的标准曲线方程计算样品中各自的浓度。DA和5-HT的标准曲线方程的获得、待测物和IS的峰面积积分，峰面积比值计算及浓度的计算等均由仪器所自带的分析处理软件进行。DA和5-HT的色谱图如图2所示。
实施例3毒品对DAT和SERT的重摄取抑制作用实验
按如下操作流程：
实验前24h将分别转染表达DAT和SERT的HEK293细胞系分别进行铺板培养。细胞用500μL 37℃预热KHB缓冲溶液轻轻清洗2遍，然后分别加入250μL含系列浓度毒品的KHB缓冲溶液37℃孵育20min，然后分别加入含有DA(考察DAT)和5-HT(考察SERT)的KHB缓冲溶液50μL，使DA终浓度为1μM，5-HT终浓度为1μM。在37℃中孵育15min，弃去反应溶液终止反应后，按“2.1样品前处理”项下进行操作。非特异性结合则分别加入250μL分别含有10μM的马吲哚(考察DAT)和10μM氟西汀(考察SERT)的KHB缓冲溶液，空白对照则不加任何药物。以空白对照扣除非特异性结合后的值作为100％，其它加药组别扣除非特异性结合后与该值的比值作为重摄取抑制比，采用GraphPad Prism 7.0计算IC50并作图。
实施例4毒品对DAT和SERT的促释放作用实验
按如下操作流程：
实验前24h将分别转染表达DAT和SERT的HEK293细胞系分别进行铺板培养。细胞用500μL 37℃预热KHB缓冲溶液轻轻清洗2遍，然后分别加入250μL含DA溶液(终浓度1uM)或者5-HT(终浓度500nM)的KHB缓冲溶液，孵育20min，然后弃去反应溶液，用37℃预热KHB溶液轻洗细胞2遍，然后加入1mL含系列浓度毒品的KHB缓冲溶液，摇床300rpm，37℃孵育15min，弃去反应液终止反应，然后按“2.1样品前处理”项下进行SPE操作。非特异性结合则分别加入250μL分别含有10μM的马吲哚(考察DAT)和10μM氟西汀(考察SERT)的KHB缓冲溶液，空白对照则不加任何药物。以空白对照扣除非特异性结合后的值作为100％retain，其它加药组别扣除非特异性结合后与该值的比值作为释放retain，药物的释放百分比为100％减去释放retain后的值，采用GraphPad Prism 7.0计算EC50并作图。
本发明通过经典的毒品(苯丙胺与可卡因)验证，所得结果与采用放射性同位素检测方法一致，如表3所示。
Figure BDA0002281331460000081
95％CI:95％置信区间.n＝3：3份平行样品.DAT/SERT Ratio＝1/DAT IC50:1/SERTIC50.Inactive：释放效率<25％of Emax.
(1)Simmler,L.D.,et al.,Pharmacological characterization of designercathinones in vitro.British Journal of Pharmacology,2013.168(2):p.458-70.。
序列表
<110> 复旦大学
<120> 基于液相色谱-质谱分析毒品对单胺类转运体作用的方法
<130> 20191120
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 24
<212> DNA
<213> GADPH F
<400> 1
cggagtcaac ggatttggtc gtat 24
<210> 2
<211> 24
<212> DNA
<213> GADPH R
<400> 2
agccttctcc atggtggtga agac 24
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> DAT F
<400> 3
ccagcgtgtg gattgatg 18
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> DAT R
<400> 4
aaggagaaga ccacgaagc 19
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> SERT F
<400> 5
tggacttcct gctgtccgtg atcgg 25
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> SERT R
<400> 6
aacagaggga ttccgccaaa gat 23

Claims (4)

1.基于液相色谱-质谱分析毒品对单胺类转运体作用的方法，其特征在于，其包括步骤，
(1)构建DAT和SERT过表达HEK293细胞系；
(2)建立检测HEK293细胞中DA和5-HT的LC-MS/MS检测分析技术；
(3)制订毒品对DAT和SERT的重摄取抑制作用实验的操作流程；
(4)制订毒品对DAT和SERT的促释放作用实验的操作流程。
2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所属步骤(2)中，包括：
1)样品前处理；
2)建立DA和5-HT LC-MS/MS检测方法，其中，
色谱条件：
流动相：A相：0.01％甲酸水溶液；B相：0.01％甲酸乙腈溶液；
流速：0.25mL/min；
柱温：45℃；
进样量：10μL；
进样盘温度：5℃；
梯度洗脱条件为：
Figure FDA0002281331450000011
质谱条件为：
电喷雾离子源(Electrospray ion source，ESI)；喷雾电压(Spray voltage)：
正离子扫描(ESI+)3.0kV，鞘气(Sheath gas)：55Arb；辅助气(Aux gas)：5Arb。离子传输管温度(Ion transfer tube temperature)：350℃；雾化温度(Vaporizertemperature)：250℃。采用选择反应检测(Selective Reaction Monitoring，SRM)扫描分析；
使用定性、定量两种离子对待分析对化合物进行定性确证，使用定量离子对进行定量分析，各分析物的质谱优化参数为：
Figure FDA0002281331450000021
定量分析方法：
将样品中DA和5-HT的峰面积与其各自对应氘代内标的峰面积比值，代入各自的标准曲线方程计算样品中各自的浓度。
3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所属步骤(3)中，按如下操作流程：
实验前24h将分别转染表达DAT和SERT的HEK293细胞系分别进行铺板培养，细胞用预热KHB缓冲溶液清洗后分别加入含系列浓度毒品的KHB缓冲溶液37℃孵育，然后分别加入含有DA和5-HT的KHB缓冲溶液使DA终浓度为1μM，5-HT终浓度为1μM；在37℃中孵育，弃去反应溶液终止反应，；非特异性结合则分别加入含有10μM的马吲哚和10μM氟西汀的KHB缓冲溶液，以空白对照扣除非特异性结合后的值作为100％，其它加药组别扣除非特异性结合后与该值的比值作为重摄取抑制比，采用GraphPad Prism 7.0计算IC50并作图。
4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所属步骤(4)中，按如下操作流程：
细胞用37℃预热KHB缓冲溶液清洗后分别加入含DA溶液或者5-HT KHB缓冲溶液孵育，弃反应溶液，用KHB溶液洗细胞，加入含系列浓度毒品的KHB缓冲溶液，摇床300rpm，37℃孵育，弃反应液终止反应；非特异性结合分别加入含有10μM的马吲哚和10μM氟西汀的KHB缓冲溶液，以空白对照扣除非特异性结合后的值作为100％retain，其它加药组别扣除非特异性结合后与该值的比值作为释放retain，药物的释放百分比为100％减去释放retain后的值，采用GraphPad Prism 7.0计算EC50并作图。
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