CN111579796A - 一种高通量集成化磷酸化蛋白组学检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种高通量集成化磷酸化蛋白组学检测方法，通过将连接在链霉亲和素板上的探针与诱饵蛋白形成捕获骨架，对酪氨酸磷酸化蛋白复合物进行富集捕获，酶解得到多肽，实现减少100倍探针用量的条件下300倍灵敏度的提升。利用150μm内径自填色谱柱高效液相色谱实现短梯度快速分离，结合Q Extractive HF‑X质谱仪在DIA数据采集模式下进行高效检测，可在不损失定性与定量检测性能条件下，实现单个样品35min内分离检测。实现了对不同EGF刺激时间下与不同浓度抑制剂作用下细胞中相关信号通路蛋白磷酸化条件瞬时变化的鉴定。为酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集与鉴定提供了高通量、高灵敏、快速的检测方法。

Description

一种高通量集成化磷酸化蛋白组学检测方法

技术领域

本发明涉及蛋白质组学技术领域，涉及一种高通量、集成化酪氨酸磷酸化蛋白捕捉方法及其应用，尤其涉及一种高灵敏的集成化样品前处理方法与快速质谱检测方法。

背景技术

磷酸化酪氨酸(pTyr)蛋白及其所介导的信号蛋白复合物的异常激活常常揭示着疾病相关信号通路的激活，这类蛋白常作为生物标志物与药物靶点。因此，对这类蛋白复合物的捕捉与检测对于生物标志物及药物靶点的发现发挥着重要作用。

亲和纯化-质谱联用的蛋白质相互作用研究方法目前被广泛用于对这类蛋白复合物的捕捉与鉴定。通常，将带有特定标签的一个关键信号蛋白在活细胞当中表达，利用特定抗体对该蛋白及其相互作用的蛋白进行富集。该方法已被广泛应用于特定生长因子刺激细胞时动态pTyr信号蛋白复合物的表征。另一种方法是利用合成多肽序列或含磷酸化酪氨酸位点的全长蛋白片段作为亲和探针来从细胞或组织裂解液中亲和纯化pTyr蛋白复合物。但是亲和纯化-质谱联用的方式每次只可实现对一种特定诱饵蛋白进行检测，要实现对细胞中pTyr蛋白全面的分析是一件工程量浩大的工作。因此，有必要发展适用于对某一特定细胞系中存在的蛋白复合物进行全局特征描述的方法。天然蛋白复合物层析色谱或热邻近共聚与质谱联用的方法已被成功应用于对蛋白复合物的全面解析。但这些方法需要复杂的、多层次的层析分馏才可实现高分辨和深入的分析。

另一方面，大量工作通过对色谱分离与质谱检测过程进行通量优化，实现对蛋白复合物的高效检测。Bache等采用基于Evosep One系统的快速nano LC系统，在QExtractive HF-X质谱仪上进行数据非依赖采集(data independent acquisition，DIA)，每天可分析200个样品。Bian等采用微升级LC系统，利用1×150mm色谱柱可将色谱梯度缩短至每个样品20分钟，利用该方法进行kinobeads相关实验，可在20分钟梯度内达到常规利用nano LC系统52分钟梯度时所达到效果，这一改进大大提高了其通量。但这些方法所需初始蛋白和其他材料用量较大，因而会限制其在大规模样品中的应用。

因此，开发和优化高通量、高灵敏的样品前处理过程与分离检测步骤实现对蛋白复合物的高效鉴定分析，对于挖掘新的蛋白复合物及发蛋白复合物的新功能具有重要意义。对于蛋白组学方法的改进和创新，为研究蛋白信号转导通路提供了更加快速、灵敏、高通量的方法支撑，为蛋白标志物与药物靶点的发现提供了科学的研究方法。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种高通量、集成化的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的分析方法及其应用，所述方法利用含特定SH2结构域的诱饵蛋白与三功能基团探针连接对特定细胞中pTyr蛋白及蛋白复合物进行全面捕获，将连接有诱饵蛋白的三功能探针结合到负载有链霉亲和素的96孔板上，实现微量细胞样品中pTyr蛋白与蛋白复合物的全面富集。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明将探针与诱饵蛋白连接在负载有链霉亲和素的96孔板上，对含有磷酸化酪氨酸的蛋白质及其相互作用的蛋白质复合物进行捕获。这一操作大大降低了探针用量，同时增长了其保存时间。首先，利用三功能基团探针的NHS反应基团，将诱饵蛋白SH2结构域连接在探针上。随后，利用三功能基团探针的生物素基团与链合亲霉素基团之间的连接作用，将探针与诱饵蛋白固定在96孔板上。在含有0.02％(w/v)NaN₃的NP-40缓冲液中于4℃可保存一个月。包括以下步骤：

(1)将纯化的诱饵蛋白与探针结合，超滤；

(2)将结合了探针的诱饵蛋白加入96孔板中，孵育；

(3)加入含有稳定剂的NP-40缓冲液，保存待用。

优选地，步骤(1)中超滤完成后，利用BCA试剂盒进行浓度测定，最终保证蛋白浓度为0.02μg/μL。

优选地，步骤(2)所述孵育的时间为1.5～2.5小时，例如可以是1.5小时、1.6小时、1.7小时、1.8小时、1.9小时、2小时、2.1小时、2.2小时、2.3小时、2.4小时或2.5小时，所述孵育的温度为0～4℃，例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃或4℃。

优选地，步骤(2)所述孵育过程伴随着低转速的均匀振荡，以保证与链霉亲和素的结合。

优选地，步骤(3)中加入稳定剂可选含0.02％～0.05％(w/v)NaN₃，例如可以是0.02％、0.03％、0.04％或0.05％。

优选地，步骤(3)中加入稳定剂可选含0.02％(w/v)NaN₃的NP-40缓冲液50～100μL，例如可以是50μL、60μL、70μL、80μL、90μL或100μL。

本发明的包含SH2结构域的探针由间隔臂和连接于所述间隔臂上的SH2结构域、光反应基团和生物素形成，探针的通式例如可以是通式I：

第二方面，本发明提供了一种适用于微量细胞裂解液中pTyr蛋白质复合物检测的方法，针对于链霉亲和素负载96孔板特性，优化条件以实现高效样品捕获和酶解分析。包括以下步骤：

(1)将待测细胞或组织裂解液加入连接了诱饵蛋白与探针的链霉亲和素负载96孔板上，孵育；

(2)孵育产物于350～370nm、优选为365nm波长紫外光下照射20～40min；

(3)加入洗脱缓冲液清洗，还原、烷基化、酶解、多肽的除盐和洗脱，准备质谱分析。

本发明中，洗脱缓冲液为含5～8M(例如可以是5M、6M、7M或8M)尿素的RIPA缓冲盐，优选配方为6M尿素，1M NaCl，1％(w/v)脱氧胆酸钠，1％(w/v)十二烷基磺酸钠，1％(v/v)Triton X-100，与50mM Tris-HCl(pH 7.4)。其他操作所用到试剂(还原剂、烷基化试剂、胰蛋白酶)与缓冲盐溶液等均为本领域公知的试剂，典型但非限制性的实例为：还原剂可以选自三(2-羧乙基)膦盐酸盐，烷基化试剂可以是碘乙酰胺。

酶解过程里优化的胰蛋白酶浓度为0.1μg/50μL，即保证每个孔内加入0.1μg胰蛋白酶，50μL的30～60mM(例如可以是30mM、40mM、50mM或60mM)碳酸氢铵水溶液。这大大降低了胰蛋白酶的用量，并有效避免了因胰蛋白酶自酶切对于目标蛋白检测的影响。

第三方面，本发明提供了一种快速、高效的色谱分离方法，结合最新Q ExactiveHF-X质谱仪，对于单个样品的质谱分析时间可在35分钟以内。

(1)数据非依赖采集模式需要先利用液相色谱分馏后的相应细胞裂解液于数据依赖采集模式(data dependent acquisition，DDA)下进行建库、将1mg的HeLa细胞裂解液酶解成多肽后，利用高效液相色谱(C18色谱柱，5μm填料，2.1mm i.d.×15cm)分成12个馏分。多肽样品复溶于0.1～1％(v/v)、优选为0.1％(v/v)甲酸溶液(流动相A)，依操作要求与iRT试剂按比例混合，于15cm×50μm自制C18(1.9μm)色谱柱，Easy-nLC 1200色谱系统(ThermoFisher Scientific)中进行分离，流动相梯度如表1所示，流速600～1000nL/min、优选为800nL/min，其他色谱参数如表2所示。

表1色谱流动相梯度

流动相B(含0.1％(v/v)甲酸的乙腈)比例	时间
		0％
0％	30s
		3％	30s
9％	12min
		30％	3min
45％	30s
		98％	4min
98％	30s

表2 Q Extractive HF-X具体参数设置(DDA)

参数	设置
		Full MS resolution	120000
Full MS scan range	350-1550m/z
		Full MS AGC target	3e6
Full MS maximum IT	50ms
		dd-MS<sup>2</sup>resolution	7500
dd-MS<sup>2</sup>AGC target	1e5
		dd-MS<sup>2</sup>maximum IT	15ms
topN	50
		dd-MS<sup>2</sup>isolation window	1.2m/z
NCE	27

(2)利用本发明第二方面所述的方法处理后的多肽样品复溶于0.1％(v/v)甲酸溶液，依操作要求与iRT试剂按比例混合后，经由与(1)中同样的液相色谱与分离条件进行色谱分离，利用Q Extractive HF-X质谱在DIA模式下采集。DIA的扫描范围是350-1550m/z，将扫描范围分为不等分的40个连续的窗口，并在其中插入3次全扫描，采集窗口设置如表3所示，其中窗口之间有1m/z的重叠。Full MS的分辨率为120000，AGC target为3e6，maximumIT为50ms，DIA二级扫描分辨率为30000，AGC target为3e6，maximum IT为auto。

表3 DIA采集窗口设置

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供了一种适用于微量样品的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物检测和分析方法，对于5μg细胞裂解液即可实现靶向蛋白及相关通路蛋白的捕获与精确定量，相较于之前的方法，实现了在减少100倍探针用量的条件下300倍灵敏度的提升；

(2)本发明首次实现了诱饵蛋白的长达一个月的保存，通过将连接了探针的诱饵蛋白结合于链霉亲和素修饰的96孔板上，在含有蛋白稳定剂的缓冲溶液中，可将诱饵蛋白的保存时间由一周延长至一个月，大大提高了通量，为规模化、批量化酪氨酸磷酸化蛋白复合物的富集和鉴定及药物筛选提供了高通量的解决方案；

(3)本发明采用150μm内径的自填色谱柱，20分钟流动相梯度，结合可变窗口数据非依赖采集模式与最新Q Extractive HF-X质谱，实现在不使用柱温加热装置、不损失样品定性与定量鉴定性能的情况下，实现单个样品在35分钟内的分离和检测，大大降低样品分析时间，提高了通量，为批量化生物标志物发现与药物筛选提供技术支持；

(4)本发明用于动态检测不同EGF刺激时间下与不同浓度抑制剂作用下细胞内相关信号通路蛋白磷酸化条件瞬时变化的鉴定，对酪氨酸磷酸化抑制剂处理后药物靶点精准捕获，并对相关通路蛋白变化准确测定，可在生物标志物与药物靶点筛选发挥重要作用。

附图说明

图1为本申请操作流程示意图。

图2A为不同碳酸氢铵溶液体积下蛋白与肽段匹配谱图数量的鉴定结果，图2B为不同碳酸氢铵溶液体积下蛋白与肽段匹配谱图数量的0％漏切比例结果，图2C为不同碳酸氢铵溶液体积下变异系数分布。

图3A为不同细胞用量时在刺激条件下磷酸化酪氨酸蛋白质合物鉴定数量结果图，图3B为富集蛋白分类，图3C为本发明的方法仅5μg细胞裂解液即可实现之前方法中1.4mg细胞所达到的蛋白富集效果。

图4A为在同等探针、诱饵蛋白与细胞裂解液用量情况下，经过EGF刺激后，本方法可富集与鉴定到更多的蛋白复合物，图4B为本发明的方法与现有技术的结果比较，图4C为本发明的方法与现有技术的蛋白鉴定强度倍数差异，图4D为现有技术的检测流程产生空间位阻效应。

图5A为不同保存时间下定量蛋白数量，图5B为不同保存时间下各样品间Pearson相关系数图，图5C为已报道EGFR信号通路蛋白随着保存时间增长鉴定效果结果图。

图6A为不同色谱柱内径对鉴定影响结果，图6B为数据非依赖采集模式窗口优化结果。

图7A为不同EGF刺激时间条件及不同AG1478抑制剂浓度条件下EGFR信号通路蛋白动态变化，图7B为EGFR、CBL、SHC1三种蛋白随着抑制剂鉴定强度变化结果图。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1不同碳酸氢铵溶液体积对酶解效率的优化

本实施例旨在实现微量细胞裂解液中相关酪氨酸磷酸化蛋白的捕获与分析，降低细胞裂解液浓度，以检测方法的可行性与灵敏度，其中整体操作流程如图1。

在诱饵蛋白SH2结构域(1mg/mL，溶于HEPES缓冲液)中按照1:10(蛋白:探针)的摩尔比加入对应量探针，室温下孵育2分钟。随后按照1:10(探针:甘氨酸)的摩尔比加入1mol/L的甘氨酸溶液，终止探针与诱饵蛋白的反应。将得到的标记有探针的诱饵蛋白超滤7遍，以除去未反应的探针与甘氨酸分子。测定蛋白浓度，并稀释至0.02μg/μL。将上述标记有探针的诱饵蛋白以50μL/孔，加入到负载有链霉亲和素修饰的96孔板中，4℃均匀缓慢振荡孵育2小时。每孔加入50μg的HeLa细胞裂解液，4℃均匀缓慢振荡孵育2小时，然后于365nm紫外光下照射30分钟。随后采用含6M尿素的RIPA缓冲液清洗3次，并用50mM的碳酸氢铵清洗3次。随后加入还原剂、烷基化试剂进行标准化还原烷基化过程。最后加入胰蛋白酶溶液进行孔内酶解(In-well酶解)，保证每个微孔内含0.1μg胰蛋白酶，对应50mM碳酸氢铵溶液体积为30μL、50μL、100μL和200μL。

如图2A所示，随着碳酸氢铵溶液的体积增大，相应胰蛋白酶浓度降低，蛋白数量与肽段谱图匹配数发生变化，在碳酸氢铵溶液体积50μL时均达到最大值。如图2B所示，质谱中0％漏切比例来看，在0.1μg胰蛋白酶质量情况下，不同的碳酸氢铵溶液体积条件下，0％漏切比例均大于80％，说明0.1μg胰蛋白酶已足以实现高效酶切，酶解效果良好。图2C的箱线图展示出不同碳酸氢铵溶液体积下三次重复的变异系数(CV)均小于0.2，说明该前处理过程具有良好的重复性。基于以上结果，将0.1μg胰蛋白酶溶解于50μL的50mM碳酸氢铵条件作为后续酶解实验通用条件。

实施例2不同细胞用量对样品前处理方法灵敏度的探索

按照实施例1的方法，分别向连接了探针与诱饵蛋白的链霉亲和素包被的96孔板中加入5μg、50μg、300μg的EGF刺激前后的HeLa细胞裂解液(含3次技术重复)，然后按实施例1中所述的通用条件进行后续处理，并进行EGF刺激条件下蛋白质复合物富集与鉴定的对比。

结果如图3A所示，随着细胞裂解液用量的增多，经过EGF刺激后，更多蛋白复合物被富集与鉴定到。其中，仅5μg细胞裂解液中有17个EGFR信号通路相关蛋白被富集，当细胞裂解液用量增至50μg与300μg时，EGF刺激后可分别富集到68与92个刺激相关蛋白。

对这些富集鉴定到的蛋白进行分析，结果如图3B和图3C所示。首先，与已有磷酸化蛋白质复合物鉴定方法中富集鉴定的蛋白进行比较。5μg细胞裂解液所富集的17个蛋白中与15个已报道的富集蛋白(专利201910599017.6中所报道的富集蛋白)之间有10个相同的蛋白，另7个蛋白也属于磷酸化酪氨酸蛋白；50μg细胞裂解液所富集的68个蛋白中包含15个已报道的富集蛋白，还含有42个磷酸化酪氨酸蛋白及10个已报道的与磷酸化酪氨酸蛋白具有相互作用的蛋白；当细胞裂解液用量增至300μg时，所富集蛋白除已报道富集蛋白，还含有51个磷酸化酪氨酸蛋白及8个已报道与磷酸化酪氨酸蛋白具有相互作用的蛋白。这一结果表示，利用上述集成化样品前处理方法，可用仅5μg细胞裂解液即可实现之前方法中1.4mg细胞所达到的蛋白富集效果。说明本方法灵敏度高，适合于大批量样品中磷酸化酪氨酸蛋白质复合物的富集与鉴定。后续实验中，为保证鉴定效果，均采用50μg细胞裂解液进行实验。

实施例3方法对比

按照实施例1与实施例2所确定的方法，向连接了探针与诱饵蛋白的链霉亲和素包被的96孔板中加入50μg的EGF刺激前后的HeLa细胞裂解液(含3次技术重复)，然后按实施例1中所述的通用条件进行后续处理。另一方面，在1.5mL离心管内加入同等质量连接了探针的诱饵蛋白，按照专利201910599017.6处理方法，加入50μg的EGF刺激前后的HeLa细胞裂解液(含3次技术重复)，并利用10μL链霉亲和素珠子进行捕获，然后按照专利201910599017.6中所述的通用条件进行后续处理。对两种方法处理的样品进行EGF刺激条件下蛋白质复合物富集与鉴定的对比。

结果如图4A和图4B所示，在同等探针、诱饵蛋白与细胞裂解液用量情况下，经过EGF刺激后，本方法可富集与鉴定到更多的蛋白复合物。利用本发明方法，可富集到38个EGFR通路相关蛋白，其中包含15个已报道的富集蛋白，而利用之前的方法，相同条件下，可富集鉴定15个相关蛋白，且与已报道的15个富集蛋白有9个重复蛋白。两种方法对比，富集鉴定的蛋白中有14个重复蛋白，有24个蛋白是利用本发明方法特异性鉴定到的。对比14个在两种方法中均富集到的蛋白的各自鉴定强度，结果如图4C所示，多数蛋白在本发明方法中的鉴定强度远高于之前的方法，最大差异可达11倍。造成这一差异的可能原因有两点：一方面，本发明的方法中，先将连接了诱饵蛋白的探针与链霉亲和素连接，随后再对细胞裂解液中的蛋白复合物进行捕获，而之前的方法中，先利用连接了诱饵蛋白的探针对细胞裂解液中的蛋白复合物进行捕获，再用链霉亲和素进行富集，这一顺序上的改变可能会造成连接了蛋白复合物的探针中生物素基团被包裹，产生空间位阻效应，从而难以被链霉亲和素富集(如图4D所示)。另一方面，之前的方法中涉及两次溶液转移，会造成样品的损失，对于微量样品来说，这一损失所造成的蛋白富集鉴定量的减少会尤其明显，而本发明的方法所有操作均集成于负载有链霉亲和素的96孔板内，避免了样品损失。说明相较于之前的方法，本发明具有更高的灵敏度，可鉴定到更多酪氨酸磷酸化蛋白复合物，这对于微量样品中丰度较低的蛋白复合物鉴定捕获十分有利。

实施例4诱饵蛋白与探针保存时间对蛋白鉴定能力的影响

按照实施例1与实施例2所确定的方法，分别将集成有诱饵蛋白的96孔板保存于含有0.02％(w/v)NaN₃的NP-40缓冲液中，并将其置于4℃条件下保存1～30天。然后将保存不同天数的含有诱饵蛋白的96孔板，对EGF刺激后的HeLa细胞裂解液中的蛋白质复合物进行富集和鉴定，对比随着保存时长的增加，蛋白质复合物的富集能力是否会发生改变。

结果如图5A和图5B所示，随着保存时间的增长，所能定量检测到的pTyr蛋白数量出现小幅减少，但所报道的15个EGFR信号通路相关蛋白在30天仍可准确定量，且批量样品间Pearson相关系数始终大于0.88，说明随着保存时间的增长，蛋白鉴定能力虽然会受到一定影响，但仍可用于pTyr蛋白的定性与定量检测(注：此处定量蛋白数量是指在三次重复实验中均可定量检测到的蛋白数量)。对已报道的15个富集蛋白进行定量分析，结果显示于图5C，可发现在1～10天保存时长范围内，这些蛋白的定量检测效果所受影响较小；时间增长至15天，大部分蛋白的强度会下降约50％；时间继续增长，强度不再降低。相较于之前方法中诱饵蛋白与探针需当天结合使用，本发明的方法大大延长了诱饵蛋白与探针的保存时长，为高通量、快速的、批量化样品检测提供强力支持。

实施例5色谱分离与质谱数据非依赖采集模式的优化

按照实施例1与实施例2所确定的方法制备好样品，同时准备1μg的HeLa细胞裂解后酶解多肽，利用nano LC联用Q Extractive HF-X质谱进行样品检测。首先优化色谱分离效果，对比三种内径自填色谱柱(75μm i.d.，100μm i.d.，150μm i.d.)，再对质谱数据非依赖采集模式窗口设置进行优化，并对比可变窗口与固定窗口采集。

色谱分离条件优化结果如图6A所示，色谱柱内径的增大可使流速由250nL/min增加至800nL/min，可大大降低色谱平衡、样品加载的时长。但色谱柱内径的增大不可避免的会造成一部分定量蛋白的损失，本实施例利用1μg的HeLa细胞裂解液酶解多肽进行分析，结果也表明100μm i.d.的色谱柱可定量检测到最多的蛋白。然而，对于处理后的pulldown样品来说，由于样品复杂度降低，反而不会受此影响，总定量蛋白与定量检测到的pTyr蛋白数量均无变化，且总分离检测时长由60分钟缩短至35分钟，在保持原有定性效果与定量深度的情况下，大大提高了分析检测效率。

本实施例采用质谱非依赖性数据采集模式，并选择含40个窗口数量的可变窗口条件进行质谱鉴定，对其中所加入的MS1扫描数量进行优化，以期增加平均单个色谱峰采集的点数。实验结果如图6B所示，平均单个色谱峰采集点数越多，数据可信度越高。此处在保证40个可变窗口采集的模式下，分别于其中加入1、2、3个MS1采集窗口，平均单个色谱峰采集点数由2增至5点，数据可信度显增大，并且定量检测到的CV<10％与CV<20％的pTyr蛋白比例增加，说明方法的重复性与稳定性随着MS1扫描窗口的加入而逐渐提高。对比于相同条件下15Da间隔固定窗口采集模式，可变窗口采集模式可定量检测到更多目标蛋白，且重复性更好。基于以上结果，采用150μm i.d.色谱柱进行色谱分离，含3个MS1扫描的40个可变窗口数据非依赖采集进行后续实验。

实施例6高通量磷酸化蛋白质复合物鉴定蛋白组学方法对动态蛋白质复合物的鉴定

当HeLa细胞密度达到了80％时，将培养基置换成无血清培养基，并在细胞培养箱中培育过夜，随后加入终浓度100μg/mL的EGF，于37℃条件下分别刺激0分钟、2分钟、5分钟、10分钟和30分钟，其他后续步骤同实施例1、2、4中所确定。

如图7A与图7B所示，EGFR信号通路蛋白随着EGF刺激时间的动态变化可被准确捕捉，即使是通路中的下游蛋白，其动态变化亦可准确鉴定。多数EGFR信号通路蛋白均在2～5分钟达到最大强度，与文献报道一致。EGFR、CBL和SHC1的强度变化结果表明，该方法对时间动态变化蛋白捕获重复性好。这些数据证实了此高通量磷酸化酪氨酸蛋白复合物鉴定方法可准确、稳定的从复杂生物样品中捕获具有动态和弱相互作用的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物。

实施例7高通量磷酸化蛋白复合物鉴定蛋白组学方法对靶向药物作用蛋白质复合物的鉴定与筛查

当HeLa细胞密度达到70％时，加入酪氨酸激酶抑制剂AG1478刺激20小时，然后加入终浓度100μg/mL的EGF刺激5分钟，其他步骤同实施例5。本实施例旨在检测经AG1478抑制后，细胞内EGFR蛋白质复合物的变化。

如图7A与图7B所示，AG1478可以抑制EGFR及其下游信号通路蛋白的活化。其中，随着给药浓度的增加，对于EGFR及相关蛋白的抑制效果越好；对于大多数EGFR通路中上游的蛋白来说，给药浓度为0.1μM时，所鉴定到的蛋白强度有小幅下降，当给药浓度增至1μM，强度大幅下降，随后继续增大给药浓度，强度无显著变化。EGFR、CBL和SHC1的强度变化遵循前述规律，且误差棒显示该方法重复性好。这些数据证实了此高通量磷酸化酪氨酸蛋白复合物鉴定方法可以有效地从复杂生物样品中识别酪氨酸磷酸化蛋白介导的蛋白质复合物，并用于抗癌药物的筛选及相关通路蛋白研究。

综上所述，本发明含有高通量、高灵敏的磷酸化酪氨酸蛋白质复合物富集的样品前处理方法与快速、准确的色谱分离与质谱鉴定方法。利用该样品前处理方法可在探针与诱饵蛋白用量相较之前方法降低100倍的条件下将灵敏度提高300倍；在含有稳定剂的缓冲溶液中诱饵蛋白保存时间可延长至一个月；在EGF刺激条件下，仅用5μg细胞裂解液即可实现之前方法中1.4mg细胞裂解液用量所富集到的蛋白数量，为pTyr蛋白及相互作用蛋白复合物的鉴定提供了稳定、灵敏、高通量的前处理方法；同时，结合150μm i.d.自填色谱柱，20分钟色谱梯度，40个可变窗口DIA采集模式及最新Q Extractive HF-X质谱仪，在不使用外加柱温稳定装置，不损失定性与定量检测性能的前提下，可对富集到的蛋白复合物进行快速、准确的鉴定。应用此方法对不同EGF刺激时间下，蛋白复合物动态变化进行捕获，对于信号通路蛋白及瞬时、弱相互作用蛋白质复合物的动态变化可准确捕捉。进行磷酸化酪氨酸激酶抑制剂剂量实验，表明此方法适用于生物标志物与药物靶点的筛选，并可对药物影响的下游信号通路蛋白动态变化进行高灵敏度的捕获。此方法为磷酸化酪氨酸蛋白质复合物鉴定提供高通量、高灵敏检测方法，并为新的诊断标志物与药物靶点的筛选提供新思路，具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种磷酸化酪氨酸蛋白质复合物的样品前处理方法，其特征在于，所述样品前处理方法包括：

(1)将包含SH2结构域的探针通过生物素固定在链霉亲和素细胞培养板上，保存于保存试剂中；

(2)加入样本孵育，并对孵育产物进行光辐射；

(3)对光辐射产物进行还原烷基化后，加入酶解试剂，进行样品前处理；

所述探针由间隔臂和连接于所述间隔臂上的SH2结构域、光反应基团和生物素形成；

所述酶解试剂为含有胰蛋白酶的碳酸氢铵溶液。

2.根据权利要求1所述的样品前处理方法，其特征在于，所述胰蛋白酶在所述碳酸氢铵溶液中的浓度为0.0005～0.003μg/μL，优选为0.002μg/μL。

3.根据权利要求1或2所述的样品前处理方法，其特征在于，所述碳酸氢铵溶液的浓度为30～60mM，优选为50mM。

4.根据权利要求1-3任一项所述的样品前处理方法，其特征在于，所述胰蛋白酶与所述样本的质量比为1:(300～500)，优选为1:500。

5.根据权利要求1-4任一项所述的样品前处理方法，其特征在于，所述包含SH2结构域的探针的保存试剂为含有NaN₃的NP-40缓冲液；

优选地，所述NaN₃在所述NP-40缓冲液中的质量体积百分比为0.02～0.05％。

6.根据权利要求1-5任一项所述的样品前处理方法，其特征在于，所述保存的温度为0～4℃。

7.一种磷酸化酪氨酸蛋白质复合物的分析方法，其特征在于，所述分析方法包括对权利要求1-6任一项所述的样品前处理方法制备的样本进行色谱分离和质谱分析的步骤。

8.根据权利要求7所述的分析方法，其特征在于，所述色谱分离中色谱柱的内径为75～150μm，优选为150μm；

所述色谱柱为C18色谱柱；

优选地，所述色谱分离的流动相为0.1～1％甲酸溶液和含0.1～1％甲酸的乙腈；

优选地，所述流动相的流速为600～1000nL/min，优选为800nL/min；

优选地，所述色谱梯度为20min有效分离梯度。

9.根据权利要求7或8所述的分析方法，其特征在于，所述质谱采用非依赖性数据采集模式进行；

优选地，所述质谱采用Q Extractive HF-X质谱仪；

优选地，所述非依赖性数据采集模式的扫描范围为350～1550m/z；

优选地，所述扫描范围包括40个窗口数量的可变窗口；

优选地，在40个可变窗口中，含有1～3个MS1采集窗口，优选为含有3个MS1采集窗口。

10.一种权利要求1-6任一项所述的样品前处理方法和/或权利要求7-9任一项所述的分析方法在鉴定磷酸化蛋白复合物中的应用。

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