CN110231490A - 一种探针及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种探针及其应用,所述探针包括间隔臂和连接于所述间隔臂上的诱饵蛋白、光反应基团和富集基团,其中诱饵蛋白包括识别特定蛋白质翻译后修饰的蛋白质结构域,例如识别酪氨酸磷酸化的SH2结构域;本发明的探针不影响目标蛋白活性,当诱饵蛋白与目标蛋白相互作用时,紫外光辐射促进了光反应基团与目标蛋白的共价结合,通过富集基团有效富集得到蛋白复合物,有利于进行蛋白质间弱相互作用和瞬时相互作用分析,显著提高了人或动物组织样本及细胞膜附近目标蛋白及其复合物的富集和鉴定能力,成功实现对不同乳腺癌细胞系中和乳腺癌组织内的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集和鉴定,具有广阔的应用前景和市场价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种探针及其应用,尤其涉及一种含有三个功能基团的探针及其在高通量检测蛋白质间相互作用中的应用。
背景技术
蛋白质是构成生物体的主要成分,在生物体中,每时每刻都发生着数十万种蛋白质间相互作用,这些数量庞大的相互作用将蛋白质组装成种类繁多、功能各异的蛋白质复合物,执行和调控着几乎所有的生命过程和功能,包括蛋白质翻译、细胞周期控制、蛋白质合成和降解等。蛋白质复合物通过彼此间的串联和并联相互作用形成高维度、复杂性的细胞信号转导网络;通过外源信号刺激和基于时间和亚细胞器的精准定位实现对细胞功能的宏观精确控制。这些蛋白质之间的相互作用通常在研究蛋白质的翻译后修饰,如磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化等过程中被发现。Src homology 2(SH2)结构域是蛋白质相互作用结构域的一个很具有代表性的例子,SH2结构域可以特异性的识别很多信号转导通路中的酪氨酸磷酸化蛋白质。目前,已经在人的蛋白质组中发现了120多种不同的SH2结构域。激酶或磷酸酶可以动态的调控酪氨酸磷酸化蛋白质的活性,因此,利用SH2结构域可以很好的富集鉴定这些动态的蛋白质复合物。
与SH2结构域结合的蛋白质复合物通常具有动态变化的天然特性,结合力弱(从微摩尔到纳摩尔的结合常数),并且存在于难溶的细胞膜附近。因此,利用标准的吸附纯化方法很难将这些蛋白质复合物分离出来。蛋白质芯片技术可以用于高通量的鉴定SH2结构域与酪氨酸磷酸化蛋白质酶解多肽之间的结合特异性,但是这种技术不能对蛋白进行精确地定性,因此很难在复杂的生物样品中展开应用。目前,亲和富集联合质谱鉴定技术(affinity purification and mass spectrometry,AP-MS)以其能够定性和定量研究蛋白的特性,被广泛应用于复杂体系中蛋白质复合物的高通量鉴定工作。然而,AP-MS在鉴定弱的相互作用以及存在于难溶的细胞膜附近的蛋白质复合物具有很大的限制性,因为这些相互作用的蛋白在AP-MS的吸附纯化过程中很容易丢失。因此,目前急需发展一种能够克服AP-MS技术短板,并在复杂体系中鉴定动态蛋白质相互作用的技术。
近年来,也出现了一些新兴的研究蛋白质间弱相互作用组或瞬时相互作用组的分析方法。近程标记技术通过向靶点蛋白引入生物素连接酶标签,实现了蛋白质复合物的体内原位生物素标记,显著提高了弱相互作用力蛋白质复合物的鉴定效率,然而该方法存在标记时间长、无法应用于体内动态蛋白质复合物研究的缺点;瑞士苏黎世联邦理工学院Ruedi实验室提出了一种基于化学交联的质谱技术,实现了弱相互作用的复杂蛋白质复合物的结构解析,应用于蛋白质磷酸酶2A复合物及线粒体核糖体等大型蛋白质复合物的精细结构解析,但是该技术主要应用于单个蛋白质复合物的表征。随着蛋白质相互作用组研究技术的不断成熟,生物学家已经开始关注各种功能蛋白质的相互作用组,特别是弱相互作用组或瞬时相互作用组在细胞信号转导中的动态调控过程。然而,目前尚缺乏能够体现细胞信号转导全通路蛋白质相互作用组的系统研究策略。
US005532379A公开了一种Sulfo-SBED探针,所述探针包括生物素基团、NHS基团和芳基叠氮化物光反应基团,其中的芳基叠氮化物基团存在明显的非特异性标记作用,不能直接应用于蛋白质间相互作用研究;US20140011212A1公开了一种三功能探针用于研究糖蛋白受体及其配体间相互作用,但是不能用于其他蛋白质间相互作用的研究。
酪氨酸磷酸化蛋白复合物在信号转导调节中具有重要作用,SH2结构域能够特异性识别并结合酪氨酸磷酸化蛋白。然而,酪氨酸磷酸化蛋白通常位于细胞膜附近,且两者的相互作用结合力弱且呈动态变化状态,现有的蛋白提取技术对膜蛋白的提取能力有限,且往往会破坏蛋白质间弱相互作用和瞬时相互作用。
在SH2结构域内插入外源性光反应基团实现了蛋白间瞬时相互作用的表征(A.Uezu等,Modified SH2domain to phototrap and identify phosphotyrosineproteins from subcellular sites within cells,PNAS,1,E2929,2012;Y.Tian等,Genetically encoded 2-aryl-5-carboxytetrazoles for site-selective proteinphoto-cross-linking,JACS,139,6078,2017),然而该方法采用基因编辑手段将非天然氨基酸插入SH2结构域中,可能会影响SH2结构域的完整性和功能性,且方法繁琐复杂。
SH2结构域结合蛋白质阵列技术,可用于高通量分析各种生物样品中酪氨酸磷酸化蛋白的状态。蛋白质阵列技术包括反相蛋白阵列(reverse phase protein assay,RPPA)和正向蛋白阵列(forward phase protein assay,FPPA)。在RPPA中,细胞裂解物或磷酸化肽固定在固相载体上,多种可溶性SH2结构域作为探针进行探测,以表征SH2结构域-酪氨酸磷酸化蛋白结合特异性,并分析特定SH2结构域识别酪氨酸磷酸化蛋白的水平。最近,Ye课题组基于RPPA提出了一种高通量酪氨酸磷酸化定量分析方法(Anal.Chem.2017Feb 21;89(4):2304-2311.Sensitive Approaches for the Assay of the Global ProteinTyrosine Phosphorylation in Complex Samples Using a Mutated SH2Domain),利用SH2超亲体与酪氨酸磷酸化蛋白具有高亲和高特异性的优势,实现了检测灵敏度低于传统抗体方法的酪氨酸磷酸化蛋白质的定量分析。但是该方法无法对酪氨酸磷酸化蛋白调控的蛋白质复合物进行检测,也无法对其进行定性分析。相反,FPPA使用一组SH2结构域作为固定化诱饵,从细胞裂解液中捕获酪氨酸磷酸化蛋白及其介导的蛋白质复合物。Liu等通过进一步结合RPPA和FPPA,系统地描述了78个SH2结构域和194个人类免疫受体酪氨酸磷酸化蛋白多肽的相互作用(Liu,H.;Li,L.;Voss,C.;Wang,F.;Liu,J.;Li,S.S.-C.Mol.Cell.Proteomics 2015,14,1846-1858.)。不幸的是,SH2结构域与酪氨酸磷酸化蛋白之间的亲和力较弱,并且这些复合物的形成往往是动态变化的。使用这些方法从复杂的生物样品中鉴定酪氨酸磷酸化蛋白介导的信号转导复合物的效率较低。
因此,开发和利用含有多功能基团的分子探针,并基于质谱或蛋白质阵列技术,用以高通量地研究蛋白质之间弱相互作用或瞬时相互作用,可显著促进蛋白质相互作用研究的范围和领域,有利于开发和发展蛋白质组学研究的新方法,并为研究蛋白质之间相互作用的信号转导网络提供有力支持,为系统地研究肿瘤微环境中的细胞间信号转导过程提供科学的研究方法。
发明内容
针对现有技术的不足,本发明提供了一种探针及其应用,所述探针利用诱饵蛋白结合目标蛋白复合物,光辐射后光反应基团与目标蛋白复合物形成共价键结合,显著提高了蛋白质间相互作用的结合力,最后通过富集基团富集得到蛋白复合物,进行后续蛋白质间相互作用分析,实现了结合力弱的相互作用蛋白的有效富集和鉴定。
为达此目的,本发明采用以下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种探针,所述探针包括间隔臂和连接于所述间隔臂上的诱饵蛋白、光反应基团和富集基团。
本发明中,发明人充分调研蛋白质间相互作用研究所面临的挑战和难题,设计了含有功能基团的探针,包括用于靶向目标蛋白的诱饵蛋白、用于共价结合目标蛋白的光反应基团和用于富集的生物素基团。所述探针不影响目标蛋白的活性的条件下,当诱饵蛋白与目标蛋白相互作用时,紫外光辐射促进了光反应基团与目标蛋白的共价结合,显著提高了诱饵蛋白与目标蛋白的结合力,通过富集基团有效富集得到蛋白复合物,有利于进行蛋白质间弱相互作用和瞬时相互作用分析,所述探针不仅实现了结合力弱的相互作用蛋白的富集和鉴定,而且通过优化探针骨架的长度以及不同的光反应基团,显著提高了人或动物组织样本及细胞膜附近的目标蛋白及其复合物的富集和鉴定能力,降低了其他非特异性吸附蛋白背景干扰,具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
优选地,所述间隔臂包括赖氨酸,优选为L-赖氨酸。
优选地,所述诱饵蛋白包括含有SH2结构域的蛋白和/或多肽,优选为SH2结构域,进一步优选为突变型SH2结构域。
本发明中,利用SH2结构域对酪氨酸磷酸化蛋白的特异性结合能力,采用SH2结构域作为诱饵蛋白,紫外光辐射后将SH2结构域和酪氨酸磷酸化蛋白间的弱的动态变化相互作用增强为共价结合相互作用,有利于实现酪氨酸磷酸化蛋白复合物在细胞信号转导中的研究。
优选地,所述突变型SH2结构域为Src SH2结构域突变体,所述突变体是在野生型Src SH2结构域的基础上对SH2结构域内第138位的苏氨酸替换为缬氨酸、第188位的半胱氨酸替换为丙氨酸、第206位的赖氨酸替换为亮氨酸。
本发明中,采用三位点突变型Src SH2结构域(Src superbinder)作为诱饵蛋白,进一步提高了对酪氨酸磷酸化蛋白的亲和力,显著提高了探针的灵敏性。
优选地,所述光反应基团包括联苯二甲酮、芳基叠氮化物或二氮嗪中的任意一种。
本发明中,联苯二甲酮、芳基叠氮化物和二氮嗪作为光反应基团,在紫外光(365nm)的照射下被激活,与蛋白质的肽链骨架反应,形成共价键结合;包含有光反应基团的探针不仅能够用于检测诱饵蛋白和目标蛋白间的直接一对一的弱相互作用或瞬时相互作用,而且能够发挥光反应基团的超长的共价键结合范围,检测多个蛋白质间的间接相互作用和蛋白质相互作用后形成的蛋白质复合物。
优选地,所述富集基团包括生物素。
本发明中,采用生物素作为富集基团,可以利用生物素和链霉亲合素的亲和作用力,采用链霉亲合素微球作为富集载体,有利于实现蛋白复合物的有效提取和富集。
优选地,所述SH2结构域通过游离的伯氨基和/或巯基连接于所述间隔臂上的NHS基团和/或I基团。
本发明中,SH2结构域可以通过其游离伯氨基与NHS基团结合连接于间隔臂上,也可以通过其游离巯基与I基团结合连接于间隔臂上,NHS基团和I基团在间隔臂上具有相同的结合诱饵蛋白的功能。
本发明中,采用L-赖氨酸作为间隔臂,其上修饰NHS基团和/或I基团、光反应基团和生物素基团,得到的探针骨架用于连接SH2结构域,所述探针中与SH2结构域结合的探针骨架如通式I和/或通式II所示:
其中,n1选择0、1或2,n2选择0、1或2,R选自
优选地,n1为0,n2为0,R为
优选地,n1为1,n2为2,R为
优选地,n1为1,n2为2,R为
优选地,n1为1,n2为2,R为
第二方面,本发明提供了一种如第一方面所述的探针在检测蛋白质间相互作用中的应用,优选为在检测含有酪氨酸磷酸化残基的蛋白质间相互作用中的应用。
第三方面,本发明提供了一种蛋白质间相互作用的检测方法,包括以下步骤:
(1)向待测样品中加入如第一方面所述的探针,混合后孵育;
(2)将孵育的产物进行光辐射;
(3)加入微球后孵育、清洗,进行蛋白分析。
优选地,步骤(1)所述孵育的温度为2-6℃,例如可以是2℃、3℃、4℃、5℃或6℃。
优选地,步骤(1)所述孵育的时间为1.5-2.5h,例如可以是1.5h、1.6h、1.7h、1.8h、1.9h、2h、2.1h、2.2h、2.3h、2.4h或2.5h。
优选地,步骤(2)所述光辐射的波长为360-370nm,例如可以是360nm、361nm、362nm、363nm、364nm、365nm、366nm、367nm、368nm、369nm或370nm。
优选地,步骤(2)所述光辐射的时间为10-60min,例如可以是10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min。
优选地,步骤(3)所述微球修饰有链霉亲和素。
优选地,步骤(3)所述孵育的温度为2-6℃,例如可以是2℃、3℃、4℃、5℃或6℃。
优选地,步骤(3)所述孵育的时间为1.5-2.5h,例如可以是1.5h、1.6h、1.7h、1.8h、1.9h、2h、2.1h、2.2h、2.3h、2.4h或2.5h。
优选地,步骤(3)所述清洗采用优化的RIPA缓冲液和/或碳酸氢铵溶液。
本发明中,优化的RIPA(mRIPA)缓冲液的配方为50mM Tris-HCl,1M NaCl,1%(v/v)Triton X-100,1%(w/v)脱氧胆酸钠,1%(w/v)SDS,pH=7.4,较传统的RIPA缓冲液(50mMTris-HCl,150mM NaCl,1%(v/v)Triton X-100,1%(w/v)脱氧胆酸钠,0.1%(w/v)SDS,pH=7.4)具有更强的洗脱能力,不会影响通过探针骨架形成共价键结合的蛋白复合物,显著提高了细胞膜蛋白的富集和鉴定能力并降低了非特异性吸附。
优选地,步骤(3)所述蛋白分析包括免疫印迹分析和/或质谱分析。
作为优选技术方案,本发明提供了一种蛋白质间相互作用的检测方法,包括以下步骤:
(1)向待测样品中加入如第一方面所述的探针,混合后在2-6℃下孵育1.5-2.5h;
(2)将孵育的产物在360-370nm下光辐射10-60min;
(3)加入链霉亲合素微球,在2-6℃下孵育1.5-2.5h,采用mRIPA缓冲液和/或碳酸氢铵溶液清洗后,对得到的蛋白进行免疫印迹分析和质谱分析。
第四方面,本发明提供了一种高通量的蛋白质间相互作用的检测方法,包括以下步骤:
(1’)将如第一方面所述的探针固定在固相载体上,加入待测样品,混合后孵育;
(2’)将孵育的产物进行光辐射,进行蛋白分析。
优选地,步骤(1’)所述固相载体上修饰有链霉亲和素。
优选地,所述固相载体包括96孔细胞培养板、384孔细胞培养板或载玻片中的任意一种,优选为96孔细胞培养板或384孔细胞培养板。
优选地,步骤(1’)所述固定的温度为2-6℃,例如可以是2℃、3℃、4℃、5℃或6℃。
优选地,步骤(1’)所述固定的时间为1.5-2.5h,例如可以是1.5h、1.6h、1.7h、1.8h、1.9h、2h、2.1h、2.2h、2.3h、2.4h或2.5h。
优选地,步骤(1’)所述待测样品包括细胞裂解液。
优选地,所述细胞裂解液与所述探针的质量比为(1~200):1,例如可以是1:1、10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、110:1、120:1、130:1、140:1、150:1、160:1、170:1、180:1、190:1或200:1,优选为(10~100):1。
优选地,步骤(1’)所述孵育的温度为2-6℃,例如可以是2℃、3℃、4℃、5℃或6℃。
优选地,步骤(1’)所述孵育的时间为1.5-2.5h,例如可以是1.5h、1.6h、1.7h、1.8h、1.9h、2h、2.1h、2.2h、2.3h、2.4h或2.5h。
优选地,步骤(2’)所述光辐射的波长为360-370nm,例如可以是360nm、361nm、362nm、363nm、364nm、365nm、366nm、367nm、368nm、369nm或370nm。
优选地,步骤(2’)所述光辐射的时间为1-60min,例如可以是1min、5min、10min、15min、20min、25min、30min、35min、40min、45min、50min、55min或60min,优选为10-30min。
优选地,在步骤(2’)光辐射后采用洗涤缓冲液进行洗涤。
优选地,所述洗涤缓冲液为包含0-10mol/L尿素的mRIPA洗涤缓冲液,所述尿素的浓度例如可以是0mol/L、2mol/L、3mol/L、4mol/L、5mol/L、6mol/L、7mol/L、8mol/L、9mol/L或10mol/L,优选为6mol/L。
第五方面,本发明提供了一种正向蛋白阵列,所述正向蛋白阵列由固相载体与固定在所述固相载体上的如第一方面所述的探针组成。
优选地,所述探针通过富集基团固定在固相载体上。
优选地,所述固相载体上修饰有链霉亲和素。
优选地,所述固相载体包括96孔细胞培养板、384孔细胞培养板或载玻片中的任意一种,优选为96孔细胞培养板或384孔细胞培养板。
与现有技术相比,本发明具有如下有益效果:
(1)本发明含有功能基团的探针包括用于靶向目标蛋白的诱饵蛋白、用于共价结合目标蛋白的光反应基团和用于富集的生物素基团,所述探针在不影响目标蛋白活性的条件下,当诱饵蛋白与目标蛋白相互作用时,紫外光辐射促进了光反应基团与目标蛋白的共价结合,显著提高了诱饵蛋白与目标蛋白的结合力,最后通过富集基团富集得到蛋白复合物,不仅实现了结合力弱的相互作用蛋白的富集和鉴定,而且通过优化探针骨架的长度以及不同的光反应基团,显著提高了人或动物组织样本及细胞膜附近的目标蛋白及其复合物的富集和鉴定能力,并降低了其他非特异性吸附蛋白背景干扰;
(2)本发明的探针采用SH2结构域作为诱饵蛋白的探针,成功实现对EGFR信号通路的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集和鉴定;
(3)将SH2结构域优化为Src superbinder作为诱饵蛋白形成的探针,对不同乳腺癌细胞系中和乳腺癌组织内的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物均具有高效的富集和鉴定能力,成功实现对EGFR和ERBB2的富集,与传统的免疫组化技术相比,灵敏度提高近100倍,实现了一次性监测64种靶点蛋白激酶的活性的效果;
(4)本发明将三功能探针固定在96孔板上形成的正向蛋白阵列可用于高通量的探索复杂生物样品中弱的、动态变化的酪氨酸磷酸化蛋白介导的蛋白质复合物,具有良好的定量性质,只需少量的起始材料即可检测动态EGF刺激的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物,并且可以高通量检测erlotinib刺激后的癌细胞系内酪氨酸磷酸化蛋白的状态,为基于光亲和性正向蛋白阵列更系统地应用于临床肿瘤组织样本,发现新的诊断标志物和药物靶点提供新的思路,具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
附图说明
图1A为本发明功能性探针的结构和应用示意图,图1B为含有NHS基团的探针骨架的结构式,图1C为含有I基团的探针骨架的结构式;
图2为实施例5不同探针间隔臂长度对目标蛋白富集和鉴定能力的优化质谱鉴定结果图,其中,图2A为探针2的对目标蛋白富集和鉴定能力的质谱鉴定结果图,图2B为探针1对目标蛋白富集和鉴定能力的质谱鉴定结果图,图2C为探针2和探针1对EGFR信号通路中相关蛋白质的富集能力的比较结果图;
图3为实施例6不同探针光反应基团对目标蛋白富集和鉴定能力的优化质谱鉴定结果图,其中,图3A为不同探针光反应基团对EGFR信号通路的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集能力的比较结果图,图3B为不同探针光反应基团对非特异性蛋白质吸附能力的比较结果图;
图4为实施例7探针2对细胞膜附近目标蛋白及其复合物的富集和鉴定结果图,其中,图4A为含有不同诱饵蛋白的探针2对EGFR信号通路的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集效果结果图,图4B为这些含有不同诱饵蛋白的探针2鉴定到的酪氨酸磷酸化蛋白质相互作用网络图;
图5为实施例8Src superbinder探针对酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集和鉴定结果图,其中,图5A为Src superbinder探针对EGFR信号通路的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集效果结果图,图5B为Src superbinder探针和N-PI3K探针对EGFR蛋白富集能力的比较结果图;
图6为实施例9Src superbinder探针对不同乳腺癌细胞系内酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集和鉴定结果图,其中,图6A为Src superbinder探针对BT-474和MDA-MB-468两种乳腺癌细胞系内酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集和鉴定能力的比较结果图,图6B为Src superbinder探针对MDA-MB-468和MDA-MB-231两种乳腺癌细胞系内酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集和鉴定能力的比较结果图,图6C为Src superbinder探针对乳腺癌细胞系内EGFR/ERBB2信号通路相关酪氨酸磷酸化蛋白质的富集和鉴定结果图;
图7A为实施例10的免疫组化结果图,图7B为实施例10的质谱结果图,图7C为实施例10的64种靶点蛋白激酶结果图;
图8为光亲和性正向蛋白阵列检测原理图;
图9为通过EGFR优化链霉亲和素包被的96孔板的洗涤条件;
图10A为通过不同体积NP-40裂解液优化标记光交联效率,图10B为通过不同紫外光照时间来优化光交联效率;
图11A为通过anti-4G10测定链霉亲和素包被的96孔板结合容量,每个孔中加入5μg Src superbinder探针并改变加入蛋白的量来探究蛋白的饱和结合量,图11B为每个中孔加入300μg蛋白并改变Src superbinder探针的量来探究Src superbinder探针的饱和结合量;
图12为基于正向蛋白阵列平台的Src superbinder探针的定量性能;
图13A为已知的EGFR、GRB2、SHC1和CBL的相互作用图,图13B为基于Srcsuperbinder探针的正向蛋白阵列从5μg EGF刺激的HeLa细胞裂解液中捕获酪氨酸磷酸化的EGFR及其调控的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物;
图14A为使用蛋白质印迹实验检测EGF刺激后HeLa细胞总体酪氨酸磷酸化水平,图14B为EGF刺激后,基于Src superbinder探针的正向蛋白阵列对EGFR信号通路的酪氨酸磷酸化蛋白复合物的检测时间梯度曲线;
图15A为基于Src superbinder探针的正向蛋白阵列对erlotinib处理HeLa细胞裂解液中的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的捕获能力,图15B为相应的免疫沉淀结果图,图15C为相应的蛋白质印迹结果图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果,以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是,此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明,而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者,按照本领域内的文献所描述的技术或条件,或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1探针骨架2标记SH2诱饵蛋白
本发明设计了7种探针骨架,连接SH2结构域后用于制备如图1A所示的功能性探针,所述功能性探针对酪氨酸磷酸化蛋白质复合物具有高效的富集和鉴定作用。其中,探针骨架的结构如图1B和图1C所示。
向50μL SH2结构域(1mg/mL,溶于HEPES缓冲液)中加入0.5μL含有光反应基团和生物素基团的探针骨架(探针骨架溶于二甲基亚砜,SH2结构域和探针骨架的摩尔比为1:10),室温条件下反应1min,随后加入5μL 1mol/L的甘氨酸溶液,终止NHS基团的活性,得到如图1A所示的标记有诱饵蛋白SH2结构域的探针。
实施例2质谱检测样品前处理
(1)按照实施例1的方法,分别采用探针骨架1-7,制备不同间隔臂长度或光反应基团的探针,加入1.4mg细胞裂解液,4℃缓慢摇动孵育2h,然后365nm紫外光照30min;
(2)加入30μL链霉亲和素微球,4℃缓慢摇动孵育2h,采用1mL mRIPA缓冲液清洗3次,并用1mL 50mM的碳酸氢铵(ammonium bicarbonate,ABC)清洗1次。
实施例3制备质谱检测样品
(1)孵育消化:
向实施例2预处理的样品中加入终浓度为10mM的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride,TCEP,溶于50mM ABC),室温孵育15min;加入终浓度为30mM的碘乙酰胺(iodoacetamide,IAA,溶于50mM ABC),室温避光孵育15min;加入终浓度为5mM的TCEP,室温孵育15min;样品采用1mL 50mM的ABC清洗1次,微球中加入50μL胰蛋白酶溶液(trypsin,2μg,溶于50mM ABC),37℃酶解消化;
(2)酶解多肽除盐:
1)收集酶解多肽:离心收集上述酶解过夜样品,加入50μL 1%(v/v)甲酸,洗涤微球2次,合并收集溶液;
2)向200μL移液管中塞入3片C18膜,加入60μL甲醇,2000×g离心2min,去除甲醇;
3)加入60μL含有80%(v/v)乙腈和0.5%(v/v)乙酸的混合溶液,2000×g离心2min;
4)加入60μL 1%(v/v)甲酸,2000×g离心2min,洗涤2次;
5)加入步骤1)中收集的酶解多肽样品,400×g离心10-15min,使样品全部通过C18膜;
6)加入60μL 1%(v/v)甲酸,2000×g离心2min,洗涤2次;
7)加入40μL含有80%(v/v)乙腈和0.5%(v/v)乙酸的混合溶液,100×g离心5-10min;
8)使用真空冷冻干燥机冻干样品。
实施例4质谱鉴定
使用连接有纳升级高效液相色谱仪(Easy-nLC 1000)的Orbitrap Fusion质谱仪进行质谱鉴定,多肽溶于0.1%(v/v)甲酸溶液中,载入装有1.9μm/的C18树脂的分析柱(100μm内径×20cm)中,以200nL/min的流速、2h有效梯度进行色谱分离和质谱检测。
实施例5不同探针间隔臂长度对目标蛋白富集和鉴定能力的优化
(1)按照实施例1的方法,分别采用探针骨架1和探针骨架2,制备不同间隔臂长度的探针1和探针2(诱饵蛋白采用PI3K p85α的N末端SH2结构域,命名为:N-PI3K);
(2)向上述制备的探针1或2中分别加入1.4mg EGF刺激后的HeLa细胞裂解液;同时设置对照组,对照组HeLa细胞不进行EGF刺激,然后按实施例2-4进行后续处理。
结果如图2A和图2B所示,经过紫外光照后,与没有经过EGF刺激的HeLa细胞相比,探针2较探针1可有效富集和鉴定9种EGFR信号通路的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物,如可有效富集和鉴定到EGFR、CBL、CBLB、SHC1和GRB2等;同时,如图2C所示,与细胞质内分子量相对较小的EGFR信号通路的蛋白质复合物,如SHC1、CBL、CBLB、GRB2等蛋白,探针2比探针1能够更好的富集和鉴定出分子量较大的(分子量约为130kDa)并且靠近细胞膜的EGFR。以上结果说明,含有长间隔臂的探针2在富集和鉴定位于难溶的细胞膜附近的EGFR信号通路动态的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物上具有更好的实验性能。通过以上实验,我们均采用间隔臂较长的探针骨架进行后续实验。
实施例6不同探针光反应基团对目标蛋白富集和鉴定能力的优化
(1)按照实施例1的方法,分别采用探针骨架2、3和4,制备不同光反应基团的探针2、探针3和探针4,诱饵蛋白采用N-PI3K;
(2)向上述制备的探针2、探针3和探针4中分别加入1.4mg EGF刺激后的HeLa细胞裂解液;同时设置对照组,对照组HeLa细胞不进行EGF刺激,然后按实施例2-4进行后续处理。
结果如图3A所示,各探针经过紫外光照后可以显著富集与N-PI3K相互作用的蛋白,但是各个探针富集相互作用蛋白的数量有明显差异,其中探针2富集相互作用的蛋白数量最多。该结果说明,光反应基团为联苯二甲酮的探针2对EGFR信号通路动态的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集和鉴定效果最佳。
为了对比不同光反应基团的标记效率,即不同探针的非特异性标记,我们设计了以下实验分组:实验组1为各探针加入1.4mg正常的HeLa细胞裂解液;实验组2为各探针加入1.4mg正常的HeLa细胞裂解液。其中,实验组2按实施例2进行紫外光照,实验组1不进行紫外光照,所有实验组按实施例3-4进行后续处理。通过这两组质谱数据之间的比较,我们可对紫外光照引起的非特异性吸附的蛋白质进行有效的鉴定和区分。
结果如图3B所示,光反应基团为联苯二甲酮的探针2产生的非特异性标记蛋白数最少。通过以上实验,我们采用光反应基团为联苯二甲酮的探针2进行后续实验。
实施例7探针2对细胞膜附近目标蛋白及其复合物的富集和鉴定能力
如实施例5中的实验结果所示,探针骨架2标记的N-PI3K可有效富集和鉴定EGFR信号通路的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物,如可有效富集和鉴定到EGFR、SHC1和GRB2等。为了更好的验证这些鉴定到的蛋白质位于EGFR酪氨酸磷酸化蛋白质复合物中,我们利用探针骨架2标记SHC1SH2结构域和GRB2SH2结构域来反向验证这些蛋白是否能够形成有效的EGFR酪氨酸磷酸化蛋白质复合物。
(1)按照实施例1制备不同诱饵蛋白的探针2,诱饵蛋白分别采用N-PI3K、GRB2蛋白的SH2结构域和SHC1蛋白的SH2结构域;
(2)向上述制备的探针2中分别加入1.4mg EGF刺激的HeLa细胞裂解液;同时设置对照组,对照组HeLa细胞不进行EGF刺激,然后按实施例2-4进行后续处理。
结果如图4A所示,SHC1SH2探针可有效富集和鉴定EGFR、GRB2和PIK3C2B;GRB2SH2探针可有效富集和鉴定EGFR和SHC1。说明SHC1SH2探针和GRB2SH2探针可有效富集和鉴定EGFR酪氨酸磷酸化蛋白质复合物,并且这些复合物形成相互作用的网络(图4B)。
实施例8 Src superbinder探针对酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集和鉴定
如前述结果所示,N-PI3K探针可有效富集EGF刺激后的HeLa细胞内的EGFR信号通路动态的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物。然而在正常培养的细胞内(没有外源EGF刺激的情况下),其EGFR信号通路中酪氨酸磷酸化蛋白质含量极低。同时,在癌症病人的肿瘤组织内,内源性的EGFR信号通路中酪氨酸磷酸化蛋白质含量也极低。但是检测和评估这些内源性的酪氨酸磷酸化蛋白质对于疾病的发生和发展,以及对于疾病的治疗都具有显著地意义。为了克服上述内源性酪氨酸磷酸化蛋白质含量较低的缺点,我们将N-PI3K换成一种通过基因突变技术改造后的Src SH2结构域(我们称其为Src superbinder)。通过将该SH2结构域内第138位的苏氨酸替换为缬氨酸、第188位的半胱氨酸替换为丙氨酸、第206位的赖氨酸替换为亮氨酸,使其对酪氨酸磷酸化多肽的亲和富集能力大大提高。
(1)为了检测Src superbinder探针对EGFR信号通路酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集和鉴定的效果,我们首先按照实施例1制备含有Src superbinder的探针2;
(2)向上述制备的探针中加入1.4mg EGF刺激的HeLa细胞裂解液;同时设置对照组,对照组HeLa细胞不进行EGF刺激。然后按实施例2-4进行后续处理。
结果如图5A所示,与N-PI3K探针相比,Src superbinder探针能有效的富集和鉴定到EGFR信号通路动态的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物中的15个蛋白,体现了其对EGFR信号通路动态的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的高效富集和鉴定能力。
为了检测Src superbinder探针对正常培养细胞内源的EGFR蛋白的富集和鉴定效果,我们首先将Src superbinder探针与正常培养的HeLa细胞裂解液进行孵育,然后进行紫外光照和链霉亲和素微球富集。结果如图5B所示,与N-PI3K探针相比,Src superbinder探针在紫外光照后能有效的富集和鉴定到EGFR蛋白,体现了其对EGFR蛋白的高效富集和鉴定能力。
实施例9 Src superbinder探针对不同乳腺癌细胞系内酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集和鉴定
以上结果说明Src superbinder探针可有效富集和鉴定正常培养细胞内含量极低的EGFR信号通路相关的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物。接下来,我们利用Src superbinder探针对正常培养的3种乳腺癌细胞系内特异性的内源性酪氨酸磷酸化蛋白质及其相应的蛋白质复合物进行富集和鉴定。
(1)按照实施例1制备含有Src superbinder的探针2;
(2)向上述制备的探针中加入1.4mg正常培养的3种乳腺癌细胞系裂解液;然后按实施例2-4进行后续处理。
结果如图6A和图6B所示,Src superbinder探针可特异性的富集MDA-MB-468细胞系中的EGFR、BT-474细胞系中的ERBB2,说明Src superbinder探针对不同的细胞系(MDA-MB-468、BT-474和MDA-MB-231)具有良好的选择性。同时,如图6C所示,Src superbinder探针对EGFR和ERBB2信号通路相关的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物也有较好的富集和鉴定能力。
实施例10 Src superbinder探针对乳腺癌组织内酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集和鉴定
我们将Src superbinder探针应用到乳腺癌病人的临床组织中,以期研究乳腺癌病人中相关的酪氨酸磷酸化蛋白质及其相应的蛋白质复合物。同时以免疫组化检测作为对照组,结果如图7A、图7B和图7C所示。
图7A为免疫组化样品图,+号表示检测到ERBB2表达,+号越多,表达越强,-号表示未检测到ERBB2表达。由图7A和图7B可知,与传统的免疫组化技术相比,本发明的探针可以显著性提高功能蛋白质复合物的鉴定灵敏度,以ERBB2受体膜蛋白为例,灵敏度提高近100倍;由图7C可知,本发明的探针还能够高通量地进行多种靶点蛋白的活性评估,可以一次性监测64种靶点蛋白激酶的活性。
实施例11光亲和性正向蛋白阵列检测原理
实施例10采用Src superbinder作为SH2结构域、联苯二甲酮作为光反应基团、生物素作为富集基因,制备得到Src superbinder探针,根据生物素-链霉亲和素之间的强亲和力,Src superbinder探针固定在链霉亲和素修饰的96孔细胞培养板中,构建光亲和性正向蛋白阵列,然后对EGF刺激的HeLa细胞中EGFR信号通路的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物进行富集和鉴定。
本实施例对构建的光亲和性正向蛋白阵列的检测原理进行简要说明。
如图8所示,Src superbinder探针是通过Src superbinder的游离伯氨基与三功能化学探针的NHS基团发生化学反应组装在一起,然后Src superbinder探针与链霉亲和素包被的96孔板孵育并通过生物素标签结合在96孔板上形成光亲和性正向蛋白阵列;随后,将细胞裂解液加入96孔板中,与光亲和性正向蛋白阵列进行孵育,结合在96孔板上的Srcsuperbinder就会识别酪氨酸磷酸化蛋白及其介导的蛋白质复合物并与其发生相互作用;在紫外照射下,Src superbinder探针能高效地共价交联直接或间接地与其发生相互作用的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物,尤其是弱的、动态变化的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物。
实施例12光亲和性正向蛋白阵列条件优化
(1)光亲和性正向蛋白阵列洗涤溶液条件优化
链霉亲和素包被的96孔板的每个孔经NP-40润洗后,加入25μL Src superbinder探针(0.2mg/mL)并置于4℃冰箱震荡反应2h,加入200μL NP-40洗涤三次,然后加入50μLEGF(100ng/mL)刺激的HeLa细胞裂解液(1mg/mL),并将其置于4℃冰箱缓慢摇动孵育2h;
将上述体系在365nm的紫外光照射下交联30min,然后分别使用NP-40、mRIPA(加入不同浓度尿素)洗涤96孔板三次,加入5%(w/v)BSA(BSA溶于TBST)封闭1h。TBST洗涤3次,加入一抗anti-EGFR(1:1000),4℃过夜反应。TBST洗涤4次,然后加入二抗,室温下结合2h。TBST洗涤4次,然后加入100μL ECL底物,利用Multimode Plate Reader测量其化学发光强度,利用化学发光成像仪显影。
如图9所示:加入含有6mol/L尿素的mRIPA洗涤缓冲液与其他三种洗涤缓冲液相比,可以显著降低非共价结合的EGFR。因此,基于光亲和性正向蛋白阵列的方法后续采用含有6mol/L尿素的mRIPA洗涤缓冲液进行洗涤。
(2)光亲和性正向蛋白阵列光交联条件优化
①光交联溶液体积的优化
将细胞裂解液(固定50μg)分别设置为30μL、50μL、100μL、150μL和200μL加入96孔板中,其他操作同实施例12中“光亲和性正向蛋白阵列洗涤溶液条件优化”。
②光交联时间的优化
固定30μL Hela细胞裂解液(1.67mg/mL)后,将光交联时间分别设置为0min、1min、5min、10min和30min,其他操作同实施例12中“光亲和性正向蛋白阵列洗涤溶液条件优化”。
如图10A所示:光亲和性正向蛋白阵列方法在细胞裂解液的体积为30μL时光交联效率最高;如图10B所示:光亲和性正向蛋白阵列方法在紫外线照射为30min时光交联效率最高,因此后续实验均采用此条件。
(3)光亲和性正向蛋白阵列结合容量的测定
①蛋白饱和上样量的测定
将Src superbinder探针与96孔板上的链霉亲和素结合后,每孔加入HeLa细胞裂解液蛋白总量分别为5μg、10μg、25μg、50μg、100μg、200μg、500μg和1000μg,光交联前将细胞裂解液定为优化好的30μL,一抗由anti-EGFR换成anti-phosphotyrosine clone 4G10,其他操作同实施例12中“光亲和性正向蛋白阵列洗涤溶液条件优化”。
②光亲和性正向蛋白阵列的Src superbinder探针饱和结合量测定
将Src superbinder探针与96孔板上包被的链霉亲和素结合前,每孔的Srcsuperbinder探针加入量分别为0.01μg、0.05μg、0.1μg、0.5μg、1μg、5μg和10μg,然后每孔中加入300μg蛋白,光交联前将细胞裂解液定为优化好的30μL,一抗由anti-EGFR换成anti-phosphotyrosine clone 4G10,其他操作同实施例12中“光亲和性正向蛋白阵列洗涤溶液条件优化”。
如图11A所示:酪氨酸磷酸化蛋白质复合物与Src superbinder的结合量随细胞裂解液中蛋白量的增加而增加,并在200μg达到饱和;如图11B所示:0.1μg Src superbinder探针可以使链霉亲和素包被的96孔板达到饱和。为了确保96孔板与Src superbinder探针结合达到饱和,后续实验均采用0.5μg Src superbinder探针。
(4)光亲和性正向蛋白阵列线性范围的测定
取0.5μg Src superbinder探针与96孔板上的链霉亲和素结合,每孔细胞裂解液上样量分别为0μg、1μg、5μg、10μg和50μg;光交联之后采用含有6mol/L尿素的mRIPA洗涤缓冲液洗涤96孔板,其他操作同实施例12中“光亲和性正向蛋白阵列洗涤溶液条件优化”。
如图12所示:光亲和性正向蛋白阵列方法显示出良好的定量能力(R2>0.999)和高灵敏度,只需5μg细胞裂解产物即可实现在复杂样品中酪氨酸磷酸化蛋白的检测。
实施例13光亲和性正向蛋白阵列用于蛋白质复合物的鉴定
取0.5μg Src superbinder探针与96孔板上的链霉亲和素结合,加入5μg HeLa细胞裂解液,光交联之后用含有6mol/L尿素的mRIPA洗涤缓冲液洗涤96孔板,一抗选择anti-EGFR、anti-GRB2、anti-SHC1和anti-CBL,其他后续操作同实施例12中“光亲和性正向蛋白阵列洗涤溶液条件优化”。
如图13A和图13B所示:结合于96孔板上的Src superbinder探针可以高效捕获EGFR及其相互作用蛋白GRB2、SHC1和CBL,其结果与EGF刺激相关。重要的是,UV交联后Srcsuperbinder探针可以结合更多的膜受体蛋白EGFR。已知的EGFR相关蛋白复合物,如GRB2、SHC1和CBL等也被光亲和性正向蛋白阵列轻松识别并捕获。这些蛋白相互作用形成EGFR相关蛋白复合物,证明了光亲和性正向蛋白阵列具有高通量的从复杂生物样品中捕获酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的性能。
实施例14光亲和性正向蛋白阵列对时间梯度变化的蛋白质复合物的鉴定
当HeLa细胞密度达到了80%时,将培养基置换成无血清培养基,并在细胞培养箱中培育;3小时后加入5μL EGF(100μg/mL),分别刺激0min、2min、5min、10min和30min,HeLa细胞裂解液一部分做蛋白质印迹实验,另外一部分应用于光亲和性正向蛋白阵列;一抗为分别anti-EGFR、anti-GRB2和anti-SHC1,其他后续步骤同实施例13“光亲和性正向蛋白阵列用于蛋白复合物鉴定”。
如图14A和图14B所示:基于光亲和性正向蛋白阵列方法检测到EGFR、GRB2和SHC1的动态变化。这些数据证实了基于光亲和性正向蛋白阵列方法可以高通量的从复杂生物样品中捕获具有动态和弱相互作用的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物。
实施例15光亲和性正向蛋白阵列用于靶向药物的筛查
当MDA-MB-468细胞密度达到50%时,加入埃罗替尼(erlotinib)刺激12h,然后加入5μL EGF(100μg/mL)刺激5min;其他步骤同实施例13“光亲和性正向蛋白阵列用于蛋白复合物鉴定”。本实验旨在检测经erlotinib抑制后,细胞内EGFR蛋白质复合物的变化。
同时,为了验证EGFR与GRB2的相互作用,构建了FLAG-GRB2稳定细胞系。稳定细胞系通过多西环素(doxycycline,1μg/mL)诱导24h,使细胞表达FLAG-GRB2,并在加入doxycycline同时加入erlotinib。然后,用EGF(100ng/mL)刺激FLAG-GRB2细胞系5min。细胞样品制备与前文一致,细胞溶解产物与30μL anti-FLAG M2微球在4℃冰箱孵育过夜;采用NP-40将anti-FLAG M2颗粒洗涤3次,然后进行SDS-PAGE电泳和蛋白质印迹实验。
如图15B所示,erlotinib可以抑制EGFR及其下游信号通路蛋白的活化;此外,如图15A所示,经erlotinib处理的细胞,使用光亲和性正向蛋白阵列技术捕获的EGFR、GRB2和SHC1明显减少;如图15C显示:erlotinib降低了EGFR与GRB2的相互作用。这些数据证实了基于光亲和性正向蛋白阵列技术可以有效地从复杂生物样品中识别酪氨酸磷酸化蛋白介导的蛋白复合物,并且该技术可应用于抗癌药物的筛选。
综上所述,本发明含有功能基团的探针包括用于靶向目标蛋白的诱饵蛋白、用于共价结合目标蛋白的光反应基团和用于富集的生物素基团,所述探针在不影响目标蛋白活性的条件下,当诱饵蛋白与目标蛋白相互作用时,紫外光辐射促进了光反应基团与目标蛋白的共价结合,显著提高了诱饵蛋白与目标蛋白的结合力,最后通过富集基团富集得到蛋白复合物,不仅实现了结合力弱的相互作用蛋白的富集和鉴定,而且通过优化探针骨架的长度以及不同光反应基团,显著提高了人或动物组织样本及细胞膜附近的目标蛋白及其复合物的富集和鉴定能力并降低了其他非特异性吸附蛋白背景干扰;采用SH2结构域作为诱饵蛋白的探针,成功实现对EGFR信号通路的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的富集和鉴定;采用Src superbinder作为诱饵蛋白形成的探针,对不同乳腺癌细胞系中和乳腺癌组织内的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物均具有高效的富集和鉴定能力,实现了对EGFR和ERBB2的富集,与传统的免疫组化技术相比,灵敏度提高近100倍,实现了一次性监测64种靶点蛋白激酶的活性的效果;将探针固定在96孔板上形成的正向蛋白阵列可高通量的探索复杂生物样品中弱的酪氨酸磷酸化蛋白介导的蛋白质复合物,特别是位于难溶的细胞膜附近的复合物。该正向蛋白阵列技术具有良好的定量性质,只需少量的起始材料即可检测动态的酪氨酸磷酸化蛋白质复合物,并且可以精确地反应靶向药物作用后肿瘤细胞内酪氨酸磷酸化蛋白质复合物的状态,为基于光亲和性正向蛋白阵列更系统地应用于临床肿瘤组织样本,发现新的诊断标志物和药物靶点提供新的思路,具有广阔的应用前景和巨大的市场价值。
申请人声明,本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法,但本发明并不局限于上述详细方法,即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了,对本发明的任何改进,对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种探针,其特征在于,所述探针包括间隔臂和连接于所述间隔臂上的诱饵蛋白、光反应基团和富集基团。
2.根据权利要求1所述的探针,其特征在于,所述间隔臂包括赖氨酸,优选为L-赖氨酸;
优选地,所述诱饵蛋白包括含有SH2结构域的蛋白和/或多肽,优选为SH2结构域,进一步优选为突变型SH2结构域;
优选地,所述突变型SH2结构域为Src SH2结构域突变体,所述突变体是在野生型SrcSH2结构域的基础上对SH2结构域内第138位的苏氨酸替换为缬氨酸、第188位的半胱氨酸替换为丙氨酸、第206位的赖氨酸替换为亮氨酸;
优选地,所述光反应基团包括联苯二甲酮、芳基叠氮化物或二氮嗪中的任意一种;
优选地,所述富集基团包括生物素;
优选地,所述SH2结构域通过游离的伯氨基和/或巯基连接于所述间隔臂上的NHS基团和/或I基团。
3.根据权利要求1或2所述的探针,其特征在于,所述探针中与SH2结构域结合的探针骨架如通式I和/或通式II所示:
其中,n1选择0、1或2,n2选择0、1或2,R选自
优选地,n1为0,n2为0,R为
优选地,n1为1,n2为2,R为
优选地,n1为1,n2为2,R为
优选地,n1为1,n2为2,R为
4.一种如权利要求1-3任一项所述的探针在检测蛋白质间相互作用中的应用,优选为在检测含有酪氨酸磷酸化残基的蛋白质间相互作用中的应用。
5.一种蛋白质间相互作用的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)向待测样品中加入如权利要求1-3任一项所述的探针,混合后孵育;
(2)将孵育的产物进行光辐射;
(3)加入微球后孵育、清洗,进行蛋白分析。
6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于,步骤(1)所述孵育的温度为2-6℃;
优选地,步骤(1)所述孵育的时间为1.5-2.5h;
优选地,步骤(2)所述光辐射的波长为360-370nm;
优选地,步骤(2)所述光辐射的时间为10-60min;
优选地,步骤(3)所述微球修饰有链霉亲和素;
优选地,步骤(3)所述孵育的温度为2-6℃;
优选地,步骤(3)所述孵育的时间为1.5-2.5h;
优选地,步骤(3)所述清洗采用优化的RIPA缓冲液和/或碳酸氢铵溶液;
优选地,步骤(3)所述蛋白分析包括免疫印迹分析和/或质谱分析。
7.根据权利要求5或6所述的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:
(1)向待测样品中加入如权利要求1-3任一项所述的探针,混合后在2-6℃下孵育1.5-2.5h;
(2)将孵育的产物在360-370nm下光辐射10-60min;
(3)加入链霉亲合素微球,在2-6℃下孵育1.5-2.5h,采用优化的RIPA缓冲液和/或碳酸氢铵溶液清洗后,对得到的蛋白进行免疫印迹分析和质谱分析。
8.一种高通量的蛋白质间相互作用的检测方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1’)将如权利要求1-3任一项所述的探针固定在固相载体上,加入待测样品,混合后孵育;
(2’)将孵育的产物进行光辐射,进行蛋白分析。
9.根据权利要求8所述的检测方法,其特征在于,步骤(1’)所述固相载体上修饰有链霉亲和素;
优选地,所述固相载体包括96孔细胞培养板、384孔细胞培养板或载玻片中的任意一种,优选为96孔细胞培养板或384孔细胞培养板;
优选地,步骤(1’)所述固定的温度为2-6℃;
优选地,步骤(1’)所述固定的时间为1.5-2.5h;
优选地,步骤(1’)所述待测样品包括细胞裂解液;
优选地,所述细胞裂解液与所述探针的质量比为(1~200):1,优选为(10~100):1;
优选地,步骤(1’)所述孵育的温度为2-6℃;
优选地,步骤(1’)所述孵育的时间为1.5-2.5h;
优选地,步骤(2’)所述光辐射的波长为360-370nm;
优选地,步骤(2’)所述光辐射的时间为1-60min,优选为10-30min;
优选地,在步骤(2’)光辐射后采用洗涤缓冲液进行洗涤;
优选地,所述洗涤缓冲液为包含0-10mol/L尿素的mRIPA洗涤缓冲液。
10.一种正向蛋白阵列,其特征在于,所述正向蛋白阵列由固相载体与固定在所述固相载体上的如权利要求1-3任一项所述的探针组成;
优选地,所述探针通过富集基团固定在固相载体上;
优选地,所述固相载体上修饰有链霉亲和素;
优选地,所述固相载体包括96孔细胞培养板、384孔细胞培养板或载玻片中的任意一种,优选为96孔细胞培养板或384孔细胞培养板。
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