CN106841368B - 一种活细胞内蛋白质棕榈酰化率的变化率的测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种比较不同状态下的活细胞内蛋白质棕榈酰化率的测定方法，本发明将细胞培养稳定同位素标记技术和点击化学相结合，借助高分辨质谱仪，可实现活细胞中目标蛋白质棕榈酰化率(即棕榈酰化目标蛋白的量/总目标蛋白质的量)的精确测定，得到棕榈酰化率的变化率，能更准确地描述蛋白质棕榈酰化修饰的过程，更直观地判断与蛋白质棕榈酰化修饰相关的疾病的发生和发展，对于临床疾病的诊断和治疗具有明显的现实意义。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定方法，尤其涉及一种活细胞内蛋白质棕榈酰化率的变化率的测定方法。
背景技术
蛋白质组学是后基因组时代生命科学研究的热点和前沿领域，是在整体水平上研究生物体蛋白质组成、变化规律及蛋白质相互作用的科学。其主要研究内容包括分离和分析细胞或组织中的全部蛋白质，探索其表达与细胞功能的关系，发现具有诊断价值的疾病标志物和可作为药物靶标的功能蛋白质，并为全面揭示重大疾病发生发展的分子机制和生物体复杂生理生化功能的分子基础提供全新的思路和策略。蛋白质组是高度动态的，细胞内蛋白质组丰度的动态变化对各种生命过程有着重要影响。定量分析细胞内蛋白质组的动态变化，对于研究蛋白质功能、揭示细胞生物机理、寻找疾病蛋白标志物和药物靶标具有重要的指导意义。因此，以质谱为基础的蛋白质分析技术也从蛋白质组的鉴定发展到定量蛋白质组学研究。
蛋白质是执行生命体功能的基本分子。蛋白质在具有生物活性功能之前要经过磷酸化、糖基化、泛素化和脂质化等一系列复杂的修饰过程。应用比较蛋白质组学技术，可以批量观察正常与疾病细胞(组织)在蛋白质表达谱上的差异，从整体水平上规模化地筛选和发掘潜在的药物靶标，以及适用于早期诊断、介入和治疗的疾病蛋白标志物。但是蛋白质的功能仅仅从量的变化上分析往往会限制我们的研究视野，许多至关重要的生命进程不仅由蛋白质的相对丰度控制，更为重要的是被那些时空特异分布的可逆翻译后修饰所控制，有时蛋白质水平上虽无明显差异、其翻译后修饰水平却已发生显著变化，揭示翻译后修饰发生规律是理解蛋白质功能复杂多样性的一个重要前提。因此，以翻译后修饰蛋白质组为研究对象的定性和定量分析已成为当前蛋白质组学研究中的重要组成部分。
蛋白质棕榈酰化修饰是生物体中广泛存在的一类重要的蛋白质翻译后修饰形式。其化学本质是长链脂肪酸(常见于饱和十六碳棕榈酸)与半胱氨酸残基(Cys)的共价结合，形成不稳定的硫酯键。长链脂肪酸的引入，增加了蛋白质的疏水性和亲脂性，协助蛋白质与细胞膜脂质双分子层的结合，从而影响细胞内各种信号传导及受体蛋白在细胞膜和胞内各细胞器上的准确定位和聚集从而精确表达其功能。与磷酸化类似，棕榈酰化是可逆的。在蛋白质酰基转移酶和棕榈酰蛋白硫酯酶的调节下，蛋白质处于棕榈酰化和去棕榈酰化的动态平衡中，以此调控被修饰蛋白质在各亚细胞单位间的转运和功能活性的实现。近年来，随着以质谱为基础的蛋白质组学和分离技术的飞速发展，一系列棕榈酰化蛋白质相继被鉴定出，使得蛋白质棕榈酰化修饰成为研究蛋白质翻译后修饰的新热点。相对于磷酸化和糖基化修饰，蛋白质的棕榈酰化修饰的研究广度与深度均有待进一步拓展。
关于棕榈酰化/去棕榈酰化过程对神经元蛋白功能调控作用的研究发现，蛋白质棕榈酰化修饰水平的变化与多种神经退行性病变及与学习记忆密切相关的神经精神疾病密切相关，如老年痴呆症、亨丁顿氏舞蹈症、精神分裂症等。因此，定量分析生物体内棕榈酰化蛋白质的动态变化，有助于阐明棕榈酰化介导的生理病理机制、寻找高特异性和灵敏性的生物标志物，是当前棕榈酰化蛋白质组学研究的热点课题之一。
早期研究蛋白质棕榈酰化的方法，通过监控细胞或生物体内代谢标记的3[H]标记棕榈酸脂，脉冲追踪分析检测棕榈酰化率。由于信号敏感度低，常常影响低丰度蛋白质棕榈酰化修饰的检测效率，不能进行定量分析。亲和富集、多维分离等技术与生物质谱的结合为棕榈酰化蛋白质组学的发展提供了契机。Davis小组2007年报道的酰基-生物素交换(acyl-biotinyl exchange，ABE)方法正式开启了棕榈酰化蛋白质组学分析的大门，是近年来广泛应用的方法之一。该法先以N-乙基顺丁烯二酰亚胺(NEM)将棕榈酰化蛋白质上已存在的游离巯基封闭，在用羟胺将结合在巯基上的内源性棕榈酰基水解释放后，用含有生物素亲和标签的功能试剂(biotin-HPDP)标记新暴露出的巯基，最后通过生物素亲和富集技术将棕榈酰化蛋白质从复杂的蛋白质提取物中分离出来，进行质谱分析。该方法适用于无细胞体系蛋白抽提物棕榈酰化修饰的原位检测，与蛋白的棕榈酰化修饰代谢率无关。缺点是羟胺对于跨膜蛋白的硫酯键裂解效率较差，致使对膜蛋白棕榈酰化修饰检测灵敏度偏低。如标记前蛋白质游离巯基未全部封闭或羟胺处理后硫酯键未全部断裂，将分别出现假阳性或假阴性结果，需同时对照无羟胺处理组方可保证实验结果的可信度。该方法虽可广泛应用于棕榈酰化蛋白质组谱的绘制，但因缺乏合适的内标，只能实现棕榈酰化蛋白质的半定量分析。
目前发展较为成熟的蛋白质组学定量分析方法并不能直接应用于棕榈酰化蛋白质组的定量分析。前者是基于氨基酸残基的选择和对一个或少数几个有代表性的肽段的定量分析，这会直接导致氨基酸序列覆盖度的降低，不能有效区分棕榈酰化蛋白和未棕榈酰化蛋白，从而阻碍样品中棕榈酰化蛋白质的鉴定和定量分析。与磷酸化蛋白质相似，棕榈酰化蛋白质在生物样本中的含量及棕榈酰化位点的化学计量值很低，对其进行规模化定量研究极具挑战性。
目前已报道的棕榈酰化蛋白质组的定量方法只是生物样本间的相对定量分析，属于比较蛋白质组学的范畴。就棕榈酰化蛋白质组学而言，棕榈酰化修饰发生于蛋白质合成之后，通过相对定量分析方法获得的不同状态下生物体棕榈酰化蛋白质水平的相对变化，是否真正反映出生物体蛋白质棕榈酰化修饰过程的改变呢？之所以产生这样的疑问，是因为蛋白质组是高度动态的，在不同生理或病理环境中，即使同一细胞中的同一种蛋白质的合成表达也是不尽相同的。换言之，某些情况下，状态的改变，不仅仅影响蛋白质翻译后修饰的过程，也影响了蛋白质被修饰之前自身的合成表达。因此，我们最终所检测到的不同状态下生物体棕榈酰化蛋白质水平的相对变化，并非由单纯意义上的蛋白质棕榈酰化修饰过程的改变所引起，而是来自于被修饰蛋白质自身的合成表达过程和其后棕榈酰化修饰过程的叠加。因此，对蛋白质棕榈酰化率(即棕榈酰化目标蛋白质的量/总目标蛋白质的量)的精确定量或对棕榈酰化蛋白质的绝对定量分析，更能准确地描述蛋白质棕榈酰化修饰的过程，更有利于直观地判断与蛋白质棕榈酰化修饰相关的疾病的发生和发展，对于临床疾病的诊断和治疗具有明显的现实意义。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种不同状态下的活细胞内蛋白质棕榈酰化率的变化率的测定方法，该方法通过对目标蛋白质棕榈酰化率(即棕榈酰化目标蛋白质的量/总目标蛋白质的量)的精确测定，能更准确地描述目标蛋白质棕榈酰化修饰的过程。
本发明的活细胞内蛋白质棕榈酰化率的变化率的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用轻型同位素试剂标记第一状态活细胞内蛋白质，再用棕榈酸类试剂标记所述第一状态活细胞内棕榈酰化蛋白质，得到第一标记活细胞；用重型同位素试剂标记第二状态活细胞内蛋白质，再用棕榈酸类试剂标记所述第二状态活细胞内棕榈酰化蛋白质，得到第二标记活细胞。
(2)将步骤(1)中第一、第二标记活细胞裂解并混合，对活细胞内总目标蛋白质进行质谱鉴定和定量分析，得到式(1)的比值R1；将棕榈酰化蛋白质和未棕榈酰化蛋白质分离，并对棕榈酰化目标蛋白质经质谱鉴定和定量分析，得到式(2)的比值R2。
(3)由式(3)得到第一、第二状态下的活细胞内目标蛋白质棕榈酰化率的变化率R2/R1。
计算公式如下：
Ht/Lt＝R1 (1)
Hp/Lp＝R2 (2)
(Hp/Ht)/(Lp/Lt)＝R2/R1 (3)
其中，Hp、Lp分别代表重型同位素试剂和轻型同位素试剂标记的活细胞内棕榈酰化目标蛋白质的强度；Ht、Lt分别代表重型同位素试剂和轻型同位素试剂标记的活细胞内总目标蛋白质的强度；R1代表第二状态和第一状态下的活细胞内总目标蛋白质的强度之比；R2代表第二状态和第一状态下的活细胞内棕榈酰化目标蛋白质的强度之比；R2/R1代表第二状态和第一状态下的活细胞内目标蛋白质棕榈酰化率的变化率。
进一步的，所述同位素试剂为稳定同位素试剂，其中重型稳定同位素的元素为2H、18O、13C、15N等。
进一步的，所述稳定同位素试剂为含有稳定同位素的氨基酸，如含重型稳定同位素13C、15N的赖氨酸(K8)、精氨酸(R10)。
进一步的，所述棕榈酸类试剂为17-十八炔酸。
进一步的，步骤(2)中，所述第一、第二标记活细胞裂解并等比例混合。
进一步的，步骤(2)中，在进行质谱鉴定和定量分析前将蛋白质进行消化处理。
进一步的，将所述蛋白质进行胰酶消化处理。
进一步的，步骤(2)中，通过基于点击反应的亲和富集将棕榈酰化蛋白质和未棕榈酰化蛋白质分离。
进一步的，所述亲和富集试剂为生物素标记的叠氮化合物(Biotin-N3)和键合抗生物素蛋白的磁珠(Avidin-Fe2O3)。
进一步的，所述质谱鉴定和定量分析为通过对轻型同位素和重型同位素分别标记的目标蛋白质中相同氨基酸序列的肽段丰度进行比较。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明将细胞培养稳定同位素标记技术和点击化学相结合，借助高分辨质谱仪，可实现活细胞中目标蛋白质棕榈酰化率(即棕榈酰化目标蛋白的量/总目标蛋白质的量)的精确测定，得到棕榈酰化率的变化率，能更准确地描述蛋白质棕榈酰化修饰的过程，更直观地判断与蛋白质棕榈酰化修饰相关的疾病的发生和发展，对于临床疾病的诊断和治疗具有明显的现实意义。相对于目前已报道的仅仅针对不同状态下生物体棕榈酰化蛋白质水平相对变化的测定，本发明既考虑了被修饰蛋白质自身合成表达量的变化，也考虑了合成后棕榈酰化修饰过程的改变。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是本发明的实施例中基于稳定同位素标记和质谱技术的活细胞内目标蛋白的棕榈酰化率的测试流程图；
图2图示了本发明的实施例中Western Blot检测CHO细胞株中FA2H的表达；
图3是本发明的实施例中17-ODYA代谢标记CHO细胞裂解蛋白的凝胶荧光成像图；
图4图示了本发明的实施例中Western Blot检测不同浓度17-ODYA代谢标记的CHO细胞中的棕榈酰化蛋白质的富集；
图5图示了本发明的实施例中Western Blot检测17-ODYA代谢标记的CHO细胞和FA2H过表达CHO细胞中Caveolin-1总蛋白的表达(A)和棕榈酰化蛋白质的表达(B)。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和脂肪酸2-羟基化酶(FA2H)过表达的CHO细胞中蛋白质棕榈酰化率的变化率的测定，测试流程图如图1所示，具体步骤如下：
(1)构建FA2H过表达的CHO细胞模型
在哺乳动物细胞中，脂肪酸2-羟基化酶(FA2H)可催化直链脂肪酸生成2-羟基脂肪酸，这一过程被认为是直链脂肪酸氧化的起始步骤。同时，其催化产物2-羟基脂肪酸因多耦合于鞘磷脂，在调控细胞膜信号转导中具有重要的生理学意义。因此，我们利用脂质体转染的方法，将FA2H真核表达载体稳定表达于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中，并以此作为细胞模型来考察和验证本技术的有效性和可行性。Western blot实验证明FA2H稳定表达于CHO细胞株，如图2所示。
(2)稳定同位素代谢标记CHO细胞和FA2H过表达的CHO细胞
将CHO细胞和FA2H过表达的CHO细胞分别置于含有轻型稳定同位素12C、14N标记的氨基酸(赖氨酸K0和精氨酸R0，属正常代谢的氨基酸)和重型稳定同位素13C、15N标记的氨基酸(赖氨酸K8和精氨酸R10)的F-12培养基中传代培养至少六代。收集每一代细胞，其蛋白质裂解液经胰酶消化为肽段后，在ThermoVelos高分辨质谱仪上进行肽段分析。根据相同肽段的一级质谱图，比较轻型稳定同位素和重型稳定同位素标记的相同肽段的同位素峰的信号强度，监测细胞稳定同位素的代谢标记率。我们发现，随着细胞培养时间的延长，相比较于轻型稳定同位素标记的肽段，重型稳定同位素标记的肽段的比例逐渐增加。在稳定同位素代谢标记六代后，细胞内蛋白质的同位素代谢标记率接近100％，说明细胞中的赖氨酸和精氨酸均被重型温度同位素标记的氨基酸置换，此时的细胞方可用于后续的实验研究。
(3)17-十八炔酸(17-ODYA)代谢标记CHO细胞和FA2H过表达的CHO细胞
将上述稳定同位素标记的CHO细胞和FA2H过表达的CHO细胞分别与含有100μM17-ODYA的培养基共培养16h后，收集细胞获取裂解蛋白。为验证17-ODYA的代谢标记效率，将100μM荧光标记的叠氮化合物(Cy7.5-N3)与100ug上述CHO细胞裂解蛋白混合，加入200μMTBTA(Tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine)、2mM CuSO4水溶液和1mMTCEP(三(2-羧乙基)膦)中，室温(25-35℃)反应1h。此时，17-ODYA代谢标记的蛋白质可被荧光基团Cy7.5标记。将反应后的溶液经SDS-PAGE电泳分离后，借助凝胶荧光成像仪，观察17-ODYA对细胞的代谢标记效率，结果示于图3。相对于阴性对照组，10μM 17-ODYA代谢标记的细胞裂解蛋白反应后呈现出明显的荧光蛋白条带，说明17-ODYA成功地代谢标记了细胞内的棕榈酰化蛋白质。
(4)17-ODYA代谢标记棕榈酰化蛋白质的富集分离
将轻型稳定同位素标记的CHO细胞和重型稳定同位素标记的FA2H过表达的CHO细胞分别与含有100μM17-ODYA的培养基共培养16h后，收集细胞获取蛋白裂解液，BCA(聚氰基丙烯酸正丁酯)蛋白定量。将100μg轻型稳定同位素和重型稳定同位素分别标记的裂解液按1:1比例混合，加入100μM生物素标记的叠氮化合物(Biotin-N3)、200μM TBTA、2mM CuSO4水溶液和1mM TCEP中，室温(25-35℃)反应1h，可将Biotin标签连接至棕榈酰化目标蛋白质上。反应溶液经氯仿-甲醇沉淀后，重悬于PBS/2％SDS(磷酸缓冲盐溶液/质量百分数为2％十二烷基硫酸钠水溶液)中。用PBS将蛋白重悬液稀释至0.1％SDS后，加入键合抗生物素蛋白Avidin的磁珠，通过免疫共沉淀反应，可将17-ODYA标记的棕榈酰化蛋白质组富集于磁珠上。Western Blot实验检测磁珠上富集的蛋白，结果示于图4。明显地，17-ODYA标记的细胞中的棕榈酰化蛋白质实现了成功富集。
5)富集后的棕榈酰化目标蛋白质和总目标蛋白质的质谱分析
将富集后的棕榈酰化蛋白质进行胰酶消化酶解，经2D-LC分离后，在ThermoOrbitrap Velos仪器上进行质谱数据采集，并用软件Protein Discoverer 2.0处理，通过对氨基酸序列相同、不同稳定同位素标记肽段丰度的比较，可以得到重型稳定同位素标记(实验组，H)轻型稳定同位素标记(对照组，L)活细胞内棕榈酰化目标蛋白质(S)和目标总蛋白质(T)的相对定量关系。将两者相比较，即可实现细胞内目标蛋白质棕榈酰化率的精确测量，计算方法参考原理图附图1中的计算公式(1)、(2)和(3)。结果显示，相对于对照组，CHO细胞中FA2H过表达诱导25个蛋白的棕榈酰化率显著上调，10个蛋白棕榈酰化率显著下调，其中Caveolin-1(窖蛋白)总蛋白质的表达虽未受到FA2H过表达的影响，但棕榈酰化修饰的Caveolin-1的含量受FA2H的调控下降了50％。
(6)生物实验验证
将CHO细胞和FA2H过表达的CHO细胞用17-ODYA代谢标记，获取其裂解蛋白。经“click”反应(点击反应)和免疫共沉淀的方法，富集蛋白裂解液中的棕榈酰化蛋白质组。Western blot实验检测Caveolin-1蛋白的表达和棕榈酰化Caveolin-1蛋白的表达。结果显示，FA2H对caveolin-1总蛋白质的表达未产生影响，但显著降低了棕榈酰化Caveolin-1的表达，如图5所示。这一结果与步骤(5)中质谱分析数据基本吻合，说明本发明中建立的稳定同位素标记技术和点击化学相结合、借助高分辨质谱仪的蛋白棕榈酰化率的测定方法是有效的。同时，该结果也说明FA2H对caveolin-1的棕榈酰化过程具有抑制作用，对理解FA2H对细胞膜脂筏的调控机制具有指导意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种活细胞内蛋白质棕榈酰化率的变化率的测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)用轻型同位素试剂标记第一状态活细胞内蛋白质，再用棕榈酸类试剂标记所述第一状态活细胞内棕榈酰化蛋白质，得到第一标记活细胞；用重型同位素试剂标记第二状态活细胞内蛋白质，再用棕榈酸类试剂标记所述第二状态活细胞内棕榈酰化蛋白质，得到第二标记活细胞；
(2)将步骤(1)中第一、第二标记活细胞裂解并混合，对活细胞内总目标蛋白质进行质谱定性和质谱定量分析，得到式(1)的比值R1；将棕榈酰化蛋白质和未棕榈酰化蛋白质分离，并对棕榈酰化目标蛋白质经质谱定性和质谱定量分析，得到式(2)的比值R2；
(3)由式(3)得到第一、第二状态下的活细胞内目标蛋白质棕榈酰化率的变化率R2/R1；
计算公式如下：
Ht/Lt＝R1(1)
Hp/Lp＝R2(2)
(Hp/Ht)/(Lp/Lt)＝R2/R1(3)
其中，Hp、Lp分别代表重型同位素试剂和轻型同位素试剂标记的活细胞内棕榈酰化目标蛋白质的强度；Ht、Lt分别代表重型同位素试剂和轻型同位素试剂标记的活细胞内总目标蛋白质的强度；R1代表第二状态和第一状态下的活细胞内总目标蛋白质的强度之比；R2代表第二状态和第一状态下的活细胞内棕榈酰化目标蛋白质的强度之比；R2/R1代表第二状态和第一状态下的活细胞内目标蛋白质棕榈酰化率的变化率。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤(1)中，所述同位素试剂为稳定同位素试剂。
3.根据权利要求2所述的测定方法，其特征在于：所述稳定同位素试剂为含有稳定同位素的氨基酸。
4.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤(1)中，所述棕榈酸类试剂为17-十八炔酸。
5.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤(2)中，所述第一、第二标记活细胞裂解并等比例混合。
6.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤(2)中，在进行质谱定性和质谱定量分析前将蛋白质进行消化处理。
7.根据权利要求6所述的测定方法，其特征在于：将所述蛋白质进行胰酶消化处理。
8.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：步骤(2)中，通过基于点击反应的亲和富集将棕榈酰化蛋白质和未棕榈酰化蛋白质分离。
9.根据权利要求8所述的测定方法，其特征在于：所述亲和富集使用的试剂为生物素标记的叠氮化合物和键合抗生物素蛋白的磁珠。
10.根据权利要求1所述的测定方法，其特征在于：所述质谱定性和质谱定量分析为通过对轻型同位素和重型同位素分别标记的目标蛋白质中相同氨基酸序列的肽段丰度进行比较。
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