CN105067821B - 一种利用小分子微阵列实现靶标垂钓和表征的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种利用小分子微阵列实现靶标垂钓和表征的方法。本发明所述方法包括以下步骤：(1)将小分子微阵列芯片放在表面等离子体共振成像生物传感器上，通入混合蛋白溶液，进行靶标垂钓；(2)通过物理手段和化学手段相结合对步骤(1)靶标垂钓之后的小分子微阵列芯片进行处理；(3)对步骤(2)处理后的小分子微阵列芯片进行原位质谱检测来实现靶标蛋白的表征。本发明方法可以实现对靶标蛋白的靶标垂钓，获取靶标蛋白与微阵列上小分子相互作用的动力学信息，本发明利用原位重生技术，应用质谱实现对靶标蛋白的原位表征，从而更加准确地确定靶标蛋白的种类。

Description

一种利用小分子微阵列实现靶标垂钓和表征的方法
技术领域
本发明属于生物微阵列芯片领域，涉及一种利用小分子微阵列实现靶标垂钓和表征的方法。
背景技术
药物靶标是指体内具有药效功能并能被药物作用的生物大分子，绝大多数为蛋白。包括多种受体，酶等。所谓靶标垂钓是指，通过对多种蛋白混合物进行一次性筛选，从而来寻找和确认可能与“孤儿”药物小分子能够发生特异性相互作用的靶标蛋白。靶标垂钓一般是先将药物小分子固定在生物芯片表面，然后在芯片上流通多种蛋白混合物进行筛选，从而来确认能够与药物小分子相互作用的靶标蛋白。靶标垂钓的意义在于，第一，通过这项技术，可以针对旧的药物小分子发现新的靶标蛋白，从而实现老药新用；第二，通过研究药物小分子与靶标蛋白质之间的相互作用，可以探究药物小分子在治疗疾病过程中的机理。
然而，目前的靶标垂钓技术存在着两个比较严重的不足。首先，传统靶标垂钓技术的实现模式主要是一对多。即一种药物小分子针对多种混合蛋白进行检测，进而筛选出一种药物小分子与一种靶标蛋白的特异性结合。这种模式存在着极大的低通量弊端：即，一次通入多种蛋白混合液，只能筛选出一对相互作用。造成这种问题的主要原因在于，不同药物小分子之间结构上的特异性，使得现实中很难采取一种普适性的方法，将不同的药物小分子同时共价固定在生物芯片上，进行多靶标垂钓。其次，传统靶标垂钓技术的检测模式信息量不够丰富。传统靶标垂钓技术利用质谱作为检测手段，可以定量地表征筛选出来的靶标蛋白的分子量，从而将其与混合溶液中的其他蛋白区分开来。但是，为了探究药物小分子与靶标蛋白的相互作用，两者之间的动力学常数以及亲和力常数是非常重要的参数，因为它们分别反映了药物小分子与靶标蛋白的结合速率以及结合能力，这对于研发新药或者探究机理起到了决定性的指导作用。
因此，针对第一点不足，如何采用一种普适性的方法，在保证药物小分子与蛋白质发生相互作用的功能域不被破坏的情况下，将不同结构的药物小分子固定在同一张生物芯片上，从而实现高通量靶标垂钓，是该领域内人们普遍关注的问题。而最新发展起来的非选择性小分子微阵列技术为上述问题提供了解决思路。
小分子微阵列(Small Molecule Microarray，SMM)是近十年来迅速发展的另一种高通量技术。SMM是指在固态表面上通过点样(或打印)然后固定各类有机小分子所形成的高密度微阵列——类似于广泛流行的DNA微阵列，一张玻璃(或塑料)衬底上可以打印上万个不同化合物的微阵列，得益于分析仪器的微型化，能够一次性、一步式地同时分析成千上万个生物化学相互作用。1999年，Schreiber等首次报道了小分子阵列，该阵列被作为探针，成功应用于FKBP12及其配基的检测。Schreiber在成功构建小分子阵列后，又成功实现了Hap3p功能抑制因子的识别；Tully等利用小分子微阵列成功发现了硫酸软骨素E和在治疗上非常重要的细胞因子TNF-α之间的相互作用。
由于小分子微阵列需要将大量的、不同化学结构或生化结构的小分子固定在载体表面，如何高效率地固定小分子，并且不影响小分子与蛋白靶标结合生化活性，一直是SMM技术最具有挑战性的难题。在众多的研究进展中，尤其以三氟甲基苯基偶氮丙因(Trifluoromethyl aryldiazirine，TFMAD)功能团为基础的光交联表面化学最受瞩目。与其它偶氮卡宾光交联化学相比，TFMAD功能团具有较高的化学稳定性，所产生的卡宾中间体有高反应活性，重排几率低，碳插入反应产率高等优点。更为重要的是，仅需要相对低能量的365nm紫外光就可以激发卡宾的产生，从而降低了小分子探针被紫外光降解的几率。TFMAD光化学固定条件温和、可控性强，可通过掩膜在指定区域内进行修饰，可广泛用于各类生物分子的固定。此外，在固相条件下进行光交联可以避免可能由溶剂引起分子特定取向与功能团选择，分子与偶氮的随机性接触得到保证。然而，高通量小分子发展迅速，却从没有人将其应用于靶标垂钓领域，主要是缺乏一种既能实现靶标垂钓，又能满足高通量要求的检测手段。
针对传统靶标垂钓领域的第二点不足，选用一种既能表征药物小分子与靶标蛋白结合的动力学信息又能表征靶标蛋白分子量的检测手段将会极大促进靶标垂钓领域的发展。
表面等离子体共振(SPR)生物传感器是一种基于物理光学原理的新型生化分析系统，与传统的超速离心、荧光法相比，具有实时检测、无需标记、耗样量少等特点。当前SPR技术主要以GE Biacore、BioRad、XanTech等低通量仪器平台为代表，而具有高通量能力的表面等离子体共振成像(SPR imaging，SPRi)的技术，近年来才走向实用化。与传统通道式SPR技术相比，SPRi基于微阵列格式，可以一次性地、实时地检测整个微阵列与样本溶液中生化分子的相互作用。
质谱是一种与光谱并列的谱学方法，是广泛应用于各个学科领域中通过制备、分离、检测气相离子来鉴定化合物的一种专门技术。质谱法在一次分析中可提供丰富的结构信息，将分离技术与质谱法相结合是分离科学方法中的一项突破性进展。
Rémy-Martin F等人(Automated cancer marker characterization in humanplasma using Surface Plasmon Resonance in Array combined with Massspectrometry(SUPRA-MS).Procedia Chemistry 6:11-19)在2012年实现了SPRi与MS的原位联用技术，但是在该技术中需采用蛋白酶原位酶解掉蛋白，进行二级结构的质谱检测，并与标准蛋白结构库进行比较，从而确定蛋白质的分子量。这种技术路线十分复杂，并且充当诱饵的是DNA序列，并没有提及小分子微阵列，此外，其对蛋白质的表征是基于酶解后的蛋白进行的，并不能实现原始蛋白的直接检测。
因此，在本领域，期望能够开发一种既能够实现对药物小分子与靶标蛋白相互作用的动力学信息的采集，又能通过直接测定靶标蛋白的一级结构而实现对靶标蛋白原位表征的方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种利用小分子微阵列实现靶标垂钓和表征的方法。本发明不仅可以实现在复杂体系中检测靶标蛋白与小分子相互作用的动力学信息，还能实现对靶标的原位表征。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
本发明提供了一种利用小分子微阵列实现靶标垂钓和表征的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将小分子微阵列芯片放在表面等离子体共振成像生物传感器(SRPi)上，通入混合蛋白溶液，进行靶标垂钓；
(2)通过物理手段和化学手段相结合对步骤(1)靶标垂钓之后的小分子微阵列芯片进行处理；
(3)对步骤(2)处理后的小分子微阵列芯片进行原位质谱检测来实现靶标蛋白的表征。
本发明所述靶标垂钓是指可以通过小分子微阵列芯片上的小分子与靶标蛋白之间的相互作用将靶标蛋白从蛋白混合溶液中筛选出来的过程。
本发明方法可以利用小分子微阵列来实现对靶标蛋白的靶标垂钓，并利用SRPi来实现对靶标蛋白与微阵列上小分子相互作用的动力学信息的获取，同时还能够利用与SRPi联用的质谱来原位表征靶标蛋白的种类，从而更加准确地确定靶标蛋白。本发明将小分子微阵列与SPRi和质谱(MS)联用技术有机结合起来，不仅拓宽了小分子微阵列的应用领域，又实现了靶标垂钓。
在本发明中利用SRPi可以实现对小分子微阵列上的多对相互作用进行检测，实现了对小分子微阵列的高通量检测。
在本发明所述利用小分子微阵列实现靶标垂钓和表征的方法中，所述小分子微阵列芯片包括基底、固定于基底表面的抗非特异性吸附材料，以及通过光交联剂与抗非特异性吸附材料共价结合的小分子点阵。
优选地，所述基底选自玻璃、石英、高分子类薄膜、金属薄膜或金属氧化物薄膜中的任意一种。
优选地，所述高分子类薄膜为聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯中的任意一种。
优选地，所述金属薄膜为金膜、银膜、铂膜、铜膜、铝膜或铬膜中的任意一种。
优选地，所述金属氧化物薄膜为三氧化二铝膜、二氧化钛膜或氧化锡膜中的任意一种。
优选地，所述抗非特异性吸附材料为烷基硫醇、带羟基末端的高分子表面或超分子自组装表面。
优选地，所述烷基硫醇为带有聚乙二醇链段的烷硫醇。
优选地，所述高分子表面为聚乙二醇或其衍生物、带羟基末端的含氟聚合物、葡聚糖、纤维素或其衍生物或带羟基末端的两性离子聚合物表面。
优选地，所述光交联剂为带有可光交联官能团的试剂。
优选地，所述可光交联官能团选自乙酰苯、苯甲酮、醌蒽类、芳香叠氮化物和芳香吖丙因，优选为芳香吖丙因。
优选地，所述小分子为具有药用价值的小分子。
优选地，所述小分子为小分子药物。
在本发明中，所述小分子微阵列可以通过以下方法来制备：
A、在芯片基底上修饰带羟基末端的抗非特异性吸附材料；
B、将带羧基末端和可光交联官能团的小分子光交联剂通过酯化反应键合到所述带羟基末端的抗非特异性吸附材料上；
C、将小分子溶液点样到步骤B所得芯片表面，干燥后，进行光交联，得到小分子微阵列芯片。
步骤B所述在芯片基底上修饰带羟基末端的抗非特异性吸附材料的具体方式，可以使用本领域技术人员已知的所有方式。常见的修饰方式主要有以下两种：1、在表面引发聚合，即先在基底表面铺上引发剂，再引发单体在表面聚合，从而获得抗非特异性的表面；2、表面接枝，即先获得具有抗非特异性吸附性质的高分子材料，再通过特定的基团反应连接到表面。
在一个具体实施方案中，步骤A中，所述带羟基末端的抗非特异性吸附材料为刷状PEG；在芯片基底上修饰刷状PEG的方法为表面引发聚合：
a、使用引发剂溶液处理芯片基底；
优选地，所述引发剂为单巯基卤代硫醇溶液；进一步优选地，所述单巯基卤代硫醇溶液的浓度为0.1～100mM、优选0.1mM～10mM、更优选1mM；更进一步优选地，所述单巯基卤代硫醇溶液还包含单巯基聚乙二醇。
在具体的实施方案中，所述单巯基卤代硫醇溶液的浓度为0.1mM、1mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM。
优选地，使用引发剂溶液处理芯片基底的方法如下：将相同浓度且各为0.1～100mM、优选0.1mM～10mM、更优选1mM的单巯基聚乙二醇和单巯基卤代硫醇的乙醇溶液，以(0～999)：1、优选(0～99)：1、更优选99:1的体积比均匀混合，铺到所述基底表面。
在具体的实施方案中，所述单巯基聚乙二醇的乙醇溶液和单巯基卤代硫醇的乙醇溶液的浓度相同且均为0.1mM、1mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、70mM、80mM、90mM、100mM，二者的体积比为0:1、1:1、9:1、49:1、99:1、199:1、299:1、399:1、499:1、599:1、699:1、799:1、899:1、999:1。
b、将步骤a所得芯片浸泡在含有机还原剂、聚合反应催化剂和PEG的烯类单体的溶液中，无氧环境下进行单体聚合反应即得。
优选地，所述有机还原剂为葡萄糖、抗坏血酸或辛酸亚锡；进一步优选地，所述有机还原剂的含量为1nM～1mM、优选为1nM～0.1mM、更优选为0.04mM。
优选地，所述聚合反应催化剂为过渡金属盐和螯合剂的混合物，所述过渡金属盐优选铁盐或铜盐；所述螯合剂优选为二联吡啶；进一步优选地，所述过渡金属盐的含量为1nM～1mM、优选为1nM～0.1mM、更优选为0.04mM；所述螯合剂的含量为1nM～100mM、优选为1nM～1mM、更优选为0.8mM。
优选地，所述PEG的烯类单体为甲基丙烯酸聚乙二醇酯；进一步优选地，所述PEG的烯类单体的含量为1mM～1M、优选为1mM～100mM、更优选为5mM。
优选地，所述高分子生长的时间为1～40小时、优选1～20小时、更优选18小时。
在另一个优选的实施方案中，所述抗非特异性吸附材料为刷状PEG，在基底上修饰刷状PEG的方法为表面接枝：
a＇、在无氧环境中，将引发剂溶液加入含有还原剂，金属有机配位催化剂和带有PEG侧链的烯类单体的溶液中，进行高分子聚合反应，得到高分子聚合物。
步骤a＇中的任何优选方案可以参照第一个实施方案中的步骤a与步骤b。
b＇、将步骤a＇中所得高分子提纯，并制备成高分子溶液，均匀铺在基底上。
作为优选，步骤b＇中所述的物质提纯技术可以使用本领域人员已知的所有方式，常见的提纯技术主要有萃取，重结晶，透析，冻干，高效液相色谱提纯和液质联用提纯。
在具体的实施方案中，将步骤a＇所得物质旋蒸，旋蒸温度为10～100℃，优选地为10～50℃，更优选45℃；再将旋蒸产物用有机试剂萃取，优选地有机试剂为二氯甲烷，乙醚，乙酸乙酯，更优选地为二氯甲烷；将萃取产物旋蒸干溶剂，旋蒸温度为10～100℃，优选地为10～50℃，更优选30℃；将旋蒸后的产物用透析袋透析，优选地透析袋规格为1000～10000，优选地为1000～5000，更优选3500；进一步优选，透析液为水，醋酸铵溶液，乙醇胺溶液，更优选水；进一步优选，透析时间为1～10天，优选地为1～5天，更优选3天。将透析产物冻干，作为优选，冻干时间为1～20h，优选1～10h，更优选8h。
作为表征手段，将步骤b＇中所述提纯后的生物素化的高分子进行凝胶渗透色谱(GPC)表征分子量。
作为优选，步骤b＇中所述提纯后的高分子溶液浓度为0.1～50mM，优选0.1～10mM，更优选1mM。
作为优选，步骤B中，所述可光交联官能团选自乙酰苯、苯甲酮、醌蒽类、芳香叠氮化物和芳香吖丙因，优选为芳香吖丙因。
优选地，步骤B具体包括：将步骤a所得带羟基末端的抗非特异性吸附材料修饰的芯片放入含所述小分子光交联剂、有机碱类催化剂和脱水剂的溶液中，18～32℃下、优选22～28℃下、更优选25℃下反应1～40小时、优选1～20小时、更优选18小时而得。
进一步优选地，所述溶液的溶剂为有机溶剂；更优选地，所述有机溶剂选自二氯甲烷、四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺。
进一步优选地，所述有机碱类催化剂选自4-二甲氨基吡啶、N,N-二异丙基乙胺和三乙胺。
进一步优选地，所述脱水剂选自1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和二环己基碳二亚胺。
进一步优选地，所述溶液中，小分子光交联剂的末端羧基与脱水剂、有机碱类催化剂的摩尔比为1：(1～3)：(1～3)，进一步优选为1：(1～2)：(1～2)，更进一步优选为1:1.5:1.5。
进一步优选地，所述溶液中，小分子光交联剂的末端羧基含量为1nM～100mM、优选为1mM～100mM、更优选为10mM。
步骤B所述酯化反应为基于固-液界面的酯化反应，通过调整反应物料配比、反应时间等条件，可以控制小分子光交联剂在芯片表面的接枝量，从而保证获得相对高的检测信号和较低的背景信号。
在具体实施方案中，步骤C所述小分子溶液可以为任意小分子，例如为小分子药物或有潜在药用价值的小分子。
优选地，所述光交联的条件为：在光强为0.1～100J/cm2、优选为0.1～10J/cm2、更优选为1J/cm2，波长为200～400nm、优选300～400nm、更优选365nm的紫外光下照射1～30分钟、优选1～20分钟、更优选10分钟。
在本发明所述利用小分子微阵列实现靶标垂钓和表征的方法中，步骤(1)中所述表面等离子体共振成像生物传感器的吸附时间为100～1000秒，例如100秒、200秒、300秒、400秒、500秒、600秒、700秒、800秒、900秒或1000秒，优选200～500秒，更优选300秒。
优选地，步骤(1)中所述表面等离子体共振成像生物传感器的解离时间为吸附时间的1～10倍，例如1.1倍、1.3倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍或9倍，优选1～5倍，更优选1.5倍。
优选地，步骤(1)中所述表面等离子体共振成像生物传感器所使用的重生液为不会影响小分子与靶标蛋白特异性结合的溶液，优选弱酸性水溶液、弱碱性水溶液或中性水溶液中的任意一种，更优选超纯水。
优选地，步骤(1)中所述表面等离子体共振成像生物传感器所使用的缓冲液为不会引起蛋白质发生变性的溶液，优选磷酸盐水溶液和/或碳酸氢钠-碳酸钠水溶液，更优选磷酸盐水溶液。
在本发明所述利用小分子微阵列实现靶标垂钓和表征的方法中，步骤(1)所述混合蛋白溶液为人工混合的蛋白溶液或天然蛋白混合液。
优选地，所述人工混合的蛋白溶液中每种蛋白的浓度为1nM～10mM，例如1nM、10nM、50nM、100nM、200nM、300nM、400nM、500nM、700nM、800nM、1μM、10μM、50μM、100μM、200μM、300μM、400μM、500μM、600μM、700μM、800μM、900μM、1mM、5mM或10mM，优选500nM～500μM，更优选1μM。
优选地，所述天然蛋白混合液为细胞裂解液或血清。
在本发明所述利用小分子微阵列实现靶标垂钓和表征的方法中，步骤(2)利用物理手段将小分子微阵列芯片加工成适合放入质谱仪的大小和形状。
例如，在具体的实施方案中，用金刚钻将小分子微阵列芯片切割成9×12厘米的长方形微阵列芯片，并在下面垫上任意支垫，使微阵列厚度达到6毫米，放入质谱仪(例如，布鲁克公司microflex型质谱仪)。
利用物理手段加工小分子微阵列芯片的目的是便于将小分子微阵列直接放入质谱中进行检测，而无需将垂钓出来的靶标蛋白从芯片上脱离下来，再去制备质谱样品进行检测，因为垂钓出来的靶标蛋白的量是很低的，很难从芯片上收集靶标蛋白样品，因此本发明的目的在于保证可以利用小分子微阵列芯片实现对靶标蛋白的原位检测和表征。
优选地，步骤(2)所述化学手段为在小分子微阵列上滴加能将靶标蛋白与小分子作用力打开的重生液，而后在小分子微阵列上滴加质谱基质。
优选地，所述重生液为强碱溶液或强酸溶液，优选pH＝2的盐酸溶液。
优选地，所述质谱基质为3-羟基吡啶甲酸、2-(4-羟基苯基偶氮)或反式-3-吲哚基丙烯酸中的任意一种，优选3-羟基吡啶甲酸。
在本发明中利用化学手段对小分子微阵列芯片进行处理的目的是使小分子微阵列垂钓出来的靶标蛋白游离下来成为单独的靶标蛋白，而不再是与芯片上小分子相结合的蛋白，这样可以实现后续对完整的靶标蛋白的检测，而不是与小分子结合后的蛋白的检测，使得检测结果更具准确性。
作为本发明的优选技术方案，本发明所述利用小分子微阵列实现靶标垂钓和表征的方法包括以下步骤：
(1)将小分子微阵列芯片放在表面等离子体共振成像生物传感器上，表面等离子体共振成像生物传感器的吸附时间为100～1000秒，解离时间为吸附时间的1～10倍，通入混合蛋白溶液，进行靶标垂钓；
(2)利用物理手段将步骤(1)靶标垂钓之后的小分子微阵列芯片加工成适合放入质谱仪的大小和形状，在小分子微阵列上滴加能将靶标蛋白与小分子作用力打开的重生液，而后在小分子微阵列上滴加质谱基质；
(3)对步骤(2)处理后的小分子微阵列芯片进行质谱检测来实现靶标蛋白的表征。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明方法可以利用小分子微阵列来实现对靶标蛋白的靶标垂钓，并利用SRPi来实现对靶标蛋白与微阵列上小分子相互作用的动力学信息的获取，利用SRPi可以实现对小分子微阵列上的多对相互作用进行检测，实现了对小分子微阵列的高通量检测。并且本发明利用原位重生技术，将与微阵列上小分子相互作用的靶标蛋白进行原位重生，从而能够利用与SRPi联用的质谱来原位表征靶标蛋白的种类，从而更加准确地确定靶标蛋白。
附图说明
图1是本发明实施例1中应用SPRi生物传感器测定得到的混合蛋白与小分子微阵列芯片上雷帕霉素的结合信号；
图2是本发明实施例1中对小分子微阵列上靶标蛋白进行的质谱表征图；
图3是本发明实施例1中质谱检测的阴性对照图；
图4是本发明实施例1中质谱检测的阳性对照图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
在本实施例中，采用表面接枝的方法制备雷帕霉素微阵列芯片，进行FKPB12蛋白的靶标垂钓，包括以下步骤：
(1)在玻璃基底上用热蒸镀的方法制备一层3.5nm厚度的铬层和一层50nm厚度的金层，作为生物芯片的基底。配制单体溶液：单体溶液共20mL，其中抗坏血酸0.04mM、氯化铜0.04mM、二联吡啶0.8mM、甲基丙烯酸聚乙二醇酯(分子量360)5mM，溶剂为甲醇和水1:1(v/v)的混合溶剂。将400μL浓度为1mM的单巯基卤代硫醇溶液作为引发剂，加入上述单体溶液中。无氧环境中，搅拌反应18小时。35℃下旋蒸干上述溶液，用20毫升二氯甲烷萃取三次。取有机层，室温下旋蒸干溶剂；用截留分子量3500的透析袋透析2～3天，每12小时换一次水。将产物冻干，并溶解到2.5毫升的乙醇内。将所制得的高分子溶液均匀铺在所得的金片上，室温放置1小时。将溶解有10mM雷帕霉素的二甲基亚砜溶液在制备好的芯片上点样，待干燥后将芯片在365nm紫外光下照射10min，光强为1J/cm2，达到预定时间后将芯片取出，用二甲基亚砜、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇、去离子水等溶剂依次进行清洗，氮气吹干，即得本发明所述小分子微阵列，阵列大小为4×4矩阵。
(2)将步骤(1)制备的小分子微阵列固定在SPRi生物传感器(广州高通生物技术有限公司，PlexArrayHT生物传感器)上。SPRi生物传感器参数设置：吸附时间为200秒，解离时间为200秒，使用超纯水作为重生液，利用磷酸盐水溶液作为缓冲液；流通入FKBP12和BSA(牛血清白蛋白)的混合溶液(FKBP12和BSA的浓度均为500nM)，观察动力学结合曲线。
(3)将步骤(2)处理过的小分子微阵列取下，用金刚钻加工成9cm×12cm大小，再在芯片下面粘上载玻片。在处理过的芯片表面每个微阵列点上滴加pH＝2的盐酸溶液，真空干燥半小时，再滴加3-羟基吡啶甲酸/甲醇溶液，真空干燥半小时。
(4)利用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)(美国布鲁克道尔顿公司，Flex质谱分析仪)对步骤(3)处理过的小分子微阵列进行质谱检测。
图1为SPRi生物传感器测定得到的混合蛋白与小分子微阵列芯片上雷帕霉素的结合信号，由图可以看出，在雷帕霉素微阵列表面通入FKBP12和BSA的混合蛋白之后，芯片表面分别经过了结合、解离过程，并且最终有500RU的靶标蛋白结合在芯片位点上。
将本实施例SPRi生物传感器测得的靶标蛋白与雷帕霉素的结合常数和解离常数总结于表1。
表1
由表1可知，本实施例得到的数据与文献报道的数据在一个数量级内，说明了实验的可靠性。
图2是对小分子微阵列上靶标蛋白进行的质谱表征，如图可以看出，分子量8000～80000的范围内，只显示出了FKBP12(12KD)的峰，而没有BSA(≈60KD)的峰，这说明本芯片将FKBP12靶标蛋白垂钓成功。图3为质谱检测的阴性对照(在没有固定雷帕霉素的空白点处的靶标蛋白垂钓情况)，如图所示，空白点处通入FKBP12/BSA的混合溶液，质谱检测几乎没有蛋白被垂钓下来，说明该芯片的抗非特异性吸附能力良好。图4为质谱检测的阳性对照，在阳性对照中，将BSA蛋白固定在芯片表面进行质谱检测，可以得到BSA蛋白的标准质谱图，将阳性对照与图3进行交叉对比，更能说明了该靶标垂钓技术是一种特异性结合的靶标垂钓。
实施例2
在本实施例中，采用表面引发的方法制备雷帕霉素微阵列芯片，进行FKPB12蛋白的靶标垂钓，具体步骤如下：
(1)在玻璃基底上用热蒸镀的方法制备一层3.5nm厚度的铬层和一层50nm厚度的金层，作为生物芯片的基底。配制400μL浓度为1mM的单巯基卤代硫醇溶液作为引发剂，配制400μL相同浓度的单巯基聚乙二醇，将两种溶液按1:99比例混合，铺到芯片表面，在4℃环境下孵育12小时。将金片用乙醇和去离子水交替清洗干净。配制单体溶液：单体溶液共20mL，其中抗坏血酸0.04mM、氯化铜0.04mM、二联吡啶0.8mM、甲基丙烯酸聚乙二醇酯(分子量360)5mM，溶剂为甲醇和水1:1(v/v)的混合溶剂。将金片浸泡在配制的单体溶液中，放置在无氧环境下生长高分子，生长时间18小时，通过控制生长时间调节高分子膜的厚度。达到预定生长时间后，将金片取出清洗。位置酯化所需光交联剂溶液：溶剂为N,N-二甲基甲酰胺(10mL)，反应液中光交联剂TFMAD10mM、脱水剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)15mM、催化剂4-二甲氨基吡啶(DMAP)15mM。将芯片浸入酯化溶液中，装入合适容器，密封，室温环境下孵育18小时。达到预定时间后，将芯片取出，用乙醇和水交替冲洗干净，氮气吹干。将溶解有10mM雷帕霉素的二甲基亚砜溶液在制备好的芯片上点样，待干燥后将芯片在365nm紫外光下照射10min，光强为1J/cm2，达到预定时间后将芯片取出，用二甲基亚砜、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇、去离子水等溶剂依次进行清洗，氮气吹干，即得本发明所述小分子微阵列，阵列大小为4×4矩阵。
(2)将步骤(1)制备的小分子微阵列固定在SPRi生物传感器上，SPRi生物传感器参数设置：吸附时间为100秒，解离时间为150秒，使用超纯水作为重生液，利用碳酸氢钠-碳酸钠水溶液作为缓冲液；流通入FKBP12和BSA的混合溶液(FKBP12和BSA的浓度均为500nM)，观察动力学结合曲线。
(3)将步骤(2)处理过的微阵列取下，用金刚钻加工成9cm×12cm大小，再在芯片下面粘上载玻片。在处理过的芯片表面每个微阵列点上滴加pH＝2的盐酸溶液，真空干燥半小时，再滴加3-羟基吡啶甲酸/甲醇溶液，真空干燥半小时。
(4)利用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)对步骤(3)处理过的小分子微阵列进行质谱检测。
通过本实施例也可以成功实现靶标蛋白FKBP12的垂钓，并可以实现靶标蛋白的原位质谱检测。
实施例3
在本实施例中，采用表面接枝的方法制备雷帕霉素微阵列芯片，进行FKPB12蛋白的靶标垂钓，包括以下步骤：
(1)同实施例1的步骤(1)；
(2)将步骤(1)制备的小分子微阵列固定在SPRi生物传感器上，SPRi生物传感器参数设置：吸附时间为1000秒，解离时间为1000秒，使用超纯水作为重生液，利用碳酸氢钠-碳酸钠水溶液作为缓冲液；流通入FKBP12和BSA的混合溶液(FKBP12和BSA的浓度均为500nM)，观察动力学结合曲线。
(3)将步骤(2)处理过的微阵列取下，用金刚钻加工成9cm×12cm大小，再在芯片下面粘上载玻片。在处理过的芯片上滴加pH＝2的甘氨酸和盐酸的混合溶液。真空干燥半小时，再滴加3-羟基吡啶甲酸的甲醇溶液，真空干燥半小时。
(4)利用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)对步骤(3)处理过的小分子微阵列进行质谱检测。
通过本实施例也可以成功实现靶标蛋白FKBP12的垂钓，并可以实现靶标蛋白的原位质谱检测。
实施例4
在本实施例中，采用表面接枝的方法制备雷帕霉素微阵列芯片，进行FKPB12蛋白的靶标垂钓，包括以下步骤：
(1)在玻璃基底上用热蒸镀的方法制备一层3.5nm厚度的铬层和一层50nm厚度的金层，作为生物芯片的基底。配制单体溶液：单体溶液共20mL，其中抗坏血酸0.04mM、氯化铜0.04mM、二联吡啶0.8mM、甲基丙烯酸聚乙二醇酯(分子量360)5mM，溶剂为甲醇和水1:1(v/v)的混合溶剂。将400μL浓度为1mM的单巯基卤代硫醇溶液作为引发剂，加入上述单体溶液中。无氧环境中，搅拌反应18小时。35℃下旋蒸干上述溶液，用20毫升二氯甲烷萃取三次。取有机层，室温下旋蒸干溶剂；用截留分子量3500的透析袋透析2～3天，每12小时换一次水。将产物冻干，并溶解到2.5毫升的乙醇内。将所制得的高分子溶液均匀铺在所得的金片上，室温放置1小时。分别将溶解有10mM雷帕霉素，10mM FK506(可与FKBP12发生相互作用的小分子)，10mM SB80(可与P38蛋白发生相互作用的小分子)，生物素(阴性对照小分子)的二甲基亚砜溶液在制备好的芯片上点样。每个小分子重复点样四次，制备成4×4矩阵。待干燥后将芯片在365nm紫外光下照射10min，光强为1J/cm2，达到预定时间后将芯片取出，用二甲基亚砜、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺、乙醇、去离子水等溶剂依次进行清洗，氮气吹干，即得本发明所述小分子微阵列。
(2)将步骤(1)制备的小分子微阵列固定在SPRi生物传感器上，SPRi生物传感器参数设置：吸附时间为500秒，解离时间为5000秒，使用超纯水作为重生液，利用碳酸氢钠-碳酸钠水溶液作为缓冲液；流通入P38和FKBP12以及BSA的混合溶液(FKBP12和BSA的浓度均为500nM)，观察动力学结合曲线。
(3)将步骤(2)处理过的小分子微阵列取下，用金刚钻加工成9cm×12cm大小，再在芯片下面粘上载玻片。在步骤(2)处理过的芯片上滴加pH＝2的甘氨酸/盐酸溶液。真空干燥半小时，再滴加3-羟基吡啶甲酸的甲醇溶液，真空干燥半小时。
(4)利用基质辅助激光解析串联飞行时间质谱仪(MALDI-TOF)对步骤(3)处理过的小分子微阵列进行质谱检测。
通过本实施例也可以在小分子微阵列芯片的雷帕霉素的点上成功垂钓到靶标蛋白FKBP12，在FK506点上也可以成功垂钓到靶标蛋白FKBP12，并且在SB80的点上可以垂钓到靶标蛋白P38，并可以实现对靶标蛋白的原位质谱检测。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的实施例，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明所选用原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (36)

1.一种利用小分子微阵列实现靶标垂钓和表征的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将小分子微阵列芯片放在表面等离子体共振成像生物传感器上，通入混合蛋白溶液，进行靶标垂钓；
(2)通过物理手段和化学手段相结合对步骤(1)靶标垂钓之后的小分子微阵列芯片进行处理；
(3)对步骤(2)处理后的小分子微阵列芯片进行原位质谱检测来实现靶标蛋白的表征；
步骤(2)所述物理手段为将小分子微阵列芯片加工成适合放入质谱仪的大小和形状；步骤(2)所述化学手段为在小分子微阵列上滴加能将靶标蛋白与小分子作用力打开的重生液，而后在小分子微阵列上滴加质谱基质。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述小分子微阵列芯片包含基底、固定于基底表面的抗非特异性吸附材料，以及通过光交联剂与抗非特异性吸附材料共价结合的小分子点阵。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基底选自玻璃、石英、高分子类薄膜、金属薄膜或金属氧化物薄膜中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述高分子类薄膜为聚二甲基硅氧烷、聚苯乙烯、聚碳酸酯或聚甲基丙烯酸甲酯中的任意一种。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述金属薄膜为金膜、银膜、铂膜、铜膜、铝膜或铬膜中的任意一种。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述金属氧化物薄膜为三氧化二铝膜、二氧化钛膜或氧化锡膜中的任意一种。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抗非特异性吸附材料为烷基硫醇、带羟基末端的高分子表面或超分子自组装表面。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述烷基硫醇为带有聚乙二醇链段的烷硫醇。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述高分子表面为聚乙二醇或其衍生物、带羟基末端的含氟聚合物、葡聚糖、纤维素或其衍生物或带羟基末端的两性离子聚合物表面。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述光交联剂为带有可光交联官能团的试剂。
11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述可光交联官能团选自乙酰苯、苯甲酮、醌蒽类、芳香叠氮化物和芳香吖丙因。
12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，所述可光交联官能团为芳香吖丙因。
13.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述小分子为具有药用价值的小分子。
14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述小分子为小分子药物。
15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述表面等离子体共振成像生物传感器的吸附时间为100～1000秒。
16.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述表面等离子体共振成像生物传感器的吸附时间为200～500秒。
17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述表面等离子体共振成像生物传感器的吸附时间为300秒。
18.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述表面等离子体共振成像生物传感器的解离时间为吸附时间的1～10倍。
19.根据权利要求18所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述表面等离子体共振成像生物传感器的解离时间为吸附时间的1～5倍。
20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述表面等离子体共振成像生物传感器的解离时间为吸附时间的1.5倍。
21.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述表面等离子体共振成像生物传感器上使用重生液，所述重生液为不会影响小分子与靶标蛋白特异性结合的溶液。
22.根据权利要求21所述的方法，其特征在于，所述重生液为弱酸性水溶液、弱碱性水溶液或中性水溶液中的任意一种。
23.根据权利要求22所述的方法，其特征在于，所述重生液为超纯水。
24.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述表面等离子体共振成像生物传感器上使用缓冲液，所述缓冲液为不会引起蛋白质发生变性的溶液。
25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐水溶液和/或碳酸氢钠-碳酸钠水溶液。
26.根据权利要求25所述的方法，其特征在于，所述缓冲液为磷酸盐水溶液。
27.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述混合蛋白溶液为人工混合的蛋白溶液或天然蛋白混合液。
28.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述人工混合的蛋白溶液中每种蛋白的浓度为1nM～10mM。
29.根据权利要求28所述的方法，其特征在于，所述人工混合的蛋白溶液中每种蛋白的浓度为500nM～500μM。
30.根据权利要求29所述的方法，其特征在于，所述人工混合的蛋白溶液中每种蛋白的浓度为1μM。
31.根据权利要求27所述的方法，其特征在于，所述天然蛋白混合液为细胞裂解液或血清。
32.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述重生液为强碱溶液或强酸溶液。
33.根据权利要求32所述的方法，其特征在于，所述重生液为pH＝2的盐酸溶液。
34.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述质谱基质为3-羟基吡啶甲酸、2-(4-羟基苯基偶氮)或反式-3-吲哚基丙烯酸中的任意一种。
35.根据权利要求34所述的方法，其特征在于，所述质谱基质为3-羟基吡啶甲酸。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其特征在于，所述利用小分子微阵列实现靶标垂钓和表征的方法包括以下步骤：
(1)将小分子微阵列芯片放在表面等离子体共振成像生物传感器上，表面等离子体共振成像生物传感器的吸附时间为100～1000秒，解离时间为吸附时间的1～10倍，通入混合蛋白溶液，进行靶标垂钓；
(2)利用物理手段将步骤(1)靶标垂钓之后的小分子微阵列芯片加工成适合放入质谱仪的大小和形状，在小分子微阵列上滴加能将靶标蛋白与小分子作用力打开的重生液，而后在小分子微阵列上滴加质谱基质；
(3)对步骤(2)处理后的小分子微阵列芯片进行质谱检测来实现靶标蛋白的表征。
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