CN112920174B - 一种光敏感型化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种光敏感型化合物及其制备方法和应用，涉及蛋白质核酸共固定技术领域，光敏感型化合物是一种聚丙烯酰胺化合物，包括四唑基团和呋喃基团；由N‑(3‑氨基丙基)氨基甲酸叔丁酯、甲基丙烯酰氯呋喃‑2‑基硼酸和[羟基(苯基)‑λ3‑碘基]4‑甲基苯磺酸盐等原料制备而成；可制成蛋白质核酸共固定电泳凝胶，定量或半定量检测单细胞或多细胞中蛋白质与核酸；还可以用于微芯片电泳迁移率分析、蛋白免疫印迹、核酸印迹杂交、单细胞蛋白免疫印迹、单细胞northern/southern印迹杂交或毛细管电泳蛋白免疫印迹。本发明的蛋白质核酸共固定凝胶可同时原位固定蛋白质与核酸来研究蛋白质与DNA相互作用。

Description

一种光敏感型化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及蛋白质核酸共固定技术领域，尤其涉及一种光敏感型化合物及其制备方法和应用。

背景技术

在大多数生物体内，遗传信息由DNA储存，经转录和翻译形成蛋白质，承担各项生命活动。作为最为重要的生物大分子，核酸和蛋白质一直是生命科学领域的研究焦点。目前单细胞高通量的各种核酸测序技术和蛋白分析技术都在蓬勃发展。使得许多关键的生物学问题的进一步研究成为可能。近年来，以研究核酸、蛋白质以及它们之间相互作用研究的基因组学和转录组学研究正得到蓬勃的发展。细胞在基因组，转录组和蛋白质组表达中表现出高度的可变性，这种可变性与细胞发育以及疾病的发生有着密切的关系。在复杂的样品中进行蛋白质与DNA相互作用分析可以使人们更好地了解系统的相互作用和整体功能。转录因子(transcription factor，又称TF)是一群能与基因5`端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。TF在转录和调节染色质可及性方面起着核心作用，了解遗传变异对TF结合的影响可以提供对有关发育和疾病的非编码遗传成分的见解，对于深入了解生物网络在健康和疾病中的作用至关重要¹。然而目前对于蛋白质(例如TF)与DNA相互作用的研究主要还是基于较大样本的分析检测，这种对复杂群体平均化的分析可能掩盖的微小群体的特性和丰富的单细胞行为，丧失细胞间的异质性信息，因此我们需要能够检测少量细胞内转录因子与其结合DNA相互作用情况的方法。

目前与核酸与蛋白质结合情况相关的研究方法主要有染色质免疫沉淀测序(ChIP-Seq)，DNase-seq、FAIRE-seq和MNase-seq等酶断裂法，电泳迁移率迁移分析法几种。这些方法还可以进一步整合微流控技术，免疫印迹分析技术，质谱分析以及PCR等对相互结合的核酸与蛋白质进行进一步定性或定量的分析。

在全基因组范围内研究蛋白质与DNA相互作用的主要技术之一是染色质免疫沉淀测序技术(ChIP-Seq)。ChIP-Seq技术结合了ChIP和第二代测序技术，被用于分析蛋白质与DNA的交互作用。该技术将染色质免疫沉淀(ChIP)与大规模并行DNA测序结合起来以鉴定与DNA相关蛋白的结合部位。采用的方法是在体内将蛋白质与染色质交联，并使用特异性抗体将蛋白质与结合的目的染色质一起纯化。然后通过深度测序来鉴定沉积的DNA区域，该方法可以有效地检测在整个基因组中与组蛋白，转录因子等相互作用的DNA位点。这些DNA位点通过染色质免疫沉淀被分离出来，再结合使用大规模平行序列分析与全基因组序列数据库可以分析任何蛋白质与DNA的相互作用模式或表观遗传染色质修饰的模式。

最近的研究表明，许多细胞类型(包括正常的免疫细胞)在复杂的组织和肿瘤中起着重要的辅助功能。为了阐明发育过程中的这种细胞异质性和细胞命运轨迹，人们已经开发了各种单细胞测定方法。其中，scChIP-seq可从低输入样本中以单细胞分辨率对组蛋白修饰和其他染色质结合蛋白进行全基因组分析。此外还有用于单细胞标记和ChIP-seq库制备的多种方法用于单细胞标记和ChIP-seq文库制备；这些方法结合使用微流体系统，Tn5转座酶标记等策略。

对于蛋白质与核酸相互关系的分析还可以采用酶断裂法如DNase-seq、FAIRE-seq和MNase-seq等技术，这些技术主要侧重于染色质可及性的分析。简单来说，染色质变得开放，就意味着DNA和组蛋白的浓聚程度降低，就会有一部分DNA暴露出来。而一旦失去了蛋白质的保护，这部分DNA就可以被DNA酶(MNase或DNase I)所切割。然后，我们再把被切割过的DNA拿来测序，和已知的全基因组序列相比较，就能发现被切掉的是哪些地方，没有被切掉的地方又在哪里，从而获知开放的染色质区域。染色体上开放区域与对应转录因子或其他调控蛋白的结合能直接影响细胞内基因复制和转录行为的发生，反映染色质的转录活性状态，精确地在基因组上鉴定这些特定开放的DNA区域对于发掘基因组调控元件至关重要。

电泳迁移率迁移分析(或凝胶迁移分析)是一种用于检测具有核酸的蛋白质的复合物的快速而灵敏的方法，被认为是现代分子生物学中蛋白质-核酸相互作用的定性和半定量分析的核心技术。这个技术最初由Fried和Crothers提出，最经典流程通常是将蛋白质和核酸溶液合并，然后在自然条件下通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶对所得混合物进行电泳。电泳后通过³²P标记核酸的放射自显影来确定含有核酸的物质的分布。通常，蛋白质-核酸复合物的迁移要比相应的游离核酸慢。该技术易于实施，可以适应广泛的结合条件，与多种核酸大小和结构的分析兼容，对高度纯化的蛋白质和粗制细胞提取物都适用。在适当的条件下，可以在单一溶液中监测蛋白质在多个核酸分子之间的分布，以及和结合位点分布不同的复合物的存在。

以上技术对于分析细胞内蛋白质与DNA结合情况已被证明非常重要，但是各种方法均存在着缺点。

1.ChIP-seq中甲醛交联这一步骤交联效率较低，对哺乳动物细胞而言，其最大交联效率仅为1％。另外还可能触发DNA的损伤反应机制，这可能改变染色质组成并使ChIP结果发生偏移。此外，甲醛还会导致许多其他无关的蛋白质与DNA交联，从而影响后续的数据分析。目前存在的各种单细胞核酸与蛋白的检测方法基本都是与液滴微流控相结合，通过单个细胞封装与条形码标记来实现的。虽然在精度上能够实现单细胞的精确度，但是依然需要较大的样本量，操作也较为复杂。

2.MNase-seq需要大量的细胞，并需要严格的酶解条件。由于DNase I在切割DNA时具有一定的偏好性，对转录因子的印记分析的可靠性有待进一步研究。FAIRE对细胞的起始状态无要求。但是对于甲醛的固定效率具有很高的依赖性。且信噪比过低，过高的背景信号对数据的分析解读产生非常大的干扰。

3.电泳迁移率迁移分析上样量较大(2-20ug)，且所用的DNA探针的标记具有放射性，难以定量检测，特别是定量检测凝胶中蛋白质。

因此，本领域的技术人员致力于开发一种保持蛋白质与核酸的原有活性、操作简单的、所需样本量少的、特异性强的、无放射性的，易定量的，检测蛋白质与核酸相互作用的方法。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是一种操作简单的、所需样本量少的、特异性强的、易定量的、对DNA损伤最低的、无放射性的检测蛋白质与核酸相互作用的方法。

为实现上述目的，本发明提供了一种光敏感型化合物，能在凝胶内特异性检测核酸与蛋白质结合情况的双功能光敏丙烯酰胺类化合物；由该光敏感型化合物制成的光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶，具有原位固定蛋白质与核酸的功能；将其与微芯片结合，用于少量细胞样本的蛋白质与核酸间的电泳迁移率分析。

一种光敏感型化合物，是一种聚丙烯酰胺化合物，包括光敏基团与丙烯酰胺基团，其中光敏基团包括四唑基团和呋喃基团。

进一步地，聚丙烯酰胺化合物的化学结构式为：

本发明还提供一种光敏感型化合物的制备方法，包括以下步骤：

步骤3.1利用N-(3-氨基丙基)氨基甲酸叔丁酯和甲基丙烯酰氯制备N-[3-(2-甲基丙-2-烯丙基氨基)丙基叔丁基氨基甲酸酯；

步骤3.2利用步骤3.1制得的N-[3-(2-甲基丙-2-烯丙基氨基)丙基叔丁基氨基甲酸酯和盐酸/二氯甲烷制备N-(3-氨基丙基)-2-甲基-丙-2-烯酰胺；

步骤3.3利用呋喃-2-基硼酸和[羟基(苯基)-λ3-碘基]4-甲基苯磺酸盐制备[2-呋喃基(苯基)-λ3-碘基]4-甲基苯磺酸盐；

步骤3.4利用步骤3.3制得的[2-呋喃基(苯基)-λ3-碘基]4-甲基苯磺酸盐、2H-四唑-5-羧酸乙酯和三氟甲烷磺酸铜以及三乙胺(TEA)制备2-(2-呋喃基)四唑-5-羧酸乙酯；

步骤3.5利用步骤3.4制得的2-(2-呋喃基)四唑-5-羧酸乙酯和LiOH制备2-(2-呋喃基)四唑-5-羧酸；

步骤3.6利用步骤3.5制得的2-(2-呋喃基)四唑-5-羧酸和步骤3.2制备的N-(3-氨基丙基)-2-甲基-丙-2-烯酰胺制备2-(2-呋喃基)-N-[3-(2-甲基丙-2-烯丙基氨基)丙基]四唑-5-甲酰胺(MAP-FTC)。

进一步地，上述步骤3.6还包括：

步骤3.6.1向2-(2-呋喃基)四唑-5-羧酸N-(3-氨基丙基)-2-甲基-丙-2-烯酰胺的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)溶液和1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)，得到反应混合物；

步骤3.6.2将步骤3.6.1获得的反应混合物在15-40℃下搅拌13-20h，用水稀释，用乙酸乙酯萃取水相，分别得到有机相和水相，其中有机相用盐水洗涤，之后用无水Na₂SO₄干燥、过滤并真空浓缩获得残余物；

步骤3.6.3将步骤3.6.2获得的残余物通过柱色谱法纯化，得到粗产物；通过制备型HPLC纯化粗产物，得到MAP-FTC。

本发明还提供一种光敏感型化合物的应用，光敏感型化合物制成光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶，用于凝胶电泳；用于单细胞或多细胞、提取出的蛋白质和核酸或纯化的蛋白质和核酸溶液的测定；包括对蛋白质和核酸进行特异性定量或半定量检测；还包括同时检测一种或多种蛋白质分析物。

进一步地，光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶的凝胶总浓度(T％)为4-8％。

进一步地，凝胶电泳中还可以后续在胶内加入原位针，胶内原位针包括抗体探针，抗体探针的标记抗体包括荧光、酶、胶体金或超顺磁性微球。

进一步地，蛋白质核酸的检测反应包括适配体、纳米抗体或凝集素。

本发明还提供一种光敏感型化合物的其他应用，光敏感型化合物应用于微芯片电泳迁移率分析、蛋白免疫印迹、核酸印迹杂交、单细胞蛋白免疫印迹、单细胞northern/southern印迹杂交或毛细管电泳蛋白免疫印迹；微芯片电泳迁移率分析步骤如下：

9.1制备微芯片：通过光刻产生单细胞大小的微孔阵列模板，制备凝胶,同时在凝胶前体溶液中混入光敏感型化合物，获得微芯片；

9.2细胞和核酸探针或者纯化蛋白滴加到步骤9.1所得到微芯片的含有微孔的凝胶上，使其重力沉降到微孔中，并用PBS洗去未能沉降的细胞；

9.3细胞原位裂解释放出蛋白质和核酸并孵育，使蛋白质和核酸探针结合，或者核酸和纯化蛋白结合，得到结合物；

9.4将步骤9.3所得到的结合物在微芯片上进行非变性凝胶电泳，分离彼此结合的聚合物与游离单体；

9.5通过紫外照射微芯片，激活光敏感型化合物，从而将蛋白质和核酸原位固定，得到固定化蛋白质/核酸的凝胶；

9.6对步骤9.5获得的固定化蛋白质和核酸的凝胶内探测，包括采用抗原抗体结合或探针杂交方法来检测相互结合的蛋白质或核酸。

进一步地，微芯片电泳迁移率用于分析细胞或者单细胞样本，细胞或者单细胞样本的上样量可低至3-5ug。

进一步地，光敏感型化合物包括同时具有四唑基团和呋喃基团的聚丙烯酰胺化合物及其衍生物和结构类似物。

进一步地，光敏感型蛋白质固定凝胶同时具有四唑基团和呋喃基团，四唑基在346nm左右紫外照射下产生的碳氮三键可以与蛋白发生亲核加成，呋喃在长波长紫外光下可以与核酸的嘧啶碱基发生[4+2]环加成反应，具有光敏感性。

进一步地，光敏感型蛋白质固定凝胶可以在紫外激发的条件下同时原位固定核酸和蛋白质。

进一步地，光敏感型化合物用于微芯片电泳迁移率分析的步骤如下：

a.通过光刻产生单细胞大小的微孔阵列模板并凝胶,同时在凝胶前体溶液中混入光敏型化合物,即同时具有四唑基团和呋喃基团的聚丙烯酰胺化合物及其衍生物和结构类似物；

b.将细胞和核酸探针/纯化蛋白滴加到含有微孔的上述凝胶上，使其重力沉降到孔中，并用PBS洗去未能沉降的细胞；

c.细胞原位裂解释放出蛋白质/核酸并孵育，使蛋白质和核酸探针/核酸和纯化蛋白结合；

d.在微芯片上进行非变性凝胶电泳，分离彼此结合的聚合物与游离单体；

e.通过紫外照射激活光敏剂，从而将蛋白质和核酸原位固定；

f.采用抗原抗体结合或探针杂交等方法对固定化蛋白质核酸的凝胶进行胶体内探测，来检测相互结合的凝胶与蛋白质。

进一步地，光敏感型化合物合成路径及合成方法可以多样化。

在本发明的较佳实施方式施例1中，说明了光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶作用原理；

在本发明的另一较佳实施方式实施例2中，说明了光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶经紫外激发与蛋白质和核酸交联作用原理；

在本发明的另一较佳实施方式实施例3中，说明了制备光敏感型化合物的方法；

在本发明的另一较佳实施方式实例4中，说明光敏感型化合物的光吸收特性；

在本发明的另一较佳实施方式实施例5中，测定不同浓度光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶对牛血清白蛋白BSA的固定效率；

在本发明的另一较佳实施方式实施例6中，不同紫外光照时间下，测定光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶对异硫氰酸荧光素(FITC)标记的牛血清白蛋白(BSA)的固定效率；

在本发明的另一较佳实施方式实例7中，不同紫外光照时间，测定光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶对核酸的固定效率；

在本发明的另一较佳实施方式实例8中，说明微芯片电泳迁移率分析步骤。

本发明提供的一种光敏感型化合物及其制备方法和应用所具有的技术效果如下：

1.光敏感型化合物具有的四唑基团和呋喃基团两个官能团，用于光敏感型蛋白质固定凝胶能够同时原位固定核酸和蛋白质，实现同一样本上蛋白质和核酸的共检。

2.光敏感型蛋白质固定凝胶不需要对相互结合的相互结合的核酸与蛋白质进行额外的预先处理，更能保持蛋白质与核酸原有的活性，避免引起相关的结合位点失活。

3.光敏感型化合物用于电泳迁移率分析(PAG)筛分能力与高分辨率的微流体联用，使其与传统的平板凝胶相比所需样本量更小，灵敏度更高。

4.蛋白质与核酸通过光敏型化合物原位固定省去了繁琐的转膜等步骤，所需时间更短，减小了样品的损失。

5.光敏感型蛋白质固定凝胶将蛋白与核酸固定之后再利用抗原抗体结合等进行信号检出，不用预先标记，标记可能扰乱蛋白质和细胞功能。

6.光敏感型蛋白质固定凝胶使用荧光分子作为检出信号，无放射性污染。

7.光敏感型蛋白质固定凝胶能同时能检测多种靶标物质，既可以检测相互结合的蛋白质与核酸，也可以通过洗脱复染检测上下游相关的其他蛋白质。

以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。

附图说明

图1是本发明实施例1的光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶作用原理示意图；

图2是本发明实施例2的光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶经紫外激发与蛋白质和核酸交联作用原理示意图；

图3是本发明实施例3的光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶的合成路线图；

图4是本发明实施例3的合成光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶的流程中第5化合物[2-呋喃基(苯基)-λ3-碘基]4-甲基苯磺酸盐的核磁共振氢谱；

图5是本发明实施例3的光敏感型化合物MAP-FTC质谱鉴定图谱；

图6是本发明实施例4的光敏感化合物MAP-FTC的紫外-可见光吸收图谱；

图7是本发明实施例5的不同浓度光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶对牛血清白蛋白BSA的固定效率；

图8是本发明实施例6的同紫外光照时间对光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶对牛血清白蛋白BSA的固定效率；

图9是本发明实施例7的光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶对核酸的固定效率；

图10是本发明实施例8的微芯片电泳用光刻模板与凝胶实物。

具体实施方式

以下参考说明书附图介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。

实施例1：光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶作用原理

光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶作用原理如图1所示，蛋白质核酸共固定包括以下步骤：

1.1材料沉降：细胞和核酸探针纯化蛋白滴加到含有微孔的凝胶上，使其重力沉降到孔中，并用PBS洗去未能沉降的细胞；

1.2蛋白-核酸结合：细胞原位裂解释放出蛋白质核酸并孵育，使蛋白质和核酸探针、核酸和纯化蛋白结合；

1.3电泳：在微芯片上进行非变性凝胶电泳，分离彼此结合的聚合物与游离单体；

1.4光敏固定：通过紫外照射激活光敏剂，从而将蛋白质和核酸原位固定；

1.5免疫固定：固定化蛋白质核酸的凝胶内探测，可以采用抗原抗体结合或探针杂交等方法来检测相互结合的凝胶与蛋白质。

实施例2：光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶经紫外激发与蛋白质和核酸交联作用原理

本发明提供的光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶所含有的新型光敏剂MAP-FTC，是一种聚丙烯酰胺类化合物，同时具有四唑基团和呋喃基团。光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶经紫外激发与蛋白质和核酸交联作用原理如图2所示，左边的化学式表示新型光敏剂MAP-FTC的四唑基在346nm左右紫外照射下产生的碳氮三键可以与蛋白发生亲核加成；右边的化学式表示新型光敏剂MAP-FTC的呋喃基团在长波长紫外光下可以与核酸的嘧啶碱基发生[4+2]环加成反应。因此光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶可以在紫外激发的条件下同时原位固定核酸和蛋白质。新型光敏剂MAP-FTC所具有的四唑基团和呋喃基团两个官能团保证了其同时原位固定核酸和蛋白质，实现同一样本上蛋白质和核酸的共检。

实施例3：制备光敏感型化合物

步骤3.1：制备N-[3-(2-甲基丙-2-烯丙基氨基)丙基叔丁基氨基甲酸酯(tert-butyl(3-methacrylamidopropyl)carbamate)：

如图3合成路线图所示，向第1化合物，即N-(3-氨基丙基)氨基甲酸叔丁酯的二氯甲烷(DCM)溶液中加入甲基丙烯酰氯，在15-40℃下搅拌13-20h，所得反应混合物用NH₄Cl和盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩；所得残余物通过柱色谱法纯化得到白色固体tert-butyl(3-methacrylamidopropyl)carbamate，即图3所示的第2种化合物。

步骤3.2：制备N-(3-氨基丙基)-2-甲基-丙-2-烯酰胺(N-(3-aminopropyl)-2-methyl-prop-2-enamide)：

如图3合成路线图所示，向第2化合物，即N-[3-(2-甲基丙-2-烯丙基氨基)丙基叔丁基氨基甲酸酯的乙酸乙酯(EtOAc)溶液中加入盐酸/二氯甲烷，甲醇液，在15-40℃下搅拌0.5-3h；所得反应混合物经减压浓缩，得到残余物为第一粗产物；将所得第一粗产物在15-40℃下用EtOAc和DCM研磨，得到白色固体N-(3-aminopropyl)-2-methyl-prop-2-enamide，即如图3所示，第3化合物。

步骤3.3：制备[2-呋喃基(苯基)-λ3-碘基]4-甲基苯磺酸盐([2-furyl(phenyl)-λ3-iodanyl]4-methylbenzenesulfonate)：

如图3合成路线图所示，向第4化合物，即呋喃-2-硼酸的DCM溶液中添加[羟基(苯基)-λ3-碘基]4-甲基苯磺酸盐在15-40℃下搅拌13-20h；将所得反应混合物过滤并浓缩，得到第二粗产物；将所得第二粗产物与聚乙烯(PE)和DCM在15-40℃下研磨，得到白色固体[2-furyl(phenyl)-λ3-iodanyl]4-methylbenzenesulfonate，即如图3所示，第5化合物，其核磁共振如附图4所示。

步骤3.4：制备2-(2-呋喃基)四唑-5-羧酸乙酯(ethyl 2-(furan-2-yl)-2H-tetrazole-5-carboxylate)：

如图3合成路线图所示，向第5化合物，即[2-呋喃基(苯基)-λ3-碘基]4-甲基苯磺酸盐的DCM溶液中加入2H-四唑-5-羧酸乙酯和三氟甲烷磺酸铜以及三乙胺(TEA)，在15-40℃下搅拌13-20h；所得反应混合物用饱和NH₄Cl和盐水洗涤，用无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩；所得残余物通过硅胶色谱法纯化，得到黄色固体ethyl 2-(furan-2-yl)-2H-tetrazole-5-carboxylate，即如图3所示，第6化合物。

步骤3.5：制备2-(2-呋喃基)四唑-5-羧酸(2-(2-furyl)tetrazole-5-carboxylicacid)：

如图3合成路线图所示，向第6化合物，即2-(2-呋喃基)四唑-5-羧酸乙酯的甲醇(MeOH)和H ₂O溶液中加入LiOH，在15-40℃下搅拌1-5h；将所得反应混合物在减压下浓缩以除去MeOH；随后将混合物用水稀释；用乙酸乙酯萃取水相；然后通过1N HCl将水相的pH调节至5-6，之后将水相用乙酸乙酯萃取；最后合并两次萃取所得的有机相，用盐水洗涤，通过无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩，得到红色固体2-(2-呋喃基)四唑-5-羧酸，即如图3所示，第7化合物。

步骤3.6：制备MAP-FTC：

如图3合成路线图所示，向第7化合物，即2-(2-呋喃基)四唑-5-羧酸N-(3-氨基丙基)-2-甲基-丙-2-烯酰胺N,N-二异丙基乙胺(DIEA)和1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)，在15-40℃下搅拌13-20h；将所得反应混合物用水稀释；随后用乙酸乙酯萃取水相；将萃取所得有机相用盐水洗涤，通过无水Na₂SO₄干燥，过滤并真空浓缩；所得残余物通过柱色谱法纯化，得到第三粗产物；通过制备型HPLC纯化所得第三粗产物，得到白色目标化合物MAP-FTC，其核磁共振如附图5所示。

实例4：光吸收特性

以安捷伦科技(中国)有限公司生产的紫外-可见分光光度计测量实施例3中所合成化合物MAP-FTC的紫外-可见吸收光谱。仪器型号为Evolution 220UV-Vis，光谱扫描范围从200nm到800nm。获得紫外-可见吸收光谱，从而获得了本发明光敏感型化合物的光吸收特性。如附图6所示，实施例3中所合成化合物MAP-FTC在波长为300nm左右有强的吸收峰。

实施例5：测定不同浓度光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶对牛血清白蛋白BSA的固定效率。

测定不同浓度光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶对牛血清白蛋白BSA的固定效率，浓度分别设置为2nM，1.5nM，1nM，0.8nM,0.6nM，0.4nM,0.2nM,0nM。结果如图7所示，随着凝胶浓度增加，对异硫氰酸荧光素(FITC)标记的牛血清白蛋白(BSA)固定效率上升，浓度为0.4mM以下固定效率上升速度和快；浓度为0.4mM，固定效率已经达到0.8％；浓度为0.4mM以上，随着凝胶浓度增加固定效率缓慢上升。说明光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶在凝胶浓度为0.4mM对胶内蛋白质具有较强较高固定效率。

实施例6：不同紫外光照时间下，测定光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶对异硫氰酸荧光素(FITC)标记的牛血清白蛋白(BSA)的固定效率。

6.1将实施例3中的产物MAP-FTC，溶解于二甲亚砜(DMSO)中，配置成浓度为100mM的储存溶液S1。

6.2在1.5ml Ep管内，25uL 1.5M pH8.8 Tris-HCl，166.7uL 30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(29：1)，265.3uL双氧水，3.75uL(0.75％)的S1,配置成胶precursor。

6.3并加入10ul 5％SDS，10ul 5％TritonX-100，4ul APS，4ul TEMED，轻轻摇匀。滴加该溶液于多孔微阵列模具上，并将玻片轻缓盖上，避免气泡产生，静置20min，待胶凝固，剥离模具，制成多孔微阵列凝胶。

6.4配置RIPA-like裂解液(Radio immune-precipitation assay lysis buffer，也是电泳缓冲液)。0.5％SDS，0.1％v/v Triton X-100，0.25％脱氧胆酸钠，12.5mM Tris，96mM glycine，pH 8.3，于4℃保存。

6.5取裂解液/电泳液水浴加热至50-55摄氏度。提前开启紫外，使光源稳定。

6.6将芯片置于新的皿中，胶面朝上，滴加200ul BSA溶液，浓度为5.12mg/mL，轻摇玻片，使BSA溶液分布均匀。静置3min。

6.7将胶置于电泳槽内，从电泳槽一角轻柔尽快倒入水浴55℃预热的10ml RIPA-like裂解液。

6.8立即开启电压电源，200V电压(E＝40v/cm2)，蛋白电泳分离30s。

6.9立即终止电压，紫外曝光。曝光时间分别设置为120s，100s，80s,60s,40s,20s，0s。

6.10曝光结束，取出胶，蓝光激发下拍摄照片，记录蛋白固定情况。

6.11 TBST(Tris buffered saline with Tween 20)摇洗，每15min换液一次，持续2h，后摇洗过夜。

6.12拍摄照片，记录蛋白固定情况。

6.13如图8所示，随着紫外照射时间延长，对异硫氰酸荧光素(FITC)标记的牛血清白蛋白(BSA)固定效率上升，40s以内固定效率上升速度和快；到40s时，固定效率已经达到0.8％；40s以内后，随着紫外照射时间延长固定效率缓慢上升。说明光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶在经较短时间(40s以内)的紫外激发后就对胶内蛋白质具有较强较高固定效率。

实例7：不同紫外光照时间，测定光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶对核酸的固定效率。

7.1将实施例1中的产物MAP-FTC，溶解于二甲亚砜DMSO中，配置成浓度为500mM的储存溶液S1。

7.2在1.5ml Ep管内，250uL 1xTBE buffer，100uL 30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(29：1)，142uL ddHO，4uL的S1,配置成胶precursor。

7.3并加入4ul APS，4ul TEMED，轻轻摇匀。滴加该溶液于多孔微阵列模具上，并将玻片轻缓盖上，避免气泡产生，静置20min，待胶凝固，剥离模具，制成多孔微阵列凝胶。

7.4配置0.5xTBE buffer作为电泳液。

7.5取电泳液预冷。提前开启紫外，使光源稳定。

7.6将芯片置于新的皿中，胶面朝上，滴加混有SYBR GREEN核苷酸胶体染料的DNAladder溶液，轻摇玻片，使溶液分布均匀。静置3min。

7.7将胶置于电泳槽内，从电泳槽一角轻柔尽快倒入预冷的25ml 0.5xTBEbuffer。

7.8立即开启电压电源，200V电压(E＝40v/cm2)，电泳分离30s。

7.9立即终止电压，紫外曝光。曝光时间设置为5min。

7.10曝光结束，取出胶，蓝光激发下拍摄照片，记录核酸固定情况。

7.11 0.5xTBE摇洗，每15min换液一次，持续2h，后摇洗过夜。

7.12拍摄照片，记录核酸固定情况如图8所示，摇洗12h后，大部分电泳条带依然保留在原位，说明光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶对核酸的固定效果良好。

实例8：微芯片电泳迁移率分析

在凝胶前体溶液中混入光敏感型化合物，通过光刻产生单细胞大小的微孔阵列模板制成凝胶。如图10所示，图中左边是电泳用光刻模板，右边是添加微芯片的凝胶实物。微芯片电泳迁移率分析具体步骤如下：

8.1将实施例1中的产物MAP-FTC，溶解于二甲亚砜DMSO中，配置成浓度为500mM的储存溶液S1。

8.2在1.5ml Ep管内，250uL 1xTBE buffer，100uL 30％丙烯酰胺/甲叉双丙烯酰胺(29：1)，129.5uL ddHO，12.5uL甘油，4uL的S1,配置成胶precursor。

8.3加入4ul APS，4ul TEMED，轻轻摇匀。滴加该溶液于微孔阵列模板上，并将玻片轻缓盖上，避免气泡产生，静置20min，待胶凝固，剥离模具，制成多孔微阵列凝胶。

8.4配置0.5xTBE buffer作为电泳液。

8.5取裂解液/电泳液水浴预冷。提前开启紫外，使光源稳定。

8.6将胶置于电泳槽内，从电泳槽一角轻柔尽快倒入预冷的25ml 0.5xTBEbuffer。

8.7立即开启电压电源，55V电压(E＝10v/cm2)，预电泳30min。

8.8按照顺序依次加入3-5ug融合蛋白,0.5–2μL标记探针,2μL结合反应缓冲液,用Nuclease-Free Water定容至10ul，混匀并且室温(20-25℃)放置20分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置30分钟。

8.9加入2μL的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，6X)，充分混合，将芯片置于新的皿中，胶面朝上，滴加样品，静置3min。

8.10将胶置于电泳槽内，从电泳槽一角轻柔尽快倒入预冷的25ml 0.5xTBEbuffer。

8.11立即开启电压电源，55V电压(E＝10v/cm2)，电泳分离30min。

8.12立即终止电压，紫外曝光。曝光时间设置为5min。

8.13曝光结束，取出胶。

8.14配制TBST 100mM Tris，盐酸滴定至pH7.5，150mM NaCl，0.1％Tween20.

8.15配制：加入2gBSA于100mL的TBST中，4℃储存不超过3个月。

8.16将胶置于TBST中，摇床摇10min，重复三次，去除多余SDS。

8.17将胶取出，用吸水纸去除玻璃面多余液体。

8.18胶面朝下，隔胶布将胶面置于一75x50mm的玻璃片上。

8.19 10倍-20倍稀释抗体于2％BSA的TBST。一块玻璃片需要100ul抗体。离心10000g 5min去除聚合物。

8.20将抗体工作液滴入胶和玻璃片的空隙。一抗孵育2小时。将胶布轻柔移除。

8.21 TBST洗胶30min(轻摇)。每10min更换一次TBST。

8.22孵二抗30min后洗胶，步骤同上5.17-5.21。

8.23用ddH2O润洗胶，去除盐分，在氮气下干燥。

用荧光显微镜成像，可以得到有聚合物和单体两个不同的条带。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种光敏感型化合物，其特征在于，所述光敏感型化合物的化学结构式为：

2.如权利要求1所述的一种光敏感型化合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

步骤3.1利用N-(3-氨基丙基)氨基甲酸叔丁酯和甲基丙烯酰氯制备N-[3-(2-甲基丙-2-烯丙基氨基)丙基叔丁基氨基甲酸酯；

步骤3.2利用步骤3.1制得的N-[3-(2-甲基丙-2-烯丙基氨基)丙基叔丁基氨基甲酸酯和盐酸、二氯甲烷制备N-(3-氨基丙基)-2-甲基-丙-2-烯酰胺；

步骤3.3利用呋喃-2-基硼酸和[羟基(苯基)-λ3-碘基]4-甲基苯磺酸盐制备[2-呋喃基(苯基)-λ3-碘基]4-甲基苯磺酸盐；

步骤3.4利用步骤3.3制得的[2-呋喃基(苯基)-λ3-碘基]4-甲基苯磺酸盐、2H-四唑-5-羧酸乙酯和三氟甲烷磺酸铜以及三乙胺(TEA)制备2-(2-呋喃基)四唑-5-羧酸乙酯；

步骤3.5利用步骤3.4制得的2-(2-呋喃基)四唑-5-羧酸乙酯和LiOH制备2-(2-呋喃基)四唑-5-羧酸；

步骤3.6利用步骤3.5制得的2-(2-呋喃基)四唑-5-羧酸和步骤3.2制备的N-(3-氨基丙基)-2-甲基-丙-2-烯酰胺制备2-(2-呋喃基)-N-[3-(2-甲基丙-2-烯丙基氨基)丙基]四唑-5-甲酰胺，即MAP-FTC。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3.6还包括：

步骤3.6.1向所述2-(2-呋喃基)四唑-5-羧酸、N-(3-氨基丙基)-2-甲基-丙-2-烯酰胺的N,N-二异丙基乙胺(DIEA)溶液和1-羟基-7-氮杂苯并三氮唑(HOAt)的二甲基甲酰胺(DMF)溶液中加入2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HATU)，得到反应混合物；

步骤3.6.2将步骤3.6.1获得的反应混合物在15-40℃下搅拌13-20h，用水稀释，用乙酸乙酯萃取水相，分别得到有机相和水相，其中所述有机相用盐水洗涤，之后用无水Na₂SO₄干燥、过滤并真空浓缩获得残余物；

步骤3.6.3将步骤3.6.2获得的残余物通过柱色谱法纯化，得到粗产物；通过制备型HPLC纯化所述粗产物，得到所述MAP-FTC。

4.如权利要求1所述的一种光敏感型化合物在制备光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶中的应用，其特征在于，所述光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶用于凝胶电泳；所述凝胶电泳用于单细胞或多细胞、提取出的蛋白质和核酸或纯化的蛋白质和核酸溶液的测定；所述测定包括对所述蛋白质和核酸进行特异性定量或半定量检测；所述特异性定量或半定量检测还包括同时检测一种或多种蛋白质分析物。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述光敏感型蛋白质核酸共固定凝胶的凝胶总浓度T％为4-8％。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用还包括在所述凝胶电泳的胶内加入原位针，所述胶内原位针包括抗体探针，所述抗体探针的标记包括荧光、酶、胶体金或超顺磁性微球。

7.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述蛋白质核酸的检测试剂包括适配体、纳米抗体或凝集素。

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