KR20080100771A - 검출용 핵산 가닥 및 물질간 결합 또는 상호작용 검출 방법 - Google Patents

검출용 핵산 가닥 및 물질간 결합 또는 상호작용 검출 방법 Download PDF

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Abstract

본 명세서에는, 압타머(aptamer)로서 기능할 수 있는 제1 염기 서열 영역을 가지는 제1 핵산 가닥(核酸鎖; nucleic acid strand)과, 그 제1 염기 서열 영역에 대해 상보적이고 그 제1 염기 서열 영역과 상보 가닥(相補鎖; complementary strand)을 형성하는 제2 염기 서열 영역을 가지는 제2 핵산 가닥을 포함하고 있으며, 제1 염기 서열 영역과 소정의 물질이 상호작용하는 것에 의해서, 상기 제1 및 제2 염기 서열 영역의 상보 가닥이 단일 가닥(一本鎖; single strand)으로 해리하도록 조정(설계)된 검출용 핵산 가닥이 개시되어 있다.
핵산 가닥, 유전체, 형광 물질, 퀀처, 삽입물, 압타머.

Description

검출용 핵산 가닥 및 물질간 결합 또는 상호작용 검출 방법{DETECTING NUCLEIC ACID STRANDS AND INTER-SUBSTANCE BINDING OR INTERACTION DETECTING METHOD}
본 발명은, 그 전체 내용이 본원 명세서에 참고용으로 병합되어 있는, 2007년 5월 14일자로 일본 특허청에 출원된 일본특허출원 제2007-128188호에 관련된 주제를 포함한다.
본 발명은, 특정의 물질이나 물질 사이의 결합 또는 상호작용의 검출에 사용할 수 있는 검출용 핵산 가닥(核酸鎖; nucleic acid strand) 및 검출 방법에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은, 특정의 물질이나 물질 사이의 결합 또는 상호작용을 검출할 수 있는 검출용 핵산 가닥 및, 물질 사이의 결합 또는 상호작용 검출 방법에 관한 것이다.
단백질, 유기 소분자(小分子), 핵산, 다량체(多量體), 세포, 세포 조직, 금속 이온, 미생물, 바이러스 등을 검출하는 기술은, 각종 분야의 연구, 개발 등에서, 극히 중요한 일단(일부분)을 담당하고 있다. 예를 들면, 특정 질병의 진단, 약품개발(創藥), 식품 등의 위생 관리, 환경 오염의 정화 및 수복(restoration) 등 과 같은 모든 분야에서 검출 기술의 개발이 진행되고 있다.
그 중에서도, 특히 요즈음에는, 기판 등의 표면(계면)에서 물질 사이의 상호작용이나 반응을 진행시키고, 이들을 물리적 수단이나 광학적 수단 등에 의해서 검출하는 기술이 진전되고 있다. 이들 기술은, 질병(질환) 진단, 약물 등의 화합물 스크리닝, 법의학, 유전 정보의 망라적 해석, 생체물질의 기능 해석, 프로테옴 해석, 생체내 반응의 해석 등과 같은 분야에서는, 이미 중요한 기간 기술로 되어 있다.
검출 기술로서는, 일본공개특허공보 평(特開平; JP-A-08-333398호에 있어서, 소변 중의 코르티졸(호르몬의 일종)을 특이적으로(specifically) 인식하는 폴리크로날 또는 모노크로날 항체를 이용하는 임노앗세이(immunoassay) 방법이 개시되고; 일본공개특허공보 제(特開)2007-000009호에 있어서, 두가닥(2本鎖; double-stranded) 핵산에 대해 특이적인 분해 효소를 이용하는 것에 의해, 표적 핵산 분자를 간편하게 또 정밀도 좋게 검출하는 방법이 개시되고; 일본공개특허공보 제2006-133098호에 있어서, 단백질 시료를 전기영동시킨 분리 매체 중에 작용극을 삽입해서, 단백질의 작용기를 산화시키며, 그 결과 발생하는 전류를 측정하는 것에 의해, 단백질의 유무를 검출하는 단백질 검출 방법이 개시되고; 일본공개특허공보 제2002-296274호에 있어서, 유전자 발현에서의 질병관련 변화를 보이고 있는 적어도 2종의 다른 분자 마커를, 항체 또는 핵산 프로브(probe)를 사용해서, 동시에 염색 및 검출하는 것에 의해서, 자궁경부 도말(塗抹; smear) 표본에서의 종양 세포 및 그들의 전구체(前驅體)를 검출하는 방법이 개시되고; 일본공개특허공보 제2006- 262775호에 있어서는, 휘도 증감제를 미생물 세포 시료에 접촉시켜서, 미생물 세포가 발광하는 형광 강도를 증가시키는 것을 특징으로 한 미생물 세포의 검출 방법이 개시되어 있다.
여기서, 본 발명에 관계가 있는 "압타머(aptamer)"에 대해서 설명한다. "압타머"라 함은, 단백질, 유기 소분자, 핵산, 다량체, 세포, 세포 조직, 금속 이온, 미생물, 바이러스 등과 같은 특정의 물질에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 기능을 가진 핵산 분자나 펩티드를 의미한다. "압타머"는, 제약 없이 어떠한 대상에도 결합할 수 있으며, 높은 친화성과 특이성을 가지고 대상에 결합시키는 것이 가능하다. 또, 대량의 합성이 용이하며, 작용 기서(機序; mechanism)가 단순하다. 그 때문에, 구조 프로테오믹스, 타겟 해석, 타겟 밸러데이션, 약품개발 등의 분야에서 폭넓게 이용할 수가 있다.
상기한 이유에 의해, 요즈음에는, 각종 압타머에 관한 기술 개발이 진행되고 있다. 예를 들면, 일본공개특허공보 제2006-320289호에는, 프리온병의 진단, 치료 또는 예방을 위해서 이용할 수 있는 이상형(異常型; abnormal) 프리온 단백질 유래의 원(原)섬유(mSAF)에 특이적으로 결합하는 RNA 압타머가 개시되고; 일본공개특허공보 제2007-082543호에는, 대장균 종결(終結; release) 인자를 저해하는 RNA 압타머가 개시되어 있다.
상술한 물질 검출 방법에는 모두, 각각 장단점이 있다. 예를 들면, 소분자 의 검출에는 적합하지 않거나, 미량의 샘플에서는 검출 불능으로 되거나, 및/또는 물질의 활성소실(deactivation)을 방지하기 위해 특별한 공정이 필요하다는 등, 그들 각각은 1개 이상의 문제를 안고(포함하고) 있다. 따라서, 더 개선 할 여지가 있다.
그래서, 본 발명의 목적은, 종래의 방법에는 없는 물질 검출 방법에 사용가능한 신규한 검출용 핵산 가닥을 제공하는 것에 있다.
본원 발명자들은, 압타머의 성질을 살린 물질 검출 방법을 개발하는 관점에서 예의 연구하였다. 그 결과, 종래의 방법에서 행해지고 있던 프로브나 타겟 자체의 변화를 측정한다고 하는 발상을 크게 전환해서, 압타머와 타겟과의 결합시에 압타머나 타겟과는 다른 물질이 변화하도록 궁리하고 또 그의 변화를 측정하는 것에 의해, 타겟을 검출할 수 있는 신규한 방법을 찾아냈다.
본 발명의 제1 요지(aspect)에서는, 압타머로서 기능할 수 있는 제1 염기 서열 영역을 가지는 제1 핵산 가닥과, 그 제1 염기 서열 영역에 대해 상보적이고 그 제1 염기 서열 영역과 상보 가닥(相補鎖; complementary strand)을 형성하는 제2 염기 서열 영역을 가지는 제2 핵산 가닥을 포함하고 있으며, 상기 제1 염기 서열 영역과 소정의 물질이 상호작용하는 것에 의해서, 상기 제1 및 제2 염기 서열 영역의 상보 가닥이 단일 가닥(一本鎖; single strand)으로 해리하도록 조정(design; 설계)된 검출용 핵산 가닥을 제공한다.
상기 제1 및 제2 염기 서열 영역의 상보 가닥이 단일 가닥으로 해리한 것을 검출하는 방법은 특별히 한정되지 않는다. 그러나, 1예로서는, 검출용 핵산 가닥이 프로브를 포함하도록 조정하는 것이 가능하다.
상기 프로브(probe)는, 상기 제1 및 제2 염기 서열 영역의 상보 가닥이 단일 가닥으로 해리한 것을 나타내는 검출 신호를 제공하는 기능을 가지고 있으면, 상기 프로브의 위치 및 기능 등은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 상기 프로브는, 상기 검출용 핵산 가닥의 제2 핵산 가닥에 보존유지(保持; hold)되고 또 검출 신호를 생성할 수 있는 물질일 수가 있다. 구체적인 1예로서는, 유전체나 형광 물질을 포함할 수 있다.
상기 프로브는, 2종류 이상의 물질로 형성(구성)되는 것이더라도 좋다. 예를 들면, 상기 제2 핵산 가닥에 표지(標識; label)붙여진 형광 물질과, 상기 제1 핵산 가닥에 표지붙여져 있고, 상기 제1 및 제2 염기 서열 영역 영역의 상보 가닥 존재(형성)시에 상기 형광 물질을 소광할 수 있는 퀀처(quencher)로 구성되는 것을 들 수 있다.
본 발명의 제2 요지에서는, 상기 검출용 핵산 가닥을 적어도 이용하는 것에 의해서, 압타머로서 기능할 수 있는 제1 염기 서열 영역과 소정 물질 사이의 상호작용을 검출하는 방법도 제공한다.
상기 방법에서는, 상기 제1 핵산 가닥은 그의 한 말단(末端; end)이 고상(固相) 표면에 고정(immobilize)될 수도 있다.
제1 염기 서열 영역과 소정 물질 사이의 결합 또는 상호작용의 검출 방법은, 특별히 한정되지 않는다. 그러나, 예를 들면 상기 제2 핵산 가닥에 보존유지된 유 전체로부터 얻어지는(available) 유전 상수의 변화를 측정하여, 상기 상보 가닥의 단일 가닥으로의 해리를 검출하는 것에 의해서, 제1 염기 서열 영역과 소정 물질 사이의 결합 또는 상호작용을 검출할 수도 있다.
상기 검출용 핵산 가닥의 무게 변화를 측정하여, 상기 상보 가닥의 단일 가닥으로의 해리를 검출하는 것에 의해서, 제1 염기 서열 영역과 소정 물질 사이의 결합 또는 상호작용을 검출할 수도 있다.
또, 검출용 핵산 가닥의 제1 및 제2 염기 서열 영역의 상보 가닥에 결합 또는 흡착되어 형광을 발할 수 있는 삽입물(intercalator)로부터의 형광 강도의 저하를 측정하여, 상기 상보 가닥의 단일 가닥으로의 해리를 검출하는 것에 의해서, 제1 염기 서열 영역과 소정 물질 사이의 결합 또는 상호작용을 검출할 수도 있다.
본 발명에 관련된 기술 용어의 설명을 한다. 본 발명에서 사용되는 "압타머"라 함은, 단백질, 유기 소분자, 핵산, 다량체, 세포, 세포 조직, 금속 이온, 미생물, 바이러스 등과 같은 특정의 물질에 특이적으로 결합할 수 있는 기능을 가진 핵산 분자나 펩티드를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 "프로브(probe)"라 함은, 소정 물질을 검출하기 위한 검출 신호를 취득할 수 있는 물질을 모두 포함한다. 예를 들면, 유전체, 임의의(desired) 무게를 가지는 비즈, 형광 물질, 방사성 물질 및 삽입물 등을 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 "퀀처"라 함은, 여기(勵起) 에너지 흡수제이며, 근처의 형광 물질로부터의 형광의 발광을 억제하는 기능을 가지는 물질을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 "삽입물(intercalator)"라 함은, 두가닥 핵산의 상보 가닥 부위에 결합해서 형광 등을 발하는 물질을 의미한다. 예를 들면, "POPO-1"(상표명, 모레큘러 프로브스사(Molecular Probes, Inc.)제, "TOTO-3"(상표명, 인비트로겐사(Invitrogen Corporation)제, "SYBRTM Green I"(인비트로겐사제), "PICOGREENTM""(모레큘러 프로브스사제) 및 Hoechst 33258을 들 수가 있다.
본 발명에 따른 검출용 핵산 가닥을 이용하면, 소정 물질의 크기, 양, 종류 등에 상관없이, 간편하고 또 정밀도 좋게 소정 물질의 검출을 행할 수가 있다. 또, 소정 물질의 활성 저하를 최소화(최소한으로 억제)할 수 있기 때문에, 활성 저하의 억제를 위한 어떠한 추가(여분의) 공정을 행할 필요가 없다. 또, 본 발명에 따른 검출용 핵산 가닥에 의하면, 물질 사이의 결합 또는 상호작용도 고정밀도로 검출하는 것이 가능하다.
본 발명에 따른 물질 사이의 상호작용 검출 방법은, 압타머의 기능 해석, 압타머에 결합후 소정 물질의 기능 해석 또는 물질의 스크리닝 등에 응용할 수 있으며, 질병(질환)의 진단, 약물과 같은 화합물의 스크리닝, 법의학, 유전 정보의 망라적 해석, 생체 물질의 기능 해석, 프로테옴 해석, 생체내 반응의 해석, 식품 등의 위생 관리, 환경 오염의 정화 및 수복 등과 같은 모든 분야에의 공헌을 기대할 수가 있다.
이하, 첨부 도면을 참조하면서, 본 발명의 바람직한 실시형태에 대해서 설명한다. 또한, 이하에 설명하는 실시형태는, 본 발명의 대표적인 실시형태의 1예를 나타낸 것이며, 이하의 예에 의해 본 발명의 범위(scope)가 좁게 해석되는 것은 아니다.
우선, 도 1의 (a) 및 (b)를 참조해서, 본 발명의 제1 요지의 제1 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥 N1과, 그 검출용 핵산 가닥 N1을 이용한 본 발명의 제2 요지의 제1 실시형태에 따른 소정 물질(4)의 검출 방법에 대해서 설명한다.
개략적으로 설명하면(크게 나누어서), 본 발명의 제1 요지의 제1 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥 N1은, 제1 핵산 가닥(11)과 제2 핵산 가닥(21)을 적어도 구비하고 있다.
제1 핵산 가닥(11)은, 제1 염기 서열 영역으로서, 압타머로서 기능하는 염기 서열 영역 A를 가지고 있다. 도 1의 (a) 및 (b)에서는, 제1 핵산 가닥(11)의 한 말단이 고상 표면 S(비즈 등을 포함한다. 이하에서는 이를 마찬가지로 적용한다)에 고정되어 있지만, 이것에 한정되는 것은 아니다. 나중에 도 4의 (a) 및 (b)를 참조해서 설명하는 바와 같이, 이것(제1 핵산 가닥(11)의 한 말단)은 유리된(free) 형태(상태)이더라도 좋다. 제1 핵산 가닥(11)의 한 말단을 고상 표면 S에 고정하는 경우, 그 고정 방법은 특별히 한정되지 않고, 공지의 모든 방법을 이용할 수가 있다. 1예로서는, 아비딘-비오틴(avidin-biotin) 결합이나 커플링 반응(예를 들면, 디아조-커플링 반응) 등을 들 수 있다.
제2 핵산 가닥(21)은, 제2 염기 서열 영역으로서, 상기 염기 서열 영역 A에 대해 상보적인 염기 서열 영역 B를 가지고 있다. 도 1의 (a) 및 (b)에서는, 염기 서열 영역 B의 1예로서, 염기 서열 영역 A 전체에 대해 상보적인 염기 서열 영역을 도시하고 있다. 그렇지만, 염기 서열 영역 B는, 이와 같은 염기 서열 영역에 한정되지 않고, 도 2의 (a)∼(c)에 도시하는 바와 같이, 염기 서열 영역 A보다도 긴 염기 서열 영역에 대해 상보적이어도 좋다. 또, 염기 서열 영역 B는, 도 3의 (a) 및 (b)에 도시하는 바와 같이 염기 서열 영역 A의 적어도 일부에 대해 상보적이어도 좋다.
도 1의 (a) 및 (b)에서는, 제2 핵산 가닥(21)의 한 말단은, 유전체(31)인 프로브에 의해 수식(modify)되어 있다. 그러나, 미리 프로브에 의해 제2 핵산 가닥(21)을 수식할 필요는 없다. 예를 들면, 검출 직전에, 수식 또는 표지붙이기(labeling) 등을 실시해도 좋다. 프로브의 종류도 특별히 한정되지 않지만, 물리적 또는 화학적 검출 신호를 취득할 수 있는 물질이 바람직하다. 유전체(31) 이외에도, 공지의 무게를 가지는 비즈, 형광 물질, 방사성 물질 및 삽입물 등과 같은 공지의 모든 프로브를 이용할 수가 있다.
상기한 제1 핵산 가닥(11)과 제2 핵산 가닥(21)이 두 가닥으로 되어 있는 형태(상태)가, 본 발명의 제1 요지의 제1 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥 N1이다.
도 1의 (a) 및 (b)에서, 부호 (4)는, 염기 서열 영역 A에 특이적으로 결합하는 소정 물질을 나타낸다. 압타머로서 기능하는 염기 서열 영역 A에 특이적으로 결합 또는 상호작용하는 물질이면, 검출할 수 있는 소정 물질(4)은, 특별히 한정되지 않는다. 1예로서는, 단백질, 유기 소분자, 핵산, 다량체, 세포, 세포 조직, 금 속 이온, 미생물, 바이러스 등을 포함할 수 있다.
반응장(反應場) 또는 상호작용장에 있어서, 검출용 핵산 가닥 N1이 반응 또는 상호작용을 위해 대기하고 있다(도 1의 (a) 참조). 그곳에 소정 물질(4)이 송입(送入; charge)되면, 소정 물질(4)과 염기 서열 영역 A와의 결합성(associativity) 쪽이 소정 물질(4)과 염기 서열 영역 B와의 결합성보다도 우세한 경우, 도 1의 (b)에 도시하는 바와 같이, 염기 서열 영역 A와 소정 물질(4)이 서로 결합하고, 제2 핵산 가닥(21)이 해리하게 된다. 결합성의 강도는, 염기 서열 영역 A 또는 B의 길이 및/또는 GC 함유량을 변경(조작)함으로써 조절하는 것이 가능하다.
제2 핵산 가닥(21)에는 그의 수식을 위해서 유전체(31)가 담지(carry)되어 있기 때문에, 제2 핵산 가닥(21)이 해리하면, 고상 표면 위의 유전 상수가 크게 변화한다. 그래서, 예를 들면 표면 플라즈몬(plasmon) 공명 센서(SPR 센서) 등을 이용해서, 유전 상수의 변화를 측정함으로써, 소정 물질(4)을 검출할 수가 있다.
이 때, 제2 핵산 가닥(21)에 그의 수식을 위해서 담지된 프로브가 임의의 무게를 가지는 비즈인 경우에는, 수정 진동자 마이크로밸런스법(QCM법) 등에 의한 무게 변화를 측정함으로써, 소정 물질(4)을 검출할 수도 있다.
본 발명의 제1 요지의 제1 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥 N1은, 통상 이용되는 프로브 핵산과는 달리, 두가닥을 형성하는 제1 핵산 가닥(11)의 염기 서열 영역 A만이, 소정 물질(4)과 결합 또는 상호작용하고, 이 때, 두가닥을 형성하는 다른 핵산 가닥, 즉 제2 핵산 가닥(21)이 동시에 해리하도록 조정되어 있다. 따라 서, 소정 물질(4)에 표지 등을 붙일 필요가 없다. 또, 소정 물질(4) 자체의 변화를 측정하는 방법이 아니라, 해리하는 제2 핵산 가닥(21)의 변화를 측정하는 것에 의해, 소정 물질(4)의 검출을 행하는 방법인 것이다. 그 때문에, 소정 물질(4)이 소분자이거나 미량인 경우에도, 소정 물질(4)을 고감도로 검출하는 것이 가능하다.
도 2의 (a)∼(c)를 참조해서, 본 발명의 제1 요지의 제2 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥 N2와, 그 검출용 핵산 가닥 N2를 이용한 본 발명의 제2 요지의 제2 실시형태에 따른 소정 물질(4A)의 검출 방법에 대해서 설명한다.
본 발명의 제1 요지의 제2 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥 N2는, 제2 핵산 가닥(22)의 제2 염기 서열 영역으로서의 염기 서열 영역 D가, 제1 핵산 가닥(12)의 염기 서열 영역 C보다도 긴 제1 염기 서열 영역으로서의 염기 서열 영역과 상보적으로 두가닥을 형성한 형태이다. 또, 프로브의 1예로서의 형광 물질(32)을, 제2 핵산 가닥(22)의 한 말단에 표지붙이고 있다. 형광 물질(32)의 종류는 특별히 한정되지 않는다. 그러나, 예를 들면 Cy3이나 Cy5의 형광 색소 또는 루시페라아제(luciferase)나 GFP 등의 형광 단백질 등과 같은 공지의 모든 형광 물질을 이용할 수가 있다.
도 1의 (a) 및 (b)에 도시한 제1 실시형태와 마찬가지로, 반응장 또는 상호작용장에서, 검출용 핵산 가닥 N2가 반응 또는 상호작용을 위해서 대기하고 있다(도 2의 (a) 참조). 그곳에 소정 물질(4A)이 송입되면, 도 2의 (b)에 도시하는 바와 같이, 염기 서열 영역 C와 소정 물질(4A)이 서로 결합하고, 제2 핵산 가닥(22)이 해리하게 된다.
그리고, 반응장 또는 상호작용장을 세정한 후, 소정 파장의 형광 여기광에 의해 형광이 방출되는지 여부를 결정함으로써, 소정 물질(4A)을 검출할 수가 있다. 구체적으로 설명하면, 염기 서열 영역 C와 결합 또는 상호작용하는 소정 물질(4A)이 존재하는 경우에는, 제2 핵산 가닥(22)이 해리하기 때문에, 도 2의 (c)에 도시하는 바와 같이, 그 후의 세정에 의해 제2 핵산 가닥(22)은 제거되고, 소정 파장의 형광 여기광을 조사(照射)해도 형광은 방출되지(emitted) 않는다. 한편, 염기 서열 영역 C와 결합 또는 상호작용하는 소정 물질(4A)이 존재하지 않는 경우에는, 제2 핵산 가닥(22)은 해리하지 않고, 검출용 핵산 가닥 N2는 두가닥의 형태로 남는다. 검출용 핵산 가닥 N2는 세정에 의해서도 제거되지 않기 때문에, 소정 파장의 형광 여기광을 조사하면 형광이 방출된다.
도 3의 (a) 및 (b)를 참조해서, 본 발명의 제1 요지의 제3 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥 N3과, 그 검출용 핵산 가닥 N3을 이용한 본 발명의 제2 요지의 제3 실시형태에 따른 소정 물질(4B)의 검출 방법에 대해서 설명한다.
본 발명의 제1 요지의 제3 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥 N3은, 제2 핵산 가닥(23)의 제2 염기 서열 영역으로서의 염기 서열 영역 F가, 제1 핵산 가닥(13)의 제1 염기 서열 영역으로서의 염기 서열 영역 E의 일부와 상보적으로 두가닥을 형성하는 형태로 되어 있다. 프로브로서는, 형광 물질(331)과, 그 형광 물질(331)을 소광할 수 있는 퀀처(332)로 구성되는 것을 이용하고 있다. 그리고, 형광 물질(331)을 제2 핵산 가닥(23)의 한 말단에 표지붙이고, 퀀처(332)를 제1 핵산 가닥(13)의 한 말단에 표지붙여서, 두가닥 형성시에는 형광 물질(331)을 소광하도 록 조정(설계)되어 있다.
상기 도 1의 (a), (b)와 도 2의 (a)∼(c)에 도시한 실시형태와 마찬가지로, 반응장 또는 상호작용장에서, 검출용 핵산 가닥 N3이, 반응 또는 상호작용을 위해서 형광 물질(331)을 소광한 상태로 대기하고 있다(도 3의 (a) 참조). 그곳에 소정 물질(4B)이 송입되면, 도 3의 (b)에 도시하는 바와 같이, 염기 서열 영역 E와 소정 물질(4B)이 서로 결합하고, 제2 핵산 가닥(23)이 해리한다.
제1 핵산 가닥(13)과 제2 핵산 가닥(23)이 서로 해리하면, 형광 물질(331)과 퀀처(332)가 서로 분리되고, 형광 물질(331)이 형광을 발하게 된다. 따라서, 소정 파장의 형광 여기광에 의한 형광의 방출(emission)를 측정함으로써, 소정 물질(4B)을 검출할 수가 있다.
이 제3 실시형태와 같이 퀀처(332)를 이용하면, 상기 도 2의 (a)∼(c)에 도시한 제2 실시형태와 같이 세정 공정을 행할 필요가 없다고 하는 메리트가 생긴다.
도 4의 (a) 및 (b)를 참조해서, 본 발명의 제1 요지의 제4 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥 N4와, 그 검출용 핵산 가닥 N4를 이용한 본 발명의 제2 요지의 제4 실시형태에 따른 소정 물질(4C)의 검출 방법에 대해서 설명한다.
이 제4 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥 N4는, 고상 표면에 고정되어 있지 않고, 유리된 상태이다. 또, 프로브의 1예로서, 삽입물(34)를 이용하고, 제1 핵산 가닥(14)의 제1 염기 서열 영역으로서의 염기 서열 영역 G와, 제2 핵산 가닥(24)의 제2 염기 서열 영역으로서의 염기 서열 영역 H와의 상보 가닥에 결합 및 흡착시키고 있다.
도 1의 (a) 및 (b), 도 2의 (a)∼(c) 및 도 3의 (a), (b)에 도시한 실시형태와 마찬가지로, 반응장 또는 상호작용장에서, 검출용 핵산 가닥 N4가, 반응 또는 상호작용을 위해서 대기하고 있다(도 4의 (a) 참조). 그곳에 소정 물질(4C)이 송입되면, 도 4의 (b)에 도시하는 바와 같이, 염기 서열 영역 G와 소정 물질(4C)이 서로 결합하고, 제2 핵산 가닥(24)이 해리하게 된다.
제1 핵산 가닥(14)과 제2 핵산 가닥(24)이 서로 해리하면, 삽입물(34)도 해리한다. 따라서, 소정 파장의 형광 여기광 등의 조사 하에서 형광 방출의 저하를 측정함으로써, 소정 물질(4C)을 검출할 수가 있다.
도 5의 (a) 및 (b)는, 본 발명의 제2 요지의 제5 실시형태에 따른, 소정 물질(4a, 4b) 사이의 상호작용 검출 방법을 도시하는 도면이다. 이 제5 실시형태에서는, 검출용 핵산 가닥으로서, 도 1의 (a) 및 (b)에 도시한 검출용 핵산 가닥 N1을 이용해서 설명하고 있다. 그러나, 제5 실시형태는, 검출용 핵산 가닥 N1의 사용에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 전술한 제1∼제4 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥을, 원하는 대로 이용할 수도 있다.
도 5의 (a) 및 (b)에서 부호 (4a)로 나타내는 소정 물질은, 그 자체로는 염기 서열 영역 A와 결합하지 않는 물질이다. 그러나, 다른 소정 물질(4b)과 상호작용 하면, 염기 서열 영역 A와 결합할 수 있도록 그의 성질이 변화된다.
반응장 또는 상호작용장에서, 검출용 핵산 가닥 N1과 소정 물질(4a)이, 반응 또는 상호작용을 위해서 대기하고 있다(도 5의 (a) 참조). 그곳에 소정 물질(4b)이 송입되면, 소정 물질(4a)과 소정 물질(4b) 사이에서 상호작용이 일어난다. 그 리고, 이와 같이 상호작용을 일으킨 소정 물질(4a, 4b)은, 염기 서열 영역 A에 결합하고, 제2 핵산 가닥(21)이 해리하게 된다.
제2 핵산 가닥(21)에는 그의 수식을 위해서 유전체(31)가 담지되어 있기 때문에, 제2 핵산 가닥(21)이 해리하면, 고상 표면 위의 유전 상수가 크게(현저하게) 변화한다. 그래서, 예를 들면 표면 플라즈몬 공명 센서(SPR 센서) 등을 이용해서, 유전 상수의 변화를 측정함으로써, 소정 물질(4a)과 소정 물질(4b) 사이의 상호작용을 검출할 수가 있다.
도 6의 (a) 및 (b)는, 본 발명의 제2 요지의 제6 실시형태에 따른 소정 물질(4)과 결합 저해 물질(5) 사이의 상호작용 검출 방법을 개략적으로 도시하는 도면이다. 이 제6 실시형태에서도, 검출용 핵산 가닥으로서, 도 1의 (a) 및 (b)에 도시한 검출용 핵산 가닥 N1을 이용해서 설명한다. 그러나, 제6 실시형태는 검출용 핵산 가닥 N1의 이용에 한정되지 않는다. 예를 들면, 전술한 제1∼제4 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥의 어느것이라도 원하는 대로 이용할 수가 있다.
도 6의 (a)에 있어서, 부호 (5)로 나타내는 물질은, 소정 물질(4)과 염기 서열 영역 A와의 결합을 저해하는 물질이다. 결합 저해 물질(5)이 어떠한(certain) 작용에 의해 소정 물질(4)로부터 해리하거나, 또는 결합 저해 물질(5)의 기능을 손상시키거나 하면, 소정 물질(4)은 염기 서열 영역 A와 결합하고, 제2 핵산 가닥(21)이 해리하게 된다.
제2 핵산 가닥(21)에는, 그의 수식을 위해서 유전체(31)가 담지되어 있기 때문에, 제2 핵산 가닥(21)이 해리 하면, 고상 표면 위의 유전 상수가 크게 변화한 다. 그래서, 예를 들면 표면 플라즈몬 공명 센서(SPR 센서) 등을 이용해서, 유전 상수의 변화를 측정함으로써, 소정 물질(4)로부터의 결합 저해 물질(5)의 해리 또는 결합 저해 물질(5)의 기능 부전(不全; failure)을 검출할 수가 있다.
이 제6 실시형태에 따른 방법은, 예를 들면 결합 저해 물질(5)의 기능 저해제(inhibitor) 등의 스크리닝에 응용하는 것이 가능하다. 도 6 의 (a)에 도시하는 바와 같이, 검출용 핵산 가닥 N1, 구체적으로 염기 서열 영역 A에의 결합이 결합 저해 물질(5)에 의해 저해된 상태로 소정 물질(4)이 존재하고, 결합 저해 물질(5)의 기능 저해제로 될 수 있는 도시하지 않은 물질을 공급하여, 결합 저해 물질(5)의 기능이 저해되면, 소정 물질(4)은 염기 서열 영역 A와 결합한다. 이 결합에 의해서, 제2 핵산 가닥(21)이 해리하게 되어, 고상 표면 위의 유전 상수가 크게 변화한다. 이와 같이, 본 발명의 제1 요지의 제1 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥 N1은, 결합 저해 물질(5)의 기능 저해제의 스크리닝에 이용할 수가 있다.
이상 설명한 각 검출용 핵산 가닥을 이용한 방법은, 이하와 같은 기능 해석 방법 등에도 응용할 수가 있다. 그 응용의 1예를, 도 7의 (a)∼(c)를 참조해서 설명한다.
도 7의 (a)∼(c)에는, 본 발명의 제2 요지의 제7 실시형태에 따른 물질 사이의 결합 또는 상호작용 검출 방법을, 압타머의 기능 해석, 압타머에의 결합후의 소정 물질의 기능 해석 또는 물질의 스크리닝에 응용한 경우에 대해서 도시하고 있다. 이 제7 실시형태에서도, 검출용 핵산 가닥으로서, 도 1의 (a) 및 (b)에 도시한 검출용 핵산 가닥 N1을 이용해서 설명하고 있다. 그러나, 제7 실시형태는 이검출 용 핵산 가닥 N1의 이용에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 전술한 제1∼제4 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥의 어느것이라도 원하는 대로 이용할 수가 있다.
우선, 전술한 바와 같이, 반응장 또는 상호작용장에서, 검출용 핵산 가닥 N1이 반응 또는 상호작용을 위해서 대기하고 있다(도 7의 (a) 참조). 그곳에 소정 물질(4c)이 송입되면, 도 7의 (b)에 도시하는 바와 같이, 소정 물질(4c)과 염기 서열 영역 A가 서로 결합하고, 제2 핵산 가닥(21)이 해리하게 된다. 이 때의 유전 상수의 변화 등을 측정함으로써, 우선은, 소정 물질(4c)이 압타머로서 기능하는 염기 서열 영역 A에 결합(트랩)한 것을 확인할 수가 있다.
압타머는, 각종 물질에 결합해서 그들의 작용에 영향을 미친다고 하는 기능을 가진다. 그러나, 예를 들면 통상적으로는 물질(61)과 상호작용을 하지 않는 소정 물질(4c)이, 압타머(염기 서열 영역 A)와 결합한 후에, 물질(61)과 상호작용할 수 있게 되면, 이 압타머(염기 서열 영역 A)는, 소정 물질(4c)을, 물질(61)과 상호작용할 수 있는 물질(4d)로 변화(modify)시키는 기능을 가진다는 것을 알 수 있다.
소정 물질(4c)이 압타머에 결합된 후에 제공되는 기능이 불명한 경우에는, 제7 실시형태에 따른 방법에 의해, 소정 물질(4c)의 압타머(염기 서열 영역 A)에의 결합후의 물질(4d)의 기능 해석을 행할 수도 있다. 예를 들면, 도 7의 (c)에 도시하는 바와 같이, 소정 물질(4c)이, 압타머(염기 서열 영역 A)에 결합된 후, 물질(61)과 상호작용할 수 있게 된 것을 확인할 수 있으면, 소정 물질(4c)의 압타머(염기 서열 영역 A)에의 결합후의 물질(4d)은, 물질(61)과 상호작용할 수 있는 성질로 변화한 것을 알 수가 있다.
또한, 상기한 방법의 원리를 이용하면, 소정 물질(4c)의 압타머(염기 서열 영역 A)와의 상호작용으로 얻어지는 물질(61)을 스크리닝하는 것도 가능하다.
이상 설명한 응용방법에서, 물질(61)과 물질(4d) 사이의 상호작용의 유무는, 공지의 방법으로 검출할 수가 있다. 예를 들면, 물질(61)과 물질(4d) 사이의 상호작용에 의해 무게가 변화하기 때문에, 수정 진동자 마이크로 밸런스법(QCM법) 등에 의해 상호작용을 검출할 수가 있다. 또, 물질(61) 또는 물질(4d)에 형광 물질, 방사성 물질 또는 삽입물 등과 같은 표지 물질(labeling material)을 결합 또는 흡착시키는 방법이나, PFRET의 원리와 같이, 물질 사이의 상호작용에 의해 그 물질(61) 또는 물질(4d) 자체의 형광색 등을 변화시키는 방법에 의해서, 상호작용을 검출하는 것도 가능하다.
본 발명은 첨부하는 특허청구범위 또는 그 균등물의 범위내에서, 설계 요구조건 및 그 밖의 요인에 의거하여 각종 변형, 조합, 수정 및 변경 등을 행할 수 있다는 것은 당업자라면 당연히 이해할 수 있을 것이다.
도 1의 (a) 및 (b)는, 본 발명의 제1 요지의 제1 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥과, 그 검출용 핵산 가닥을 이용한 본 발명의 제2 요지의 제1 실시형태에 따른 물질 검출 방법을 개략적(모식적)으로 도시하는 도면,
도 2의 (a)∼(c)는, 본 발명의 제1 요지의 제2 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥과, 그 검출용 핵산 가닥을 이용한 본 발명의 제2 요지의 제2 실시형태에 따른 물질 검출 방법을 개략적으로 도시하는 도면,
도 3의 (a) 및 (b)는, 본 발명의 제1 요지의 제3 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥과, 그 검출용 핵산 가닥을 이용한 본 발명의 제2 요지의 제3 실시형태에 따른 물질 검출 방법을 개략적으로 도시하는 도면,
도 4의 (a) 및 (b)는, 본 발명의 제1 요지의 제4 실시형태에 따른 검출용 핵산 가닥과, 그 검출용 핵산 가닥을 이용한 본 발명의 제2 요지의 제4 실시형태에 따른 물질 검출 방법을 개략적으로 도시하는 도면,
도 5의 (a) 및 (b)는, 본 발명의 제2 요지의 제5 실시형태에 따른 소정 물질 사이의 상호작용 검출 방법을 개략적으로 도시하는 도면,
도 6의 (a) 및 (b)는, 본 발명의 제2 요지의 제6 실시형태에 따른 소정 물질 사이의 상호작용 검출 방법을 개략적으로 도시하는 도면,
도 7의 (a)∼(c)는 본 발명의 제2 요지의 제7 실시형태에 따른 물질 사이의 결합 또는 상호작용 검출방법을, 압타머의 기능해석, 압타머에의 결합후의 소정 물질의 기능해석 또는 물질의 스크리닝에 응용한 경우를 개략적으로 도시하는 도면.

Claims (11)

  1. 검출용 핵산 가닥(核酸鎖; nucleic acid strand)으로서,
    압타머(aptamer)로서 기능할 수 있는 제1 염기 서열 영역을 가지는 제1 핵산 가닥과,
    상기 제1 염기 서열 영역에 대해 상보적이고 상기 제1 염기 서열 영역과 상보 가닥(相補鎖; complementary strand)을 형성하는 제2 염기 서열 영역을 가지는 제2 핵산 가닥
    을 포함하고 있으며,
    소정 물질이 상기 제1 염기 서열 영역과 상호작용할 때, 상기 제1 및 제2 염기 서열 영역의 상기 상보 가닥이 단일 가닥(一本鎖; single strand)으로 해리하도록 조정(design; 설계)된, 검출용 핵산 가닥.
  2. 제1항에 있어서,
    상보적인 상기 제1 및 제2 염기 서열 영역의 상기 상보 가닥이 상기 단일 가닥으로 해리한 것을 검출하는데 이용가능한 프로브(probe)를 더 포함하는, 검출용 핵산 가닥.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 프로브는, 상기 제2 핵산 가닥에 보존유지(保持; hold)되어 있고 검출 신호를 생성할 수 있는 물질인, 검출용 핵산 가닥.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 물질은 유전체인, 검출용 핵산 가닥.
  5. 제3항에 있어서,
    상기 물질은 형광 물질인, 검출용 핵산 가닥.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 프로브는,
    상기 제2 핵산 가닥에 표지(標識; label)붙여진 형광 물질과,
    상기 제1 핵산 가닥에 표지붙여져 있고, 상기 제1 및 제2 염기 서열 영역의 상기 상보 가닥 존재시에 상기 형광 물질을 소광할 수 있는 퀀처(quencher)를 포함하는, 검출용 핵산 가닥.
  7. 제1항에 기재된 검출용 핵산 가닥을 적어도 이용하는 것에 의해서, 압타머로서 기능할 수 있는 제1 염기 서열 영역과 소정 물질 사이의 상호작용을 검출하는 방법.
  8. 제7항에 있어서,
    제1 핵산 가닥의 한 말단(末端; end)이 고상(固相) 표면에 고정(immobilize)되어 있는, 방법.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 제2 핵산 가닥에 보존유지된 유전체로부터 얻어지는(available) 유전 상수의 변화를 측정하는 것에 의해서, 상기 상보 가닥의 상기 단일 가닥으로의 해리를 검출하는, 방법.
  10. 제7항에 있어서,
    상기 검출용 핵산 가닥의 무게 변화를 측정하는 것에 의해서, 상기 상보 가닥의 상기 단일 가닥으로의 해리를 검출하는, 방법.
  11. 제7항에 있어서,
    상기 검출용 핵산 가닥의 상기 제1 및 제2 염기 서열 영역의 상기 상보 가닥에 결합 또는 흡착해서 형광을 발(emit)할 수 있는 삽입물(intercalator)로부터의 형광 강도의 저하를 측정하는 것에 의해서, 상기 상보 가닥의 상기 단일 가닥으로의 해리를 검출하는, 방법.
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