JP4576945B2 - 物質間の相互作用を検出する検出表面と該検出表面を用いるセンサチップとセンサ装置及び検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、物質間の相互作用を検出する技術に関する。より詳しくは、物質間の相互作用を検出できるように工夫された検出表面と該検出表面を用いるセンサチップとセンサ装置及び検出方法に関する。

近年、分子生物学、ナノテクノロジーに代表される微細加工技術、バイオインフォマティクスなどの進展を主な背景として、種々の測定原理を活用して、微細狭小な表面上で物質間の相互作用を進行させて、これを検出する技術（以下、「センサ技術」と称する。）が開発され、実用化されている。

このセンサ技術は、ゲノム解析、ゲノムから転写の全解析を行うトランスクリプトーム解析、生体内・細胞内で翻訳生産される全発現タンパク質の機能解析を行うプロテオーム解析、あるいは代謝の全解析を行うメタボローム解析や全生体のシグナルを解析するシグナローム解析などのような生体情報の解析に広範に利用され、創薬、臨床診断、薬理ジェノミクス、法医学等の分野においては、既にその技術的地位を固め始めている。

現在知られている、物質間の相互作用を検出可能なセンサ技術の代表的なものを幾つか挙げる。まず、マイクロアレイ技術によって所定のＤＮＡが微細配列された、いわゆるＤＮＡチップ又はＤＮＡマイクロアレイと呼ばれるバイオアッセイ用の集積基板に関する技術である（例えば、特許文献１、特許文献２参照）。この技術は、ガラス基板やシリコン基板上に多種・多数のＤＮＡオリゴ鎖やｃＤＮＡ（complementary DNA）等が集積されて
おり、ハイブリダイゼーションの網羅的解析が可能となる点が特徴である。このため、遺伝子の変異解析、ＳＮＰｓ（一塩基多型）分析、遺伝子発現頻度解析等に利用されている。

次に、基板表面上に精製したタンパク質をマイクロチップ上にアレイした、いわゆる「プロテインチップ（又はプロテインアレイチップ）」である。このプロテインチップは、固定化されるタンパク質の活性を損なわれるかもしれないという問題を抱えているが、タンパク質−タンパク質間、タンパク質−他の化学物質間の相互作用を解析できる技術が提案されている（例えば、特許文献３、４参照）。

また、種々の物質間の相互作用をリアルタイムに高速解析することが特徴である、表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance：ＳＰＲ）原理を用いるセンサ技術が開発されている（例えば、特許文献５、６参照）。このＳＰＲセンサ技術は、吸着部位、基盤（基板）、プリズムの三層からなる構造を持ち、入射光の全反射臨界角の変化によって対象物の相互作用を測定するもので、実際に全反射臨界角の変化に寄与するのは、相互作用による誘電率の変化である。近年、このＳＰＲセンサを用いて、センサチップ上にエストロゲン応答遺伝子のプロモータ領域のホルモン応答配列（二本鎖ＤＮＡ）を固定化しておき、これに精製したエストロゲンレセプターαを添加することで、前記ホルモン応答配列と前記エストロゲンレセプターαとの間の相互作用を非標識でリアルタイムに測定し、これによって、内分泌攪乱物質のスクリーニングが可能であること明らかにされている（非特許文献１参照）。

さらには、水晶振動子（水晶発振子）の振動数変化を測定することによって、生体高分子の構造変化を解析する方法が提案されている（特許文献７参照）。あるいは、同測定に基づいて、レセプター−リガンド間の相互作用の解析を行う方法も提案されている（特許文献８参照）。
特表平４−５０５７６３号公報。 特表平１０−５０３８４１号公報。 特開２００３−1３０８７７号公報。 特開２００３−１５５３００号公報。 特表平４−５０１４６２号公報。 特表平１１−５１２５１８号公報。 特開２００３−０８３８６４号公報。 特開２００３−０８３９７３号公報。 ＢＵＮＳＥＫＩ ＫＡＧＡＫＵ Ｖｏｌ．５１，Ｎｏ．６，ｐｐ．３８９−３９６（２００２）。

上掲したセンサ技術はいずれも、検出用に調整された表面上において、検出用に固定化された物質と標的となる物質との間の相互作用を、物質の特性や目的等に応じた好適な測定原理を選択することで、高精度に検出する技術であると言える。

しかしながら、物質のサイズや構造等によっては、相互作用が発生した状態を感度良く検出することが困難な場合があることから、これを克服することが技術的課題の一つとなっている。例えば、小分子量の小さな物質（例えば、疎水性ホルモン）が標的となる相互作用解析では、相互作用による質量変化や誘電率変化が充分に大きくないので、高精度の検出が困難となっている。この状況下、シグナル伝達を担う物質としてのホルモンやホルモン様物質を、多成分・高感度・経時的に計測できる技術が、ゲノミクスやプロテオミクスなどの分野、さらには、医療・創薬の分野や環境ホルモン検出技術等の分野において強く求められている。

そこで、本発明は、検出表面の新規なアッセイ系を創出することによって、分子量の小さな物質が係わる相互作用レベルでも高精度に測定できるセンサ技術を提供することを主な目的とする。

本発明では、まず、物質間の相互作用を検出するための表面上に、該表面に末端部位が固定化された一本鎖ＤＮＡと相補結合することにより形成された二本鎖ＤＮＡを設けておき、前記相互作用の発生に応答して、前記二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに解離するように構成されている検出表面を提供する。加えて、この検出表面を少なくとも備えるセンサチップ（相互作用の場を提供するチップ）、並びに、前記検出表面と、該検出表面における前記二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの解離の発生を検出可能な検出手段と、を少なくとも用いるセンサ装置を提供する。

本発明において、「検出表面」とは、物質間の相互作用が進行する領域又は空間として機能する、基板、粒状物、膜体、繊維状物などの表面及び該表面上の領域又は空間を意味する。

本発明における前記検出表面は、二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡに解離する現象を有効に利用することを技術的特徴とする。従って、端的に言えば、ハイブリダイゼーションによって一本鎖ＤＮＡから二本鎖ＤＮＡを形成することで、遺伝子発現解析等を達成するＤＮＡチップとは、全く逆のアッセイ系を用いるものと言える。

ＤＮＡチップ上でのハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ鎖がランダムコイル状の高次構造をとることによって発生する立体障害などが原因となって反応効率が悪く、また、検出精度の低下の要因となるミスハイブリダイゼーションの発生は避けられない等の問題を抱えている。この点、二本鎖ＤＮＡから一本鎖への解離は、このような問題がないことから、前記解離を基軸反応とするアッセイは、アッセイ条件の調整や操作がし易いという利点がある。

本発明において「相互作用」とは、物質間の非共有結合、共有結合、水素結合を含む化学的結合あるいは解離を広く意味し、検出表面上の領域に対して添加、送液、注入等された結果、「検出表面上に存在する標的物質」と「予め固定化された二本鎖ＤＮＡの所定配列部位に結合する検出用物質」との間の相互作用を含む。

「標的物質」は、相互作用の標的となる物質、あるいは相互作用の標的となる可能性のあるスクリーニング対象の物質を広く含み、例えば、ホルモンや内分泌攪乱物質を少なくとも含む。

なお、「ホルモン」は、特定の細胞によって、生体内外の情報に応じて生産・分泌され、体液を介してその情報を他の細胞へ伝達する物質である。ホルモンの種類によって、細胞膜貫通型の受容体に働きかけるもの（タンパク質・ペプチド性ホルモン、カテコラミン）、細胞内の受容体に働きかけるもの（ステロイドホルモン）、細胞核内の受容体に直接働きかけるもの（甲状腺ホルモン、レチノイド、ビタミンＤ）などが知られている。

「内分泌攪乱物質」とは、ヒトの性ホルモンであるエストロゲン等と同様の作用を持ち、生体に作用する物質であって、いわゆる「環境ホルモン」と称される物質を意味する。本来、生体に存在するホルモンが結合するはずのホルモンレセプターに外界から入り込んだ化学物質が結合することによって、本来のホルモン様の作用がもたらされたり（アゴニスト作用）、逆に本来のホルモン作用が阻害されたり（アンタゴニスト作用）する。例えば、ビスフェノール、ノニフェノール、ＤＤＴは、エストロゲンレセプターに結合することでエストロゲンと類似の反応をもたらすと言われている。その他、抗エストロゲン作用を示す物質として、ダイオキシン類、抗アンドロゲン作用を示す物質として、ピンクロゾリン、ＤＤＥ、甲状腺ホルモン攪乱物質として、ＴＣＤＤ，ＰＣＢなどが知られている（「ＤＮＡチップ応用技術ＩＩ」、監修・松永 是、株式会社シーエムシー発行、Ｐ９３〜９５参照）。

「検出用物質」は、前記標的物質との間で、直接又は間接的に相互作用を示す物質であって、例えば、測定アッセイ開始時において、標的物質（リガンド）との相互作用に関係なく、二本鎖ＤＮＡの所定配列部位に予め直接又は間接的に結合等の作用を示す状態を提供できる物質、例えば、リガンド非依存性のホルモンレセプター、あるいは、標的物質（リガンド）と相互作用するとその立体構造が変化して前記所定配列部位に対して直接又は間接的に結合等の作用を示すようになる物質、例えば、リガンド依存性のホルモンレセプターを少なくとも含む。また、この「検出用物質」には、転写活性化因子が含まれ、この場合、二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの解離は、転写活性化に起因する状態変化としてもたらされるものも採用可能となる。

二本鎖ＤＮＡの「所定配列部位」は、検出用物質が結合可能な塩基配列部位を意味し、例えば、ホルモン応答遺伝子上流に位置するプロモータ領域にあるホルモン応答部位を含む。このホルモン応答部位には、検出用物質として機能するホルモンレセプターが結合する。

検出表面に固定化される「二本鎖ＤＮＡ」は、該二本鎖ＤＮＡ中の所定配列部位にホルモンレセプターなどの検出用物質が結合したのに応答して、一本鎖へ解離するように、予め人為的に機能改変又は調整された「デオキシリボ核酸の相補結合体」、あるいは前記検出用物質によってもたらされる転写活性シグナルに応答して、一本鎖へ解離するように機能改変又は調整された「デオキシリボ核酸の相補結合体」を意味する。

この二本鎖ＤＮＡには、蛍光インターカレーターなどのインターカレーターが挿入される場合がある。蛍光インターカレーターを用いた場合、二本鎖ＤＮＡが一本鎖に解離すると、この蛍光インターカレーターは検出表面上に遊離し、発色が変化する。なお、「蛍光インターカレーター」は、二本鎖ＤＮＡの相補結合中に挿入されるように結合する特性を有する蛍光物質である。

また、検出表面に固定化されていない側のＤＮＡ鎖の末端部位に蛍光物質（例えば、蛍光色素）が標識される場合がある。この場合、二本鎖ＤＮＡが一本鎖に解離すると、前記蛍光物質は標識された側のＤＮＡ鎖が検出表面上に遊離し、蛍光強度が変化する。

さらに、本発明では、検出表面に固定化されている側のＤＮＡ鎖の末端部位に誘電体（dielectric substance）が標識される場合がある。この場合、二本鎖ＤＮＡが一本鎖に解離すると、前記誘電体と検出表面との間の距離が変化し、誘電率が変化する。「誘電体」は、静電場を加えるとき電気分極を生ずるが、直流電流を生じない物質である。

本発明では、前記二本鎖ＤＮＡの相補塩基対部位に、前記標的物質とインターカレーターとからなる複合体が結合される場合がある。例えば、標的物質であるホルモンとインターカレーターとからなる複合体は代表例である。なお、この場合のインターカレーターは、蛍光性、非蛍光性のいずれも採用可能である。

次に、本発明では、二本鎖ＤＮＡを検出表面に固定化する手順と、物質間の相互作用の発生に応答して前記二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる手順と、前記解離の発生を検出する手順と、を少なくとも含むように工夫された物質間の相互作用を検出する方法を提供する。

この方法では、前記二本鎖ＤＮＡの相補塩基対部位に、検出対象である標的物質（例えば、ホルモン）とインターカレーターとからなる結合体を結合させる手順を含むように工夫し、前記二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡへ解離する際に、前記結合体が前記検出表面上の媒質中へ放出される手順と、放出された前記結合体を構成する前記標的物質が、受容体との結合を介して、前記解離を促進する手順と、を含むように工夫してもよい。

これらの工夫によれば、検出表面上に整列固定化された二本鎖ＤＮＡに対して前記結合体を、インターカレーターの特性を用いて二本鎖ＤＮＡの相補塩基対部位に挿入結合（インターカレート）した状態を形成しておき、そこに、検出対象の標的物質を導入することで、多数の二本鎖ＤＮＡを連鎖的に次々に一本鎖へ解離させていくことができる。即ち、測定対象の初期シグナルが指数関数的に増幅され、より高感度のセンシングを実現できる。

前記検出に係わる測定原理は、特に限定するものでないが、例えば、表面プラズモン共鳴（Surface PlasmonResonance、以下、しばしば「ＳＰＲ」と略称）原理に基づいて行うことが好適な場合がある。あるいは、他の光学的原理や水晶振動子の振動数変化を捉える測定原理も採用し得る。

より具体的には、二本鎖ＤＮＡの固定化されている側のＤＮＡ鎖の末端部位に標識した誘電体と検出表面との間の距離が、前記二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡへ解離する際に変化することに起因する誘電率の変化を、前記表面プラズモン共鳴原理によって検出することが可能である。

本発明に係る方法における相互作用の検出では、（１）二本鎖ＤＮＡに標識された蛍光物質の蛍光強度の変化、（２）二本鎖ＤＮＡに挿入された蛍光インターカレーターの発色の変化、これら（１）、（２）のいずれかを光学的に測定する手順を採用することができる。

本発明によれば、小さな物質が係わる相互作用レベルであっても、高精度に測定することができる。

以下、本発明を実施するための好適な形態について、添付図面を参照しながら説明する。

まず、図１は、本発明に係わる基本的な作用機序の概念を説明するための模式図、図２は、本発明に係わる基本的な他の作用機序の概念を説明するための模式図である。なお、図１、図２中の矢印Ｘは、二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの状態変化の移行を示すものである（他の図面でも同様）。

図１、図２中に示された符号１は、本発明に係る検出表面の一実施形態を示している。図示された検出表面１の場合では、ガラス、光透過性の合成樹脂、アモルファスカーボンなどで形成された基板１１の表面及び該表面上の領域あるいは空間を、相互作用検出の場として機能させている。なお、表面プラズモン共鳴原理を用いて相互作用を検出する場合などでは、検出表面１に、金などの金属薄膜を蒸着等によって形成してもよい。

なお、検出表面１は、平板状に形成された基板１１に狭く限定されるものではなく、合成樹脂ビーズなどの粒状物、膜体、繊維物などを含む多様な基材物の表面及び該表面上の領域あるいは空間であってもよい。

検出表面１には、二本鎖ＤＮＡ２が固定化された状態で準備されている。この二本鎖ＤＮＡ２を該検出表面１上にアレイするのは自由である。検出表面１上に固定化されるすべての二本鎖ＤＮＡ２は、検出表面１の一末端部位が固定化された一本鎖ＤＮＡ２１と、該一本鎖ＤＮＡ２１と相補的な塩基配列を備える一本鎖ＤＮＡ２２と、によって形成されたデオキシリボ核酸の相補的な二本鎖である（図１参照）。

検出表面１に対する二本鎖ＤＮＡ２の固定化方法は、特に限定されず、適宜選択可能ではあるが、一般には、前記二本鎖ＤＮＡ２を確実に固定化するための表面処理を施す必要がある。

一例を挙げると、ストレプトアビジンによって表面処理した場合には、ビオチン化されたＤＮＡ末端の固定に適している。あるいは、チオール（ＳＨ）基によって表面処理した場合には、チオール基が末端に修飾されたＤＮＡをジスルフィド結合（−Ｓ−Ｓ−結合）によって固定することに適している。

二本鎖ＤＮＡ２の所定の塩基配列部位には、検出用物質Ｄが結合する応答配列部位３が存在する。なお、二本鎖ＤＮＡ２に前記応答配列部位３それ自体を採用する構成を、本発明では排除していない。

図１では、アッセイ開始時において、前記応答配列部位３に検出用物質Ｄが結合した状態が提供される構成が示されている。同時に、この図１には、この検出用物質Ｄに対して、添加、送液、注入等されてきた標的物質Ｔが相互作用するという作用機構が模式的に示されている。

また、図１では、二本鎖ＤＮＡ２の応答配列部位３に結合した状態の検出用物質Ｄに対して標的物質Ｔが結合したときに、これに応答して、二本鎖ＤＮＡ２は、例えば、転写因子の働きなどにより、転写活性化等されるという作用機序により、その下流側において、一本鎖ＤＮＡ２１，２２に解離するように設計されていることが示されている。

図１に示された作用機序の典型例は、標的物質Ｔがホルモン、あるいは生体内でホルモン用の作用機能を示す内分泌攪乱物質であり、検出用物質Ｄが、リガンドである標的物質Ｔに対して非依存性のホルモンレセプターの場合であろう。

例えば、レチノイド（ホルモン）と特異的に結合可能なホルモンレセプターが始めから二本鎖ＤＮＡ２と結合した状態で、予め検出表面１上に準備されており、前記レチノイドとホルモンレセプターとが複合体を形成したことに応答して、二本鎖ＤＮＡ２の転写が活性化され、一本鎖ＤＮＡ２１、２２に解離する。

次に、図２には、本発明に係わる他の基本的な作用機序の概念が示されている。この図２に示された作用機序は、標的物質Ｔと検出用物質ｄ_１が相互作用を示すことによって、該検出用物質ｄ_１の立体構造が変化して検出用物質ｄ_２となり、この検出用物質ｄ_２が、二本鎖ＤＮＡ２中の応答配列部位３に結合するというものである。

そして、この図２には、検出用物質ｄ_２と応答配列部位３との間の結合に応答して、二本鎖ＤＮＡ２は、例えば、転写因子の働きなどにより、転写活性化等されるという作用機序によって、その下流側において、一本鎖ＤＮＡ２１，２２に解離するように設計されていることが示されている。

図２に示された作用機序の典型例は、標的物質Ｔがホルモン、あるいは生体内でホルモン様の作用機能を示す内分泌攪乱物質であり、検出用物質ｄ_１が、リガンドである標的物質Ｔに依存性を示すホルモンレセプター（リガンド依存性ホルモンレセプター）の場合であろう。

例えば、検出表面１に対して、エストロゲン応答遺伝子のプロモータ領域のホルモン応答配列（二本鎖ＤＮＡ２に対応）を固定化しておいて、これに標的物質Ｔであるエストロゲン（ホルモン）と検出用物質ｄ_１に相当するエストロゲンレセプターαとを添加し、前記エストロゲンとエストロゲンレセプターαとが相互作用すると、エストロゲンレセプターαの立体構造が変化して、前記ホルモン応答配列に結合し、転写因子の働きなどにより、エストロゲン応答遺伝子の転写が活性化され、一本鎖ＤＮＡに解離する。

ここで、L.L.Loogerらは、大腸菌の５つの受容体（グルコース、リボース、アラビノース、グルタミン、ヒスチジンの各結合タンパク）に関して、これらの受容体と天然のリガンドとは異なる分子とが特異的に結合するように機能改変を行った結果、i）特異性が高いこと（類似の分子構造や光学異性体などの認識が可能）、ii）天然のリガンドと同程度の結合度（affinity）を持つこと、iii）複合体となった際の機能性が失われていないことを、確かめている。また、実験を行う前に候補を絞る計算の時間も、現実的な範囲であることも示している(L.L.Looger,M.A.Dwyet,J.J.Smith,and H.W.Hellinga:`Computationaldesign of receptor and sensor proteins with novel unctions″,Nature,423,185-190(2003)）。

前記したL.L.Loogerらによる論文によれば、受容体の機能（リガンドと相互作用することによって二本鎖ＤＮＡ２を一本鎖にする機能）を保持させたままで、特異的に結合する相手（リガンド）を変更することが可能と考えられる。これは、受容体本来の機能を保持させたままで、当該受容体の相互作用の相手となる標的物質Ｔを人為的に選択することが可能となることを意味しており、ひいては当該受容体を検出用物質として機能させることができることを意味している。このことから、図１、図２に示されたような作用機序を当業者が現実に実施することは可能である。

また、受容体として機能する前記検出用物質Ｄ又はｄ_１については、この検出用物質Ｄ又はｄ_１がリガンドである標的物質Ｔと相互作用し、目的の二本鎖ＤＮＡ２の応答配列部位３に結合したときに、当該二本鎖ＤＮＡ２の転写を活性化等して、一本鎖ＤＮＡへの解離へと導くように、機能改変することも原理的に可能であると考えられる。このことから、図１、図２に示されたような作用機序を当業者が現実に実施することは可能である。

ここで、添付した図３は、二本鎖ＤＮＡ２の一本鎖ＤＮＡへの解離を検出するために好適な第一実施形態の基本的な概念を示す図、図４は、同第二実施形態の基本的な概念を示す図、図５は、同第三実施形態の基本的な概念を示す図である。

まず、図３に示された第一実施形態について説明する。

基板１１に形成された検出表面１には、二本鎖ＤＮＡ２が固定化されている。この二本鎖ＤＮＡ２の固定化された側の一本鎖ＤＮＡ２１の上方末端部位には、誘電体４が標識されている。前記誘電体４は、例えば、誘電体クリスタルを採用することができる。

この二本鎖ＤＮＡ２の応答配列部位３に対して、ホルモンレセプターなどの検出用物質Ｄ（又はｄ_２）が結合すると、これに応答して、二本鎖ＤＮＡ２は、転写活性化等される作用機序によって、一本鎖ＤＮＡ２１、２２に解離する。

このとき、誘電体４と基板１１の表面との間の距離が変化する。具体的には、解離前の距離Ｌ_１より、解離後の距離Ｌ_２は長くなる（Ｌ_１＜Ｌ_２）。この結果、誘電率が変化するので、反射光強度のピークが変化する。この透過光強度のピークの変化現象を検出することによって、相互作用の有無を判定することができる。なお、図３に示された符号Ｐ_１は、相互作用の検出に用いられる入射光、符号Ｐ_２はその反射光を表している。

次に、図４に示された第二実施形態について説明する。

基板１１に形成された検出表面１には、二本鎖ＤＮＡ２が固定化されている。この二本鎖ＤＮＡ２の固定化されていない側の一本鎖ＤＮＡ２２の上方末端部位には、蛍光物質５が標識されている。蛍光物質５は、例えば、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５（Amersham Pharmacia社）などの蛍光色素を採用することができる。

この二本鎖ＤＮＡ２の応答配列部位３に対して、ホルモンレセプターなどの検出用物質Ｄ（又はｄ_２）が結合したときに、これに応答して、二本鎖ＤＮＡ２は、転写活性化等される作用機序によって、一本鎖ＤＮＡ２１、２２に解離する。

このとき、蛍光物質５が標識された一本鎖ＤＮＡ２２は、遊離状態で検出表面１上の領域に存在することになるので、透過光強度のピークが消滅する。この透過光強度のピークの消滅を検出することによって、標的物質Ｔと検出用物質Ｄ（又はｄ_１）との間の相互作用の有無を判定することができる。なお、図４の符号Ｐ_１は、相互作用の検出に用いられるレーザ光などの入射光を示している。

次に、図５に示された第三実施形態について説明する。

基板１１に形成された検出表面１には、二本鎖ＤＮＡ２が固定化されている。この二本鎖ＤＮＡ２には蛍光性のインターカレーターＩが挿入されている。なお、インターカレーターＩは、例えば、ＰＯＰＯ−１、ＴＯＴＯ−３、ＳＹＢＲ（登録商標）ＧｒｅｅｎＩなどを採用することができる。

この二本鎖ＤＮＡ２中の応答配列部位３に対して、ホルモンレセプターなどの検出用物質Ｄ（又はｄ_２）が結合したときに、これに応答して、二本鎖ＤＮＡ２は、転写活性化等される作用機序によって、一本鎖ＤＮＡ２１、２２に解離する。

このとき、蛍光インターカレーターＩは、遊離状態で検出表面１上の領域に存在することになるので、発色が変化する。この発色の変化を光学的に検出することによって、標的物質Ｔと検出用物質Ｄ（又はｄ_１）との間の相互作用の有無を判定できる。

次に、図６〜図１１を参照しながら、本発明に係る第四実施形態について説明する。

本実施形態は、外部環境からの刺激（ストレッサー）によって、生体がストレスを受けると、副腎皮質からグルココルチコイドというステロイドホルモン（脂溶性の小型ホルモン）が血液中に放出される。このグルココルチコイドは、水溶性の輸送タンパクと結合した状態で血液中を移動し、対象細胞中の受容体へ直接作用する。

図６Ａは、グルココルチコイドなどのホルモンの作用機序の概念を表す模式図である。この図６Ａに示すように、ホルモンＨと受容体Ｒからなる複合体は、核内へ移動し、ＤＮＡのホルモン応答配列部位（この場合は、ＧＲＥ:Glucocorticoid Reaction Element）に作用することによって、その下流側のＤＮＡでコードされたタンパク質の発現を促進する。なお、甲状腺ホルモン、レチノイド、ビタミンＤ等は、核内に移動してから受容体に作用することが知られている（図６Ｂ参照）。

タンパク質の発現は、公知の通り、ＤＮＡの二本鎖が、転写因子の作用によって一本鎖に解かれながら、転写されることから開始する。図７は、本発明の理解に資するために添付した図面であって、二本鎖ＤＮＡ２の前記ＧＲＥ配列部位にホルモン-受容体複合体Ｃが作用して、二本鎖ＤＮＡ２が一本鎖に解離している様子を模式的に示した図である。

ここで、ハイブリダイゼーションを検出する技術において、インターカレーターＩが採用される場合があるが、本第四実施形態では、前述したホルモン応答に係わる転写時の二本鎖ＤＮＡの一本鎖への解離反応とともに、該インターカレーターＩを用いることを特徴とする。

以下、添付の図８に基づいて、第四実施形態の検出表面領域の構成を詳しく説明する。なお、ここで説明する第四実施形態は、グルココルチコイドの一つであるコルチゾールを検出するアッセイ系を想定したものであるが、本発明はこれに狭く限定されない。また、検出に係わる測定原理としては、本実施形態ではＳＰＲを想定しているが、本発明は、これに限定されない。

まず、ＳＰＲ測定に適する構成とされた検出表面１（例えば、金薄膜表面）に対して、ＧＲＥ配列部位を有する二本鎖ＤＮＡ２ａ，２ｂ，２ｃ・・・２ｎを多数固定化する。そして、（検出対象の）標的物質であるコルチゾールＴｃ（グルココルチコイドの一つ）とインターカレーターＩを結合させた結合体Ｍを予め準備しておいて、この結合体Ｍを二本鎖ＤＮＡ２に予め挿入結合（インターカレート）させておく。さらには、検出表面１上に導入された媒質中へ、コルチゾール受容体Ｒと、必要な転写因子Ｅを添加しておくようにする（図８参照）。

ここで、添付の図９を参照すると、コルチゾールＴｃが検出表面１の領域に導入され、このコルチゾールＴｃが遊離状態で存在する受容体Ｒに特異的に結合して複合体Ｃを形成すると、該複合体Ｃは、二本鎖ＤＮＡ（例えば二本鎖ＤＮＡ２ａ）のＧＲＥ配列部位へ二量体を形成して作用する。この作用を起点として、二本鎖ＤＮＡ２ａが、転写因子Ｅの協働作用によって一本鎖へ解離する。

一本鎖への解離過程で、二本鎖ＤＮＡ２ａに挿入結合されていた前記結合体Ｍａが媒質中へ遊離する（図９の点線矢印参照）。この遊離した結合体Ｍａは、図１０に示すように、二本鎖ＤＮＡ２ａと同一の検出表面１上に固定化されており、依然として二本鎖状態にある他の二本鎖ＤＮＡ２ｂの相補塩基対部分へ挿入結合する。なお、図１０は、二本鎖ＤＮＡ２ａから放出された結合体Ｍａが他の二本鎖ＤＮＡ２ｂの相補塩基対に挿入結合した状態が示されている。図１０の符号Ｍｂは、二本鎖ＤＮＡ２ｂに最初から挿入結合されている結合体を示している。

あるいは、図１１に示すように、一本鎖への解離に伴って、二本鎖ＤＮＡ２ａから放出された結合体Ｍａは、該結合体Ｍａを構成しているコルチゾールＴｃが遊離状態の受容体Ｒに結合してホルモン-受容体複合体Ｃを形成する。この複合体Ｃは、他の二本鎖ＤＮＡ２ｃのＧＲＥ部位に作用し、この作用を起点として、二本鎖ＤＮＡ２ｃが、転写因子Ｅの協働作用によって一本鎖へ解離する。

一本鎖への解離の過程で、二本鎖ＤＮＡ２ｃの相補塩基対部分に挿入結合されていた結合体Ｍｃは、媒質中へ放出される。放出された結合体Ｍｃは、上記結合体Ｍａと同様に、他の二本鎖ＤＮＡの相補塩基対部分に挿入結合したり、受容体Ｒとホルモン-受容体複合体Ｃを形成し、他の二本鎖ＤＮＡのＧＲＥ部位に作用し、転写因子Ｅの協働作用によって一本鎖へ解離させたりする。

以上説明したように、検出表面１上に整列固定化された二本鎖ＤＮＡ２ａ〜２ｎに、（検出対象の）標的物質Ｔ（例えば、ホルモン）とインターカレーターＩとからなる結合体Ｍを二本鎖ＤＮＡ２ａ〜２ｎに予め挿入結合（インターカレート）しておいた状態を形成しておき、そこに、検出対象の標的物質Ｔを導入することによって、連鎖的に二本鎖ＤＮＡ２ａ〜２ｎを次々に一本鎖へ解離させていくことができる。

この連鎖的な一本鎖への解離手段によって、測定対象の初期シグナルが指数関数的に増幅され、より高感度のセンシングが可能となる。なお、二本鎖ＤＮＡの一本鎖への変化は、ＳＰＲ原理の場合では誘電率の変化として測定するが、それ以外の原理で測定することは自由である。例えば、インターカレーターＩとして蛍光インターカレーターを用いて、該蛍光インターカレーターが挿入結合状態にあるときと遊離状態にあるときの蛍光の変化に基づいて、測定することができる。

以上のように、予め調整された二本鎖ＤＮＡ２を検出表面に固定化する手順と、物質間の相互作用の発生に応答して前記二本鎖ＤＮＡ２を一本鎖ＤＮＡ２１，２２に解離させる手順と、前記解離の発生を検出する手順と、を用いて、物質間の相互作用の検出あるいは測定を実施することができる。

また、上記した検出表面１を用いて、既存の公知技術に基づき、センサチップやマイクロアレイを製造し、提供することができる。また、この検出表面１と、該検出表面１における二本鎖ＤＮＡ２から一本鎖ＤＮＡ２１，２２への解離の発生を検出可能な検出手段と、を少なくとも備えるセンサ装置を提供することができる。このセンサ装置には、バイオセンサという範疇の装置も含まれ、この場合、検出表面１は、「生物素子」を提供する手段であると解釈されるだろう。

図１２は、前記センサ装置の基本構成を簡略に示す図である。図１２中の符号Ｕは、センサ装置を示している。このセンサ装置Ｕは、検出表面１（あるいは該検出表面１が設けられたセンサチップ、図示せず。）と、該検出表面１での誘電率変化に基づく反射光強度のピークの変化（図３に示す第一実施形態参照）、透過光強度ピークの消失（図４に示す第二実施形態参照）、発色の変化（図５に示す第三実施形態参照）などを検出可能な検出原理ユニット６を少なくとも備え、さらには、検出原理ユニット６からのデータを解析する解析部７や試料を一定流量で送液するためのマイクロ流路系８などを含む。

検出原理ユニット６では、レーザ光照射装置、共焦点レンズ及び共焦点スキャニング装置、ＣＣＤカメラ、プラズモン共鳴原理に係わる手段、水晶振動子の振動数変化を捕捉可能な手段、トランスデューサ（変換器）などを、検出原理に応じて、適宜採用することができる。

センサ装置Ｕでは、検出表面１に向けて、標的物質Ｔを含む試料を添加、送液、注入等して送り込み、該標的物質Ｔと検出用物質Ｄとの間で相互作用を進行させ、この相互作用の発生を、前記検出原理ユニット６で捕捉し、解析部７でデータ解析を行うことができる。

本発明は、物質間の相互作用の検出のためのアッセイ技術、ホルモン応答反応等の生体反応列を用いることができるセンサチップ、マイクロアレイ、バイオセンサを含むセンサ装置などに利用できる。

あるいは、本発明は、創薬スクリーニングや内分泌攪乱物質のスクリーニング技術として利用でき、カイネティクス解析、アフィニティ解析、多分子複合体の機能解析、構造・機能相関の解析、結合の特異性の解析を行う際の技術としても利用することができる。

また、本発明は、ゲノム解析、ゲノムから転写の全解析を行うトランスクリプトーム解析、生体内・細胞内で翻訳生産される全発現タンパク質の機能解析を行うプロテオーム解析、あるいは代謝の全解析を行うメタボローム解析や全生体のシグナルを解析するシグナローム解析などのような生体情報の解析にも利用できる。例えば、感情、ストレスなどを測定、検査又は診断するためのセンサ技術として利用することもできる。

本発明に係わる基本的な作用機序の概念を説明するための模式図である。 本発明に係わる他の基本的な作用機序の概念を説明するための模式図である。 二本鎖ＤＮＡ２の一本鎖ＤＮＡへの解離を検出するために好適な第一実施形態の基本的な概念を示す図である。 同第二実施形態の基本的な概念を示す図である。 同第三実施形態の基本的な概念を示す図である。 グルココルチコイドなどのホルモンの作用機序の概念を表す模式図である。 甲状腺ホルモンなどのホルモンの作用機序の概念を表す模式図である。 ＤＮＡのＧＲＥ部位にホルモン-受容体複合体が作用し、ＤＮＡが一本鎖に解かれている様子を模式的に示した図である。 検出表面（１）上に整列固定化された二本鎖ＤＮＡ（２ａ〜２ｎ）等の状態を模式的に示す図である。 ホルモン応答配列部位（ＧＲＥ）へのホルモン−受容体複合体（Ｃ）の作用により、二本鎖ＤＮＡ（２ａ）が転写促進され、一本鎖へ解離し、結合体（Ｍａ）を放出している状態を模式的に示す図である。 二本鎖ＤＮＡ（２ａ）から放出された結合体（Ｍａ）が他の二本鎖ＤＮＡ（２ｂ）の相補塩基対部分へ挿入結合した状態を模式的に示す図である。 二本鎖ＤＮＡ（２ａ）から放出された結合体（Ｍａ）を構成する標的物質（例えば、コルチコイドＴｃ）がホルモン−受容体複合体（Ｃ）を形成して、他の二本鎖（２ｃ）のＧＲＥへ作用している様子を模式的に示す図である。 本発明に係るセンサ装置（Ｕ）の基本構成を簡略に示す図である。

符号の説明

１ 検出表面
２（２ａ〜２ｎ） 二本鎖ＤＮＡ
３ 応答配列部位
４ 誘電体
５ 蛍光物質
１１ 基板
２１ （表面に固定化されている側の）一本鎖ＤＮＡ
２２ （表面に固定化されていない側の）一本鎖ＤＮＡ
Ｃ ホルモン−受容体複合体
Ｄ 検出用物質（例、ホルモンレセプター、転写活性因子）
Ｅ 転写因子
Ｉ インターカレーター（例えば、蛍光インターカレーター）
Ｍ（Ｍａ，Ｍｂ，Ｍｃ） 標的物質（例えば、コルチコイドＴｃ）と蛍光インターカレーターとの結合体
Ｔ 標的物質（例、ホルモン、内分泌攪乱物質）
Ｔｃ 標的物質の例であるコルチコイド
Ｕ センサ装置

Claims (13)

1. 標的物質と検出用物質との物質間の相互作用を検出するための表面であって、
   該表面に末端部位が固定化された一本鎖ＤＮＡと該一本鎖ＤＮＡと相補的な塩基配列を備える一本鎖ＤＮＡによって形成され、前記標的物質と前記検出用物質との複合体が結合可能な所定塩基配列部位を有する二本鎖ＤＮＡと、
   前記二本鎖ＤＮＡの相補的塩基対部位に結合する、前記標的物質と同一の物質とインターカレーターとからなる結合体と、
   から構成された検出表面。
2. 前記標的物質はホルモンであることを特徴とする請求項１記載の検出表面。
3. 前記標的物質はホルモンであり、前記検出用物質はホルモンレセプターであり、前記所定配列部位はホルモン応答配列部位であることを特徴とする請求項２に記載の検出表面。
4. 前記標的物質はホルモンであり、前記検出用物質はリガンド依存性のホルモンレセプターであり、前記所定配列部位はホルモン応答配列部位であることを特徴とする請求項２または３に記載の検出表面。
5. 前記ホルモンは、ステロイドホルモンである請求項２から４のいずれか一項に記載の検出表面。
6. 前記ステロイドホルモンは、グルココルチコイドである請求項５記載の検出表面。
7. 請求項１から６のいずれか一項に記載の検出表面を少なくとも備えることを特徴とするセンサチップ。
8. 請求項１から６のいずれか一項に記載の検出表面と、
   該検出表面における前記二本鎖ＤＮＡから一本鎖ＤＮＡへの解離の発生を検出可能な検出手段と、
   を少なくとも用いることを特徴とするセンサ装置。
9. 二本鎖ＤＮＡを検出表面に固定化する手順と、
   前記二本鎖ＤＮＡの相補塩基対部位に、検出対象であるホルモンと同一のホルモンとインターカレーターとからなる結合体を結合させる手順と、
   検出対象であるホルモンとホルモンレセプターとの複合体と、所定の転写因子とが、前記二本鎖のホルモン応答配列部位に協同作用することにより、前記二本鎖ＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる手順と、
   前記解離の発生を検出する手順と、
   を含むホルモンとホルモンレセプターとの結合を検出する方法。
10. 前記二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡへ解離する際に、前記結合体が前記検出表面上の媒質中へ放出される手順と、
    放出された前記結合体を構成する前記ホルモンが、前記ホルモンレセプターとの結合を介して、前記解離を促進する手順と、
    を含むことを特徴とする請求項９記載の方法。
11. 前記検出を表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance）原理に基づいて行うことを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。
12. 前記二本鎖ＤＮＡの固定化されている側のＤＮＡ鎖の末端部位に標識した誘電体と表面との間の距離が、前記二本鎖ＤＮＡが一本鎖ＤＮＡへ解離する際に変化することに起因する誘電率の変化を、前記表面プラズモン共鳴原理によって検出することを特徴とする請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 前記検出を、次の（１）、（２）のいずれかを光学的に測定する手順に基づいて行うことを特徴とする請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
    （１）前記二本鎖ＤＮＡに標識された蛍光物質の蛍光強度の変化。
    （２）前記二本鎖ＤＮＡに挿入された蛍光インターカレーターの発色の変化。