JP2003527606A5 - - Google Patents
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Description
【書類名】 明細書
【発明の名称】 表面結合リガンドから溶出された分析物を捕捉するための方法
【特許請求の範囲】
【請求項1】 表面結合リガンドに結合した分析物を捕捉するための方法であって、
表面結合リガンドから分析物を解離させる第一の液体の流れに表面結合リガンドを接触させることによって分析物を表面結合リガンドから溶出させ、第一の液体の流れの中で遊離分析物を生成させる溶出工程と、
第一の液体の中で運ばれる固体捕捉材料で遊離分析物を捕捉して、捕捉分析物を含む第一の液体の流れを生成する捕捉工程と、
上記表面結合リガンドから離れた位置へと捕捉分析物を送り、その位置で捕捉分析物を集積させる集積工程と
を含む、方法。
【請求項2】 前記表面結合リガンドに結合した分析物が、抗原(抗体)、抗体(抗原)、ホルモン(ホルモン受容体)、ホルモン受容体(ホルモン)、ポリヌクレオチド(相補的ポリヌクレオチド)、アビジン/ストレプトアビジン(ビオチン)、ビオチン(アビジン/ストレプトアビジン)、酵素(酵素基質)、酵素(酵素阻害剤)、酵素基質(酵素)、酵素阻害剤(酵素)、レクチン(カルボキシハイドレート)、カルボキシハイドレート(レクチン)、脂質(脂質結合タンパク質)、脂質(膜結合タンパク質)、脂質結合タンパク質(脂質)、膜結合タンパク質(脂質)、ポリヌクレオチド(ポリヌクレオチド結合タンパク質)、ポリヌクレオチド結合タンパク質(ポリヌクレオチド)、受容体(伝達物質)、伝達物質(受容体)、薬物(標的)、標的(薬物)、タンパク質(タンパク質)、タンパク質(ポリヌクレオチド)、ポリヌクレオチド(タンパク質)、DNA(DNA)、DNA(RNA)、及びRNA(DNA)からなる群から選択される分析物(リガンド)相互作用対である、請求項1に記載の方法。
【請求項3】 前記分析物(リガンド)相互作用対が抗原(抗体)相互作用対である、請求項2記載の方法。
【請求項4】 前記表面結合リガンドが結合した表面が検出表面である、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。
【請求項5】 前記表面結合リガンドが結合した表面が非検出表面である、請求項1乃至請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項6】 前記検出表面が親和性バイオセンサーの検出表面である、請求項4記載の方法。
【請求項7】 前記親和性分バイオセンサーが表面プラズモン共鳴バイオセンサーである、請求項6記載の方法。
【請求項8】 前記第一の液体の流れが表面結合リガンドと接触する際に層流である、請求項1乃至請求項7のいずれか1項記載の方法。
【請求項9】 前記第一の液体の流れが、1種以上の酸性、塩基性、イオン性、有機界面活性剤又はキレート剤を含む水溶液である、請求項1乃至請求項8のいずれか1項記載の方法。
【請求項10】 前記固体捕捉材料が分離ビーズである、請求項1乃至請求項9のいずれか1項記載の方法。
【請求項11】 前記分離ビーズが、アガロース、デキストラン、ヒドロキシアパタイト、シリカ、ポリアクリルアミド又は親水性ポリマーからなる、請求項10記載の方法。
【請求項12】 前記分離ビーズが磁性を有する、請求項10又は請求項11に記載の方法。
【請求項13】 前記分離ビーズが、直径2〜10μmの球形クロマトグラフィー媒体を含む、請求項10乃至請求項12のいずれか1項記載の方法。
【請求項14】 前記溶出工程及び前記接触工程がバイオセンサーの流路内で行われる、請求項1乃至請求項13のいずれか1項記載の方法。
【請求項15】 複数の分析物が複数の表面結合リガンドに結合しており、前記溶出工程で複数の遊離分析物を生成し、前記捕捉工程で複数の捕捉分析物を生成する、請求項1乃至請求項14のいずれか1項記載の方法。
【請求項16】 前記集積工程が、捕捉分析物と結合した固体捕捉材料は通過させないが、第一の液体の流れは通過させる分離装置に、第一の液体の流れ中の捕捉分析物を導き、もって捕捉分析物を集積する工程を含む、請求項15記載の方法。
【請求項17】 前記分離装置がカラムを含み、複数の捕捉分析物を含む第一の液体をカラムに流す、請求項16記載の方法。
【請求項18】 前記集積された捕捉分析物を、前記固体捕捉材料から分析物を解離させる第二の液体に接触させることによって、固体捕捉材料から複数の遊離分析物を溶出させる工程をさらに含む、請求項16又は請求項17記載の方法。
【請求項19】 前記第二の液体が、1種以上の酸性、塩基性、イオン性、有機界面活性剤又はキレート剤を含む水溶液である、請求項18記載の方法。
【請求項20】 前記固体捕捉材料から複数の遊離分析物を溶出させる工程が、捕捉分析物の集積に用いたカラムで行われる、請求項18又は請求項19記載の方法。
【請求項21】 前記第二の液体で溶出させた遊離分析物を回収する、請求項18乃至請求項20のいずれか1項記載の方法。
【請求項22】 前記回収した分析物を続いで分析に供する、請求項21記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【0001】
【技術分野】
本発明は一般に表面結合リガンドに結合した分析物を捕捉するための方法、さらに具体的には、表面結合リガンドから溶出した分析物を捕捉するための固体捕捉材料の使用に関する。
【0002】
【背景技術】
分子間の相互作用の特徴付け、特に生体分子の相互作用の検出のためのアッセイに、様々な分析技術が用いられている。例えば、抗体−抗原相互作用は、生物学、免疫学及び薬理学を始めとする多くの分野で基本的に重要なものである。これに関連して、多くの分析技術では、「リガンド」(例えば、抗体)を固体担体に結合させ、次いでリガンドを「分析物」(例えば、抗原)と接触させる。リガンドと分析物との結合後、相互作用の指標となる幾つかの特性(例えば、分析物に対するリガンドの結合能)について測定する。相互作用の測定後、リガンド−分析物対は、通例、追加の分析測定のために表面結合リガンドを再生させるため、溶出及び/又は再生溶液で解離させる。
【0003】
しかし、リガンド−分析物対から遊離した分析物は、一般には再使用されず、遊離分析物は溶出及び/又は再生溶液と共に処分されるのが一般的である。こうした慣行は望ましくない。研究者が有する分析測定用の分析物は限られた量しかないことが多く、分析物自体に関する追加の分析測定を行うことを研究者が望むことが多いからである。従って、本技術分野では、遊離分析物について後段での分析測定を行うことができるように、リガンド−分析物対から遊離した分析物を効果的に集積する必要がある。
【0004】
遊離分析物を後段での分析測定のために効果的に集積する必要性について、固体担体に結合したリガンドと分析物との相互作用を表面プラズモン共鳴(SPR)でモニターするバイオセンサーに関して例示する。これに関して、代表的な種類のバイオセンサー機器が、Biacore社(スウェーデン、ウプサラ)からBIAcore(登録商標)という商標で市販されている(以下、「BIAcore機器」という)。BIAcore機器は、発光ダイオード、金薄膜で覆われたセンサーチップ、内蔵マイクロ流路カートリッジ(integrated microfluidic cartridge)及び光検出器を含む。ダイオードからの入射光は金薄膜で反射され、光検出器によって検出される。表面プラズモン共鳴波は、特定の入射角(「SPR角」)で金の層に設定され、反射光の強度損失つまり「低下」として検出される。BIAcore機器の背景をなす理論的基礎は、文献に十分に記載されている(例えば、Joensson, U. et al., Biotechniques 11: 620-627 (1991)参照)。
【0005】
BIAcore機器を使用するSPR分析に加えて、研究者らは、SPR技術を他の分析技術と組み合わせたときの相乗効果を認識し始めている。これに関連して、BIAcore機器で得られるリアルタイム相互作用分析は、生体分子の構造及び機能の両方を調査するための他の公知の方法を補完する。例えば、SPRは最近、質量分析(すなわち、SPR−MS)と組み合わされ、生体分子の検査のための非常に強力な微量調製技術を提供する(例えば、国際公開第97/09608号参照)。SPR−MSに関連して、分析物は、質量分析による次の分析測定のために、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化によって表面結合リガンドから遊離される。
【0006】
次の分析測定のために表面結合リガンドから分析物を溶出させる際の問題の1つは、マイクロ流路カートリッジを通して溶出及び/又は再生溶液が流れる際に、分析物のかなりの量が、マイクロ流路カートリッジの壁面その他の構成要素への分析物の非特異的結合のため失われるおそれがあることである。さらに、一旦表面結合リガンドから溶出されてしまうと、次の分析のために十分なサンプルが存在するように分析物をさらに集積させる必要がある。従って、本技術分野では、表面結合リガンドに結合した生体分子を集積するための方法及び微量調製技術を改善するニーズが存在する。本発明は、これらのニーズを満たし、それに関連した追加の利点をもたらす。
【0007】
【発明の概要】
簡潔に述べると、本発明は、表面結合リガンドに結合した分析物を捕捉するための方法、並びに該分析物を集積するための方法に関する。一実施形態では、この方法は、表面結合リガンドから分析物を解離させる第一の液体の流れに表面結合リガンドを接触させることによって分析物を表面結合リガンドから溶出させ、第一の液体の流れの中で遊離分析物を生成させる工程を含む。遊離分析物を次いで第一の液体の中で運ばれる固体捕捉材料で捕捉し、捕捉分析物を含む第一の液体の流れを得る。表面結合リガンドが結合する表面は、バイオセンサーの検出表面のような検出表面であってもよいし、或いは非検出表面であってもよい。
【0008】
代替実施形態では、本方法は、バイオセンサーの表面の表面結合リガンドから分析物を解離させる第一の液体に表面結合リガンドを接触させることによって分析物を表面結合リガンドから溶出させ、第一の液体中で遊離分析物を生成させる工程を含む。遊離分析物を次いで第一の液体中の固体捕捉材料で捕捉し、捕捉分析物を含む第一の液体を得る。この実施形態では、表面結合リガンドが結合する表面はバイオセンサーの表面であり、第一の液体は流動性の液体であっても、非流動性の液体であってもよい。
【0009】
上記いずれの実施形態でも、捕捉分析物を、表面結合リガンドから離れた位置で、同様に捕捉した分析物と共に集積してもよい。例えば、このような集積は、例えば、捕捉分析物は通過させないが第一の液体は通過させる分離装置に、第一の液体の捕捉分析物を流すことによって達成し得る。一旦集積されれば、捕捉分析物を、固体捕捉材料から捕捉分析物の分析物を溶出させる第二の液体に接触させて、遊離分析物を得てもよく、次いで遊離分析物を後段の分析技術又は分析法に使用してもよい。
【0010】
本発明の上記その他の態様は、以下の詳細な説明を参照すれば明らかとなろう。この目的のため、本願全体で、様々な文献を引用して本発明の特定の態様をさらに例示する。かかる文献の各々の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【0011】
【発明を実施するための形態】
上述の通り、本発明は、表面結合リガンドに結合した分析物を固体捕捉材料で捕捉するための方法に関する。第一の実施形態では、固体捕捉材料は、第一の液体の流れ中で運ばれ、表面結合リガンドが結合する表面は、検出表面又は非検出表面である。第二の実施形態では、固体捕捉材料は、第一の液体(流動性又は非流動性)中に存在し、表面結合リガンドが結合する表面は、バイオセンサーの表面である。
【0012】
第一の実施形態では、表面結合リガンドから分析物を解離させる第一の液体の流れに表面結合リガンドを接触させることによって分析物を表面結合リガンドから溶出させ、第一の液体の流れの中で遊離分析物を生成させることによって、表面結合リガンドに結合した分析物を捕捉するための方法について開示する。例えば、可溶化した生体分子の捕捉に用いられた表面(例えば、バイオセンサーでの分析物−リガンドの生体分子相互作用の「リアルタイム」モニタリング)は、その表面結合リガンドに結合した分析物を有する。分析物は、典型的には非共有結合力(例えば、静電及びルイス酸−ルイス塩基の力)によってリガンドに会合(例えば、結合)している。本発明に関しては、表面に結合した試薬を「表面結合リガンド」といい、表面結合リガンドに結合した試薬を「分析物」という。
【0013】
この目的のため、「リガンド」及び「分析物」という用語は、広く解釈されるべきであり、低分子から大きいタンパク質に至る多種多様な分子、並びに様々な相互作用対を包含する。例えば、代表的な分析物/リガンド相互作用対としては、以下のものが挙げられる(最初に分析物を記し、次いで括弧内に対応する分析物を記す):抗原(抗原特異的抗体)、抗原特異的抗体(抗原)、ホルモン(ホルモン受容体)、ホルモン受容体(ホルモン)、ポリヌクレオチド(相補的ポリヌクレオチド)、アビジン/ストレプトアビジン(ビオチン)、ビオチン(アビジン/ストレプトアビジン)、酵素(酵素基質又は阻害剤)、酵素基質又は阻害剤(酵素)、レクチン(特異的カルボキシハイドレート)、特異的カルボキシハイドレート(レクチン)、脂質(脂質結合タンパク質又は膜結合タンパク質)、脂質結合タンパク質又は膜結合タンパク質(脂質)、ポリヌクレオチド(ポリヌクレオチド結合タンパク質)、ポリヌクレオチド結合タンパク質(ポリヌクレオチド)、受容体(伝達物質)、伝達物質(受容体)、薬物(標的)、標的(薬物)、並びにより一般的な型の相互作用(例えば、タンパク質(タンパク質)、タンパク質(ポリヌクレオチド)、ポリヌクレオチド(タンパク質)、DNA(DNA)、DNA(RNA)、及びRNA(DNA)相互作用)。さらに、分析物は、単一源、天然化合物の混合物、遺伝子ライブラリー、mRNAもしくはタンパク質提示遺伝子ライブラリー、又は任意の種類の化学的ライブラリーに由来するものであってもよいと解される。
【0014】
従って、本発明の実施に際して、表面結合リガンドから分析物を解離させる第一の液体の流れに分析物を接触させることによって表面結合リガンドから分析物を溶出させる。こうした表面結合リガンドからの分析物の溶出又は解離は、任意の数の適切な溶出液又は再生溶液(本明細書中では「第一の液体」及び「第二の液体」という)の使用によって達成し得る。例えば、1種以上の酸性、塩基性、イオン性、有機界面活性剤又はキレート剤を含む水溶液を第一の液体及び第二の液体として使用し得る。かかる水溶液としては、Identification and Optimization of Regeneration Conditions for Affinity-Based Biosensor Assaysという題する報文(Andersson, K. et al., Anal. Chem. 71(13): 2475-81(1999年7月1日)に記載されたものが挙げられ、その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【0015】
さらに一般的には、文献で報告されているように、様々なクラスの分析物−リガンド系を以下の例示的条件下で解離させることができる。(1)抗体−抗原相互作用対−様々な濃度の塩酸(HCl)(Malmborg et al., Scandinavian Journal of Immunology 35: 643-50, 1992; Ward et al., Biochemistry International 26: 559-65, 1992)、或いは弱酸、代表的にはリン酸又はギ酸(Corr et al., Journal of Experimental Medicine 178: 1877-92, 1993; VanCott et al., Journal of Immunological Methods 183: 103-17, 1995)、或いは界面活性剤又はカオトロピック溶液(Tanchou et al., AIDS Research and Human Retroviruses 10: 983-93, 1994; End et al., Journal of Biological Chemistry 268: 10066-75, 1993)で様々な程度に解離させることができる。(2)受容体−伝達物質相互作用対−酸(Morelock et al., Journal of Medicinal Chemistry 38: 1309-18, 1995)、塩基(Lemmon et al., Journal of Biological Chemistry 269: 31653-58, 1994)、カオトロピック条件及び高イオン強度(Stitt et al., Cell 80: 661-70, 1995)、又は天然の解離条件下(Ma et al., Journal of Biological Chemistry 39: 24430-36, 1994)で解離させることができる。(3)DNA相互作用対−界面活性剤、EDTAを用いた非常に穏和な再生条件下或いは天然の解離条件下で(Cheskis et al., Molecular Endocrinology 1996; Casanovas et al., Journal of Biological Chemistry 270: 13216-24, 1995)解離させることができる。(4)糖タンパク質相互作用対−酸性条件下で又は糖溶液を使用して(Okazaki et al., Journal of Molecular Recognition 8: 95-99, 1995)解離させることができる。無論、表面結合リガンドから分析物を溶出するための正確な条件は、調べようとする系に依存する。しかし、このような条件は、当業者が容易に決定し得る。
【0016】
本発明の第一の実施形態では、第一の液体は、表面結合リガンドに流体接触する(本明細書中では「第一の液体の流れ」という)。第一の液体の流れを表面結合分析物と接触させるための適切な装置は当業者に公知であり、一般に流体送達システムといわれる。代表的な流体送達システムは、背景技術の欄で説明したBIAcore機器に使用される内蔵マイクロ流路カートリッジであり、表面に液体を正確にかつ制御可能に流すことができる。このような送達システムは、当業者に公知であり、例えば、米国特許第5,313,264号及び同第5,443,890号に記載されており、それらの開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【0017】
第一の液体の流れで運ばれるのは、固体捕捉材料であり、表面結合リガンドから溶出した遊離分析物を捕捉することができる。換言すれば、固体捕捉材料は、第一の液体の流れを表面結合リガンドと接触させる流路内を第一の液体と共に流れる。このようにして、固体捕捉材料は(典型的には吸着又は吸収によって)表面結合リガンドから溶出した表面結合リガンド近傍の分析物を捕捉して、非特異的結合(例えば、流路の壁面その他の構成要素への遊離分析物の結合)に起因する遊離分析物の損失量を低減させる。流路の寸法が通例小さいため、例示的な固体捕捉材料は典型的には小さな直径(例えば、2〜10μm)の分離ビーズからなる。さらに、固体捕捉材料は、一般に検討中の分析物−リガンド系に適するように選択される。すなわち、本材料は、溶出された分析物を容易に捕捉する種類のものとすべきである。この点に関して、これらのパラメーターを満たす多種多様な固体捕捉材料が存在する。
【0018】
上述の通り、例示的な固体分離材料は、分離ビーズ、例えば、液体カラム吸着クロマトグラフィーに使用さるクロマトグラフィービーズ、特に高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)に使用されるクロマトグラフィービーズである。ただし、本発明はクロマトグラフィービーズに限定されない。物理化学的性質に基づいて、溶液中の溶質の分離に適した任意の固体捕捉材料を使用し得る。従って、本発明の固体捕捉材料は、あらゆるクロマトグラフィー媒体、その他同様の性質を有する固体又は半固体担体(例えば、ポリマー系粒状固体担体)を包含する。従って、本発明に関して用いる「固体捕捉材料」という用語は、広義に解釈すべきであり、合成、半合成及び/又は天然の有機ポリマーで、表面結合リガンドから遊離した分析物を吸着する能力を有するポリマーからなるなる任意の固体又は半固体の担体を包含するとともに、同様の性質を有する各種の無機材料も包含する。ただし、好ましくは、本発明の固体捕捉材料は球形であり、非晶質構造を有するシリカゲル材料を含み、ある程度多孔質である。固体捕捉材料は、磁性ビーズ(特にMALDIのようなイオン化による後段での溶出に有用なもの)のような本質的に磁性のものであってもよい。さらに、当業者には自明であろうが、本発明の固体捕捉材料は、特に目的の遊離分析物を吸着するために、広範な化学官能基で誘導体化してもよい。これに関する具体例は、アガロース、デキストラン、ヒドロキシアパタイト、シリカ、ポリアクリルアミド、及び架橋型の親水性ポリマーからなるビーズ材料であり、ビーズ材料は、多孔質、非多孔質及び/又は稠密でもよい。
【0019】
従って、本発明の一つの態様では、固体捕捉材料は、第一の液体の流れで運ばれる分離ビーズである。一実施形態では、第一の液体の流れで運ばれる複数の分離ビーズは、バイオセンサーの1以上のフローセル(例えば、BIAcore機器のフローセル)を通して送液される。好ましくは、流速は、第一の液体の流れが層流となる速度である。当業者には自明であろうが、層流速度は、第一の液体の流れの中で運ばれる分離ビーズを中央に濃縮させる傾向がある(つまり、ビーズは一般に流路の中央を流れる傾向がある)。この現象(流体力学的絞り込み(hydrodynamic focusing)としても知られる)は、導管の壁が流体に及ぼする剪断力に起因する。剪断力は、流路の横断方向に流速の勾配を生じ、流れるビーズは、その両側で同等又は対称な流れ力をもつように中央を流れる傾向がある。
【0020】
本発明の第一の実施形態では、表面結合リガンドが結合する表面は、検出表面又は非検出表面のいずれでもよい。従って、本発明での検出表面は、バイオセンサーの検出表面であってもよく、かかる検出表面は、米国特許第5,436,161号(その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。)に記載されているように、密に充填された単層有機皮膜を表面に有する固体金属担体(例えば、金又は銀)を含む。検出表面はさらに、例えば、バイオセンサーと共に動作できるように単層有機皮膜に結合したヒドロゲル(例えば、デキストランのような多糖類)のような、生物適合性の多孔質マトリックスを含んでいてもよい。
【0021】
当業者には自明であろうが、バイオセンサーは、目的の分析物を有する少量のサンプル溶液を分析するための分析装置であり、分析物は、様々な検出法のいずれかを用いる検出装置で分析される。典型的には、かかる方法としては、質量検出法(例えば、圧電、光学、熱光学及び弾性表面波(SAW)装置法)、並びに電気化学的方法(例えば、電位差測定、電気伝導、電流測定及び電気容量法)が挙げられるが、これらに限定されない。最適な検出方法に関して、代表的な方法としては、質量表面濃度を検出する方法、例えば、内部及び外部反射法を始めとする反射−光学法、角度、波長又は位相分解法、例えば、偏光解析法及びエバネッセント波分光法(EWS)が挙げられ、後者には、表面プラズモン共鳴(SPR)分光、ブルースター偏光角屈折計、臨界角屈折計、フラストレート全反射法(FTR)、エバネッセント波偏光解析法、散乱全内部散乱反射(STIR)、光導波路センサー、エバネッセント波に基づくイメージング法、例えば、臨界角分解イメージング、ブルースター偏光角分解イメージング、SPR角分解イメージングなどがある。さらに、例えば、エバネッセント蛍光(TIRF)及びリン光に基づく光度測定法も、導波路干渉計と同様に、使用し得る。本発明の特定の態様については、以下でSPR技術を用いたBIAcore機器(Biacore社(スウェーデン、ウプサラ))に関連して説明するが、本発明は、かかるシステムに限定されない。
【0022】
本発明の第二の実施形態では、バイオセンサーの表面の表面結合リガンドから分析物を溶出して第一の液体中に遊離分析物を生成させ、第一の液体中の固体捕捉材料で遊離分析物を捕捉して、捕捉分析物を含む第一の液体を生成することによって、バイオセンサーの表面の表面結合リガンドに結合した分析物を捕捉するための方法について開示する。この実施形態は、第一の液体が、表面結合リガンドに接触する際に流動性又は非流動性の液体のいずれであってもよい点を除いて、上記で開示した通りに実施される。第一の液体が流動性の液体である限り、この実施形態は、第一の実施形態において表面結合リガンドが結合する表面がバイオセンサー表面であるという特定の態様を表し、上記で十分に説明した。対照的に、第一の液体が非流動性の液体である場合、第一の液体は、ストップフロー式液体送達技術を始めとする任意の数の手順及び/又は装置、並びにバイオセンサーの表面結合リガンドへの(又は離れた)第一の液体の単純な吸引によって、表面結合リガンドに接触させればよい。この実施形態では、固体捕捉材料は、遊離分析物を捕捉する時点では第一の液体中に存在するが、必ずしも第一の液体中で運ぶ必要はない。例えば、固体捕捉材料を、溶出工程後の第一の液体に添加してもよい。
【0023】
従って、本発明のこの態様では、「バイオセンサー」という用語は、第一の液体を表面結合リガンドに接触させるための流動系(例えば、BIAcore機器の内蔵マイクロ流路カートリッジ)を用いる分析的装置だけでなく、例えばキュベットの底の検出表面のように、第一の液体を検出表面に接触させるために非流動系を用いる分析装置も包含する。このように、本発明のこの態様は、流動式及び非流動式バイオセンサーシステムのいずれにも適用できる。
【0024】
本発明の第一及び第二の実施形態のいずれにおいても、遊離分析物を固体捕捉材料で捕捉して捕捉分析物(典型的には複数の捕捉分析物)を含む第一の液体を生成させた後に、捕捉分析物を、表面結合リガンドから離れた位置で集積させる。かかる集積は、例えば、固体捕捉材料(例えば、分離ビーズ)を捕捉するが、第一の液体は通過させるカラム(例えば、微量調製HPLCに用いられるカラム)を用いて達成し得る。例えば、第一の液体が表面結合リガンドに流体接触する実施形態では、カラムは、表面結合リガンドと接触した後で流出する第一の液体を受けるように出口に動作可能に接続すればよい。カラムは、固体分離ビーズを捕捉するが、第一の液体は通過させるように篩分ければよい。このようにして捕捉分析物を有する分離ビーズはカラム内に集積され、一方、第一の液体は排出される。
【0025】
ただし、集積工程は、カラムに限定されるものではなく、第一の液体から固体捕捉材料を少なくとも部分的に分離する任意の技術を本発明の実施に際して使用し得る。これに関する具体例は、固体捕捉材料を凝集させることのできる他の任意の装置、例えば、固体捕捉材料を沈降させることのできるデカント装置、固体捕捉材料から第一の液体を分離することのできる遠心分離装置、固体捕捉材料は通過させないが第一の液体は通過させる濾過装置、及び磁性ビーズを引き付ける装置である。
【0026】
さらに別の態様では、カラムその他の集積装置での集積の後、結合した分析物を溶出させるために、捕捉分析物を第二の液体に接触させてもよい。従って、一実施形態では、第二の液体を、複数の捕捉分析物を有するカラムに流して、分析物を遊離させてもよい。固体捕捉材料はカラム内に集積されているので、第二の溶出液中の遊離分析物は、通例、追加の分析測定(例えば、質量分析法)その他の用途(例えば、他の分析技術又は分析法)に有用な濃度である。第一の液体の選択と同様に、第二の液体の選択は、調べるべき系に依存する(すなわち、分析物と固体捕捉材料とのカップリング力の種類に依存する)。分析物−リガンド対の解離に関連して説明し通り、様々な分析物−固体捕捉材料の組合せに対する適切な溶出条件は、当業者が容易に決定し得る。
【0027】
さらに別の態様では、カラムその他の集積装置での集積の後、捕捉分析物を、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析に供してもよい。この実施形態では、固体捕捉材料は、適切なマトリックス(例えば、ニコチン酸又はシナピン酸)を含む外側表面を有し得る。一般に、このようなマトリックス上又はマトリックス中に捕捉された分析物は、当業者には明らかな通り、レーザー照射によるインタクトな脱離を起こしやすい。
【0028】
【実施例】
限定のためではなく、例示を目的として、以下の実施例を挙げる。
【0029】
実施例1
バイオセンサー機器:BIACORE(登録商標)3000(Biacore社(スウェーデン、ウプサラ)製)
センサーチップ:CM5(Biacore社(スウェーデン、ウプサラ)製)
カップリング試薬:アミンカップリングキット(Biacore社(スウェーデン、ウプサラ)製)
捕捉分子:HIVプロテアーゼ Q7K 981126(ウプサラ大学のHelena Danielsson博士から提供)
分析物:HIV阻害剤 サキナビル(Medivir社(スウェーデン)から提供)
捕捉媒体:RP2多孔質10μm径逆相媒体(Perseptive Biosystems社(米国カリフォルニア州)製)
溶出液:2%ギ酸(98〜100%ギ酸(PA Riedel de Haen社(ドイツ)製から調製)
質量分析計:Bruker Biflex III(商標)(Bruker Daltonics社(米国)製)
捕捉分子を、機器供給元のアミンカップリングに関する標準的なプロトコールを用いてセンサーチップに固定化し、BIACORE3000のフローセル4、3、2の逐次注入量のベースラインに比して、フローセル当たり4000RUの捕捉分析物を生じる。次いで分析物を注入し、上記で固定化した量のHIVプロテアーゼは、30〜100RUのHIV阻害剤を捕捉することができたが、これはフローセル当たり50〜150フェムトモルの阻害剤に相当する。
【0030】
捕捉分析物を、BIOCORE3000の「MICRORECOVER」コマンドを用いて注入した2%ギ酸中のクロマトグラフィービーズの2〜4%スラリーの4μlスラリーを使用して回収する。ビーズは、Gobom et al., J. Mass. Spectrom. 34: 105-116, 1999の記載に準拠してゲルローダーチップ中で平衡化し、次いで、MICRORECOVERの前に2%ギ酸約50μl中に分注する。捕捉分析物と共に回収したビーズを、次いで、前出のGobom他の記載に準拠して平衡化したRPCゲルと共にEppendorffピペットでゲルローダーチップの上に手作業で移す。次いで、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)中の5%アセトニトリル(ACN)での溶出を含む洗浄工程を実施した後、分析物を、前出のGobom他の記載に準拠して、α−シアノ桂皮酸で飽和した45%ACN/0.1%TFAでMALDIプローブチップ上に直接溶出する。回収した分析物の存在は、リフレクトロンモードのBruker Bifex III質量分析計で実施されるMALDI MSで検証する。
【0031】
実施例2
捕捉媒体として、Micromer(登録商標)−M C8,C18逆相、粒径8μmの磁性ビーズ(Micromod Partikeltechnologie社(ドイツ、ロストック)を使用する点を除いて、実施例1に記載の手順に従った。MICRORECOVERコマンドによるBIACORE 3000への注入の前に、クロマトグラフィー磁性ビーズを、回分法を用いた濾過によって、2%のギ酸中で平衡化する。次いで、平衡化したビーズの2〜4%スラリーを、2%のギ酸中で調製し、BIACORE 3000への注入のために自動サンプラーバイアルに移す。
【0032】
本発明を、本明細書に例示し説明した実施形態に関して説明してきたが、本発明は、その要旨又は本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の方法又は他の特定の形態に具体化することができる。従って、記載した実施形態は、いかなる点においても例示似すぎず、限定的なものではない。従って、本発明の技術的範囲は、発明の詳細な説明の記載ではなく、特許請求の範囲によって決まる。特許請求の範囲の文言及びその均等な範囲に属するあらゆる変更は、本発明の技術的範囲に属する。
【発明の名称】 表面結合リガンドから溶出された分析物を捕捉するための方法
【特許請求の範囲】
【請求項1】 表面結合リガンドに結合した分析物を捕捉するための方法であって、
表面結合リガンドから分析物を解離させる第一の液体の流れに表面結合リガンドを接触させることによって分析物を表面結合リガンドから溶出させ、第一の液体の流れの中で遊離分析物を生成させる溶出工程と、
第一の液体の中で運ばれる固体捕捉材料で遊離分析物を捕捉して、捕捉分析物を含む第一の液体の流れを生成する捕捉工程と、
上記表面結合リガンドから離れた位置へと捕捉分析物を送り、その位置で捕捉分析物を集積させる集積工程と
を含む、方法。
【請求項2】 前記表面結合リガンドに結合した分析物が、抗原(抗体)、抗体(抗原)、ホルモン(ホルモン受容体)、ホルモン受容体(ホルモン)、ポリヌクレオチド(相補的ポリヌクレオチド)、アビジン/ストレプトアビジン(ビオチン)、ビオチン(アビジン/ストレプトアビジン)、酵素(酵素基質)、酵素(酵素阻害剤)、酵素基質(酵素)、酵素阻害剤(酵素)、レクチン(カルボキシハイドレート)、カルボキシハイドレート(レクチン)、脂質(脂質結合タンパク質)、脂質(膜結合タンパク質)、脂質結合タンパク質(脂質)、膜結合タンパク質(脂質)、ポリヌクレオチド(ポリヌクレオチド結合タンパク質)、ポリヌクレオチド結合タンパク質(ポリヌクレオチド)、受容体(伝達物質)、伝達物質(受容体)、薬物(標的)、標的(薬物)、タンパク質(タンパク質)、タンパク質(ポリヌクレオチド)、ポリヌクレオチド(タンパク質)、DNA(DNA)、DNA(RNA)、及びRNA(DNA)からなる群から選択される分析物(リガンド)相互作用対である、請求項1に記載の方法。
【請求項3】 前記分析物(リガンド)相互作用対が抗原(抗体)相互作用対である、請求項2記載の方法。
【請求項4】 前記表面結合リガンドが結合した表面が検出表面である、請求項1乃至請求項3のいずれか1項記載の方法。
【請求項5】 前記表面結合リガンドが結合した表面が非検出表面である、請求項1乃至請求項のいずれか1項記載の方法。
【請求項6】 前記検出表面が親和性バイオセンサーの検出表面である、請求項4記載の方法。
【請求項7】 前記親和性分バイオセンサーが表面プラズモン共鳴バイオセンサーである、請求項6記載の方法。
【請求項8】 前記第一の液体の流れが表面結合リガンドと接触する際に層流である、請求項1乃至請求項7のいずれか1項記載の方法。
【請求項9】 前記第一の液体の流れが、1種以上の酸性、塩基性、イオン性、有機界面活性剤又はキレート剤を含む水溶液である、請求項1乃至請求項8のいずれか1項記載の方法。
【請求項10】 前記固体捕捉材料が分離ビーズである、請求項1乃至請求項9のいずれか1項記載の方法。
【請求項11】 前記分離ビーズが、アガロース、デキストラン、ヒドロキシアパタイト、シリカ、ポリアクリルアミド又は親水性ポリマーからなる、請求項10記載の方法。
【請求項12】 前記分離ビーズが磁性を有する、請求項10又は請求項11に記載の方法。
【請求項13】 前記分離ビーズが、直径2〜10μmの球形クロマトグラフィー媒体を含む、請求項10乃至請求項12のいずれか1項記載の方法。
【請求項14】 前記溶出工程及び前記接触工程がバイオセンサーの流路内で行われる、請求項1乃至請求項13のいずれか1項記載の方法。
【請求項15】 複数の分析物が複数の表面結合リガンドに結合しており、前記溶出工程で複数の遊離分析物を生成し、前記捕捉工程で複数の捕捉分析物を生成する、請求項1乃至請求項14のいずれか1項記載の方法。
【請求項16】 前記集積工程が、捕捉分析物と結合した固体捕捉材料は通過させないが、第一の液体の流れは通過させる分離装置に、第一の液体の流れ中の捕捉分析物を導き、もって捕捉分析物を集積する工程を含む、請求項15記載の方法。
【請求項17】 前記分離装置がカラムを含み、複数の捕捉分析物を含む第一の液体をカラムに流す、請求項16記載の方法。
【請求項18】 前記集積された捕捉分析物を、前記固体捕捉材料から分析物を解離させる第二の液体に接触させることによって、固体捕捉材料から複数の遊離分析物を溶出させる工程をさらに含む、請求項16又は請求項17記載の方法。
【請求項19】 前記第二の液体が、1種以上の酸性、塩基性、イオン性、有機界面活性剤又はキレート剤を含む水溶液である、請求項18記載の方法。
【請求項20】 前記固体捕捉材料から複数の遊離分析物を溶出させる工程が、捕捉分析物の集積に用いたカラムで行われる、請求項18又は請求項19記載の方法。
【請求項21】 前記第二の液体で溶出させた遊離分析物を回収する、請求項18乃至請求項20のいずれか1項記載の方法。
【請求項22】 前記回収した分析物を続いで分析に供する、請求項21記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【0001】
【技術分野】
本発明は一般に表面結合リガンドに結合した分析物を捕捉するための方法、さらに具体的には、表面結合リガンドから溶出した分析物を捕捉するための固体捕捉材料の使用に関する。
【0002】
【背景技術】
分子間の相互作用の特徴付け、特に生体分子の相互作用の検出のためのアッセイに、様々な分析技術が用いられている。例えば、抗体−抗原相互作用は、生物学、免疫学及び薬理学を始めとする多くの分野で基本的に重要なものである。これに関連して、多くの分析技術では、「リガンド」(例えば、抗体)を固体担体に結合させ、次いでリガンドを「分析物」(例えば、抗原)と接触させる。リガンドと分析物との結合後、相互作用の指標となる幾つかの特性(例えば、分析物に対するリガンドの結合能)について測定する。相互作用の測定後、リガンド−分析物対は、通例、追加の分析測定のために表面結合リガンドを再生させるため、溶出及び/又は再生溶液で解離させる。
【0003】
しかし、リガンド−分析物対から遊離した分析物は、一般には再使用されず、遊離分析物は溶出及び/又は再生溶液と共に処分されるのが一般的である。こうした慣行は望ましくない。研究者が有する分析測定用の分析物は限られた量しかないことが多く、分析物自体に関する追加の分析測定を行うことを研究者が望むことが多いからである。従って、本技術分野では、遊離分析物について後段での分析測定を行うことができるように、リガンド−分析物対から遊離した分析物を効果的に集積する必要がある。
【0004】
遊離分析物を後段での分析測定のために効果的に集積する必要性について、固体担体に結合したリガンドと分析物との相互作用を表面プラズモン共鳴(SPR)でモニターするバイオセンサーに関して例示する。これに関して、代表的な種類のバイオセンサー機器が、Biacore社(スウェーデン、ウプサラ)からBIAcore(登録商標)という商標で市販されている(以下、「BIAcore機器」という)。BIAcore機器は、発光ダイオード、金薄膜で覆われたセンサーチップ、内蔵マイクロ流路カートリッジ(integrated microfluidic cartridge)及び光検出器を含む。ダイオードからの入射光は金薄膜で反射され、光検出器によって検出される。表面プラズモン共鳴波は、特定の入射角(「SPR角」)で金の層に設定され、反射光の強度損失つまり「低下」として検出される。BIAcore機器の背景をなす理論的基礎は、文献に十分に記載されている(例えば、Joensson, U. et al., Biotechniques 11: 620-627 (1991)参照)。
【0005】
BIAcore機器を使用するSPR分析に加えて、研究者らは、SPR技術を他の分析技術と組み合わせたときの相乗効果を認識し始めている。これに関連して、BIAcore機器で得られるリアルタイム相互作用分析は、生体分子の構造及び機能の両方を調査するための他の公知の方法を補完する。例えば、SPRは最近、質量分析(すなわち、SPR−MS)と組み合わされ、生体分子の検査のための非常に強力な微量調製技術を提供する(例えば、国際公開第97/09608号参照)。SPR−MSに関連して、分析物は、質量分析による次の分析測定のために、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化によって表面結合リガンドから遊離される。
【0006】
次の分析測定のために表面結合リガンドから分析物を溶出させる際の問題の1つは、マイクロ流路カートリッジを通して溶出及び/又は再生溶液が流れる際に、分析物のかなりの量が、マイクロ流路カートリッジの壁面その他の構成要素への分析物の非特異的結合のため失われるおそれがあることである。さらに、一旦表面結合リガンドから溶出されてしまうと、次の分析のために十分なサンプルが存在するように分析物をさらに集積させる必要がある。従って、本技術分野では、表面結合リガンドに結合した生体分子を集積するための方法及び微量調製技術を改善するニーズが存在する。本発明は、これらのニーズを満たし、それに関連した追加の利点をもたらす。
【0007】
【発明の概要】
簡潔に述べると、本発明は、表面結合リガンドに結合した分析物を捕捉するための方法、並びに該分析物を集積するための方法に関する。一実施形態では、この方法は、表面結合リガンドから分析物を解離させる第一の液体の流れに表面結合リガンドを接触させることによって分析物を表面結合リガンドから溶出させ、第一の液体の流れの中で遊離分析物を生成させる工程を含む。遊離分析物を次いで第一の液体の中で運ばれる固体捕捉材料で捕捉し、捕捉分析物を含む第一の液体の流れを得る。表面結合リガンドが結合する表面は、バイオセンサーの検出表面のような検出表面であってもよいし、或いは非検出表面であってもよい。
【0008】
代替実施形態では、本方法は、バイオセンサーの表面の表面結合リガンドから分析物を解離させる第一の液体に表面結合リガンドを接触させることによって分析物を表面結合リガンドから溶出させ、第一の液体中で遊離分析物を生成させる工程を含む。遊離分析物を次いで第一の液体中の固体捕捉材料で捕捉し、捕捉分析物を含む第一の液体を得る。この実施形態では、表面結合リガンドが結合する表面はバイオセンサーの表面であり、第一の液体は流動性の液体であっても、非流動性の液体であってもよい。
【0009】
上記いずれの実施形態でも、捕捉分析物を、表面結合リガンドから離れた位置で、同様に捕捉した分析物と共に集積してもよい。例えば、このような集積は、例えば、捕捉分析物は通過させないが第一の液体は通過させる分離装置に、第一の液体の捕捉分析物を流すことによって達成し得る。一旦集積されれば、捕捉分析物を、固体捕捉材料から捕捉分析物の分析物を溶出させる第二の液体に接触させて、遊離分析物を得てもよく、次いで遊離分析物を後段の分析技術又は分析法に使用してもよい。
【0010】
本発明の上記その他の態様は、以下の詳細な説明を参照すれば明らかとなろう。この目的のため、本願全体で、様々な文献を引用して本発明の特定の態様をさらに例示する。かかる文献の各々の開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【0011】
【発明を実施するための形態】
上述の通り、本発明は、表面結合リガンドに結合した分析物を固体捕捉材料で捕捉するための方法に関する。第一の実施形態では、固体捕捉材料は、第一の液体の流れ中で運ばれ、表面結合リガンドが結合する表面は、検出表面又は非検出表面である。第二の実施形態では、固体捕捉材料は、第一の液体(流動性又は非流動性)中に存在し、表面結合リガンドが結合する表面は、バイオセンサーの表面である。
【0012】
第一の実施形態では、表面結合リガンドから分析物を解離させる第一の液体の流れに表面結合リガンドを接触させることによって分析物を表面結合リガンドから溶出させ、第一の液体の流れの中で遊離分析物を生成させることによって、表面結合リガンドに結合した分析物を捕捉するための方法について開示する。例えば、可溶化した生体分子の捕捉に用いられた表面(例えば、バイオセンサーでの分析物−リガンドの生体分子相互作用の「リアルタイム」モニタリング)は、その表面結合リガンドに結合した分析物を有する。分析物は、典型的には非共有結合力(例えば、静電及びルイス酸−ルイス塩基の力)によってリガンドに会合(例えば、結合)している。本発明に関しては、表面に結合した試薬を「表面結合リガンド」といい、表面結合リガンドに結合した試薬を「分析物」という。
【0013】
この目的のため、「リガンド」及び「分析物」という用語は、広く解釈されるべきであり、低分子から大きいタンパク質に至る多種多様な分子、並びに様々な相互作用対を包含する。例えば、代表的な分析物/リガンド相互作用対としては、以下のものが挙げられる(最初に分析物を記し、次いで括弧内に対応する分析物を記す):抗原(抗原特異的抗体)、抗原特異的抗体(抗原)、ホルモン(ホルモン受容体)、ホルモン受容体(ホルモン)、ポリヌクレオチド(相補的ポリヌクレオチド)、アビジン/ストレプトアビジン(ビオチン)、ビオチン(アビジン/ストレプトアビジン)、酵素(酵素基質又は阻害剤)、酵素基質又は阻害剤(酵素)、レクチン(特異的カルボキシハイドレート)、特異的カルボキシハイドレート(レクチン)、脂質(脂質結合タンパク質又は膜結合タンパク質)、脂質結合タンパク質又は膜結合タンパク質(脂質)、ポリヌクレオチド(ポリヌクレオチド結合タンパク質)、ポリヌクレオチド結合タンパク質(ポリヌクレオチド)、受容体(伝達物質)、伝達物質(受容体)、薬物(標的)、標的(薬物)、並びにより一般的な型の相互作用(例えば、タンパク質(タンパク質)、タンパク質(ポリヌクレオチド)、ポリヌクレオチド(タンパク質)、DNA(DNA)、DNA(RNA)、及びRNA(DNA)相互作用)。さらに、分析物は、単一源、天然化合物の混合物、遺伝子ライブラリー、mRNAもしくはタンパク質提示遺伝子ライブラリー、又は任意の種類の化学的ライブラリーに由来するものであってもよいと解される。
【0014】
従って、本発明の実施に際して、表面結合リガンドから分析物を解離させる第一の液体の流れに分析物を接触させることによって表面結合リガンドから分析物を溶出させる。こうした表面結合リガンドからの分析物の溶出又は解離は、任意の数の適切な溶出液又は再生溶液(本明細書中では「第一の液体」及び「第二の液体」という)の使用によって達成し得る。例えば、1種以上の酸性、塩基性、イオン性、有機界面活性剤又はキレート剤を含む水溶液を第一の液体及び第二の液体として使用し得る。かかる水溶液としては、Identification and Optimization of Regeneration Conditions for Affinity-Based Biosensor Assaysという題する報文(Andersson, K. et al., Anal. Chem. 71(13): 2475-81(1999年7月1日)に記載されたものが挙げられ、その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【0015】
さらに一般的には、文献で報告されているように、様々なクラスの分析物−リガンド系を以下の例示的条件下で解離させることができる。(1)抗体−抗原相互作用対−様々な濃度の塩酸(HCl)(Malmborg et al., Scandinavian Journal of Immunology 35: 643-50, 1992; Ward et al., Biochemistry International 26: 559-65, 1992)、或いは弱酸、代表的にはリン酸又はギ酸(Corr et al., Journal of Experimental Medicine 178: 1877-92, 1993; VanCott et al., Journal of Immunological Methods 183: 103-17, 1995)、或いは界面活性剤又はカオトロピック溶液(Tanchou et al., AIDS Research and Human Retroviruses 10: 983-93, 1994; End et al., Journal of Biological Chemistry 268: 10066-75, 1993)で様々な程度に解離させることができる。(2)受容体−伝達物質相互作用対−酸(Morelock et al., Journal of Medicinal Chemistry 38: 1309-18, 1995)、塩基(Lemmon et al., Journal of Biological Chemistry 269: 31653-58, 1994)、カオトロピック条件及び高イオン強度(Stitt et al., Cell 80: 661-70, 1995)、又は天然の解離条件下(Ma et al., Journal of Biological Chemistry 39: 24430-36, 1994)で解離させることができる。(3)DNA相互作用対−界面活性剤、EDTAを用いた非常に穏和な再生条件下或いは天然の解離条件下で(Cheskis et al., Molecular Endocrinology 1996; Casanovas et al., Journal of Biological Chemistry 270: 13216-24, 1995)解離させることができる。(4)糖タンパク質相互作用対−酸性条件下で又は糖溶液を使用して(Okazaki et al., Journal of Molecular Recognition 8: 95-99, 1995)解離させることができる。無論、表面結合リガンドから分析物を溶出するための正確な条件は、調べようとする系に依存する。しかし、このような条件は、当業者が容易に決定し得る。
【0016】
本発明の第一の実施形態では、第一の液体は、表面結合リガンドに流体接触する(本明細書中では「第一の液体の流れ」という)。第一の液体の流れを表面結合分析物と接触させるための適切な装置は当業者に公知であり、一般に流体送達システムといわれる。代表的な流体送達システムは、背景技術の欄で説明したBIAcore機器に使用される内蔵マイクロ流路カートリッジであり、表面に液体を正確にかつ制御可能に流すことができる。このような送達システムは、当業者に公知であり、例えば、米国特許第5,313,264号及び同第5,443,890号に記載されており、それらの開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。
【0017】
第一の液体の流れで運ばれるのは、固体捕捉材料であり、表面結合リガンドから溶出した遊離分析物を捕捉することができる。換言すれば、固体捕捉材料は、第一の液体の流れを表面結合リガンドと接触させる流路内を第一の液体と共に流れる。このようにして、固体捕捉材料は(典型的には吸着又は吸収によって)表面結合リガンドから溶出した表面結合リガンド近傍の分析物を捕捉して、非特異的結合(例えば、流路の壁面その他の構成要素への遊離分析物の結合)に起因する遊離分析物の損失量を低減させる。流路の寸法が通例小さいため、例示的な固体捕捉材料は典型的には小さな直径(例えば、2〜10μm)の分離ビーズからなる。さらに、固体捕捉材料は、一般に検討中の分析物−リガンド系に適するように選択される。すなわち、本材料は、溶出された分析物を容易に捕捉する種類のものとすべきである。この点に関して、これらのパラメーターを満たす多種多様な固体捕捉材料が存在する。
【0018】
上述の通り、例示的な固体分離材料は、分離ビーズ、例えば、液体カラム吸着クロマトグラフィーに使用さるクロマトグラフィービーズ、特に高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)に使用されるクロマトグラフィービーズである。ただし、本発明はクロマトグラフィービーズに限定されない。物理化学的性質に基づいて、溶液中の溶質の分離に適した任意の固体捕捉材料を使用し得る。従って、本発明の固体捕捉材料は、あらゆるクロマトグラフィー媒体、その他同様の性質を有する固体又は半固体担体(例えば、ポリマー系粒状固体担体)を包含する。従って、本発明に関して用いる「固体捕捉材料」という用語は、広義に解釈すべきであり、合成、半合成及び/又は天然の有機ポリマーで、表面結合リガンドから遊離した分析物を吸着する能力を有するポリマーからなるなる任意の固体又は半固体の担体を包含するとともに、同様の性質を有する各種の無機材料も包含する。ただし、好ましくは、本発明の固体捕捉材料は球形であり、非晶質構造を有するシリカゲル材料を含み、ある程度多孔質である。固体捕捉材料は、磁性ビーズ(特にMALDIのようなイオン化による後段での溶出に有用なもの)のような本質的に磁性のものであってもよい。さらに、当業者には自明であろうが、本発明の固体捕捉材料は、特に目的の遊離分析物を吸着するために、広範な化学官能基で誘導体化してもよい。これに関する具体例は、アガロース、デキストラン、ヒドロキシアパタイト、シリカ、ポリアクリルアミド、及び架橋型の親水性ポリマーからなるビーズ材料であり、ビーズ材料は、多孔質、非多孔質及び/又は稠密でもよい。
【0019】
従って、本発明の一つの態様では、固体捕捉材料は、第一の液体の流れで運ばれる分離ビーズである。一実施形態では、第一の液体の流れで運ばれる複数の分離ビーズは、バイオセンサーの1以上のフローセル(例えば、BIAcore機器のフローセル)を通して送液される。好ましくは、流速は、第一の液体の流れが層流となる速度である。当業者には自明であろうが、層流速度は、第一の液体の流れの中で運ばれる分離ビーズを中央に濃縮させる傾向がある(つまり、ビーズは一般に流路の中央を流れる傾向がある)。この現象(流体力学的絞り込み(hydrodynamic focusing)としても知られる)は、導管の壁が流体に及ぼする剪断力に起因する。剪断力は、流路の横断方向に流速の勾配を生じ、流れるビーズは、その両側で同等又は対称な流れ力をもつように中央を流れる傾向がある。
【0020】
本発明の第一の実施形態では、表面結合リガンドが結合する表面は、検出表面又は非検出表面のいずれでもよい。従って、本発明での検出表面は、バイオセンサーの検出表面であってもよく、かかる検出表面は、米国特許第5,436,161号(その開示内容は援用によって本明細書の内容の一部をなす。)に記載されているように、密に充填された単層有機皮膜を表面に有する固体金属担体(例えば、金又は銀)を含む。検出表面はさらに、例えば、バイオセンサーと共に動作できるように単層有機皮膜に結合したヒドロゲル(例えば、デキストランのような多糖類)のような、生物適合性の多孔質マトリックスを含んでいてもよい。
【0021】
当業者には自明であろうが、バイオセンサーは、目的の分析物を有する少量のサンプル溶液を分析するための分析装置であり、分析物は、様々な検出法のいずれかを用いる検出装置で分析される。典型的には、かかる方法としては、質量検出法(例えば、圧電、光学、熱光学及び弾性表面波(SAW)装置法)、並びに電気化学的方法(例えば、電位差測定、電気伝導、電流測定及び電気容量法)が挙げられるが、これらに限定されない。最適な検出方法に関して、代表的な方法としては、質量表面濃度を検出する方法、例えば、内部及び外部反射法を始めとする反射−光学法、角度、波長又は位相分解法、例えば、偏光解析法及びエバネッセント波分光法(EWS)が挙げられ、後者には、表面プラズモン共鳴(SPR)分光、ブルースター偏光角屈折計、臨界角屈折計、フラストレート全反射法(FTR)、エバネッセント波偏光解析法、散乱全内部散乱反射(STIR)、光導波路センサー、エバネッセント波に基づくイメージング法、例えば、臨界角分解イメージング、ブルースター偏光角分解イメージング、SPR角分解イメージングなどがある。さらに、例えば、エバネッセント蛍光(TIRF)及びリン光に基づく光度測定法も、導波路干渉計と同様に、使用し得る。本発明の特定の態様については、以下でSPR技術を用いたBIAcore機器(Biacore社(スウェーデン、ウプサラ))に関連して説明するが、本発明は、かかるシステムに限定されない。
【0022】
本発明の第二の実施形態では、バイオセンサーの表面の表面結合リガンドから分析物を溶出して第一の液体中に遊離分析物を生成させ、第一の液体中の固体捕捉材料で遊離分析物を捕捉して、捕捉分析物を含む第一の液体を生成することによって、バイオセンサーの表面の表面結合リガンドに結合した分析物を捕捉するための方法について開示する。この実施形態は、第一の液体が、表面結合リガンドに接触する際に流動性又は非流動性の液体のいずれであってもよい点を除いて、上記で開示した通りに実施される。第一の液体が流動性の液体である限り、この実施形態は、第一の実施形態において表面結合リガンドが結合する表面がバイオセンサー表面であるという特定の態様を表し、上記で十分に説明した。対照的に、第一の液体が非流動性の液体である場合、第一の液体は、ストップフロー式液体送達技術を始めとする任意の数の手順及び/又は装置、並びにバイオセンサーの表面結合リガンドへの(又は離れた)第一の液体の単純な吸引によって、表面結合リガンドに接触させればよい。この実施形態では、固体捕捉材料は、遊離分析物を捕捉する時点では第一の液体中に存在するが、必ずしも第一の液体中で運ぶ必要はない。例えば、固体捕捉材料を、溶出工程後の第一の液体に添加してもよい。
【0023】
従って、本発明のこの態様では、「バイオセンサー」という用語は、第一の液体を表面結合リガンドに接触させるための流動系(例えば、BIAcore機器の内蔵マイクロ流路カートリッジ)を用いる分析的装置だけでなく、例えばキュベットの底の検出表面のように、第一の液体を検出表面に接触させるために非流動系を用いる分析装置も包含する。このように、本発明のこの態様は、流動式及び非流動式バイオセンサーシステムのいずれにも適用できる。
【0024】
本発明の第一及び第二の実施形態のいずれにおいても、遊離分析物を固体捕捉材料で捕捉して捕捉分析物(典型的には複数の捕捉分析物)を含む第一の液体を生成させた後に、捕捉分析物を、表面結合リガンドから離れた位置で集積させる。かかる集積は、例えば、固体捕捉材料(例えば、分離ビーズ)を捕捉するが、第一の液体は通過させるカラム(例えば、微量調製HPLCに用いられるカラム)を用いて達成し得る。例えば、第一の液体が表面結合リガンドに流体接触する実施形態では、カラムは、表面結合リガンドと接触した後で流出する第一の液体を受けるように出口に動作可能に接続すればよい。カラムは、固体分離ビーズを捕捉するが、第一の液体は通過させるように篩分ければよい。このようにして捕捉分析物を有する分離ビーズはカラム内に集積され、一方、第一の液体は排出される。
【0025】
ただし、集積工程は、カラムに限定されるものではなく、第一の液体から固体捕捉材料を少なくとも部分的に分離する任意の技術を本発明の実施に際して使用し得る。これに関する具体例は、固体捕捉材料を凝集させることのできる他の任意の装置、例えば、固体捕捉材料を沈降させることのできるデカント装置、固体捕捉材料から第一の液体を分離することのできる遠心分離装置、固体捕捉材料は通過させないが第一の液体は通過させる濾過装置、及び磁性ビーズを引き付ける装置である。
【0026】
さらに別の態様では、カラムその他の集積装置での集積の後、結合した分析物を溶出させるために、捕捉分析物を第二の液体に接触させてもよい。従って、一実施形態では、第二の液体を、複数の捕捉分析物を有するカラムに流して、分析物を遊離させてもよい。固体捕捉材料はカラム内に集積されているので、第二の溶出液中の遊離分析物は、通例、追加の分析測定(例えば、質量分析法)その他の用途(例えば、他の分析技術又は分析法)に有用な濃度である。第一の液体の選択と同様に、第二の液体の選択は、調べるべき系に依存する(すなわち、分析物と固体捕捉材料とのカップリング力の種類に依存する)。分析物−リガンド対の解離に関連して説明し通り、様々な分析物−固体捕捉材料の組合せに対する適切な溶出条件は、当業者が容易に決定し得る。
【0027】
さらに別の態様では、カラムその他の集積装置での集積の後、捕捉分析物を、マトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析に供してもよい。この実施形態では、固体捕捉材料は、適切なマトリックス(例えば、ニコチン酸又はシナピン酸)を含む外側表面を有し得る。一般に、このようなマトリックス上又はマトリックス中に捕捉された分析物は、当業者には明らかな通り、レーザー照射によるインタクトな脱離を起こしやすい。
【0028】
【実施例】
限定のためではなく、例示を目的として、以下の実施例を挙げる。
【0029】
実施例1
バイオセンサー機器:BIACORE(登録商標)3000(Biacore社(スウェーデン、ウプサラ)製)
センサーチップ:CM5(Biacore社(スウェーデン、ウプサラ)製)
カップリング試薬:アミンカップリングキット(Biacore社(スウェーデン、ウプサラ)製)
捕捉分子:HIVプロテアーゼ Q7K 981126(ウプサラ大学のHelena Danielsson博士から提供)
分析物:HIV阻害剤 サキナビル(Medivir社(スウェーデン)から提供)
捕捉媒体:RP2多孔質10μm径逆相媒体(Perseptive Biosystems社(米国カリフォルニア州)製)
溶出液:2%ギ酸(98〜100%ギ酸(PA Riedel de Haen社(ドイツ)製から調製)
質量分析計:Bruker Biflex III(商標)(Bruker Daltonics社(米国)製)
捕捉分子を、機器供給元のアミンカップリングに関する標準的なプロトコールを用いてセンサーチップに固定化し、BIACORE3000のフローセル4、3、2の逐次注入量のベースラインに比して、フローセル当たり4000RUの捕捉分析物を生じる。次いで分析物を注入し、上記で固定化した量のHIVプロテアーゼは、30〜100RUのHIV阻害剤を捕捉することができたが、これはフローセル当たり50〜150フェムトモルの阻害剤に相当する。
【0030】
捕捉分析物を、BIOCORE3000の「MICRORECOVER」コマンドを用いて注入した2%ギ酸中のクロマトグラフィービーズの2〜4%スラリーの4μlスラリーを使用して回収する。ビーズは、Gobom et al., J. Mass. Spectrom. 34: 105-116, 1999の記載に準拠してゲルローダーチップ中で平衡化し、次いで、MICRORECOVERの前に2%ギ酸約50μl中に分注する。捕捉分析物と共に回収したビーズを、次いで、前出のGobom他の記載に準拠して平衡化したRPCゲルと共にEppendorffピペットでゲルローダーチップの上に手作業で移す。次いで、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)中の5%アセトニトリル(ACN)での溶出を含む洗浄工程を実施した後、分析物を、前出のGobom他の記載に準拠して、α−シアノ桂皮酸で飽和した45%ACN/0.1%TFAでMALDIプローブチップ上に直接溶出する。回収した分析物の存在は、リフレクトロンモードのBruker Bifex III質量分析計で実施されるMALDI MSで検証する。
【0031】
実施例2
捕捉媒体として、Micromer(登録商標)−M C8,C18逆相、粒径8μmの磁性ビーズ(Micromod Partikeltechnologie社(ドイツ、ロストック)を使用する点を除いて、実施例1に記載の手順に従った。MICRORECOVERコマンドによるBIACORE 3000への注入の前に、クロマトグラフィー磁性ビーズを、回分法を用いた濾過によって、2%のギ酸中で平衡化する。次いで、平衡化したビーズの2〜4%スラリーを、2%のギ酸中で調製し、BIACORE 3000への注入のために自動サンプラーバイアルに移す。
【0032】
本発明を、本明細書に例示し説明した実施形態に関して説明してきたが、本発明は、その要旨又は本質的特徴から逸脱することなく、他の特定の方法又は他の特定の形態に具体化することができる。従って、記載した実施形態は、いかなる点においても例示似すぎず、限定的なものではない。従って、本発明の技術的範囲は、発明の詳細な説明の記載ではなく、特許請求の範囲によって決まる。特許請求の範囲の文言及びその均等な範囲に属するあらゆる変更は、本発明の技術的範囲に属する。
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