JP2012010664A - 細胞分析装置 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明は、特定の標的分子と結合する機能を持った捕獲領域に標的分子を結合させ、その結果として発生する細管のイオン流のインピーダンス変化を継続して計測する機能と、上記、捕獲領域に結合した標的分子を一定の周期でリリースさせる手段を有する細胞分析装置を提供する。
【選択図】図1
Description
すなわち、本発明者らは、このような細管表面またはチップ表面(捕獲領域)に特定の分泌物を捕獲することができる捕獲物質を固定し、この捕獲物質と特定の分泌物との特異的結合によって細管を流れるイオン流のインピーダンスの変化を検出し、かつ、一定時間のインターバルで表面に結合した分泌物を除去して初期状態に戻すことを繰り返すことで、特定の分泌物の存在を継続して計測し同定する手法および装置、あるいは表面に結合した分泌物を表面に固定した物質からリリースし、リリースされる分泌物の総量を計測することで、特定の分泌物の存在を継続して計測し同定する手法および装置を開発した。
標的分子を分泌する細胞および緩衝液を保持するための容器と、
上記容器内の上記緩衝液に一方の開口部が接するように配された細管であって、該細管内に上記緩衝液を通過させてその通過する該緩衝液中の上記標的分子の量的変化を計測する手段を備えた細管と、
上記細管の上記緩衝液に接する上記開口部近傍に配された、上記標的分子を特異的に結合する標的分子結合表面を備えた捕獲領域と、
上記捕獲領域に関連して配された、上記標的分子結合表面に結合した上記標的分子を一定時間の周期でリリースする手段とを備え、
上記標的分子の量的変化を計測する手段が、以下の(i)〜(iii):
(i) 上記標的分子結合表面に上記標的分子が結合することによって変化する上記細管内外のインピーダンスの変化または光散乱もしくは光吸収を含む光強度の変化を測定すること、
(ii) 上記リリースする手段により上記標的分子結合表面から上記標的分子がリリースされることによって生じる上記細管内外のインピーダンスの変化または光散乱もしくは光吸収を含む光強度の変化を計測すること、または
(iii) 上記細管を上記標的分子が通過することによって生じる上記細管内外のインピーダンスの変化を計測すること、
のいずれかまたはその組合せによって上記標的分子数を計測する、細胞解析装置システム。
[2]上記容器内に一個の細胞、または複数の細胞が2次元に平面上に培養され保持されている、上記[1]に記載の装置システム。
[3]上記標的分子結合表面が、1細胞レベルのサイズである、上記[1]または[2]に記載の装置システム。
[4]さらに、上記標的分子結合表面および上記細管の位置を1細胞レベルの空間分解能で3次元的に調節することが可能な位置制御手段を備える、上記[1]〜[3]のいずれかに記載の装置システム。
[5]上記標的分子結合表面に、上記標的分子と特異的な結合能力を持ったDNAもしくはRNAまたはこれらに硫黄イオンを付加して酵素による分解を抑制した核酸鎖断片の一端が固定されている、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の装置システム。
[6]上記標的分子結合表面に、上記標的分子と特異的な結合能力を持った抗体の一端が固定されている、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の装置システム。
[7]上記標的分子結合表面に、上記標的分子と特異的な結合能力を持った高分子(macromolecule)の一端が固定されている、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の装置システム。
[8]上記標的分子結合表面に結合した上記標的分子を一定時間の周期でリリースする手段が、上記表面を加熱する手段を含む、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の装置システム。
[9]上記加熱手段として電気抵抗によって上記表面を発熱させる手段を含む、上記[8]に記載の装置システム。
[10]上記加熱手段として、上記表面の加熱したい領域に光吸収が他の領域より高い物質からなり、ここへの光吸収によって上記表面を発熱させる手段を含む、上記[8]に記載の装置システム。
[11]上記標的分子結合表面に結合した上記標的分子を一定時間の周期でリリースする手段が、上記表面に高周波電場を印加する手段を含む、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の装置システム。
[12]上記緩衝液を通過させてその通過する該緩衝液中の上記標的分子の量的変化を計測する手段が、上記細管を通過するイオン電流の電気的インピーダンス変化を計測することによって上記細管を通過する上記標的分子数を計測する手段である、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の装置システム。
[13]上記緩衝液を通過させてその通過する該緩衝液中の上記標的分子の量的変化を計測する手段が、上記標的分子が上記細管を通過するときに発生する光学的散乱または吸収の量的変化を計測することによって上記細管を通過する上記標的分子数を計測する手段である、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の装置システム。
[14]上記標的分子結合表面を備えた上記捕獲領域が、2つ以上の複数の上記標的分子について、それぞれについて1領域として複数の領域が基板上に配置されたものであり、かつ、各領域に各々独立して熱を発生させて、1領域単位で上記標的分子をリリースする手段を備える、上記[1]〜[4]のいずれかに記載の装置システム。
[15]細胞からの分泌物の時間的空間的分解能を持った定量解析方法であって、
細胞からの分泌物のうち標的分子のみを微小領域に固定する工程、
上記標的分子が固定されたことを経時的に定量的に検出する工程、
上記微小領域に結合した上記標的分子を、一定の時間周期で該微小領域からリリースする工程、
を含み、
上記細胞からの分泌物を同定する、解析方法。
[16]細胞からの分泌物の時間的空間的分解能を持った定量解析方法であって、
細胞からの分泌物のうち標的分子のみを微小領域に固定する工程、
上記微小領域に結合した上記標的分子を、一定の時間周期で微小領域からリリースする工程、
リリースされた物質の量を定量的に計測する工程、
を含み、
上記細胞からの分泌物を同定する、解析方法。
[17]上記微小領域に結合した上記標的分子をリリースするために一定の時間周期で、上記標的分子がリリースされる最短の時間だけ熱を加える工程を含む、上記[15]または[16]に記載の方法。
[18]上記微小領域に結合した標的分子をリリースするために一定の時間周期で、上記標的分子がリリースされる最短の時間だけ高周波電場を加える工程を有する、上記[15]または[16]に記載の方法。
[19]上記標的分子の量を見積もるために上記細管を通過するイオン電流のインピーダンス変化計測を用いる、上記[15]または[16]に記載の方法。
[20]上記標的分子の量を見積もるためにリリースされた上記標的分子の光学的散乱または吸収などの光学的強度変化計測を用いる、上記[15]または[16]に記載の方法。
(1)標的物質を選択的に固定する表面を持つ細胞分泌物の空間分布を見積もるのに十分な小さな捕獲領域を持つ固定層、
(2)捕獲領域に結合した標的物質の量を時間的な変化として計測する手段、
(3)時間的に特定の周期で繰り返し上記捕獲領域に結合した標的物質をリリースする手段、
(4)上記、捕獲領域の位置を特定の細胞の分泌物計測を可能にするために3次元で位置の制御することができ、かつ、その位置を計測中は維持することができる手段を備える。
本明細書において、「生体分子」とは、核酸、mRNAなどのRNA、アミノ酸、ジペプチド、トリペプチドなどのオリゴペプチド、タンパク質などのポリペプチド、単糖、2単糖やオリゴ糖、多糖類などの糖類、ステロイドなどのホルモン類、ノルアドレナリン、ドーパミン、セロトニンなどの神経伝達物質、そのほか内分泌攪乱剤、各種薬剤、カリウム、ナトリウム、塩化物イオン、水素イオンなど生命現象にかかわる任意の生化学物質を指す。
(2−1)標的物質が捕獲領域に結合することで変化するイオン電流量または光散乱光もしくは吸収などの光強度変化を計測する手段、
あるいは
(2−2)捕獲領域に結合した標的物質を(3)の手段によってリリースするときに、そのリリースされた物質の量を、リリース直後のイオン電流量または光散乱もしくは光吸収などの光強度変化を計測することで見積もる手段、
の2つの手段のいずれか、あるいはその両方を用いることができる。
図1は本発明のうち電気特性を利用した細胞分析装置の実施例のひとつを示す概念図である。細管(例えば、ガラス製)101において、検出部である細管先端開口部の直径は100〜150nm前後に絞られ、また肉厚も薄いものとされている。細管の先端開口部以外の肉厚は太くても良い。細管101の先端部分を細くする方法は既存の方法で十分対応できる。たとえば、高周波加熱しながらフューズドシリカチューブを伸ばすことで先端部分を細くすると同時に先端部の肉厚を薄いものにできる。
図1の装置システムにおいて、捕獲領域108を細管入り口に配置し、標的分子の捕獲領域への結合によって細管のインピーダンス変化を計測する実施例の一つを示したが、図2は、細管入り口近傍に、捕獲領域1081を配置し、ここへの標的分子の結合は細管のインピーダンス変化をもたらさないが、周期的な捕獲領域からの標識分子のリリースによって、細管のインピーダンスが急激に変化することで、この変化量から、捕獲領域に結合していた標的分子の量を見積もる手法の一例を示したものである。また、技術面についても、捕獲領域表面の加熱手段として図1の場合には、電気的な加熱手段を用いたのに対して、図2では光吸収を用いた場合の一例を示している。ここでは、細管が光伝導性を持っていることを利用して、細管101に、外部から加熱用赤外レーザー光源201の光を光ファイバー202によって導入し、上記、加熱用赤外レーザー光源からの波長の光に強い吸収特性を持つ素材からなる、捕獲領域1081において熱を発生させることで、捕獲領域1081に結合した標的分子をリリースするものである。例えば、利用する加熱用波長として、水やたんぱく質の吸収が無い1064nmのレーザーを用い、捕獲領域には、可視光領域で吸収が無く、かつ1064nmに対しては強い吸収を持つITOを用いればよい。特に可視光領域でも吸収があっても良い場合には、捕獲領域にはクロム等の金属酸化物の層を付加すれば、これが強い吸収を持って、これら吸収層を持つ領域のみで特異的に光が熱に効率的に変換される。このような捕獲領域1081は、細管101の開口部先端部にITO、金属酸化物などを蒸着させる(例えば、スパッタリング、真空蒸着、ゾル・ゲル法、クラスタービーム法、PLDなどを用いて)ことで設けることができる。あるいは、表面にITOや金属酸化物の皮膜を形成した微小な基板(例:ガラス基板)を細管101開口部近傍に設けることで作製することができる。
102 計測用電極
103 検出装置
104 容器
105 加熱用電極
1051 電源
106 検出対象の標的分子
107 標的分子とは異なる分泌分子
108 捕獲領域
1081 捕獲領域
109 細胞
201 加熱用赤外レーザー光源
202,204 光ファイバー
203 レーザー光源
205 光学レンズ
206 光検出器
301 細胞からの分泌開始時間
302 細胞からの分泌終了時間
303 捕獲領域からの標的分子のリリースの時間
311、312、313、314 グラフ
321、322、323、324 グラフ
401 基板
402 捕獲領域
403 標的分子との結合部分
404 配線
Claims (20)
- 細胞からの分泌物中の標的分子を測定する細胞解析装置システムであって、
標的分子を分泌する細胞および緩衝液を保持するための容器と、
前記容器内の前記緩衝液に一方の開口部が接するように配された細管であって、該細管内に前記緩衝液を通過させてその通過する該緩衝液中の前記標的分子の量的変化を計測する手段を備えた細管と、
前記細管の前記緩衝液に接する前記開口部近傍に配された、前記標的分子を特異的に結合する標的分子結合表面を備えた捕獲領域と、
前記捕獲領域に関連して配された、前記標的分子結合表面に結合した前記標的分子を一定時間の周期でリリースする手段とを備え、
前記標的分子の量的変化を計測する手段が、以下の(i)〜(iii):
(i) 前記標的分子結合表面に前記標的分子が結合することによって変化する前記細管内外のインピーダンスの変化または光散乱もしくは光吸収を含む光強度の変化を測定すること、
(ii) 前記リリースする手段により前記標的分子結合表面から前記標的分子がリリースされることによって生じる前記細管内外のインピーダンスの変化または光散乱もしくは光吸収を含む光強度の変化を計測すること、または
(iii) 前記細管を前記標的分子が通過することによって生じる前記細管内外のインピーダンスの変化を計測すること、
のいずれかまたはその組合せによって前記標的分子数を計測する、細胞解析装置システム。 - 前記容器内に一個の細胞、または複数の細胞が2次元に平面上に培養され保持されている、請求項1に記載の装置システム。
- 前記標的分子結合表面が、1細胞レベルのサイズである、請求項1または請求項2に記載の装置システム。
- さらに、前記標的分子結合表面および前記細管の位置を1細胞レベルの空間分解能で3次元的に調節することが可能な位置制御手段を備える、請求項1〜3のいずれかに記載の装置システム。
- 前記標的分子結合表面に、前記標的分子と特異的な結合能力を持ったDNAもしくはRNA、またはこれらに硫黄イオンを付加して酵素による分解を抑制した核酸鎖断片の一端が固定されている、請求項1〜4のいずれかに記載の装置システム。
- 前記標的分子結合表面に、前記標的分子と特異的な結合能力を持った抗体の一端が固定されている、請求項1〜4のいずれかに記載の装置システム。
- 前記標的分子結合表面に、前記標的分子と特異的な結合能力を持った高分子(macromolecule)の一端が固定されている、請求項1〜4のいずれかに記載の装置システム。
- 前記標的分子結合表面に結合した前記標的分子を一定時間の周期でリリースする手段が、前記表面を加熱する手段を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の装置システム。
- 前記加熱手段として電気抵抗によって前記表面を発熱させる手段を含む、請求項8に記載の装置システム。
- 前記加熱手段として、前記表面の加熱したい領域に光吸収が他の領域より高い物質からなり、ここへの光吸収によって前記表面を発熱させる手段を含む、請求項8に記載の装置システム。
- 前記標的分子結合表面に結合した前記標的分子を一定時間の周期でリリースする手段が、前記表面に高周波電場を印加する手段を含む、請求項1〜4のいずれかに記載の装置システム。
- 前記緩衝液を通過させてその通過する該緩衝液中の前記標的分子の量的変化を計測する手段が、前記細管を通過するイオン電流の電気的インピーダンス変化を計測することによって前記細管を通過する前記標的分子数を計測する手段である、請求項1〜4のいずれかに記載の装置システム。
- 前記緩衝液を通過させてその通過する該緩衝液中の前記標的分子の量的変化を計測する手段が、前記標的分子が前記細管を通過するときに発生する光学的散乱または吸収の量的変化を計測することによって前記細管を通過する前記標的分子数を計測する手段である、請求項1〜4のいずれかに記載の装置システム。
- 前記標的分子結合表面を備えた前記捕獲領域が、2つ以上の複数の前記標的分子について、それぞれについて1領域として複数の領域が基板上に配置されたものであり、かつ、各領域に各々独立して熱を発生させて、1領域単位で前記標的分子をリリースする手段を備える、請求項1〜4のいずれかに記載の装置システム。
- 細胞からの分泌物の時間的空間的分解能を持った定量解析方法であって、
細胞からの分泌物のうち標的分子のみを微小領域に固定する工程、
前記標的分子が固定されたことを経時的に定量的に検出する工程、
前記微小領域に結合した前記標的分子を、一定の時間周期で該微小領域からリリースする工程、
を含み、
前記細胞からの分泌物を同定する、解析方法。 - 細胞からの分泌物の時間的空間的分解能を持った定量解析方法であって、
細胞からの分泌物のうち標的分子のみを微小領域に固定する工程、
前記微小領域に結合した前記標的分子を、一定の時間周期で微小領域からリリースする工程、
リリースされた物質の量を定量的に計測する工程、
を含み、
前記細胞からの分泌物を同定する、解析方法。 - 前記微小領域に結合した前記標的分子をリリースするために一定の時間周期で、前記標的分子がリリースされる最短の時間だけ熱を加える工程を含む、請求項15または16に記載の方法。
- 前記微小領域に結合した標的分子をリリースするために一定の時間周期で、前記標的分子がリリースされる最短の時間だけ高周波電場を加える工程を有する、前記請求項15または16に記載の方法。
- 前記標的分子の量を見積もるために前記細管を通過するイオン電流のインピーダンス変化計測を用いる、請求項15または16に記載の方法。
- 前記標的分子の量を見積もるためにリリースされた前記標的分子の光学的散乱または吸収などの光学的強度変化計測を用いる、請求項15または16に記載の方法。
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