KR100506508B1 - Ｓｐｍ을 이용한 나노 바이오어레이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 SPM(scanning probe microscope)의 팁에 표적물질과 반대되는 극성의 팁바이어스 전압을 인가하면서, 표적물질이 포함된 시료를 팁에 채취하는 단계; 시료를 스포팅할 기판 상으로 상기 팁을 이동시키는 단계; 및 팁 바이어스를 제거한 후, 상기 팁을 기판에 접근시켜 시료를 기판 상에 적하시키는 단계를 포함하는 나노 바이오어레이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

ＳＰＭ을 이용한 나노 바이오어레이의 제조방법{Method for manufacturing nano bio-array using SPM}

본 발명은 바이오어레이의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 나노수준의 고집적도로 바아오어레이를 제조하는 방법에 관한 것이다.

흔히 바이오칩으로 불리우는 바이오칩은 작은 기판 위에 DNA, 단백질 등의 생물학적 분자들을 결합시켜 유전자 결합, 단백질 분포, 반응양상 등을 분석할 수 있는 생물학적 마이크로 칩이다. 바이오칩은 프로티오믹스 (proteomics)와 게노믹스 (genomics) 분야에서 필수적으로 이용될 수 있으며, 특히 유전적 또는 병원성 질병의 진단, 단백질의 발현 및 기능연구, 단백질의 상호작용 연구, 신약개발 등 다양한 응용분야를 가지고 있어 의학, 약학, 생명과학분야에서 광범위하게 이용될 수 있다.

단백질 칩은 검출하고자 하는 물질(표적단백질)과 반응하는 단백질의 마이크로 어레이가 형성되어 있어, 이를 이용하여 시료 중의 표적단백질의 유무를 확인할 수 있다. DNA 칩은 특정 단백질의 발현에 관여하는 DNA의 염기서열을 확인함으로써 유전적 질병의 유무를 알아낼 수 있다. 이를 위해 DNA칩은 표적DNA에 대해 상보적인 폴리뉴클레오티드를 프로브로 이용하며, 시료 중의 표적DNA와 프로브의 하이브리드 결합의 유무를 검출함으로써 시료 중의 표적DNA 유무를 확인한다. 그러나 DNA 프로브와 표적DNA의 하이브리드 결합이나 항체와 항원의 반응성은 인비보(in vivo) 상태에 있을 때와는 달리 인비트로(in vitro) 상태에선 현저하게 떨어진다. 따라서 이러한 단점을 극복하기 위한 방법으로 시료 물질을 여러 가지 증폭 기술을 사용하여 쓰고 있다. 즉 DNA칩의 경우, PCR을 이용하여 시료중의 표적 DNA를 증폭시켜 사용하고 단백질 칩의 경우에는 롤링서클증폭기술 (Rolling-circle-amplification technique)이라는 방법을 이용하여 단백질을 증폭하여 사용한다. 이러한 전처리 과정 없이 바이오칩의 검출 감도를 높이고 더 나아가 렙온어칩 (Lab on a chip) 등의 다검출 바이오칩을 제조하는 상위 기술로 발전하기 위해선 시료 중의 표적물질의 농도를 높이는 방법과 마이크로 어레이를 고농도로 시료를 채취하여 고집적화하는 방법이 있다.

한편, 마이크로 어레이의 고집적화 방법의 하나로 스폿의 크기를 최소화하는 방법이 있다. 마이크로 어레이의 스폿 형성 방법으로는 분사방식과 팁 방식 등이 있다. 그러나, 이러한 종래의 방법으로는 스폿의 크기를 줄이는데 한계가 있었다. 예를 들어, 단백질 칩의 경우 스폿 크기가 보통 수백 마이크로이며, DNA 칩은 수십 마크로 단위의 스폿 크기를 갖는다. 최근에는 원자현미경기술 (AFM: atomic force microscopy)을 이용하여 나노크기의 프로브를 제조하는 방법이 알려졌다. 구체적으로는 기판 상에 금박막과 유기 단분자층을 형성한 다음 AFM을 이용하여 유기 단분자층을 소정의 패턴으로 에칭하여 금박막을 노출시킨 후, 노출된 금박막 영역에 DNA 프로브를 부착시킨다. AFM 팁의 스캐닝 트랙을 따라 기판 상의 선택된 영역들이 깍여, 유기단분자층이 제거되고 곧바로 DNA 분자들이 이러한 영역으로 흡착된다 (Production of Nano Structures of DNA on Surfaces," Nano Letters, August 14, 2002). 그러나, 이 방법도 시료를 고농도로 농축하는 정도에는 이르지 못하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 시료의 고농도로 채취하여, 마이크로 어레이의 고집적화를 가능하게 하는 나노 바이오어레이의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SPM의 팁에 표적물질과 반대되는 극성의 팁바이어스 전압을 인가하면서, 표적물질이 포함된 시료를 팁에 채취하는 단계; 시료를 스포팅할 기판 상으로 상기 팁을 이동시키는 단계; 및 팁 바이어스를 제거한 후, 상기 팁을 기판에 접근시켜 시료를 기판 상에 적하시키는 단계를 포함하는 나노 바이오어레이의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 어레이의 제조방법에서, 표적물질은 생물학적 분자인 것이 바람직하고, 단백질, 핵산, 또는 지질인 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 어레이의 제조방법에서, SPM은 통상적으로 사용되는 SPM을 사용할 수 있으나, 특히 AFM, EFM 또는 LFM인 것이 바람직하다.

본 발명의 어레이의 제조방법에서, 시료 채취 단계 전에 표적물질에 티올기를 결합시키는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 어레이의 제조방법에서, 시료 채취 단계 전에 표적물질이 양전하 또는 음전하를 나타내도록 전처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 어레이의 제조방법에서, 시료 채취 단계 전에 기판에 금속박막을 형성하는 단계를 더 포함할 수 있고, 금속박막은 금, 은, 구리 또는 백금으로 형성되는 것이 바람직하다. 또한, 금속박막 형성 단계 후 상기 기판을 표적물질이 양전하 또는 음전하를 나타내도록 전처리하는 단계를 더 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 SPM을 이용하여 기판 상에 어레이를 제작하는 방법을 보다 상세히 설명한다.

대부분의 단백질은 최적의 pI 값을 갖고 있다. 이 값을 완충용액을 이용하여 조절하면 단백질의 전체 전하(Net charge)를 양전하 또는 음전하로 변화시킬 수 있다. 어레이하고자 하는 표적물질이 DNA인 경우에는 자체적으로 음의 전하를 갖고 있다. 그리고 컨덕팅 AFM (conducting AFM), 또는 외부에서 전원을 연결한 AFM, EFM과 같은 SPM의 팁 자체는 전극의 역할을 하기 때문에 단백질 및 DNA를 농축하여 채취할 수 있다. 따라서 이와 같은 표적물질과 반대되는 극성의 전하의 팁 바이어스로 걸어주면 전기적 인력에 의해 팁에 표적물질이 포함된 시료가 고농도로 채취된다. 시료를 스포팅할 기판 상으로 상기 팁을 이동시킨 후, 팁을 기판에 접근시켜 어레이를 한다. 어레이 된 점의 크기는 보통 400~600nm 정도 된다.

먼저, 본 발명에 사용되는 SPM (Scanning Prove Microscope)은 높은 공간 분해능을 가진 표면 분석장비의 하나로서, 그 종류는 다양하나, 대표적으로 AFM, EFM, 또는 LFM 등이 있다.

상기 장비들의 기본적인 작동 원리는 같기 때문에, 외부에서 팁에 바이어스를 걸어줄 수 있게 하면 모두 사용이 가능하다.

AFM (Atomic Force Microscope)은 표면 분석장치이다. AFM이란 날카로운 탐침이 시료 표면에 수 Å 내로 접근하게 될 때 원자의 힘에 의한 캔틸레버의 굽힘 현상을 측정하여 피드백 제어함으로써 표면의 3차원 이미지를 얻는 초정밀 장치를 말한다. 시료의 전기적인 특성과 무관하므로 전도체, 부도체, 반도체 등의 모든 시료의 이미지를 얻을 수 있다.

LFM(Lateral Force Microscope)은 물질 표면의 마찰력의 차이를 이용하여 표면의 이미지를 얻는 원자 현미경이다. 즉, 접촉 모드 (contact mode)의 AFM에서 탐침이 시료 표면을 좌우로 주사할 때 캔틸레버는 측정 물질의 표면의 상태에 따라 위아래로 휠 뿐만 아니라 마찰력에 의해 옆으로도 비틀리게 된다. 이 비틀리는 정도는 캔틸레버에 반사된 레이저 광선의 수평성분 각도에 비례함으로 쉽게 측정된다. 따라서 이를 이용하면 기판 표면의 마찰력의 분포를 알 수 있다.

또한, EFM (Electrostatic Force Microscope)는 시료의 전기적 특성을 파악하여 표면의 이미지를 얻는 원자현미경이다. 즉 얻어진 이미지는 표면의 전하 분포를 의미한다. AFM은 표면의 전기적 특성을 알 수 없는 것과는 달리 EFM은 물질 표면의 전기적 성질을 알아 낼 수 있다.

이들을 본 발명에 적용할 때에는, 팁에 특별한 전원 공급장치를 인위적으로 연결 할 필요없이 자체 바이어스를 가해 줄 수 있는 경우 (예: 컨덕팅 AFM, EFM (conducting AFM, EFM))를 제외하고는, 외부에서 전원을 연결하여 AFM 등의 팁에 바이어스를 가할 수 있다.

도 1은 본 발명의 나노 바이오어레이의 제작 원리를 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 1에서 참조번호 1은 팁이고, 2는 표적물질이고, 3은 AFM이고, 4는 금속막이고, 5는 기판이다.

먼저, 어레이어로 사용되는 팁(1)은 AFM, EFM 등에서 사용되는 팁과 같은 SPM의 팁이면 된다. 이것은 상업적으로 구입가능하다.

시료를 채취하기 전에 표적물질에 티올기를 결합시킬 수 있다. 기판이 그 표면에 금속박막(4)을 가지는 경우, 특히 금막이 형성된 기판을 사용하는 경우, 표적물질에 티올기를 결합시키는 것이 바람직하다. 티올기를 결합시키는 방법으로는 종래에 티올기 부착방법으로 당해 분야에서 이용되는 어떠한 방법이라도 이용할 수 있다.

표적물질이 중성전하를 가지는 경우, 완충액으로 전체전하를 양전하 또는 음전하로 만드는 것이 바람직하다.

본 발명에 사용되는 기판(5)은 유리, 실리콘, 폴리머 등 종래에 당해 기술분야에서 이용되는 것이라면 어느 것이나 가능하고, 기판에 금막을 형성시킨 실리콘 또는 유리 기판이 바람직하다.

팁(1)을 현미경으로 관찰하여 시료에 팁의 끝 부분이 살짝 들어가도록 조절하여 담근다. 표적물질과 반대되는 극성으로 팁 바이어스의 전압을 인가하여 팁 끝 부분에 표적물질, 예를 들어 음의 전하를 띠는 DNA(2)가 농축된 상태로 부착되도록 3~5초간 팁을 시료에 담근다.

그 후 스폿팅 하고자하는 위치로 바이어스를 걸어준 상태로 AFM을 이동시킨 후 팁 바이어스를 제거해준 후 팁(1)을 제어기를 통하여 팁을 기판(5)에 접근시킨다.

탐침이 기판에 육안으로 기판과 거의 붙었을 때 자동 접근 모드로 바꾼 후 접근시켜 표적물질을 스폿팅한다. 표적물질이 적하되면 팁을 들어올리고 위치를 조정한 후 다시 자동 접근 모드에서 스폿팅을 반복하여 어레이를 완성한다. 또한, 이때 자동 접근 모드에서 탐침이 기판에 닿을 때의 전류를 확인하여 2번째 어레이를 제작할 때엔 강제모드에서 확인된 전류값에 도달할 때에 강제로 멈추게 할 수도 있다. 이는 자동 접근을 하는 경우, 팁이 멈출 때 약간의 진동으로 팁이 움직이기 때문에 이를 막아주기 위해서 미리 기판에 닿을 때의 전류를 확인하여 강제적으로 또는 수동으로 접근시키도록 하는 것이 바람직하기 때문이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

<실시예 1> AFM을 이용한 나노 어레이의 제작

1. AFM 및 팁의 준비

본 실시예에서 사용한 AFM은 PSI(Park Scientific Instruments)사 제품 (모델명:CP)으로 본 발명의 실시에 적합하게 팁부분에 외부전원을 연결하여 사용하였다. 외부 전원을 공급 할 수 장치가 되어있는 EFM 카트리지에 전원을 연결 한 후 AFM 팁 (PSI사)을 그 카트리지에 결합하여 어레이어로 사용하였다.

2. 시료의 준비

티올기(-SH)가 표지된 외가닥 DNA(20μM)((주)제노텍)를 사용하였다.

3. 시료 채취 및 이동 단계

시료를 채취하여 기판 위에 적하 하기 전에 AFM 팁을 사용하여 기판 위에 표시를 했다. 이것은 AFM으로 어레이 된 점을 쉽게 찾기 위한 전처리과정이다. 프로브로서 이용될 외가닥 DNA를 보습효과를 위해 3% 글리세롤 용액에 용해하였고, 그 용액 5ml에 팁을 담그어 시료를 채취하였다. 이 때 표적물질과 반대되는 전하로 약 +2V의 팁 바이어스를 걸어서 시료용액에 현미경을 이용하여 팁을 약 5초간 담지하여 표적물질인 외가닥 DNA를 포함하는 시료가 충분히 팁에 붙게 하였다.

팁에 DNA가 부착된 후에, 팁을 기판의 소정 위치로 이동시켰다.

4. 적하 단계

이동이 끝나면 팁에 공급한 전원을 차단하였다. 접근이 완료된 후 팁을 기판 위에 접근시킨 후에 자동 접근 모드로 바꾸어 스폿팅하였다. 이 때 셋 포인트값 (Set Point)은 20nN으로 하였다. 이후 팁을 기판과 거리를 떨어지게 한 후 위치를 옮겨 상기와 같은 단계를 반복적으로 수행하여 어레이를 제작하였다.

5. 나노 어레이의 확인

고배율 CCD카메라를 이용하여 미리 표시된 어레이된 위치를 찾아낸 뒤, AFM(PSI사, 모델명:CP)으로 스케닝(100㎛ 스케너를 사용함)하여 나노 어레이의 이미지를 얻었다 (도 2 및 도 3 참조). 측정결과 약 400nm 크기의 스폿의 형성되었음을 확인하였다.

외가닥DNA가 표면에 고정되었는지를 확인하기 위해서 표면 플라즈몬 공명 장치(Optrel사, 모델명:multiscope)를 이용한 인시투 (in situ) 실험을 하였다(도 2 참조).

도 4에서 초기(0~약 900초)에는 물을 흘려보냈고, 이 때의 반사도 세기가 0.36을 나타내었다. 약 900초 정도 시간이 흐른 후 외가닥 DNA를 넣어 주었는데, 반사도 크기가 0.45로 크게 변하였다. 그러나 약 7000초가 경과한 후에 다시 물로 세척을 해주었으나 반사도 세기가 0.45에서 크게 변화지 않았다. 이 결과로 외가닥 DNA가 기판 위에 결합된 것을 알 수 있다.

<실시예 2> LFM을 이용한 나노 어레이의 제작

AFM팁 대신에 LFM팁(제작사:ULCT-AUMT, 모델명:Contact Ultra Lever)을 사용한 것을 제외하고는 상기 <실시예 1>과 같은 방식으로 실시하였다.

AFM으로 스케닝하여 얻은 나노 어레이의 이미지를 도 5~6에 도시하였다. 실시예 1과 같이 약 400nm 크기의 스폿의 형성되었음을 확인하였다.

실시예 1과 같이 표면 플라즈몬 공명 장치를 이용한 인시투 (in situ) 실험을 하여 DNA의 고정 여부를 확인하였다(도 7 참조). 도 4와 같은 결과를 얻었고, 이를 통해 외가닥 DNA가 기판 위에 결합된 것을 알 수 있다.

<실시예 3> EFM을 이용한 나노 어레이의 제작

먼저, 상기 실시예 1에서 사용한 AFM용 헤드를 EFM전용 헤드로 교체한 후 EFM용 카트리지를 결합하였다. EFM은 자체적으로 팁에 바이어스를 가할 수 있기 때문에 AFM과는 달리 외부에서 별도의 전원을 가해주지 않는다. EFM팁(제작사:ULCT-AUMT, 모델명:Contact Ultra Lever)을 카트리지에 결합하여 어레이어로 사용하였다. 그 외에는 상기 실시예 1과 같은 방식으로 실시하였다.

AFM으로 스케닝하여 얻은 나노 어레이의 이미지를 도 8~9에 도시하였다. 실시예 1 및 2와 같이 약 400nm 크기의 스폿의 형성되었음을 확인하였다.

실시예 1과 같이 표면 플라즈몬 공명 장치를 이용한 인시투 (in situ) 실험을 하여 DNA의 고정 여부를 확인하였다(도 10 참조). 도 10과 같은 결과를 얻었고, 이를 통해 외가닥 DNA가 기판 위에 결합된 것을 알 수 있다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 AFM, EFM, LFM, MFM 등의 SPM을 이용하여 시료 중의 표적물질의 고농도화 및 바이오어레이의 고집적화가 이루어질 수 있어서 간단한 방법과 저렴한 비용으로 고감도 센서 및 다검출 바이오칩의 제작 및 소형화를 가능하게 한다.

도 1은 본 발명에 따른 나노 어레이의 제작 원리를 개략적으로 나타낸 도면이다.

도 2는 AFM팁을 이용하여 나노크기의 어레이를 제작한 후, 그 결과를 AFM을 이용하여 확인한 평면도이다.

도 3은 AFM팁을 이용하여 나노크기의 어레이를 제작한 후, 그 결과를 AFM을 이용하여 확인한 사시도이다.

도 4는 AFM팁을 이용하여 고정화 시료 물질인 외가닥 DNA가 기판표면에 고정됨을 표면 플라즈몬 공명장치로 확인한 그래프이다.

도 5은 LFM팁을 이용하여 나노크기의 어레이를 제작한 후, 그 결과를 AFM을 이용하여 확인한 평면도이다.

도 6은 LFM팁을 이용하여 나노크기의 어레이를 제작한 후, 그 결과를 AFM을 이용하여 확인한 사시도이다.

도 7은 LFM 팁을 이용하여 고정화 시료 물질인 외가닥 DNA가 기판표면에 고정됨을 표면 플라즈몬 공명장치로 확인한 그래프이다.

도 8은 EFM팁을 이용하여 나노크기의 어레이를 제작한 후, 그 결과를 EFM을 이용하여 확인한 평면도이다.

도 9는 EFM팁을 이용하여 나노크기의 어레이를 제작한 후, 그 결과를 AFM을 이용하여 확인한 사시도이다.

도 10은 EFM 팁을 이용하여 고정화 시료 물질인 외가닥 DNA가 기판표면에 고정됨을 표면 플라즈몬 공명장치로 확인한 그래프이다.

<도면의 주요부분에 대한 부호의 설명>

1. 팁

2. 표적물질

3. AFM

4. 금속막

5. 기판

Claims (9)

1. SPM의 팁에 표적물질과 반대되는 극성의 팁바이어스 전압을 인가하면서, 표적물질이 포함된 시료를 팁에 채취하는 단계;

   시료를 스포팅할 기판 상으로 상기 팁을 이동시키는 단계; 및

   팁 바이어스를 제거한 후, 상기 팁을 기판에 접근시켜 시료를 기판 상에 적하시키는 단계를 포함하는 나노 바이오어레이의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기 표적물질은 생물학적 분자인 것을 특징으로 하는 제조방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 생물학적 분자는 단백질, 핵산, 또는 지질인 것을 특징으로 하는 제조방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기 시료 채취하는 단계 전에 표적물질에 티올기를 결합시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
5. 제 1항에 있어서, 상기 시료 채취 단계 전에 상기 표적물질이 양전하 또는 음전하를 나타내도록 전처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 SPM은 AFM, EFM, 또는 LFM인 것을 특징으로 하는 제조방법.
7. 제 1항에 있어서, 상기 시료 채취 단계 전에 기판에 금속박막을 형성하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.
8. 제 7항에 있어서, 상기 금속박막은 금, 은, 구리 또는 백금으로 형성되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
9. 제 7항에 있어서, 상기 금속박막 형성 단계 후 상기 표적물질이 양전하 또는 음전하를 나타내도록 전처리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.