KR20040010539A

KR20040010539A - 힘 층화 및 힘 패닝에 의한 결합 친화도의 평가방법

Info

Publication number: KR20040010539A
Application number: KR10-2003-7004991A
Authority: KR
Inventors: 헨더슨에릭; 모셔커티스
Original assignee: 바이오포스 나노사이언스, 인크.
Priority date: 2000-10-10
Filing date: 2001-10-10
Publication date: 2004-01-31
Also published as: JP2004511768A; CA2425410A1; AU2002213086B2; AU1308602A; US7060448B2; EP1330651A2; WO2002031464A2; WO2002031464A3; EP1330651A4; US20020042081A1; US20050059091A1

Abstract

본 발명은 프로브(probe)를 이용하여 표면으로부터 물체를 선택적으로 제거하는 방법에 관한 것이다. 프로브는 일정 수의 물체가 표면으로부터 제거되도록 보다 큰 상대적인 양의 힘을 이용하여 표면에 걸쳐서 스캐닝된다. 표면으로부터 물체를 제거하는 데 필요한 힘은 후크의 법칙 및 프로브의 탄성 상수를 이용하여 산출할 수 있다. 표면과의 결합 친화도가 비교적 약한 물체를 제거한 후, 잔여 물체를 수거하고 특성화하고 추가로 연구할 수 있다.

Description

힘 층화 및 힘 플래닝에 의한 결합 친화도의 평가방법{Evaluating binding affinities by force stratification and force planning}

우선권

본 출원은 2000년 10월 10일자 미국 가출원 제60/238,556호 및 2001년 10월 9일자 미국 특허원 제 호의 우선권으로 청구한다. 미국 가출원 제60/238,556호 및 미국 특허원 제 호의 전문 내용은 본원에서 참조로 인용된다.

기술분야

본 발명은 표면과 물체 같의 상호작용 분자력의 작용으로서 표면에 결합된 물체 또는 표면 위의 물질을 분석하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 이들의 결합 친화도에 의한 물체의 구별 및 평가방법에 관한 것이다.

배경기술

물질, 분자 및 셀 사이의 결합 친화도를 측정하는 것은 광범위한 산업분야, 즉 물질 개발, 반도체 제조, 생물분석적 검정, 생물의학적 진단 및 약제개발에 중요하나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 고체 상태 배열에 기초한 생물분석적 및 유전학적 진단 기구 및 관련 장비의 개발로, 소형 고체 상태 형태에서의 다수의 반응을 저렴하게 스크리닝하는 새로운 방법이 점점 요구되고 있다.

현재 통상의 방법은 광학적 특성의 변화, 통상적으로 공지된 형광 표식 분자가 분자 배열의 특정 위치에서 공지된 분자 종과 상호작용하는 경우, 형광성의 변화를 모니터링하는 것이다. 그러나, 이들 장치 및 방법은 종종 분자 배열을 인터로게이션(interrogation)하는 데 사용되는 분자에 리포터 시스템을 부가하여 입체화학적 제약을 부과한다. 게다가, 이들 방법은 실제 결합 친화도를 직접 보고하지 않는다. 따라서, 미세 기계적 리포터를 사용하는 분자 결합 친화도의 라벨부재 직접 인터로게이션은 명백히 유용하다. 다양한 표면에 결합되거나 흡착되거나 그렇지 않으면 부착된 상이한 물질의 범위를 보다 양호하게 분석하기 위해 보다 복잡하고 힘든 당해 인터로게이션 방법이 필요하다.

표면에 분자가 결합되었는지 기타 다른 물질이 결합되었는지를 직접 검출하는 한 가지 방법은 주사 탐침 현미경이다. 주사 탐침 현미경의 한 가지 유형은 원자력 현미경("AFM")이다. AFM에서, 예리한 프로브(probe)가 가요성 캔틸레버(cantilever)의 말단에 위치하고 시료 표면에 걸쳐서 스캐닝된다. 스캐닝하는 동안, 프로브 및 캔틸레버는 프로브의 팁(tip)과 표면 및/또는 표면에 침착된 물체 사이의 인력과 반발력의 총합에 의해 편향된다. 캔틸레버의 편향은 일반적으로 "광학 레버" 또는 "빔 편향" 기구를 구성하는 스플릿 포토다이오드 상의 캔틸레버의 후방으로부터 초점이 모아진 레이져 빔의 반사에 의해 측정된다. 편향의 변화는 표면상의 물체의 존재를 나타낸다. 이들 이전의 방법은 프로브에 결합된 물질을 이용하여 프로브와 표면상에 결합된 물질 사이의 생성된 힘의 상호작용을 나타낸다. 캔틸레버 편향을 검출하는 기타 다른 방법은 간섭 측정법 및 압전 변형률 측정법을 포함한다.

제1 AFM은 캔틸레버의 수직 변위만을 표시한다. 보다 최근의 방법은 또한 토션력을 표시하는 단계, 팁을 공명시키는 단계 및 프로브와 샘플 사이에 일시적인 접촉만을 허용하거나 경우에 따라서는 전혀 접촉시키지 않는 단계를 포함한다. 프로브의 팁 변위의 플롯 또는 이것이 샘플 표면을 트래버스할 때의 공명 변화가 지형학적 영상을 생성하는 데 사용된다. 이러한 영상은 물질, 화학적 시편 및 생물학적 시편을 포함하는 3차원 구조의 광범위한 샘플 유형을 나타낸다. 후자의 몇 가지 예로 DNA, 단백질, 크로마틴, 염색체, 이온 채널 및 살아 있는 규칙적인 세포를 들 수 있다. 그러나, 이들 선행 방법은 프로브에 결합된 후 표면상의 각종 물질을 가로질러 드래그(drag)될 수 있는 착물로 제한된다. 이런 식으로 제한되지 않는 신규한 방법이 필요하다.

이의 영상 능력 이외에도, AFM은 매우 정밀한 힘 측정을 수행할 수 있다. AFM은 마이크로뉴튼(10^-6) 내지 피코뉴튼(10^-12) 범위의 힘을 직접 감지하고 측정할 수 있다. 따라서, AFM은 분자 쌍 및 심지어 단일 분자에 힘을 적용하고 이들 사이의 힘을 측정할 수 있다. 게다가, AFM은 광범위한 기타 다른 힘 및 현상, 예를 들면, 자기장, 열적 구배 및 점탄성을 측정하고 적용할 수 있다. 이러한 능력을 이용하여 샘플 표면상에 힘의 장을 지도화하고, 예를 들면, 특정 표면상에 위치한 중요한 착물을 배치할 때와 같이 이들 장의 위치와 크기를 고분해능으로 나타낼 수있다. 또한, 추가의 분자력을 측정하기 위해, AFM 프로브는 중요한 분자와 함께 작용할 수 있다.

표면에 결합된 물체를 제거하는 데 필요한 기계적 힘을 평가하는 이전의 방법은 하나 이상의 물체를 표면에 반복적으로 결합시킨 후 그 물체를 씻어내는 것과 같은 조합된 화학 기술을 포함하였다. 이런 식으로, 당해 물체를 표면에 얼마나 잘 결합시키거나 흡수시키는지의 특성화는 모집단 평균에 기초하여 결정할 수 있다. 표면에 남아있는 물체를 이동시키기 위해 필요한 힘의 특성화를 초래하는 당해 방법론의 비용 효과적이고 실용적인 개선을 위한 필요성이 존재한다.

결합된 분자, 세포 또는 기타 다른 물체의 표면에의 친화성을 신속하게 평가하는 간단하고 효과적인 방법의 필요성이 존재한다. 당해 방법은 표면을 가로질러 물질을 드래그하면서 프로브에 부착되거나 전체 모집단 샘플에 기초하여 친화성을 측정하기 위해 마이크로타이터 판을 연속적으로 세척해야만 하는 선행 기술의 한계를 극복해야 한다. 당해 방법은 또한 물체와 표면에 결합되어 있는 기타 다른 물질과의 사이의 결합 친화도를 측정할 수 있어야 한다. 결국, 추가의 연구를 위해 보다 단단히 결합된 물체를 수득할 수 있도록 관심 대상인 표면상의 결합이 잘 되어 있지 않은 물체를 제거하는 방법의 필요성이 존재한다.

도면의 간단한 설명

도 1a는 표면 위에 물체를 접촉시키고 그 물체 위에 수직의 힘을 가하는 프로브의 입측면도이다.

도 1b는 표면 위의 물체의 상부에 걸쳐서 라이딩(riding)하는 도 1a의 프로브의 입면도이다.

도 1c는 도 1a의 물체를 이동시키는 수직 프로브 힘의 입면도이다.

도 2a는 표면 위에 물체를 접근시키는 프로브의 입면도이다.

도 2b는 토션력을 가하고 표면상의 물체를 라이딩하여 지나간 프로브의 입면도이다.

도 3a는 프로브가 표면을 스캐닝하기 전에 표면에 부착된 다수의 파지 미립자를 포함하는 표면의 정면도이다.

도 3b는 프로브를 이용하여 표면을 스캐닝하여 약하게 결합된 파지 미립자를 제거한 후의 도 3a의 표면의 정면도이다.

도 4a는 표면 위의 결합된 세포의 분포를 나타내는 정면도이다.

도 4b는 프로브를 이용하여 스캐닝한 후의 다수의 세포가 제거된 도 4a의 세포의 정면도이다.

도 5a는 표면 위의 결합된 세포의 분포를 나타내는 정면도이다.

도 5b는 프로브를 이용하여 스캐닝한 후의 세포가 거의 제거되지 않은 도 5a의 세포의 정면도이다.

개요

본 발명은 적용된 힘을 조절하여 표면에 결합된 물체를 차동 분리하고/거나 제거하기 위해 힘 변환 장치를 사용하는 방법에 관한 것이다. 적용하는 힘을 점진적으로 증가시켜 표면과 표면상의 물체 사이의 결합 강도를 결정할 수 있다. 당해 물체는 분자, 바이러스, 세포, 파지 및 기타 유기 또는 무기 분자를 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 당해 방법은 표면에의 보다 높은 결합 친화도를 갖는 것들을 분류하기 위해 다수의 결합 상호작용의 신속하고 저렴한 스크리닝(screening)을 위해 패턴화된 표면상에서 수행할 수 있다. 본 발명은 또한 물체와 표면상에 위치한 일부 물질 사이의 결합 친화도를 특징화하기 위해 이용할 수 있다.

AFM 및 이에 부착된 프로브가 표면에 걸쳐서 스캐닝될 때, 프로브의 팁이 물체에 대하여 가압되어 프로브의 토션 및 편향을 발생시킨다. 팁에 의해 소정의 물체 위에 가해진 힘은 프로브의 토션 및 수직 탄성 상수와 관련된다. 토션 및/또는 수직 프로브 변위의 측정은 물체와 표면 사이의 결합 친화도를 정성적으로 및 정량적으로 평가하기 위해 이용할 수 있다. 수직 힘에 대하여, 탄성 상수는 적용된 힘을 산출하기 위해 사용된다. 토션에 기초하여 측정하기 위해, 프로브의 뒤틀림 정도를 측정하고 프로브의 공지된 토션 탄성 상수로 승산하여 관찰된 동작의 뒤틀림 정도에 필요한 힘에 대응하는 값을 생성한다. 게다가, 표면으로부터 제거된 각 그룹의 물체를 추가로 연구하기 위해 수거할 수 있다.

본 발명은 특히 특정 결합 특성을 갖는 물질, 약제 및 약제 억제제, 생체분자 결합 강도를 나타내는 진단 검정, 단백질-단백질 상호작용 스크린, 바이러스 항체 결합 스크린 뿐만 아니라 기타 수많은 다른 것들을 개발하고 연구하는 데 유용할 수 있다.

본 발명은 또한 표면에 하나 이상의 물체를 부착시키는 단계, 표면에 부착된 하나 이상의 물체를 위치시키기 위해 스캐닝 프로브 현미경(scanning probe microscope)을 이용하여 표면을 스캐닝하는 단계, 표면 위의 하나 이상의 물체에 힘을 적용하여 표면에 대한 결합 친화도가 비교적 낮은 하나 이상의 물체를 제거하는 단계, 하나 이상의 물체에 적용된 힘을 모니터링하는 단계 및 하나 이상의 물체를 제거하기 위해 적용된 힘으로부터 하나 이상의 물체와 표면 사이의 결합 친화도를 산출하는 단계를 포함하는, 물체와 표면 사이의 결합 친화도의 측정방법을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 하나 이상의 물질이 침착되어 추가로 포함된 표면을 수득하는 단계, 표면에 침착된 하나 이상의 물질에 하나 이상의 연구 물체를 부착시키는 단계, 하나 이상의 물체를 위치시키기 위해 스캐닝 프로브 현미경을 이용하여 표면을 스캐닝하는 단계 및 하나 이상의 물체에 힘을 적용하여 하나 이상의 물체를 제거하는 단계를 포함하는, 물체와 하나 이상의 물질 사이의 결합 친화도의 측정방법을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 표면에 하나 이상의 물질을 침착시키는 단계, 표면에 침착된 물질에 하나 이상의 물체를 부착시키는 단계, 표면에 부착된 하나 이상의 물체를 위치시키기 위해 원자력 현미경(atomic force microscope)을 이용하여 표면을 스캐닝하는 단계, 원자력 현미경을 이용하여 하나 이상의 물체에 힘을 적용하는 단계(힘은 사용자에 의해 결정되고, 어떤 물체는 이러한 힘에 의해 표면으로부터 제거된다), 여전히 표면에 부착되어 있는 하나 이상의 물체를 위치시키기 위해 표면을 스캐닝하는 단계, 원자력 현미경을 이용하여 표면 위의 하나 이상의 물체에 보다 큰 제2 힘을 적용하는 단계 및 여전히 표면에 부착되어 있는 하나 이상의 물체를 수거하는 단계를 포함하는, 물체와 표면 사이의 상호작용 힘의 평가방법을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태는 표면에 하나 이상의 물체를 침착시키는 단계(a), 표면 위에 물체를 위치시키기 위해 원자력 현미경을 이용하여 표면을 스캐닝하는 단계(b), 원자력 현미경을 이용하여 표면 위의 하나 이상의 물체에 제1 힘을 적용하여 결합 친화도가 비교적 낮은 표면으로부터 하나 이상의 물체를 제거하는 단계(c), 제1 힘에 의해 표면으로부터 제거된 하나 이상의 물체를 수거하는 단계(d), 원자력 현미경을 이용하여 하나 이상의 물체에 보다 큰 제2 힘을 적용하여 결합 친화도가 비교적 낮은 표면으로부터 하나 이상의 물체를 제거하는 단계(e), 제2 힘에 의해 표면으로부터 제거된 하나 이상의 물체를 수거하는 단계(f) 및 단계(b) 내지 단계(f)를 반복하는 단계(g)를 포함하는, 물체와 표면 사이의 결합 친화도의 측정방법을 포함한다.

또 다른 양태는 표면에 하나 이상의 물질을 침착시키는 단계(a), 하나 이상의 물질에 하나 이상의 물체를 결합시키는 단계(b), 원자력 현미경을 이용하여 표면 위의 하나 이상의 물체에 제1 힘을 적용하는 단계(c), 제1 힘에 의해 표면으로부터 제거된 하나 이상의 물체를 수거하는 단계(d), 원자력 현미경을 이용하여 표면 위의 하나 이상의 물체에 제2 힘을 적용하여 표면으로부터 하나 이상의 물체를 제거하는 단계(e), 제2 힘에 의해 표면으로부터 제거된 하나 이상의 물체를 수거하는 단계(f) 및 단계(b) 내지 단계(f)를 반복하는 단계(g)를 포함하는, 물체와 표면 위에 침착된 물질 사이의 결합 친화도의 측정방법을 포함한다.

양태의 기술

본 발명의 기술에서, "물체"라는 용어는 표면에 결합되고 프로브, 예를 들면, AFM 프로브를 사용하여 검출하고/거나 제거할 수 있는 물질을 포함하기 위해 이용된다. 물체는 연구의 관심 대상인 무기 분자, 유기 분자, 생체 분자, 단백질, 파지 미립자, 세포 등일 수 있다. 물체가 표면에 결합되거나 흡수된 후, 물체의 표면에의 결합 친화도에 따라 스캐닝되고 제거된다. 물체는 또한 표면에 침착된 또 다른 물질에 결합될 수 있다. 게다가, "결합"이라는 용어는 공유 결합에 한정되지 않으며, 흡착을 포함하는 분자 결합, 이온 결합 뿐만 아니라 특이 및 비특이 분자 상호작용의 기타 다른 유형들을 포함할 수 있다.

"비교적"이란 용어는 연구할 물체 위에 프로브에 의해 가해진 힘의 양을 기술하기 위해 사용한다. 용어 "비교적"은 오직 힘이 물체를 제거하기에 충분히 높은지 아니면 물체가 제거되지 않을 정도로 너무 낮은지에 의해 힘을 기술할 것이다. 본원에서 "비교적 낮은" 힘은 표면으로부터 물체를 제거하기 위해 필요한 양보다 적은 힘을 기술하기 위해 사용된다. 따라서 비교적 낮은 결합 친화도는 힘을 적용할 때 물체가 표면으로부터 제거되는 결합 친화도이다. 비교적 높은 결합 친화도는 적용된 힘을 견뎌내기에 충분히 강한 결합 친화도이다. "설정점"은 사용자가 프로브를 물체 위에 가하고자 하는 힘의 양이다.

본 발명은 표준 AFM 프로브를 이용하여 표면상의 물체에 힘을 적용한다. 표준 AFM 프로브는 프로브와 팁을 포함한다. 프로브는 AFM에 연결된다. 프로브의 편향은 적용된 힘을 측정하기 위해 사용되며 본원에서 추가로 설명된다. 팁은 표면을 가로질러 스캐닝할 때 표면 및 이에 결합된 물체에 접촉된다. 인지할 수 있듯이, 통상의 프로브 또는 기타 철물 조각이 부착되어, AFM 또는 기타 다른 기구에 의해 표면을 가로질러 이동될 수 있다. 단지 기구, 프로브 및 팁이 표면이나 표면 위에 침착된 물질에 결합된 물체에 목적하는 힘을 적용하기에 충분히 정밀할 필요가 있다.

끝으로, 본 기술은 물체와 이 물체가 결합되어 있는 표면 또는 표면 위의 물질 사이의 인력을 일반적으로 언급하기 위해 "결합 친화도"라는 용어를 사용한다. 표면에 결합된 물질은 랜덤하게 결합되거나, 표면상에 배열을 형성하기 위해 특정 침착 영역에 위치할 수 있다. 침착 물질 및 이의 배열이, 전문이 본원에서 참조문헌으로 인용되는 동시에 계류중인 미국 특허원 제09/574,519호에 추가로 기술되어 있다.

도 1a 내지 도 1c, 도 2a 및 도 2b를 참조하여, 본 방법 발명의 개요를 본원에서 기술할 것이다. 그 후, 장치의 각종 성분들을 보다 상세히 기술하고 특정 실시예를 상술할 것이다.

방법

도 1a는 하나 이상의 물체(12)가 결합되어 있는 표면(10)을 나타낸다. 물체(12)는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있는 결합 상호작용 방법을 이용하여 표면(10)상에 결합된다. 물질을 표면에 결합시킬 수 있는 각종 방법은 공유결합, 비공유결합, 자발적, 정전기적 또는 당해 기술분야에 공지되어 있는 기타 다른 방법들을 포함한다. 물체(12)는 무기 또는 유기 분자, 예를 들면, 단백질 또는 세포 또는 파지 미립자와 같은 미립자일 수 있다. 표면(10)과 물체(12)가 본원에서 추가로 기술될 것이다.

도 1a에 나타낸 바와 같이, 본 발명은 프로브(14)를 추가로 포함한다. 본원에서 사용된 프로브(14)는 캘리포니아의 산타바바라에 소재하는 디지탈 인스트루먼츠(Digital Instruments)에 의해 시판중인 표준 실리콘 질화물 원자력 현미경 기법 프로브(도시하지 않음)이다. 프로브는 또한 디지탈 인스트루먼츠에 의해 시판중인 AFM 기구에 부착된다. 도 1a에 나타낸 바와 같이, 프로브(14)는 팁(16)을 추가로 포함할 수 있다. 팁(16)은 사실상 표면(10)과 접촉하는 프로브의 접촉 부분이며 본원에서 보다 상세히 설명된다.

이어서 (물체(12)를 갖는) 표면(10)을 AFM 유동 셀 및 AFM 스캔이 실행되는 액체 매질에 위치시킨다. 액체 매질은 표면(10) 및 연구중인 물체(12)에 따라서 당해 기술분야의 숙련가에 의해 선택될 수 있다.

본 양태에서, AFM은 표면을 스캐닝하고 물체(12)의 위치를 검출하기 위해 이용된다. 도 1b에 나타낸 바와 같이, 팁(16)은 표면(10)상에 물체를 접촉시키고, 사용되는 AFM 스캐닝의 유형에 따라서 물체(12)의 상부에 걸쳐서 라이드될 것이다. 프로브(14)가 물체(12)와 접촉하는 시간 동안, 프로브(14)는 물체(12)와의 상호작용에 의해 편향된다. 프로브(14)의 편향이 AFM 수단에 의해 트랙킹되어 물체(12)의 위치와 크기를 측정하고 기록할 수 있다. 이러한 스캔을 실행하기 위한 AFM의 이용은 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 본 발명의 사용자로 하여금 표면(10)에 결합된 물체(12)의 초기 위치를 측정할 수 있게 한다. 본 발명은 본 발명의 방법 동안 물체가 표면으로부터 언제 제거되는지를 측정하기 위해 이와 같은 단계를 이용한다. 다른 양태에서, 물체(12)를 위치시키는 단계는 본 발명의 특성 및 범위를 변화시키지 않고 생략할 수 있다. 또 다른 양태에서, 물체(12)의 위치는 이들이 표면(10)상에 특정 배열로 위치하기 때문에 이미 공지되어 있을 수 있다.

일단 물체(12)의 위치가 결정되면, 그 후 AFM의 설정점이 증가한다. 설정점의 증가는 실험적으로 측정할 수 있다. 마찬가지로, 설정점이 매우 적은 양으로 증가하여 물체(12)의 상이한 결합 친화도의 층화를 보다 크게 할 수 있다. 증가시, 설정점은 표면(10)상의 물체(12)에 적용된 힘의 양을 증가시킨다.

제2 스캐닝 동안, 설정점 힘을 표면(10) 위의 물체(12)상에 가한다. 프로브(14)의 팁(16)이 물체(12)와 접촉하는 경우, 힘이 물체(12)를 이동시키거나 옮겨 놓는 데 필요한 힘보다 작으면, 팁(16)과 프로브(14)가 도 1b에 나타낸 바와 같이 물체(12) 위에 걸쳐서 라이드될 것이다. 이러한 경우에, 물체(12)와 표면(10)과의 비교적 높은 결합 친화도는 물체(12)에 가해진 비교적 낮은 힘에 의해 깨지지 않는다. 그러나, 팁(16)과 프로브(14)에 의해 가해진 힘이 물체(12)와 표면(10) 사이의 결합 친화도보다 비교적 높은 경우, 힘이 물체(12)를 표면으로부터 제거할 수 있다. 도 1c를 참조한다.

당해 기술분야의 숙련가에 의해 추가로 인지될 수 있는 바와 같이, 프로브(14)는 가해진 힘이 물체(12)와 표면(10) 사이의 결합 친화도보다 큰 시점까지 물체(12)에 가하는 힘에 의해 편향될 수 있다. 당해 프로브(14)의 편향은 AFM 기구에 의해 모니터링된다. 표면(10) 전체를 이런 방식으로 스캐닝하면서, AFM 기구는 물체(12)가 제거된 데이터를 수거하고 또한 각각의 제거된 물체(12)에 대한 프로브의 편향도의 데이터를 수거할 수 있다. 하나의 양태에 있어서, 편향도는 각각의 설정점 힘에서 제거된 물체(12)의 결합 친화도를 측정하기 위해 이후에 이용될 수 있다. 또 다른 양태에서, 결합 친화도는 적용된 설정점 힘과 관련된 바와 같이 측정될 수 있다.

본 발명의 방법의 다음 단계에서는, 제거된 물체(12)가 특성화 및 추가의 연구를 위해 수거될 수 있다. 본 발명의 방법에서 제거된 물체(12)는 유동 셀의 액체 매질에 현탁된다. 유동 셀로부터의 분자 및 기타 물질의 수거는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지되어 있으며, 표준 방법에 의해 성취될 수 있다. 수거된 물체(12)는 특성화 및 추가의 연구를 위해 이러한 방식으로 수득될 수 있다. 또 다른 양태에서는, 표면(10)에 여전히 결합되어 있는 물체(12)가 특성화 및 연구를 위해 또한 수득될 수 있다. 침착 영역이 공지된 위치에 공지된 물질을 함유하는 또 다른 하나의 양태에 있어서, 물체(12)가 제거된 곳에 위치시키기 위해 표면(10)을 다시 스캐닝함으로써 특성화를 위해 물체(12)를 수거할 필요없이 어떤 물질의 결합 친화도가 비교적 높고 비교적 낮은지를 사용자에게 알려줄 수 있다.

본 양태의 다음 단계에서, AFM은 표면에 남아 있는 물체를 위치시키기 위해다시 이용된다. 인지할 수 있듯이, 선택된 물체(12)의 표면(10)에의 결합 친화도와 비교하여 설정점이 비교적 높게 설정된 경우, 적용된 힘은 물체를 모두 제거할 수 있다. 마찬가지로, 설정점이 비교적 낮게 설정된 경우, 이 때 적용된 힘은 표면(10)상의 물체(12)를 단지 몇 개 제거하거나 하나도 제거할 수 없다. 일단 잔여 물체(12)의 위치가 결정되고 나면, 설정점은 프로브(14) 및 팁(16)이 다음 스캐닝 동안에 물체(12)에 보다 큰 힘을 가하도록 소정의 양만큼 증가한다.

당해 기술분야의 숙련가에 의해 인지되듯이, 물체(12)를 위치시키고, 물체(12)에 힘을 적용하고, 이어서 용액으로 옮겨진 물체(12)를 수거하는 사이클을 수회 반복할 수 있다. 표면(10)에 위치한 다양한 물체(12)에 따라서, 표면(10)으로부터 이들을 제거하기 위해 필요한 상이한 힘의 범위는 작을 수도 있고 클 수도 있다.

점진적인 힘의 증가가 특히 적은 경우, 이 때 물체(12)와 각각의 실행 동안에 제거된 물체(12)의 표면(10) 사이의 결합 친화도는 공지된 설정점 힘으로부터 근접할 수 있다. 또 다른 하나의 양태에서, 프로브의 편향도는 결합 친화도를 개별적으로 산출하기 위해 (이하에 기술된 바와 같이) 이용될 수 있다. 점진적인 힘의 증가량이 보다 큰 경우, 프로브의 편향도를 이용하는 것이 물체(12)와 표면(10) 사이의 상대 및 절대 결합 친화도를 측정하는 가장 정확한 방법일 수 있다. 보다 적은 점진적 설정점 힘이 물체(12)에 적용되는 경우, 결합 친화도는 상이한 결합 친화도의 계층을 결정하기 위해 적용된 설정점 힘과 관계될 수 있다.

인지할 수 있듯이, 본 발명의 방법은 특히 제1 물체(12)와 제2 물체 사이의결합 친화도를 연구하는 데 유용하다. 제1 물체(12)가 표면에 결합되고, 제2 물체(12)가 이에 결합될 수 있다. 제1 물체(12)로부터의 제2 물체의 분리는 사용자가 두 물체(12) 사이의 결합 친화도를 특징 지을 수 있게 한다. 이러한 상호작용은 상보적 및 부분적으로 상보적인 핵산, 약제 후보 분자 및 이의 분자 표적, 유기체의 부분 또는 완전 프로테옴 또는 유기체를 구성하는 단백질, 바이러스, 박테리오파지, 식물 및 동물 세포 뿐만 아니라 각종 물질 및 시스템을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법은 반복성 벤치 화학 반응 및 일련의 마이크로타이터 플레이트 실행의 이용이 필요하지 않으므로 특히 유리하다. 더우기, 본 발명은 다양한 결합 친화도와 동시 비교하여 상이한 유형의 각종 물체(12)가 동일 표면 또는 표면상에 침착된 동일 물질에 결합될 수 있으므로 유리하다.

장치

본 발명을 보다 충분히 설명하기 위해 본 발명의 성분들을 이하에 기술한다.

물체(12)는 당해 기술분야의 숙련가에게 공지된 방식으로 표면 위나 표면에 위치하거나, 침착되거나, 결합되거나 또는 흡착될 수 있으며, 기계적 침착, 동일 계내 화학적 합성, "잉크 젯" 프린팅 또는 기타 침착 방법, 예를 들면, 용액으로부터의 흡착, 생체 고분자 인식 및 비공유 또는 공유 화학적 결합을 포함하나 이에 한정되는 것은 아니다. 물체(12)는 분자, 단백질 또는 세포와 같은 생체 분자, 무기 분자 또는 연구의 관심대상인 파지 입자와 같은 기타 다른 입자일 수 있다. 또한, 연구를 위한 추가의 물체(12)를 본 발명의 특성과 범위를 변화시키지 않고 표면(10) 위에 배치할 수 있다.

또 다른 양태의 결합 친화도는 이하의 것들을 포함한다:

자발 흡착당해 방법에서는 물질이 용액으로부터 표면으로 직접 흡착될 수 있다. 부착 방법이 반드시 한정되는 것은 아니나, 흡착중인 물체와 같은 것들에 대해서 균일하다. 부착 메카니즘은 정전기적, 소수성 또는 기타 성분들을 포함할 수 있다.

한정된 정전기적 상호작용당해 방법에서는, 한정된 정전기적 특성을 갖는 표면이 생성된다. 예를 들면, 폴리-L-리신은 양 전하의 비교적 균일한 분포를 갖는 표면을 생성하는 표면에 흡착될 수 있다. 이어서, 물질이 물질상의 음 전하 잔기와 양 전하 표면 사이의 상호작용을 거쳐 폴리-L-리신 피복된 표면에 흡착된다. 전해질 및 다양한 pH의 완충제를 포함할 수 있는 주위 용액의 변화는 물질의 표면에의 결합 점성을 초래한다.

한정된 소수성 상호작용당해 방법에서는, 한정된 소수성 표면이 생성되어 물질에 결합한다. 하나의 예시에 있어서, 소수성 표면은 기판을 금으로 피복시킨 후 말단 메틸 그룹을 갖는 알칸티올레이트로 처리하여 제조한다. 이어서 이 표면을 물질의 침착 기판으로서 사용한다. 강한 소수성 영역을 갖는 물질은 보다 덜 소수성인 영역보다 단단하게 말단 메틸 그룹에 결합된다.

공유 결합어떤 경우에는, 표면에 공유 결합된 물질과 비공유 결합된 물질 사이에서 구별하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 경우에, 한정된 화학적 결합 화학 물질을 사용할 수 있다.

전착당해 방법에서는 물질이 전기장을 통해 발생된 힘에 의해 표면에 연신된다. 비대칭 AC장이나 DC장을 사용할 수 있으며, 이들은 각각 유전연동(dielectrophoretic) 또는 전기영동(electrophoretic) 환경을 생성할 수 있다. 물질이 위에서 기술한 바와 같이 자발적 메카니즘에 의해 표면에 부착되거나, 또는 부착이 더욱 한정된 결합 방법을 포함할 수 있다. 어떤 경우에는, 산화-환원(redox)반응이 침착중인 물질과 표면 사이에서 일어나고, 그 결과 표면들 사이에서 공유 결합이 일어날 수 있다. 이러한 방법에 있어서, 표면은 일반적으로 전도성을 띄고, 전극에 결합된다. 제2 전극이 또한 계내에 존재하여 회로를 완성하고 전기장을 발생시킨다.

화학적 가교당해 방법에서는 한정된 화학적 특성을 갖는 표준 방법에 의해 표면이 제조된다. 예를 들면, 유리(glass) 표면은 유리(free) 말단 아미노 그룹을 갖는 실란 유도체로 피복될 수 있다. 실란 표면을 측면 가교시켜 안정화시킨 후, 물질을 표면에 첨가하고 당해 기술분야에 공지되어 있는 1급 아민을 포함하는 다수의 화학적 반응을 통해 결합시킬 수 있다.

상기 결합 상호작용 중 어떤 것은 본 발명의 특성 및 범위를 변화시키지 않고 본 발명을 이용하여 특성화할 수 있다.

앞서 기술한 바와 같이, 본 양태의 표면(10)은 스퍼터링된 금 층이 침착된 유리로 제조된다. 이러한 표면은 스퍼터링된 금 층으로 피복된 유리 커버가 당해 기술분야에 공지되어 있고 용이하게 수득(제조)되므로 특히 유용하다. 스퍼터링된 금 층을 갖는 유리 슬라이드는 이의 평활하고 일정한 표면(10) 특성으로 인하여 특히 유용하다. 금을 스퍼터링함으로써 다양한 화학적 작용 및 분자 결합이 수행될 수 있는 매우 평활한 표면을 생성할 수 있다. 금 표면은 비록 기타 다른 커버 또는 커버가 없는 표면을 본 발명의 특성 및 범위를 변화시키지 않고 이용할 수 있더라고 상기 이유로 인하여 유리할 수 있다.

다른 양태에 있어서, 금은 평활한 규소, 석영 또는 유사한 편평한 표면, 예를 들면, 운모, 개질된 Si, (폴리)테트라플루오로에틸렌, 관능화된 실란, 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리프로필렌 또는 이의 배합물 위에 스퍼터링될 수 있다. 하부 기판에 요구되는 평활함은 특별한 테스트에 대한 민감성 요건의 기능이다. 보다 작은 물체를 이용한 결합 친화도 분석 결과는 만족스런 결과를 달성하기 위해 보다 균일한 표면을 필요로 할 수 있다. 물체(12)를 수용할 수 있고 이에 단단히 결합될 수 있는 표면(10)이 또한 물체(12)와 연구중인 결합 친화도에 따라 목적될 수 있다.

표면(10)에 존재하는 물체(12)는 표면(10)에 결합된 하나의 물체(12)로 한정될 수 있다. 또 다른 양태에서는, 표면(10)이 이에 결합된 하나, 몇 개의 또는 수백개 이상의 물체를 포함한다. 각각의 물체는 공지된 영역 또는 이 후에 표준 AFM 스캔을 이용하여 측정되는 공지되어 있지 않은 영역에 결합될 수 있다. 게다가, 물체(12)는 특히 한 가지 유형의 분자 또는 미립자일 수도 있고, 이의 상대 결합 친화도를 측정하기 위해 동시에 연구중인 다양한 분자, 생체 분자 또는 미립자일 수도 있다.

당해 기술분야의 숙련가에 의해 인지될 수 있듯이, 프로브(14) 및 팁(16)은하나의 장치를 포함할 수 있다. AFM은 프로브(14) 및 팁(16)의 이동을 조절하고, 따라서 물체(12)에 힘을 가한다. 개질되지 않은 AFM 프로브는 곡률 반경이 5nm 내지 40nm 사이인 예리한 점을 갖는다. 본원에서 당해 방법은 정점 반경이 10nm 내지 50nm의 순서인 미세가공 프로브를 사용한다. 본 발명의 방법에서, AFM은 목적하는 결과를 달성하기 위해 필요한 마이크로파인(microfine) 조절을 갖는 유용한 표준 기구이므로 프로브를 이동시키기 위해 이용한다. 본 방법에 사용하기에 특히 적합한 이와 같은 기구는 캐나다의 산타바바라에 소재하는 디지탈 인스트루먼츠 인코포레이티드(Digital Instruments, Inc.)에 의해 시판중인 디멘션(Dimension) 3100이다. 또 다른 양태에서는 기타 다른 유형의 스캐닝 프로브 현미경을 포함하는 다른 조절 장치가 프로브 및 팁을 조절하기 위해 사용될 수 있다.

프로브(14)가 물체(12)와 직접 접촉하는 경우, 물체와 프로브(14) 사이에 수직 힘이 존재하여 그 힘이 물체를 한 방향으로 밀려고 할 것이다. 인지할 수 있듯이, 그리고 도 2a 및 도 2b에 나타낸 바와 같이, 팁(16)은 프로브(14)의 뒤틀림을 야기하는 이러한 방식으로 중심 접촉을 어긋나게 할 수 있다. 이러한 상황에서, 프로브(14)는 물체(12)와의 수직 힘 및 토션 힘 둘 다의 상호작용에 적용된다. 이어서 물체(12)는 또한 수직 힘 및 토션 힘이 적용된다. 이는 도 1a에 나타낸 바와 같이 팁(16)과 프로브(14)의 수직 변위를 초래하나, 또한 도 2b에 나타낸 바와 같이 프로브(16)를 토션 트위스트시킬 수 있다. 그러나, AFM 기구는 프로브(14)의 굽힘과 뒤틀림에 의해 나타낸 바와 같이 존재하는 토션 힘과 수직 힘 둘 다를 동시에 판독할 수 있다. 이 때 수직 힘과 토션 힘은 모두 표면(10)이나 물체(12)에 가해지는 힘의 양을 측정하기 위해 이용할 수 있다.

프로브(14)의 탄성 상수가 공지되어 있으므로, 물체(12)가 표면(10)으로부터 제거되는 지점까지 물체(12)에 가하는 힘은 후크의 법칙, 즉 F=kX(여기서, F는 힘이고, k는 탄성 상수이고, X는 변위 거리이다)를 이용하여 용이하게 계산할 수 있다.

표면(10) 또는 표면(10)에 결합된 침착 물질로부터 물체(12)를 변위시키는 데 필요한 하중도는 물체(12)의 표면(10)과의 결합 강도와 직접적으로 상관 관계에 있을 수 있다. 프로브(14)의 토션 및 팁과 표면(10) 사이의 마찰 상호작용은 정량 측정 착물을 제조할 수 있으나, 상대 힘 측정이 용이하게 수득된다.

본 양태에 있어서, 적용된 수직 힘은 물체(12)가 제거되는 지점까지 AFM 프로브의 편향을 모니터링하여 측정된다. 인지할 수 있듯이, 물체(12)에 가해진 증가한 힘과 프로브에 의해 수득된 측정값 사이의 지연 시간은 직접 측정되지 않는 물체에 가해지는 소량의 힘을 초래할 수 있다. 그러나, 이러한 갭은 AFM 기구 또는 컴퓨터로 산출할 수 있다.

실시예 1: 분자력 패닝(panning)

당해 실시예에서, 본 발명은 표면(10)에 결합된 항원으로부터 항체를 선택적으로 제거하기 위해 사용된다. 이어서 항체와 항원 사이의 결합 친화도를 측정한다. 당해 실시예는 본 발명이 침착된 래빗 IgG와 항 래빗 IgG사이의 결합 친화도를 측정하기 위해 어떻게 이용될 수 있는지를 나타낸다.

당해 실시예의 표면은 스퍼터링된 금 층에 의해 피복된 유리 슬라이드로 구성된다. 래빗 IgG는 비특이 결합 상호작용에 의해 금 표면에 결합된다. 이어서 표면은 수성 영상 환경, 당해 경우에서는 실란-인산염 완충 용액을 포함하는 AFM 유동 셀에 삽입된다. 완충 용액은 AFM의 압전체와 래빗 IgG가 위치한 표면 사이에 트랩된 pH 7.5의 20mm PBS 용액이다. 본 양태에서는, 래빗 IgG가 표면상에 랜덤하게 위치하며, 표면상의 항원의 위치를 측정하기 위해 표면을 스캐닝한다. 인지할 수 있듯이, 항원은 수 많은 방법을 이용하여 표면상의 공지된 위치에 위치할 수 있으므로, 공지된 위치와 크기의 영역에 존재할 수 있다. 또 다른 양태에서는, 항체/항원 착물이 표면상의 랜덤하고 공지되어 있지 않은 위치에 있을 수 있다. 결합 친화도의 측정은 본 발명을 이용하여 여전히 용이하게 달성할 수 있다. 항원을 함유하는 용액에 표면을 침지시키는 것과 같은 다양한 침착 기술을 또한 이용할 수 있다.

항원의 첨가는 유동 셀에 1mg/mL의 PBS 1㎕를 마이크로피펫으로 옮겨 수행한다. 이어서 표준 AFM 스캔 및 프로브를 이용하여 표면을 스캐닝하여 항원/항체 상호작용의 위치를 측정한다. AFM의 설정점 수준을 증가시킨 후, 후속 스캐닝을 행한다. 프로브의 편향을 신중하게 모니터링하여 항원/항체 착물과의 접촉이 일어나는 곳을 나타낸다. 이어서 설정점의 점진적인 증가가 달성되어 상당히 좁은 범위의 적용된 힘내에서 항원으로부터 항체를 제거한다. 생성된 착물의 균일한 동일성으로 인해 좁은 범위내에서의 항체의 제거가 기대된다. 설정점 힘의 각각의 증가 사이에 표준 AFM 스캔을 수행하여 항원/항체 착물이 언제 분리되는지를 나타내는 것을 돕는다. 이 때 항원/항체를 분리시키기 위해 필요한 힘과 관련있는 힘의 값을 이용하여 이의 상대 결합 친화도를 측정할 수 있다. 결합 친화도는 또한 항원 및 항체 착물이 제거될 때 AFM 기구에 의해 모니터링되는 바와 같이 프로브의 편향에 대하여 계산할 수 있다.

인지할 수 있듯이, 상기 실시예는 이의 대응하는 항체에의 상대 결합 친화도를 측정하기 위해 다수의 상이한 항원을 이용하여 반복할 수 있다. 추가의 양태에서는, 다양한 항체 또는 항원이 각각의 상대 결합 친화도를 측정하기 위해 동시에 실행될 수 있다. 다양한 힘의 수준에서 어떤 항체가 떨어져 나가는지는 그 힘의 설정점에서 제거된 항체를 측정하기 위해 수성 영상 용액을 수거하고 특성화 테스트를 수행함으로써 측정할 수 있다.

추가의 양태에서는, 항원/항체 착물이, 증가한 설정점 스캔 동안에 착물 전체가 제거되지 않음을 보증하는 표면에 결합될 수 있다.

실시예 2. 파지 및 바이러스 상호작용의 친화도에 기초한 선택을 위한 힘의 패닝

도 3a 및 도 3b에 나타낸 바와 같이, 힘의 패닝은 또한 표면으로부터 약하게 결합된 바이러스 또는 파지 입자를 선택적으로 제거하여 표면에의 결합 친화도가 높은 이들 입자를 수거 및 식별하는 데 사용할 수 있다. 파지 표시는 파지 입자의 표면상의 잠재적으로 목적하는 재조합형 단백질의 커다란 전체적 효과를 나타내기 위해 당해 기술분야에 공지된 방법이다. 파지는 이들이 표면상에 특정 단백질을 생성하도록 되어 있다. 매우 커다란 조합 라이브러리의 단백질이 파지의 표면상에 배열되고 스크리닝 메카니즘에 의해 선택될 수 있다. 일단 선택되고 나면, 목적하는 파지가 증식하고, 목적하는 특성을 갖는 분자가 정제되고 식별될 수 있다. 이는 커다란 라이브러리의 재조합형 생체 분자를 분석하는 데 효과적인 방법이다.

일단 파지 집단이 구성되고 나면, 이를 분류하여 관심 대상인 분자를 나타내고 있는 몇몇 파지를 발견할 수 있다. 지금까지는 표시된 분자가 결합된 분자로 피복된 마이크로타이터 디쉬로부터 파지를 반복 결합 및 세척하여 이를 수행하였다. 힘의 패닝은 이 지루한 방법의 여러가지 한계점을 극복한다.

본 발명의 실시예에서는, 섬유결합소에 결합된 세포간질 단백질을 이용한다. 본 실시예는 섬유결합소에 결합된 다양한 단백질을 결합 친화도에 의해 구별할 수 있는 방법을 나타낸다.

파지는 표준 방법으로 제조하고 정제한다. 당해 실시예에 이용된 표면은 스퍼터링된 금으로 다시 피복된 유리이다. 섬유결합소가 자발적 비특이 결합 상호작용에 의해 표면에 결합되고, 파지가 이에 합성된다. 인지할 수 있듯이, 섬유결합소는 또 다른 양태에서 표면 또는 표면에 침착된 침착 물질에 공유 결합되거나 그렇지 않으면 고정 결합될 수 있다.

섬유결합소에 결합되지 않은 과량의 파지는 금 층으로부터 세척될 수 있다. 이어서 섬유결합소 및 파지 착물을 함유하는 표면이 AFM 기구에 배치되고 적용된 적은 힘에서 상을 만들어 결합 착물의 위치를 측정한다. 이어서 설정점을 점진적으로 증가시켜 섬유결합소/파지 착물에 적용된 힘을 증가시킨다. 느슨하게 결합된 파지 입자는 차후에 각각의 적용된 설정점 힘에 의해 표면으로부터 제거되고 피복 용액에 확산된다. 이용한 용액은 3중 완충제, pH 7.2, NaCl(100mM)을 함유하는 결합 완충제이다. 이들 완충제 및 기타 다른 완충제를 함유하는 다른 용액들을 목적하는 바와 같이 이용할 수 있다. 당해 방법이 수행되는 용액을 영상실을 통해 사이클링시키거나 유동시켜 힘 패닝 방법에 의해 표면으로부터 제거된 파지 입자의 제거를 증가시킬 수 있다. 점진적으로 증가된 각각의 힘에서 제거된 파지는 추가의 연구를 위해 수거되고 식별될 수 있다. 힘은 파지가 제거될 때까지 증가하거나 특정 설정점에 도달한 후에 중지될 수 있다. 최후 힘이 적용된 후에 표면에 남아 있는 파지는 또한 추가의 연구를 위해 수거될 수 있다.

힘 패닝에 따라 표면에 결합되어 남아 있는 파지를 수거하기 위해 몇 가지 방법을 사용할 수 있다. 한 가지 방법은 경우에 따라 Tween-80과 같은 계면활성제를 함유하는 높은 염(예를 들면, 500mM NaCl) 용액을 갖는 표면을 세척하여 용액에 남아 있는 파지의 제거를 용이하게 하는 것일 수 있다. 이 때 이는 결합 친화도가 가장 큰 파지 입자의 증식 및 분석을 위한 파지 입자의 공급원으로서 사용될 수 있다.

파지를 수거하기 위한 또 다른 접근법은 차후의 복구를 위해 표면으로부터 파지 입자를 수거할 수 있는 점착층(예를 들면, 이 경우에는 섬유결합소 단백질)으로 피복된 AFM 프로브를 이용하는 것이다. 이 접근법은 표면으로부터 프로브로 파지의 전이를 최적화시키기 위해 상대 결합 힘의 정밀한 튜닝을 필요로 한다.

실시예 3. 세포-표면 상호작용의 친화도에 기초한 선택을 위한 힘의 패닝

또 다른 실시예에서는, 다양한 표면 및 표면에 침착된 물질에 세포가 결합되는 점착성을 분석하기 위해 힘의 패닝을 이용할 수 있다. 세포와 표면 사이의 점착력은 다양한 생리학적 기능의 중요한 파라미터이다. 예를 들면, 혈구가 동맥 벽에 너무 단단히 결합되어 있으면, 혈류의 차단이 발생하여 생물학적 장애나 심지어는 죽음조차도 초래할 수 있다. 본 발명의 방법은 또한 다른 유형의 세포와 각종 표면 사이의 점착력의 양을 특징 지우는 것을 돕기 위해 이용할 수 있다. 이러한 방법은 관심 대상인 세포에 대하여 낮거나 높은 점착성을 갖는 표면을 특성화한다(이러한 경우에, 세포는 통상적인 분자 상호작용 감각으로 표면에 결합될 수 없으나, 비특이 상호작용을 통해 표면에 부착될 수 있다). 이 기술은 세포를 부착시키는 생물학적 시스템에 사용되는 물질과 같은 것 및 기타 다른 생물학적 물질을 측정하는 데 유용할 수 있다.

당해 실시예에서, 적혈구는 제1 합성 중합체(중합체 1)로 피복된 유리에 결합된다(도 4a). 결합된 후, 적혈구에 본 발명을 적용하여 결합 친화도를 측정한다. 스캔을 생리학적 용액(예를 들면, PBS)에서 수행하고, 표면으로부터 세포를 제거하는 데 필요한 힘을 주목한다. 이어서 동일한 세포 유형을 제2 중합체(중합체 2)로 피복된 표면에 결합시키고, 당해 방법을 반복한다(도 5a). 각각의 표면으로부터 세포를 제거하는 데 필요한 힘을 비교함으로써, 적혈구를 결합시키거나 결합시키지 않는 이의 능력에 대하여 중합체를 비교할 수 있다. 점착성의 측정은 프로브에 의해 적용된 토션 힘 및 수직 힘에 기초할 수 있다. 정량적인 측정은 세포를 변위시키기 위해 사용된 힘을 산출함으로써 수득할 수 있다.

또 다른 양태에서는, 각종 중합체를 접촉이나 잉크젯 프린팅에 의해 표면 위에 "프린트"할 수 있다. 이어서 이 표면을 적혈구와 함께 배양하고, 감시하에 중합체 모두를 단일 힘 패닝 실험에서 동시에 시험한다.

도 4b에서, 세포는 스캐닝 방법에 의해 발생된 것보다 적은 힘으로 표면에 결합된다. 낮은 세포 결합력으로 인하여 대부분의 세포들은 스캐닝 동안에 표면으로부터 변위된다. 도 5b에서, 세포는 스캐닝 방법에 의해 발생된 것보다 큰 힘으로 표면에 결합된다. 세포는 설정점 힘을 적용하는 표면을 가로지르는 AFM 스캐닝에 의해 변위되지 않는다. 당해 방법의 변화는 사용자가 세포/표면 결합의 강도에 관하여 정량적인 정보를 수득할 수 있도록 한다.

또 다른 하나의 양태에서는, 세포 손상을 최소화하기 위해 특수화된 AFM 프로브를 사용한다. 특수화된 프로브는 AFM 프로브의 말단에 미세입자를 결합시킴으로써 "블런트(blunt)"로 제조될 수 있다. 미세입자의 프로브 말단에의 결합은 동시에 계류중인 미국 특허원 제09/574,519호에 추가로 기술되어 있다. 블런트된 프로브는 분석중인 세포로의 감소된 수의 슬라이싱을 가지며, 플라우(plow)와 같이 작용하여 이들을 파열시키지 않고 연질 세포에 대하여 가압한다.

또 다른 양태에서는, 세포-기판 상호작용을 초래하는 단백질을 식별할 수 있도록 세포들을 다수로 단리시키고 재생할 수 있다. 재조합형 단백질을 함유하는 세포인 경우에, 당해 방법은 세포가 목적하는 특정 특성을 갖는 세포 표면 단백질을 증폭시키는데 사용될 수 있는 파지 표시 방법과 유사한 것으로 여겨질 수 있다.

또 다른 양태에서는, 각각의 물체에 적용된 힘이 일정하게 남아있어 물체에 적용되는 반복적인 일정 힘의 효과를 측정할 수 있다. 인지할 수 있듯이, 표면 또는 표면에 침착된 물질에 대한 물체의 결합 친화도를 분석하기 위해 기타 연구들을또한 수행할 수 있다.

본원에서 기술된 정보 및 실시예는 설명을 목적으로 하며, 본 발명의 개념적인 문맥내에서 어떤 파생 또는 대안 방법을 제외하는 것을 의미하지 않는다. 본 발명의 범위에서 벗어나지 않으면서 당해 양태가 다양하게 변화될 수 있는 것으로 생각된다. 따라서, 본 발명의 범위는 당해 양태의 상기 기술에 의해서보다 첨부된 청구항에 의해 나타내고자 한다.

Claims

표면에 하나 이상의 물체를 부착시키는 단계,

표면 위의 하나 이상의 물체에 힘(force)을 적용하여 표면에 대한 결합 친화도가 비교적 낮은 하나 이상의 물체를 제거하는 단계,

하나 이상의 물체에 적용된 힘을 모니터링하는 단계 및

하나 이상의 물체를 제거하기 위해 적용된 힘으로부터 하나 이상의 물체와 표면 사이의 결합 친화도를 산출하는 단계를 포함하는, 물체와 표면 사이의 결합 친화도의 측정방법.
제1항에 있어서, 스캐닝 프로브 현미경(scanning probe microscope)이 원자력 현미경(atomic force microscope)인 방법.
제1항에 있어서, 힘이 원자력 현미경을 이용하여 하나 이상의 물체에 적용되는 방법.
제1항에 있어서, 적용된 힘에 의해 표면으로부터 제거된 하나 이상의 물체를 수거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 표면 위에 하나 이상의 물체를 위치시키기 위해 표면을 다시 스캐닝하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제5항에 있어서,

적용한 증가된 힘을 이용하여 표면을 스캐닝하는 단계(a) 및

증가된 힘에 의해 제거된 물체들을 수거하는 단계(b)를 추가로 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 단계(a) 및 단계(b)를 반복하는 단계(여기서, 적용된 힘은 연속적으로 증가한다)를 추가로 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 표면으로부터 하나 이상의 물체를 수거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제6항에 있어서, 하나 이상의 물체가 단백질, 핵산, 항체, 세포, 바이러스 및 파지 입자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
하나 이상의 물질이 침착되어 추가로 포함된 표면을 수득하는 단계,

표면에 침착된 하나 이상의 물질에 하나 이상의 연구 물체를 부착시키는 단계,

하나 이상의 물체에 힘을 적용하여 하나 이상의 물체를 제거하는 단계 및

물체를 제거하기 위해 적용된 힘으로부터 물체와 대응하는 물질 사이의 결합 친화도를 산출하는 단계를 포함하는, 물체와 하나 이상의 물질 사이의 결합 친화도의 측정방법.
제10항에 있어서, 대응하는 물질로부터 물체를 제거하는 데 필요한 힘을 모니터링하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 스캐닝 프로브 현미경을 이용하여 표면을 스캐닝하여 하나 이상의 물체를 위치시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 표면 스캐닝과 하나 이상의 물체에 대한 힘 적용이 액체 매질 속에서 수행되는 방법.
제11항에 있어서, 대응하는 물질로부터 제거된 하나 이상의 물체를 수거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제10항에 있어서,

하나 이상의 물체에 점진적으로 증가된 힘을 적용하는 단계 및

적용된 증가한 힘에 의해 제거된 하나 이상의 물체를 수거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제15항에 있어서, 표면에 남아 있는 하나 이상의 물체를 수거하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 결합 친화도 상호작용이 분자간 상호작용인 방법.
제10항에 있어서, 측정된 결합 친화도가 단백질 상호작용을 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 측정된 결합 친화도가 핵산 상호작용을 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 측정된 결합 친화도가 항체/항원 상호작용을 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 측정된 결합 친화도가 수용체/리간드 상호작용을 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 측정된 결합 친화도가 세포/세포 상호작용을 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 측정된 결합 친화도가 세포/기질 상호작용을 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 측정된 결합 친화도가 바이러스/바이러스 상호작용을 포함하는 방법.
제10항에 있어서, 측정된 결합 친화도가 바이러스/기질 상호작용을 포함하는 방법.
표면에 하나 이상의 물질을 침착시키는 단계,

표면에 침착된 물질에 하나 이상의 물체를 부착시키는 단계,

표면에 부착된 하나 이상의 물체를 위치시키기 위해 원자력 현미경을 이용하여 표면을 스캐닝하는 단계,

원자력 현미경을 이용하여 하나 이상의 물체에 힘을 적용하는 단계(힘은 사용자에 의해 결정되고, 어떤 물체는 이러한 힘에 의해 표면으로부터 제거된다),

여전히 표면에 부착되어 있는 하나 이상의 물체를 위치시키기 위해 표면을 스캐닝하는 단계,

원자력 현미경을 이용하여 표면 위의 하나 이상의 물체에 보다 큰 제2 힘을 적용하는 단계 및

여전히 표면에 부착되어 있는 하나 이상의 물체를 수거하는 단계를 포함하는, 물체와 표면 사이의 상호작용 힘의 평가방법.
표면에 하나 이상의 물체를 침착시키는 단계(a),

표면 위에 물체를 위치시키기 위해 원자력 현미경을 이용하여 표면을 스캐닝하는 단계(b),

원자력 현미경을 이용하여 표면 위의 하나 이상의 물체에 제1 힘을 적용하여 결합 친화도가 비교적 낮은 표면으로부터 하나 이상의 물체를 제거하는 단계(c),

제1 힘에 의해 표면으로부터 제거된 하나 이상의 물체를 수거하는 단계(d),

원자력 현미경을 이용하여 하나 이상의 물체에 보다 큰 제2 힘을 적용하여 결합 친화도가 비교적 낮은 표면으로부터 하나 이상의 물체를 제거하는 단계(e),

제2 힘에 의해 표면으로부터 제거된 하나 이상의 물체를 수거하는 단계(f) 및

단계(b) 내지 단계(f)를 반복하는 단계(g)를 포함하는, 물체와 표면 사이의 결합 친화도의 측정방법.
표면에 하나 이상의 물질을 침착시키는 단계(a),

하나 이상의 물질에 하나 이상의 물체를 결합시키는 단계(b),

원자력 현미경을 이용하여 표면 위의 하나 이상의 물체에 제1 힘을 적용하는 단계(c),

제1 힘에 의해 표면으로부터 제거된 하나 이상의 물체를 수거하는 단계(d),

원자력 현미경을 이용하여 표면 위의 하나 이상의 물체에 제2 힘을 적용하여표면으로부터 하나 이상의 물체를 제거하는 단계(e),

제2 힘에 의해 표면으로부터 제거된 하나 이상의 물체를 수거하는 단계(f) 및

단계(b) 내지 단계(f)를 반복하는 단계(g)를 포함하는, 물체와 표면 위에 침착된 물질 사이의 결합 친화도의 측정방법.
제28항에 있어서, 적용된 힘으로부터 물체와 표면상에 침착된 물질 사이의 최소 결합 친화도를 산출하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
제28항에 있어서, 물체가 비특이 결합 상호작용을 이용하여 침착되는 방법.
제28항에 있어서, 물체가 공유결합 상호작용을 이용하여 침착되는 방법.
제28항에 있어서, 물체가 단백질, 핵산, 항체, 세포 또는 바이러스로 이루어진 하나 이상의 그룹으로부터 선택되는 방법.
제28항에 있어서, 상호작용 힘이 항체와 항원 사이에 존재하는 방법.