CN100380124C - 通过力分层和力扫视评价结合力 - Google Patents

Abstract

本发明是一种利用探针将物体从一表面上选择性地移走的方法。该探针用较大的和相对较大的力扫过表面，从而将确定数量的物体从表面上移走。通过利用胡克定律以及探针的弹簧常数，可以计算出将物体从表面上移走所需的力。在与表面具有相对较弱的结合力的物体被移走之后，剩余的物体可被收集起来、得到表征并受到进一步的研究。

Description

通过力分层和力扫视评价结合力

优先权

本申请要求于为2000年10月10日提交的美国临时专利申请60/238,556以及于2001年10月9日提交的美国非临时专利申请No.的优先权。上述临时申请60/238,556和上述美国非临时专利申请的全部公开内容作为参考被引入本申请。

技术领域

本发明是一种根据对结合到表面上的物体或表面上的材料之间相互作用的分子力函数来分析它们的方法。更具体地说，本发明是一种通过物体的结合力(binding affinity)来区分和评价他们的方法。

背景技术

测量材料、分子和细胞间的结合力对广泛的产业来说是至关重要的，这些产业包括但不局限于材料开发、半导体生产、生物分析化验、生物医学诊断和药品开发。随着基于固态阵列的生物分析和遗传诊断仪器以及相关设备的出现，经济合算地筛选处于微固态形式的大量反应的新方法越来越成为了需要。

到目前为止，当一已知的荧光标记分子同一已知的分子种类在分子阵列内的一特定地址相互作用时，有利的方法是监测光学性质的变化，通常是荧光。然而，由于向分子中加入了用来查询分子阵列的指示器(reporter)系统，因而这些装置和方法经常会施加立体化学(stereochemical)的约束。另外，这些方法并不直接报告实际的结合力。因而，使用微机械指示器对分子结合力进行没有标签地直接查询是显而易见的应用。为了更好地分析不同物体结合、吸附或以其它方式附着到多种表面上的范围，就需要使这种查询具有更复杂和稳固的方法。

一种用于直接检测分子或其它物体是否与一个表面或该表面上的物体相结合的方法是扫描探针显微镜。扫描探针显微镜的一种类型是原子力显微镜(“AFM”)。在AFM内，尖锐的探针被放置在弹性悬臂的末端，并且在样品表面上扫描。在扫描时，探针和悬臂受到探针针尖和表面和/或位于表面上的物体的吸引力和排斥力的合力而发生偏转。悬臂的偏转通常通过聚焦激光束从悬臂后面向一分离的光电二极管的偏转来进行测量，从而构成“光杠杆”或“光束偏转”机构。偏转的变化代表了物体在表面上的出现。这些现有方法使用与探针相结合的材料来表示探针和结合到表面的材料之间的相互作用合力。用于检测悬臂偏转的其它方法包括干扰测量法和压电应力仪。

最初的AFM仅记录悬臂的垂直位移。比较新的方法也涉及到扭力的记录，该方法是通过使针尖发生共振并且仅允许探针和样品之间瞬时接触或者在一些情况下根本不接触来完成的。当探针在样品表面横向移动时，其针尖的位移曲线或者共振变化被用来产生形貌图像。这些图像揭示了包括材料、化合物和生物种类在内的大量不同样品类型的三维结构。最近的一些例子包括DNA、蛋白质、染色质、染色体、离子通道，甚至活细胞。然而，这些现有方法仅局限于那些能够结合到探针上并且能够被拖动穿过表面上的不同材料的复合体。一种不局限于该方式的新方法成为了需要。

除了其成像能力之外，AFM能够进行非常微小的力测量。AFM能够直接传感和测量范围为微牛顿(10^-6)到微微牛顿(10^-12)的力。因而，AFM能够把力施加到分子对上，甚至施加到单一分子上，并且测量它们之间的力。另外，AFM还能够测量和施加多种其它的力和现象，例如磁场、热梯度和粘弹性。这种能力可被用来在样品表面绘制力场，并且高分辨力地揭示这些场的位置和幅度，例如，将感兴趣的复合体定位在一个特定的表面上。而且，为了进行附加的分子力测量，AFM探针可以利用感兴趣的分子来实现功能化。

对移走与表面结合的物体所需的机械力进行评价的现有方法包括组合化学技术，例如重复地把一个或多个物体结合到表面上，然后把该物体冲走。通过这种方式，物体结合或吸附到表面上的程度的特征能够基于总体平均(population average)而被测定。经济合算和切实可行地改进工艺以对移走驻留在表面上的物体所需的力进行表征成为了需要。

快速评价与表面结合的分子、细胞或其它物体的结合力的简单有效的方法成为了需要。该方法应能克服现有技术中的局限，即，在现有技术中，当附着到探针时，必须在表面上拉动材料，或者必须随后冲洗微滴定液板，以便基于综合总体样本来测定结合力。该方法也应允许用于测定物体和其它结合到表面上的材料之间的结合力。最后，还需要有消除与感兴趣的表面结合不好的物体以便获得结合更紧密的、用于进一步研究的物体的方法。

附图简介

图1a是与表面上的物体相接触并在该物体上施加垂直力的探针的正视图。

图1b是图1a的探针骑在表面上的物体顶部上的正视图。

图1c是用于移走图1a所示物体的垂直探针力的正视图。

图2a是接近表面上的物体的探针的正视图。

图2b是施加扭力并且骑过表面上的物体的探针的正视图。

图3a是一表面的正面透视图，在探针扫描该表面之前，该表面包括结合到其上的多个噬菌体微粒。

图3b是通过用探针扫描图3a的表面以去掉了结合不好的噬菌体微粒之后该表面的正面透视图。

图4a是一表面上所结合的细胞的分布的正面透视图。

图4b是图4a的细胞经探针扫描后的正面透视图，其中大量细胞被移走。

图5a是一表面上所结合的细胞的分布的正面透视图。

图5b是图5a的细胞经探针扫描后的正面透视图，其中只有很少的细胞被移走。

发明内容

本发明是一种通过调节所施加的力以用力转换设备来有区别地分开和/或移走结合到一表面上的物体的方法。通过递增地增加所施加的力，就可以测定表面和该表面上的物体之间的结合强度。所述物体可包括但不局限于，分子、病毒、细胞、噬菌体和其它有机或无机分子。该过程能够在有图案的表面上进行，以用于快速廉价地筛选大量的结合相互作用，从而用较高的与表面的结合力来分类这些结合相互作用。本发明也可被用于表征物体和沉积于表面上的一些材料之间的结合力的特性。

当AFM和附着在其上的探针在表面上扫描时，探针的针尖会推斥其遇到的物体，从而使探针产生扭曲和偏转。通过针尖施加在给定物体上的力与探针的扭转和垂直弹簧常数有关。可以通过对扭转和/或垂直探针位移的进行定性和定量的测量，以评价物体和表面之间的结合力。对于垂直力，可用弹簧常数来计算所施加的力。对于以扭力为基础的测量，可以先测量出探针的扭转程度，再将其乘以探针的一个已知的扭转弹簧常数，从而产生与所观察到的扭转运动的程度相应的所需力的值。另外，还可以收集从表面移走的每一群物体，以用于进一步的研究。

本发明在开发和研究带有特定结合特性的材料、药物和药物抑制剂、描述生物分子结合强度的诊断化验、蛋白质-蛋白质相互作用筛选、病毒-抗体结合筛选以及许多其它方面是特别有用的。

本发明也包括一种测定物体和表面之间结合力的方法，该方法包括：使至少一个物体附着到表面上；用扫描探针显微镜扫描该表面，以定位附着在该表面上的至少一个物体；对表面上的至少一个物体施加力，以移走与表面有较低结合力的至少一个物体；监测施加到至少一个物体上的所述力；以及根据所施加的用于移走至少一个物体的力来计算至少一个物体和所述表面之间的结合力。

本发明的另一实施例包括一种用于测定物体和一个或多个材料之间的结合力的方法，该方法包括，获得一表面，该表面进一步包括沉积于其上的一个或多个材料；将至少一个待研究的物体附着到沉积于该表面上的所述一个或多个材料上；用扫描探针显微镜扫描该表面，以定位至少一个物体；以及将力施加到至少一个物体上，以移走至少一个物体。

另外，本发明的另一个实施例包括一种用于评价物体和表面之间相互作用力的方法，该方法包括：把至少一个材料沉积到一表面上，使至少一个物体附着到沉积于所述表面上的所述材料上；用原子力显微镜扫描该表面，以定位附着到所述表面的至少一个物体；用原子力显微镜将力施加到所述表面上的至少一个物体上，所述力由用户决定，并且有一些物体在所述力的作用下被从所述表面上移走；对所述表面进行扫描，以定位仍旧附着在所述表面上的至少一个物体；用原子力显微镜将更大的第二个力施加到所述表面上的至少一物体上；以及收集仍旧附着在所述表面上的至少一个物体。

本发明的另一实施例包括一种用于测定物体和表面之间结合力的方法，该方法包括：(a)将一个或多个物体沉积到一表面上；(b)用原子力显微镜扫描所述表面，以定位所述表面上的所述物体；(c)用原子力显微镜将第一力施加到所述表面上的至少一个物体上，以从所述表面上移走具有较低结合力的至少一个物体；(d)收集由所述第一力从所述表面上移走的至少一个物体；(e)用原子力显微镜将更大的第二力施加到至少一个物体上，以从所述表面上移走具有较低结合力的至少一个物体；(f)收集由所述第二力从所述表面上移走的至少一个物体；以及(g)重复步骤(b)至(f)。

还有，本发明另一实施例包括一种用于测定物体和沉积于一表面上的材料之间的结合力的方法，该方法包括：(a)将至少一个材料沉积到一表面上；(b)使至少一物体结合到至少一材料上；(c)用原子力显微镜将第一力施加到所述表面上的至少一个物体上；(d)收集由所述第一力从所述表面上移走的至少一个物体；(e)用原子力显微镜将第二力施加到所述表面上的至少一个物体上，以从所述表面移走至少一个物体；(f)收集由所述第二力从所述表面上移走的至少一个物体；以及(g)重复步骤(b)至(f)。

实施例描述

在本发明的说明书中，术语“物体(object)”被用来包括能够结合到表面上并且能够通过探针(例如AFM探针)而得到检测和/或被移走的任何材料。该物体可以是无机分子、有机分子、生物分子、蛋白质、噬菌体微粒、细胞等等，这些都属于人们感兴趣的研究对象。该物体结合或吸附在表面上，并且随后经扫描并移走，这取决于物体与所述表面的结合力。物体也可以结合到沉积于该表面上的另一种材料上。另外，术语“结合(binding)”不局限于共价键结合，而是可以包括其它类型的分子结合，包括吸附、离子键合以及特定和非特定的分子相互作用。

术语“相对地(relatively)”将被用于描述探针对待研究的物体所施加的力的量。术语“相对地”将仅就力是否高到足够移走物体或低到不能移走物体而言来描述力。这里用“相对低的(relatively low)”力来描述这样一种力，该力小于从表面移走物体所需要的力量。因此，相对低的结合力指得是当所述力被施加到物体上时导致物体从表面被移走的任何一种结合力。相对高的结合力指得是这样一种结合力，它具有足够的强度以至于能够经受正施加的力。“设定值(set point)”是用户希望用探针在物体上施加的力的量。

本发明运用标准的AFM探针来将力施加到表面上的物体上。该标准的AFM探针包括探针和针尖。探针与AFM相连。探针的偏转被用来测定所施加的力，这里将对其做进一步的解释。当针尖扫过表面时，该针尖接触表面以及与表面结合的物体。应该明白，也可以将传统的探针或其它硬件组件附着在AFM或其它仪器上并使其横跨表面移动。仪器、探针和针尖仅需要足够的精度，从而把所需的力施加到与表面结合或者与表面上沉积的材料相结合的物体上。

最后，本说明书采用术语“结合力(binding affinity)”来统称物体与表面或与结合在表面上的材料之间的吸引力。材料可以被随机地结合到表面上，或者也可以被放置于特定的沉积区域以在表面上形成阵列。沉积材料和其阵列在申请号为09/574,519的美国共同未决专利申请中得到了进一步的描述，该申请教导的全部内容作为参考被引入本申请。

这里将结合图1a-c和2a-b描述本方法发明的概要。然后，在描述一些特定的实施例之后，再对本发明装置的各组件进行更为详细的说明。

方法

图1a示出了一个表面10，其上结合有一个或多个物体12。物体12通过采用本领域普通技术人员所公知的任何结合相互作用方式而被结合到表面10上。将材料结合到表面上的不同方法包括共价的、非共价的、自发的、静电的或其它本领域公知的方法。物体12可以是无机或有机分子，如蛋白质或细胞，或者是微粒，如噬菌体微粒。表面10和物体12将在本文中作进一步描述。

如图1a所示，本发明进一步包括探针14。这里采用的探针14是标准的氮化硅原子力显微镜探针(未示出)，例如，由加利福尼亚的圣巴巴拉数字仪器公司(Digital Instrumnets，Santa Barbara，California)制造的探针。该探针被连接到AFM仪器上，该AFM仪器也可以从上述数字仪器公司获得。如图1a所示，探针14可以进一步包括针尖16。针尖16是探针实际与表面10接触的那部分，本文将对其进行详细解释。

接着，表面10(带有物体12)被放入AFM流动池，并被浸入执行AFM扫描的液体介质中。本领域的普通技术人员可根据待研究的表面10和物体12来选择该液体介质。

在本实施例中，AFM被用来扫描表面，并且探测物体12的位置。如图1b所示，针尖16将接触表面10上的物体，并且将骑在物体12的顶部上，这取决于所采用的AFM扫描类型。在探针14与物体12接触期间，探针14由于受到其与物体12的相互作用而发生偏转。探针14的偏转由AFM检测仪表跟踪，因此物体12的位置和大小能够得到测定和记录。使用AFM来执行这样的扫描对本领域的普通技术人员来说是公知的，并且使得采用本发明方法的用户能够测定结合到表面10上的物体12的初始位置。在采用本发明方法的过程中，本发明应用这样一个步骤来测定物体何时从表面上移走。在替代的实施例中，定位物体12的步骤可以忽略，但这不会改变本发明的性质和范围。在另一个实施例中，物体12的位置可以是已知的，因为它们以特定的阵列布置在表面10上。

一旦物体12的位置被测定，则AFM的设定值将被增大。设定值的增大可以通过试验测定。同样地，可以使设定值以微小的量增大，以允许物体12的不同结合力的产生较大的分层(stratification)。设定值的增大会增加施加到表面10上的物体12的力的大小。

在第二次扫描期间，设定值的力被施加到表面10上的物体12上。如图1b所示，当探针14的针尖16接触物体12时，如果该力小于移走物体12或使物体12产生位移所需的力，则针尖16和探针14将在物体12上慢慢回缩。在这种情况下，物体12与表面10之间相对高的结合力不会被施加在物体12上的相对低的力所破坏。但是，参见1c，如果针尖16和探针14所施加的力相对地高于物体12与表面10之间的结合力，那么该力可以把物体12从表面移走。

本领域的普通技术人员可以进一步理解，探针14可能受施加在物体12一点上的力而发生偏转，在该点，所施加的力克服了物体12与表面10之间的结合力。探针14的这种偏转通过AFM检测仪表受到监测。可以用这种方式扫描整个表面10，并用AFM仪器收集有关什么样的物体12被移走的数据，也可以收集有关探针相对于每一个移走的物体12的偏转程度的数据。在一个实施例中，偏转程度能够被随后用来测定在每一设定值力下所移走的物体12的结合力。在替代的实施例中，结合力由于与所施加的设定值力相关而得到测定。

在本发明方法的下一个步骤中，移走的物体12可被收集起来以用于特性表征和进一步研究。在本发明方法中移走的物体12悬浮在流动池的液体介质中。从流动池中收集分子和其它物质对于本领域的普通技术人员来说是公知的，它可以通过标准方法来完成。收集的物体12可以这种方式被获得，以便用于特性表征和进一步研究。在替代的实施例当中，也可以采集仍旧与表面10结合的物体12来用于特性表征和进一步研究。在一个替代实施例当中，其中沉积区域的已知位置上包含有已知的材料，通过再次扫描表面10以确定物体12被移走时的位置，就能够告诉用户什么样的材料具有相对高和相对低的结合力，而勿须收集物体12以用于特性表征。

在本发明方法的下一个步骤中，AFM被再次用来对残留在表面上的那些物体进行定位。可以理解，与所选定的物体12跟表面10的结合力相比，如果设定值被设定得相对较高，则施加的力会移走所有的物体。类似地，如果设定值被设定得相对较低，则施加的力会移走极少数或不会移走表面10上的物体12。一旦残留物体12的位置被测定出来，则设定值将以一些预定的量增加，从而使探针14和针尖16在下一个扫描期间对物体12施加更大的力。

正如本领域的普通技术人员所公认的那样，定位物体12、把力施加到物体12上、以及随后收集转移到溶液中的物体12的循环可以被重复多次。从表面10上移走物体所需的不同力的范围可以小或者大，这取决于表面10上沉积的不同物体12。

如果力的增量特别小，则在每一轮操作期间移走的那些物体12的表面10与该物体12之间的结合力将接近于已知的设定值力。在一个替代的实施例中，探针偏转的程度可被用来(如下所述)单独地计算结合力。当递增的力以较大量增加时，采用探针的偏转程度可能是用于确定物体12与表面10之间相对和绝对结合力的最精确的方法。当较小增量的设定力被施加到物体12上时，结合力可以与所施加的力相关联，从而测定不同结合力的层次。

可以理解，本发明方法在用于研究第一物体12和第二物体之间的结合力方面是非常有用的。第一物体12可以结合到表面上，第二物体12可以结合到第一物体12上。把第一物体12与第二物体12分开能够使用户表征出两物体12之间的结合力特性。这些相互作用包括但不局限于：互补的和部分互补的核酸、药物候选分子和它们的分子靶标、构成一个或多个有机体的部分或全部的蛋白质组(proteome)的蛋白质、病毒、噬菌体、植物和动物细胞，以及所有种类的系统和材料。

本发明方法特别有用，因为它并不需要重复的台式(bench)化学反应而是采用了一序列的微滴定液板。另外，本发明方法是有用的，因为各种不同类型的物体12能够结合到同一表面，或者结合到沉积于表面上的相同材料上，从而用于各种结合力的同时比较。

装置

为了更加全面地解释本发明，现在将对本发明的组成部件进行说明。

物体12可以按照本领域普通技术人员公知的方式被放置、沉积、连接或吸附到/在表面上，这些方式包括但不局限于：机械沉积、现场化学合成，“喷墨”打印，或者其它沉积方式，如从溶液吸附、生物分子识别，以及非共价的或共价的化学连接。物体12可以是分子、诸如蛋白质和细胞的生物分子，无机分子，或其它一些微粒，如作为感兴趣的研究对象的噬菌体微粒。另外，用于进一步研究的物体12可被沉积在表面10上，但这不会改变本发明的性质和范围。

结合力的可替代实施例包括：

自发吸附：在这种方法中，材料可被从溶液直接吸附到表面上。附着过程不必非常确定，但是对于所有的类似于正在被吸附的物体来说都是均匀的。附着机构可以包括静电的、憎水的或其它组成部分。

确定的静电相互作用：在这种方法中，带有确定的静电性质的表面被产生。例如，聚-L-赖氨酸能够被吸附到表面上，从而产生正电荷分布相对均匀的表面。然后，材料通过材料上的负电荷部分与正电荷表面的相互作用而被吸附到涂有聚-L-赖氨酸的表面上。外界溶液中的变化能影响材料与表面的结合强度韧度，所述外界溶液可以包含具有不同PH值的电解质和缓冲液。

确定的憎水相互作用：在该方法中，确定的憎水表面被产生并与材料相结合。在一个实例中，憎水表面是通过用金涂敷衬底然后用带有末端(远端)甲基的链烷硫醇盐(alkanethiolate)进行处理而得到制备的。随后该表面用作材料的沉积衬底。这些带有强憎水功能区的材料将比那些带有弱憎水功能区的材料更加紧密地结合到远端甲基上。

共价：在一些情况下，可能需要对以共价键与表面结合的材料和以非共价键与表面结合的材料进行区分。在这种情况下，可以应用确定的化合物结合化学。

电沉积：在该方法中，材料通过电场产生的力被拖到表面。可以应用非对称的AC或DC电场，以分别产生介电泳或电泳的环境。如上所述，材料可以通过一个自发的机构被附着到表面上，或者该附着可涉及更明确的结合方法。在一种情况下，沉积的材料和表面之间会发生氧化还原反应(氧化还原作用)，结果是在表面之间产生共价结合。对该方法来说，表面通常是导电的并且与一电极连接。在该系统中还有一个第二电极，从而构成完整的电路并产生电场。

化合物交联：在该方法中，表面通过具有确定化学特性的标准方法被制备出来。例如，玻璃表面可被涂以其末端有一自由氨基基团的硅烷衍生物。在硅烷表面横向交联并使其稳定后，材料可被加入到该表面上，并通过多个与伯氨相关的化学反应来进行连接，这在本领域是公知的。

通过采用本发明，可以表征出上述任何结合相互作用的特性，而不会改变本发明的性质和范围。

如前所述，本实施例的表面10由玻璃制成，在该玻璃上沉积有一个溅射金层。该表面特别有用，因为覆盖有溅射金层的玻璃涂层对本领域的普通技术人员来说是公知的，并且容易获得(或制造)。因为表面10具有光滑稳定的表面特性，所以带有溅射金层的载玻片特别有用。通过溅射金可以产生非常光滑的表面，在该表面上可以进行多种化学和分子结合。由于上述原因，虽然也可以在不改变本发明的性质和范围的情况下采用其它涂层或不带涂层的表面，但采用金层是比较有利的

在其它实施例中，金可以被溅射到光滑的硅、石英或一个类似的平面上，例如云母、改性硅、(聚)四氟乙烯、功能化的硅烷、聚苯乙烯、聚碳酸酯，或它们的组合。作为基础的衬底所需的光滑度是特定测试的灵敏度需求的函数。为了取得满意的结果，这些采用较小的物体结合力的试验会需要更均匀的表面。根据这物体12和研究中的结合力，也需要能够接受和紧密结合物体12的表面10。

驻留在表面10上的物体12可以被限制为与表面10结合的一个物体12。在其它实施例中，表面10可以包括与其结合的一个、几个、一百或更多个物体。每一个物体都可被结合在一已知区域或一未知区域内，随后通过标准AFM扫描而得到测定。另外，物体12可以是一特定类型的分子或微粒，或者可以是不同的分子、生物分子、或微粒，它们同时得到研究，以便测定它们的相对结合力。

正如本领域的普通技术人员可以理解的那样，探针14和针尖16可以构成一个整体。AFM控制探针14和针尖16的运动，并且因此把力施加到物体12上。一种未经过改进的AFM探针具有一个锋利点，其曲率半径可以为5至40nm之间。这里的方法采用了尖端半径为10-50nm数量级的微构造探针。在本发明方法中，AFM被用来移动探针，因为它是一种标准的可利用的仪器，这种仪器具有达可到所需结果的微精密控制能力。一种特别适合于本发明采用的仪器是Dimension 3100，它可以从加利福尼亚的圣巴巴拉数字仪器公司获得。在其它实施例中，包括其它类型的扫描探针显微镜在内的其它控制设备也可被用来控制探针和针尖。

当探针14直接接触物体12时，在物体和探针之间将存在一个竖直的力，该力试图在一个方向推动物体。如图2a和2b所示，可以理解，针尖16可以以偏离中心的方式进行接触，从而导致探针14扭转。在这种情况下，探针14受到物体12的垂直力和扭力的相互作用。物体12也受到垂直力和扭力的作用。如图1a所示，它将导致探针14和针尖16的垂直位移，同时，如图2b所示，它也会导致探针14发生扭转。然而，AFM检测仪表能够同时读出由探针14的弯曲和扭转所代表的产生的扭力和垂直力。然后，扭力和垂直力可被用来测定施加到表面10或物体12上的力的大小。

由于探针14的弹簧常数是已知的，因此施加到物体12上的力(该力达到和包括这样一点，在该点物体12从表面10移走)能够通过胡克定律：F＝kX进行计算，其中F是力，k是弹簧常数，X是位移距离。

从表面10上移走物体12、或者移走与表面10相结合的一些沉积材料所需的载荷度可被直接与物体12跟表面10的结合强度相关联。对测量探针14的扭转和针尖与表面10之间的摩擦相互作用会使定量测量变得复杂，但是相对力测量却很容易获得。

在本实施例中，通过监测AFM探针的偏转来测量施加的垂直力，所述AFM探针达到和包括这样一点，在该点物体12被移走。可以理解，在把增加的力施加到物体12上和探针进行测量之间的滞后时间可以产生一定量的力，它施加在不能够被直接测量的一物体内。然而，该间隙可以通过AFM检测仪表或计算机而被计算出来。

例1：分子力扫视(force panning)

本例中，本发明被用来选择性地从结合到表面10上的抗原移走抗体。然后，抗体和抗原之间的结合力被测量出来。该例子展示了如何利用本发明来测量沉积的兔子IgG和抗兔子IgG之间的结合力。

本实施例中的表面由覆盖有溅射金层的载玻片组成。兔子IgG通过非特定结合相互作用被结合到金表面上。然后，该表面被插入到一个含有水成像环境的AFM流动池中；在这种情况下为磷酸盐缓冲溶液。该缓冲溶液是PH值为7.5的20毫摩尔的PBS溶液，它被捕获在AFM的压电件(piezo)和上面沉积有兔子IgG的表面之间。在本实施例中，兔子IgG被随机地沉积在表面上，并且该表面受到扫描用以测定表面上的抗原位置。可以理解，可以通过多种方法将该抗原沉积在表面上的已知位置内，从而使其驻留在已知位置和大小的区域内。在其它的实施例中，抗体/抗原复合物可以位于表面上随机的和未知的位置。通过采用本发明，仍旧可以容易地完成结合力的测定。也可以采用不同的沉积技术，例如将表面浸入到包含有抗原的溶液中。

抗体的加入是通过微量移取1微升的1mg/ml PBS至流动池中而完成的。然后，通过采用标准的AFM扫描和探针来扫描表面，就可以测定抗原/抗体相互作用的位置。在增加AFM的设定值水平后，接着进行扫描。对探针偏转的仔细监测可显示出在何处与抗原/抗体复合物发生接触。然后进行设定值的增量增加，从而导致在相当窄的力范围内把抗体从抗原移走。因为所形成的复合物的均匀同一性，所以在窄范围内移走抗体是可以期待的。在设定值力的每一次增加之间执行标准的AFM扫描有助于指示抗原/抗体复合物何时发生分离。然后，可以利用与分开抗原/抗体所需的力相关联的力值来测定它们的相对结合力。当移走抗原和抗体复合物时，对于由AFM检测仪表监测到的探针偏转，也能够计算结合力。

可以理解，上述实施例能够用多种不同的抗原来重复，从而测定它们与相应抗体的相对结合力。在其它的实施例中，不同抗体或抗原能够被同时操作，从而测定出每一个的相对结合力。通过收集水成像溶液并进行特性测试，就可以在所述力的设定值下测定移走的抗体，从而能够测定在不同的力水平下哪一种抗体被剥去。

在其它的实施例中，抗原/抗体复合物能够被结合到表面，从而确保在增加设定值的扫描期间整个复合物不被移走。

例2.基于对噬菌体和病毒相互作用的选择的亲合力的力扫视

如图3a-c所示，力扫视可以替代地用来选择性地移走与表面结合不好的病毒或噬菌体微粒，从而允许收集和鉴定那些与表面有高结合力的微粒。噬菌体显示是本领域一种公知的方法，它用于显示噬菌体微粒表面上潜在需要的重组体蛋白的总和。噬菌体被设计成可以在表面上产生特定的蛋白。非常大的蛋白质组合库可被显示在噬菌体表面上并且通过一些筛选机构来进行选择。一旦被选中，所需的噬菌体能够得到繁殖，并且具有所需特性的分子能够得到纯化和鉴定。对于分析大库的重组体生物分子来说，这是一个非常有效的方法。

一旦噬菌体种群被建立，就可以对它进行分类，以便寻找那些显示感兴趣分子的少数噬菌体。过去，这种工作需要通过反复结合和冲洗涂有显示分子所结合的分子的微滴定液盘中的噬菌体来完成。而力扫视则克服了这种沉闷过程的多种限制。

在本发明的实施例中使用了与粘连蛋白结合的胞内基体蛋白。本例示出了如何通过结合力来区分各种与粘连蛋白结合的蛋白质。

噬菌体通过标准方法来制备和纯化。在本实施例中采用的表面也是覆盖有溅射了金的玻璃。通过自发的和非特定的结合相互作用，就可使粘连蛋白结合到表面上并且使噬菌体复合到粘连蛋白上。可以理解，在替代实施例中，粘连蛋白可以共价地或以其它方式固定地结合到该表面或沉积在表面上的一些沉积材料上。

没有与粘连蛋白结合的多余的噬菌体可被从金表面冲走。接下来，把带有粘连蛋白的表面和噬菌体复合物放置在AFM仪器内，并且在低施加力下成像，以便测定已结合的复合物的位置。然后，设定值被递增地增加，以加大施加到粘连蛋白/噬菌体上的力。松弛结合的噬菌体微粒随后通过每一施加的设定值力而被从表面移走，并且分散在经覆盖的溶液中。所采用的溶液是结合缓冲液，它包含有PH值为7.2、Nacl含量为100mM的Tris缓冲液。其它含有这种和其它缓冲液的溶液也可以按照需要使用。在其内执行该过程的溶液能够被循环或使其流过成像室，以增加噬菌体微粒的迁移，所述噬菌体已经通过力扫视过程被从表面移走。可以收集和进一步鉴定在每一个递增地增大的力下被移走的噬菌体。可以增大该力，直到所有的噬菌体被移走为止，或者该力可以在达到某一设定值时停止。也可以收集在最后施加力后残留在表面上的噬菌体，以用于进一步研究。

可以采用遵循力扫视的多种方法来收集与表面结合的残留的噬菌体。一种方式是用高浓度的盐溶液(例如500mM的Nacl)来洗涤表面，如果需要，可以加入诸如Tween-80的表面活性剂，以便于残留噬菌体向溶液中的转移。然后可以将其用作噬菌体微粒源，以用于繁殖和分析那些具有最大结合力的噬菌体微粒。

一种用于收集噬菌体的替代方法是采用AFM探针，它涂有粘性层(例如，在本例中为粘连蛋白质(fibronectin protein))，该粘性层能够从表面收集用于随后回收的噬菌体微粒。该方法需要精确地调节相对粘合力，以优化噬菌体从表面向探针的转移。

例3.基于对细胞与表面相互作用的选择的亲合力的力扫视

在另一实施例中，可以采用力扫视来分析细胞与各种表面和沉积在表面上的材料相结合的强度。在各种生理函数中，细胞和表面之间的粘附力是一个关键的参数。例如，如果血细胞与动脉壁结合得太紧，就会出现血流受阻的现象，从而导致生理机能失调，或甚至死亡。本发明方法也可以用于帮助表征不同类型的细胞与不同表面之间粘附力大小的特性。该方法允许对感兴趣细胞的低或高粘附性质的表面进行特性表征。(在这种情况下，细胞可以不按照传统的分子相互作用观念与表面结合，而是通过非特定的相互作用与表面结合)。该技术对测定材料的相似性是有用的，所述材料用于生物系统中，其上结合有细胞和其它生物材料。

在本例中，如图4a所示，血红细胞被允许结合到涂敷有第一合成聚合物(聚合物1)的玻璃上。在细胞结合后，采用本发明方法来测定结合力。可以在生理溶液(例如PBS)中执行扫描，并记录从表面移走细胞所需的力。然后，相同的细胞类型被结合到涂敷有第二聚合物(聚合物2)的表面上，并且重复该过程(如图5a所示)。通过比较从各个表面移走细胞所需的力，就可以根据聚合物与血红细胞结合或不结合的能力来对这些聚合物进行比较。对粘附力的测量可基于探针施加的扭力和垂直力来进行。可通过计算用于移走细胞的力而获得定量测量。

在一个替代的实施例中，不同的聚合物能够通过接触或喷墨打印而被“打印”到表面上去。然后，该表面用红细胞进行培养，并且通过单个力扫视试验来测试处于研究中的所有聚合物。

在图4b中，细胞通过一个力被结合到表面上，该力小于扫描过程所产生的力。由于细胞结合力低，在扫描期间，大多数细胞从所述表面移走。在图5b中，细胞以大于扫描过程产生的力的力被结合到表面上。施加了设定值力的表面横向AFM扫描不会使细胞产生移动。不同的这种过程允许用户获得与细胞/表面结合强度有关的定量信息。

在一个替代实施例中，一种专用的AFM探针被用来使细胞的损伤最小化。通过在AFM探针的一端上结合微粒，该专用探针能够制造得“钝”。在美国未决专利申请No.09/574519中进一步的描述了在探针的一端上结合微粒。这种钝的探针刺入正在受分析的细胞的几率被降低，就像用犁把软细胞推开而不刺破它们一样。

在另一个替代实施例中，细胞可被分离和大量繁殖，从而能够鉴定用于细胞-衬底相互作用的蛋白质。在细胞包含有重组体蛋白质的情况下，认为该过程对噬菌体显示过程来说是类似的，理由是该细胞能够用来扩增具有某种所需特性的细胞表面蛋白质。

在另一个替代实施例中，施加到每一物体的力可以被保持恒定，从而测定施加到该物体上的反复恒力作用。可以理解，也可执行其它研究来分析与表面、或沉积在表面上的材料相结合的物体的结合力。

本文中记载的信息和实施例只是用于解说目的，并不意味着排除蕴含于本发明概念性上下文中任何衍生的或替代的方法。可以预期，在不脱离本发明的精神和范围的情况下能够实现实施例的各种变化。因此，本发明的范围由所附的权利要求来决定，而不是由实施例的前述说明来决定。

Claims (31)

1.一种利用扫描探针显微镜测定物体和表面之间结合力的方法，包括：

将至少一个物体附着到一个表面上；

利用所述扫描探针显微镜将力施加到所述表面上的至少一个物体上，以从所述表面移走至少一个物体，其中所述被施加到至少一个物体上的力受到监测；以及

根据所施加的用于移走至少一个物体的所述力来计算至少一个物体和所述表面之间的所述结合力。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，扫描探针显微镜是原子力显微镜。

3.一种利用扫描探针显微镜分离物体的方法，包括：

(a)将多个物体附着到表面上；

(b)利用所述扫描探针显微镜的尖端将力施加给所述表面上的一个物体，以移走所述物体；以及

(c)收集从所述表面移走的所述物体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于进一步包括：

(d)扫描所述表面以定位所述表面上的一个不同的物体，其中所述不同的物体相对于被移走的所述物体具有更高的结合力。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于进一步包括：

(e)利用所述扫描探针显微镜的尖端将比所述步骤(b)的力更大的力施加给所述表面上的一个不同的物体，以移走所述不同的物体；及

(f)收集利用所述更大的力移走的所述不同的物体。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于进一步包括：重复所述步骤(e)，其中所述更大的力被顺序增大。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于进一步包括：将第二物体附着于已附着在所述表面上的第一物体上；监测将所述第二物体从所述第一物体移走所需要的力；以及根据所监测的力计算所述第一物体和第二物体之间的相对结合力。

8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述多个物体中的至少一个物体选自这样一个组合，该组合包括蛋白质、核酸、抗体、细胞、病毒和噬菌体微粒。

9.一种利用扫描探针显微镜测定物体和一个或多个材料之间的结合力的方法，包括；

获得一个表面，该表面进一步包括沉积于其上的一个或多个材料；

将至少一个待研究的物体附着到沉积于所述表面上的所述一个或多个材料上；

利用所述扫描探针显微镜将力施加到所述至少一个物体上，以移走至少一个物体，并监测从相应的材料上移走所述物体所需要的力；以及

根据所施加的用于移走所述物体的所述力来计算所述物体和相应的材料之间的结合力。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于进一步包括：用扫描探针显微镜对所述表面进行扫描以定位至少一个物体。

11.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，扫描所述表面和施加所需力到至少一个物体是在液体介质中完成的。

12.根据权利要求9所述的方法，其特征在于进一步包括：从所述相应材料收集至少一个物体。

13.根据权利要求9所述的方法，其特征在于进一步包括：

向至少一个物体施加增量式增大的力；以及

收集由所述增大的力移走的至少一个物体。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于进一步包括：采集所述表面上残留的至少一个物体。

15.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述结合力的相互作用是分子相互作用。

16.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所确定的结合力涉及蛋白质相互作用。

17.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所确定的结合力涉及核酸相互作用。

18.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所确定的结合力涉及抗体/抗原相互作用。

19.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所确定的结合力涉及受体/配体相互作用。

20.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所确定的结合力涉及细胞/细胞相互作用。

21.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所确定的结合力涉及细胞/衬底相互作用。

22.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所确定的结合力涉及病毒/病毒相互作用。

23.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所确定的结合力涉及病毒/衬底相互作用。

24.一种用于根据相对结合力分离物体的方法，包括：

将至少一个材料沉积到一个表面上；

将一个以上的物体附着到沉积于所述表面上的所述材料上；

用原子力显微镜对所述材料进行扫描，以定位附着到所述材料的至少一个物体；

利用所述原子力显微镜把力施加到所述至少一个物体，以使其中的一个物体保留在所述材料上，使一个不同的物体被从所述材料上移走；

对所述材料进行扫描，以定位仍旧附着在所述材料上的所述一个物体；

用原子力显微镜将更大的第二个力施加到所述材料上的所述一个物体上以将所述一个物体从所述材料上移走；以及

从所述材料上收集所述一个物体。

25.一种用于将物体和表面分离的方法，包括：

(a)将一个以上的物体沉积到一表面上；

(b)用原子力显微镜扫描所述表面，以定位所述表面上的所述物体；

(c)用所述原子力显微镜把第一力施加到所述表面上的至少一个物体上，以从所述表面上移走与所述表面具有相对较低结合力的所述至少一个物体；

(d)收集由所述第一力从所述表面上移走的至少一个物体；

(e)用所述原子力显微镜把较大的第二力施加到不同的物体上，以从所述表面上移走与所述表面具有相对较低结合力的所述不同的物体；

(f)收集由所述第二力从所述表面上移走的所述不同的物体；以及

(g)重复步骤(b)至(f)。

26.一种用于将物体和沉积于一表面上的材料分离的方法，包括：

(a)将至少一个材料沉积到一表面上；

(b)将至少两个物体接合到所述表面上的至少一个材料上；

(c)用原子力显微镜把第一力施加给一个物体以将该物体从所述材料上移走；

(d)收集由所述第一力从所述材料上移走的所述一个物体；

(e)用所述原子力显微镜把另一个更大的力施加给所述材料上的一个不同的物体，以从所述材料上移走所述不同的物体；

(f)收集由所述更大的力从所述材料上移走的所述不同的物体；以及

(g)重复步骤(b)至(f)。

27.根据权利要求26所述的方法，其特征在于进一步包括：根据所述步骤(c)中将物体从所述材料上移走所需的力计算所述步骤(c)的所述物体和所述材料之间的最小结合力。

28.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中的物体是利用非特定结合的相互作用而被结合的，所述非特定结合的相互作用选自这样一个群组，所述群组包括自发吸收、静电相互作用以及憎水性相互作用。

29.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述步骤(b)中的物体利用共价结合的相互作用而被结合。

30.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述物体选自于一组合中的一个或多个，该组合包括蛋白质、核酸、抗体、细胞、或病毒。

31.根据权利要求26所述的方法，其特征在于，所述物体和材料选自由抗体和抗原组成的群组。

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