CN109863391B - 用于样品分析的装置和方法 - Google Patents

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Abstract

公开用于使用纳米孔进行分析物分析的方法、装置和系统。所述方法、装置和系统利用各自特异性结合到生物样品中的分析物的第一结合成员和第二结合成员。所述方法进一步包括检测和/或计数附着于所述第二结合成员的可裂解标签，并且使标签的存在和/或数量与所述分析物的存在和/或浓度相关联。所述检测和/或计数可通过使所述标签/第二结合成员移位通过纳米孔来进行。本文还提供经程序化以操作料筒的仪器，所述料筒包括用于致动液滴的电极阵列且进一步包括电化学物质感测区。所述仪器可以用于分析料筒中的样品，所述料筒包括用于致动液滴的电极阵列且进一步包括用于检测标签/第二结合成员通过纳米孔的纳米孔层的移位。

Description

用于样品分析的装置和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2016年10月5日提交的美国临时申请第62/404,722号和2016年11月21日提交的美国临时申请第62/424,996号的优先权，所述申请的公开内容以引用的方式并入本文中。
技术领域
本公开涉及使用例如与微流体装置可操作地耦接的分析物检测装置的用于分析物分析的方法、装置和系统。
背景技术
可以准确地分析样品中所关注分析物的方法和装置对于诊断、预测、环境评估、食物安全、检测化学或生物武器制剂等而言是必需的。在细微样品被迅速地并用最小器械分析时，这类方法和装置不仅需要为准确的、精确且灵敏的，而且为有优势的。因而，对具有提高样品分析能力的方法和装置存在兴趣。
发明内容
本公开的实施例涉及用于分析样品中的分析物的方法、系统和装置。在某些实施例中，样品可为生物样品。
用于分析样品中的分析物的方法可涉及使所述样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；使固体载体与第二结合成员接触，其中第二结合成员特异性结合到分析物且其中第二结合成员包括与其连接的可裂解标签；移除未结合到分析物的第二结合成员，所述分析物结合到第一结合成员；裂解附着于结合到分析物的第二结合成员的标签，所述分析物结合到第一结合成员；使经裂解标签移位通过或跨过层中的纳米孔；确定移位通过所述层的标签数量；基于移位通过所述层的标签数量来确定样品中分析物的浓度。在某些实施例中，分析物浓度可以通过计数每单位时间移位通过所述层的标签数量来确定。在其它实施例中，分析物浓度可以通过确定移位通过所述层的标签数量达到阈值时的时间或通过设定时间段并计数在所述设定时间段中的计数累积数目来确定。
在另一实施例中，方法可以包括将含有目标分析物的样品与已知量的目标分析物或竞争分子组合，其中目标分析物(与样品组合)或竞争分子通过可裂解连接子附着于标签以分别产生经标记分析物或经标记竞争分子，并且经标记分析物或经标记竞争分子与目标分析物竞争以结合到第一结合成员。方法可进一步包括使组合样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到目标分析物(并且结合到经标记分析物或经标记竞争分子)；使固体载体与缓冲液接触以用于任选的洗涤步骤；裂解附着于经标记分析物或经标记竞争对手的标签，所述经标记分析物或经标记竞争对手结合到固定于固体载体上的第一结合成员；使裂解标签移位通过或跨过层中的纳米孔；确定移位通过所述层的标签数量；基于移位通过所述层的标签数量来确定样品中分析物的浓度。在某些实施例中，分析物浓度可以通过计数每单位时间移位通过所述层的标签数量来确定。在其它实施例中，分析物浓度可以通过确定移位通过所述层的标签数量达到阈值时的时间或通过设定时间段并计数在所述设定时间段中的计数累积数目来确定。在这个实施例中，移位通过纳米孔的标签数量或移位通过所述层的标签数量达到阈值时的时间可以与样品中的分析物浓度成反相关。举例来说，计数越低或到达阈值的时间段越长，样品中的目标分析物浓度就越高。
在一个方面中，本发明涉及一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法。所述方法包含使样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；使分析物与第二结合成员接触，其中第二结合成员特异性结合到分析物且其中第二结合成员包含与其连接的可裂解标签；去除未结合到分析物的第二结合成员，所述分析物结合到第一结合成员；裂解附着于结合到分析物的第二结合成员的标签，所述分析物结合到第一结合成员；使经裂解标签移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；和评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。在一些实施例中，对测量移位通过所述层的标签进行评定，其中移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量。在一些实施例中，对检测移位通过所述层的标签进行评定，其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
在一个方面中，本发明涉及一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法。所述方法包含使样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；使分析物与第二结合成员接触，其中第二结合成员特异性结合到分析物且其中第二结合成员包含适体；去除未结合到分析物的适体，所述分析物结合到固体衬底；解离结合到分析物的适体并使经解离适体移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；和评定移位通过所述层的适体，其中测量移位通过所述层的适体数测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中。在一些实施例中，对测量移位通过所述层的适体进行评定，其中移位通过所述层的适体数测量了样品中存在的分析物量。在一些实施例中，对检测移位通过所述层的适体进行评定，其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
在一个方面中，本发明涉及一种包含底部衬底的集成数字微流体纳米孔装置，其包含电极阵列；与底部衬底隔开的顶部衬底；以及安置在底部与顶部衬底之间的纳米孔层。所述装置包括近侧部分和远侧部分并且纳米孔层安置在远侧部分中。近侧部分中的电极阵列配置成产生液滴。电极阵列配置成将液滴定位在纳米孔层两端以使得液滴被纳米孔层分成第一部分和第二部分，其中电极阵列中的至少两个电极定位在纳米孔层两端，其中所述两个电极形成阳极和阴极并且在液体液滴定位于纳米孔层两端时用以驱动电流通过纳米孔层中的纳米孔。
在一个方面中，本发明涉及一种包含底部衬底的集成数字微流体纳米孔装置，其包含电极阵列；与底部衬底隔开的顶部衬底并且包含电极；和安置在底部与顶部衬底之间的纳米孔层。所述装置包括近侧部分和远侧部分并且纳米孔层安置在远侧部分中。电极阵列和近侧部分中的电极配置成产生液滴。电极阵列和电极配置成将液滴定位在纳米孔层两端以使得纳米孔层将液滴分成第一部分和第二部分，其中电极阵列中的至少一个电极与定位于纳米孔层两端的液滴的第一部分接触且顶部衬底中的电极定位成接触定位于纳米孔层两端的液滴的第二部分，其中两个电极形成阳极和阴极并且在液体液滴定位于纳米孔层两端时用以驱动电流通过纳米孔层中的纳米孔。
在一个方面中，本发明涉及一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法。所述方法包含使样品与结合成员接触，其中结合成员固定于固体载体上且其中结合成员特异性结合到分析物；使可能含有结合到结合成员的分析物的样品与经标记分析物接触，其中经标记分析物用可裂解标签标记；去除未结合到结合成员的经标记分析物；裂解附着于经标记分析物的标签，所述经标记分析物结合到结合成员；使经裂解标签移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；和评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了在样品中存在的分析物量，或检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。在一些实施例中，对测量移位通过所述层的标签进行评定，其中移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量。在一些实施例中，对检测移位通过所述层的标签进行评定，其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
在一个方面中，本发明涉及一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法。所述方法包含使样品与结合成员接触，其中结合成员固定于固体载体上且其中结合成员特异性结合到分析物；使可能含有结合到结合成员的分析物的样品与经标记分析物接触，其中经标记分析物包含适体；去除未结合到结合成员的经标记分析物；解离结合到经标记分析物的适体，所述经标记分析物结合到结合成员；和使经解离适体移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；和评定移位通过所述层的适体，其中测量移位通过所述层的适体数测量了样品中存在的分析物量，或检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中。在一些实施例中，对测量移位通过所述层的适体进行评定，其中移位通过所述层的适体数测量了样品中存在的分析物量。在一些实施例中，对检测移位通过所述层的适体进行评定，其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
在一个方面中，本发明涉及一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法。所述方法包含使样品与结合成员接触，其中结合成员特异性结合到分析物，且结合成员用可裂解标签标记；使可能含有结合到结合成员的分析物的样品与经固定分析物接触，其中经固定分析物被固定于固体载体上；去除未结合到经固定分析物的结合成员；裂解附着于结合成员的标签，所述结合成员结合到经固定分析物；使经裂解标签移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；和评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了在样品中存在的分析物量，或检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。在一些实施例中，对测量移位通过所述层的标签进行评定，其中移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量。在一些实施例中，对移位通过所述层的标签进行评定，其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
在一个方面中，本发明涉及一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法。所述方法包含使样品与结合成员接触，其中结合成员特异性结合到分析物且结合成员包含适体；使可能含有结合到结合成员的分析物的样品与经固定分析物接触，其中经固定分析物固定于固体载体上；去除未结合到经固定分析物的结合成员；解离结合到结合成员的适体，所述结合成员结合到经固定分析物；和使经解离适体移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；和评定移位通过所述层的适体，其中测量移位通过所述层的适体数测量了样品中存在的分析物量，或检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中。在一些实施例中，对测量移位通过所述层的适体进行评定，其中移位通过所述层的适体数测量了样品中存在的分析物量。在一些实施例中，对检测移位通过所述层的适体进行评定，其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
在某些方面，标签可为阴离子聚合物、阳离子聚合物或纳米颗粒。在某些情况下，标签可以包括阴离子聚合物，例如，寡核苷酸聚合物。在某些情况下，寡核苷酸聚合物可为脱氧核糖核酸或核糖核酸。在某些情况下，寡核苷酸聚合物可为DNA适体或RNA适体，其中适体不结合到分析物。在示范性情况中，标签可以包括纳米颗粒，所述纳米颗粒可为带正电纳米颗粒或带负电纳米颗粒。
在某些实施例中，标签可为球形标签，例如树枝状聚合物、珠粒、纳米颗粒(如纳米珠粒)等。在某些实施例中，标签可不为直链或实质上直链或细长形状，例如核糖或脱氧核糖单元的聚合物、寡核苷酸和核酸(例如DNA或RNA)。
在某些情况下，第一结合成员和第二结合成员可为适体、抗体或受体。举例来说，第一结合成员可为受体且第二结合成员可为抗体或第一结合成员可为抗体且第二结合成员可为受体。在某些情况下，第一结合成员可为第一抗体且第二结合成员可为第二抗体。
在某些情况下，标签可以带负电且移位可以包括在层两端施加正电势进而使标签移位跨过层。
在某些情况下，标签可带正电且移位可包括在层两端施加负电势进而使标签移位跨过层。
在其它实施例中，标签可为核酸且标签可在移位之前与包括与标签的序列互补的序列的寡核苷酸杂交。
在另一实施例中，提供一种通过使用适体作为第二结合成员来测量生物样品中存在的分析物的方法。举例来说，所述方法可以包括使样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；使分析物与第二结合成员接触，其中第二结合成员特异性结合到分析物且其中第二结合成员包含适体；去除未结合到分析物的适体，所述分析物结合到固体衬底；从结合到固体衬底的分析物中解离适体且使经解离适体移位通过层中的一个或多个纳米孔；确定移位通过所述层的适体数；基于移位通过所述层的适体数来测量样品中的分析物。在这个实施例中，由于第二结合成员是通过所述纳米孔来直接检测，所以第二结合成员不附着于标签。
适体可为DNA适体或RNA适体。第一结合成员可为抗体。在某些情况下，分析物可为配位体且第一结合成员可为受体。
本文还公开了用于同时分析样品中的多种不同分析物的方法，举例来说，所述方法可以包括分析第一分析物和第二分析物；第一分析物、第二分析物和第三分析物；等等。在某些情况下，用于分析样品中的多种不同分析物的方法可以包括使样品与多种不同的第一结合成员接触，其中不同的第一结合成员中的第一结合成员特异性结合到多种不同分析物中的第一分析物，不同的第一结合成员中的第二结合成员特异性结合到多种不同分析物中的第二分析物，等等。方法可进一步包括使不同分析物与多种第二结合成员接触，其中多种第二结合成员中的第一结合成员结合到第一分析物，多种第二结合成员中的第二结合成员结合到第二分析物，等等。在某些情况下，多种不同的第二结合成员中的每一个可包括彼此相异的或可区别的标签(例如，不同的第二结合成员中的每一个具有不同的标签)。举例来说，多种第二结合成员中的第一结合成员可以包括第一标签，多种第二结合成员中的第二结合成员可以包括第二标签，等等，其中第一标签和第二标签可彼此区别开。区别标签可以使用任何合适的方法，例如基于标签的性质或特征属性来完成。
方法可进一步包括去除未结合的第二结合成员；裂解附着于多种第二结合成员的标签，所述第二结合成员结合到分析物；使标签移位通过层中的纳米孔；确定移位通过所述层的标签中的每一个的数量；基于移位通过所述层的标签中的每一个的数量来测量样品中的多种不同分析物。在某些实施例中，分析物浓度可以通过计数每单位时间移位通过所述层的标签数量来确定。在其它实施例中，分析物浓度可以通过确定移位通过所述层的标签数量达到阈值时的时间来确定。如在本文中所提及，在某些情况下，第二结合成员可为多种适体且在计数适体时这些适体不附着于标签。在这些实施例中，适体在移位通过或跨过一个或多个纳米孔之前可以从分析物中解离。
在某些情况下，不同标签(如不同适体)可以通过纳米孔力谱、光学构件或电力构件或其组合来彼此区别开。
本文还提供用于执行所公开方法的试剂盒、系统和装置。试剂盒、系统和装置可以用于以自动化或半自动化方式进行分析物分析且视情况可以包括用于分析物分析的一次性/可消耗组件。自动化装置和半自动化装置可以利用微流体。示范性微流体包括数字微流体(DMF)、表面声波(SAW)微流体、基于液滴的微流体装置等。示范性微流体还包括完全集成的DMF和纳米孔装置，或完全集成的SAW和纳米孔装置。在某些情况下，用于执行所公开方法的装置可为与纳米孔装置结合使用的数字微流体装置。在其它实施例中，用于执行所公开方法的装置可为集成数字微流体纳米孔装置。这些装置可为一次性使用的装置或可再用(多次用于分析物分析)。本文中所描述的数字微流体和纳米孔装置可以提供微型化、低成本的分析物分析并且可以使用低成本技术来制造。
本文还公开一种集成数字微流体纳米孔装置，其包含微流体模块和纳米孔模块；所述微流体模块包含与单电极隔开的电极阵列，所述单电极大小设定成与所述电极阵列的至少一部分重叠，其中电极阵列和单电极将至少一滴流体传输到电极阵列中的转移电极，其中转移电极定位于可操作地耦接微流体模块和纳米孔模块的接口处；纳米孔模块包含定位于第一衬底的第一表面上的第一微通道；定位于第二衬底的第一表面上的第二微通道；其中第一衬底的第一表面与第二衬底的第一表面接触进而包封第一微通道和第二微通道以分别提供第一毛细管通道和第二毛细管通道，其中至少第一毛细管通道延伸到微流体模块与纳米孔模块之间的接口并与转移电极邻接，且定位成接收定位于转移电极上的流体液滴；其中第一毛细管通道与第二毛细管通道相交，其中纳米孔层定位于第一衬底与第二衬底之间的第一毛细管通道和第二毛细管通道相交的位置处。
在某些实施例中，电极阵列可以包含第一转移电极和第二转移电极，所述转移电极中的每一个配置成将流体液滴定位在转移电极的表面上，其中第一毛细管通道延伸到微流体模块与纳米孔模块之间的接口，与第一转移电极邻接并且定位成接收位于第一转移电极上的流体液滴，且其中第二毛细管延伸到微流体模块与纳米孔模块之间的接口，与第二转移电极邻接并且定位成接收位于第二转移电极上的流体液滴。
在某些实施例中，第二毛细管通道可以不延伸到接口并且可以不连接到微流体模块的电极且可以连接到第二毛细管的一端或两端上排放口或储槽。在某些情况下，第二毛细管连接到一端的第一储槽和另一端的第二储槽。
在某些实施例中，第一储槽和/或第二储槽包含在交叉点处与第一毛细管通道隔开定位的流体，所述流体促进纳米孔层的操作以驱动电流通过纳米孔层的纳米孔。在某些实施例中，第一毛细管通道和/或第二毛细管通道的横截面宽度在毛细管的长度上变化以使得在交叉点处的宽度与交叉点的任一侧上的宽度相比减小。
在一些实施例中，第一毛细管包含第一对电极且第二毛细管包含第二对电极，其中第一对电极定位于第一毛细管通道中且侧接纳米孔层中的纳米孔，且其中第二对电极定位于第二毛细管通道中且侧接纳米孔层中的纳米孔。液滴可为包含待通过传输通过纳米孔层中的纳米孔来检测和/或计数的分子的液滴。
在某些实施例中，流体液滴具有不同的组合物且为第一液滴和第二液滴，第一液滴包含待通过在纳米孔层两端传输通过纳米孔来检测和/或计数的分子且第二液滴包含缺少所述分子的导电流体，其中导电流体促进所述分子在纳米孔层两端传输通过纳米孔。
在某些实施例中，第一毛细管通道包含邻近于纳米孔层定位的第一电极且第二毛细管通道包含邻近于纳米孔层定位的第二电极，其中第一电极和第二电极中的每一个暴露在毛细管通道中以使得其与存在于毛细管通道中的流体接触，且其中在液体定位于第一毛细管通道和第二毛细管通道中的纳米孔层两端时，第一电极和第二电极用以驱动电流通过纳米孔层中的纳米孔。
在某些实施例中，转移电极和第一毛细管通道处于大体上相同的平面上，且其中流体液滴与第一毛细管通道的开口对准。
在一些实施例中，转移电极处于高于第一毛细管通道的平面上且其中装置配置有用于将流体液滴向下转移到第一毛细管通道的开口的竖直端口。
在一特定实施例中，第一衬底的第一表面包含其上安置有电极阵列的第一区域和其中形成有第一微通道的第二区域，其中电极阵列处于高于形成第一微通道的平面的平面上。
在一些实施例中，第二衬底包含位于接口处的侧边缘处凹槽，其中凹槽在第一毛细管通道上对齐且提供用于将位于转移电极处的液滴传输到第一毛细管通道的开口的竖直端口。
在一些情况下，单电极延伸通过转移电极且与转移电极呈双平面配置且其中单电极和转移电极用以将流体液滴移动到转移电极。
在其它情况下，单电极延伸通过转移电极且与转移电极呈双平面配置且其中单电极和转移电极用以将流体液滴移动到转移电极。
在某些实施例中，单电极不延伸通过转移电极且不与转移电极呈双平面配置，其中通过使用共平面电极将流体液滴移动到转移电极。
在某些实施例中，单电极不延伸通过转移电极且不与转移电极呈双平面配置，其中通过使用共平面电极将流体液滴移动到转移电极。
因此，使用如本文所描述的装置、试剂盒、系统和方法，可以测量生物样品中存在的分析物并且可以诊断患者。
在另一方面，本发明涉及用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含(a)使样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；(b)使分析物与第二结合成员接触，其中第二结合成员特异性结合到分析物且其中第二结合成员包含与其连接的可裂解标签；(c)去除未结合到分析物的第二结合成员，所述分析物结合到第一结合成员；(d)裂解附着于结合到分析物的第二结合成员的标签，所述分析物结合到一结合成员；(e)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
在另一方面，本发明涉及用于测量或检测生物样品中存在的所关注分析物的方法，所述方法包含(a)使样品与固体载体、第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触，其中固体载体包含固定剂，第一特异性结合成员包含用于固定剂的配位体且第一特异性结合成员特异性结合所关注分析物，第二特异性结合成员包含可裂解标签并且第二特异性结合成员特异性结合所关注分析物，其中形成固体载体/第一特异性结合成员/所关注分析物/第二特异性结合成员复合物；(b)去除未结合到固体载体/第一特异性结合成员/分析物/第二特异性结合成员复合物的第二特异性结合成员；(c)裂解附着于经标记分析物的标签，所述经标记分析物结合到固体载体/第一特异性结合成员/所关注分析物/第二特异性结合成员复合物中的第二特异性结合成员；(d)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
在另一方面，本发明涉及用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含(a)使样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；(b)使分析物与第二结合成员接触，其中第二结合成员特异性结合到分析物且其中第二结合成员包含适体；(c)去除未结合到分析物的适体，所述分析物结合到固体衬底；(d)解离结合到分析物的适体；(e)使经解离适体移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的适体，其中测量移位通过所述层的适体数测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中。
在一个方面中，本发明涉及一种集成数字微流体纳米孔装置，其包含：第一衬底，包含电极阵列；第二衬底，与第一衬底分隔开；和纳米孔层，安置在第一衬底与第二衬底之间，其中电极阵列配置成将液滴定位于纳米孔层两端以使得液滴被纳米孔层分成第一部分和第二部分，其中电极阵列中的至少两个电极定位于纳米孔层两端，其中两个电极形成阳极和阴极并在液体液滴定位于纳米孔层两端时用以驱动电流通过纳米孔层中的纳米孔。
在又一方面中，本发明涉及一种集成数字微流体纳米孔装置，其包含：第一衬底，包含电极阵列；第二衬底，与第一衬底分隔开；和纳米孔层，安置在第一衬底与第二衬底之间，其中电极阵列配置成将液滴定位在纳米孔层两端时以使得纳米孔层将液滴分成第一部分和第二部分，其中电极阵列中的至少一个电极与定位于纳米孔层两端的液滴的第一部分接触，且第二衬底中的电极定位成接触定位于纳米孔层两端的液滴的第二部分，其中两个电极形成阳极和阴极并在液体液滴定位于纳米孔层两端时用以驱动电流通过纳米孔层中的纳米孔。
在又一方面中，本发明涉及一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员固定于固体载体上且其中结合成员特异性结合到分析物；(b)使样品与经标记分析物接触，其中经标记分析物用可裂解标签标记；(c)去除未结合到结合成员的经标记分析物；(d)裂解附着于经标记分析物的标签，所述经标记分析物结合到结合成员；(e)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
在又一方面中，本发明涉及一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员固定于固体载体上且其中结合成员特异性结合到分析物；(b)使样品与经标记分析物接触，其中经标记分析物包含适体；(c)去除未结合到结合成员的经标记分析物；(d)解离结合到经标记分析物的适体并使经解离适体移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的适体，其中测量移位通过所述层的适体数测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中。
在又一方面中，本发明涉及一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员特异性结合到分析物且结合成员用可裂解标签标记；(b)使样品与经固定分析物接触，其中经固定分析物固定到固体载体上；(c)去除未结合到经固定分析物的结合成员；(d)裂解附着于结合成员的标签，所述结合成员结合到经固定分析物；(e)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
在又一方面中，本发明涉及一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员特异性结合到分析物，且其中结合成员包含适体；(b)使样品与经固定分析物接触，其中经固定分析物固定于固体载体上；(c)去除未结合到经固定分析物的结合成员；(d)解离结合到结合成员的适体，所述结合成员结合到经固定分析物，并使经解离适体移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的适体，其中测量移位通过所述层的适体数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中。
在又一方面中，本发明涉及一种集成数字微流体纳米孔装置，其包含微流体模块和纳米孔模块；所述微流体模块包含电极阵列，其中电极阵列将至少一滴流体传输到电极阵列中的第一转移位置，其中第一转移位置位于微流体模块与纳米孔模块之间的接口处；纳米孔模块包含：第一毛细管通道；和第二毛细管通道；其中至少第一毛细管通道延伸到接口且与第一转移位置邻接，并且定位成接收定位于第一转移位置处的流体液滴；其中第一毛细管通道与第二毛细管通道相交，其中纳米孔层定位于第一毛细管通道与第二毛细管通道之间的第一毛细管通道和第二毛细管通道相交的位置处。
在又一方面中，本发明涉及一种用于测量生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；(b)使分析物与第二结合成员接触，其中第二结合成员特异性结合到分析物且其中第二结合成员包含与其连接的可裂解标签；(c)去除未结合到分析物的第二结合成员，所述分析物结合到第一结合成员；(d)裂解附着于结合到分析物的第二结合成员的标签，所述分析物结合到第一结合成员；(e)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的标签，其中移位通过所述层的每一个标签为移位事件，其中测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中通过以下来确定样品中存在的分析物量：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准，其中小节i)中的标准曲线通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件的数量来确定；其中小节ii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现一定数量的移位事件所需要的时间来确定；且其中小节iii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。
在又一方面中，本发明涉及一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；(b)使分析物与第二结合成员接触，其中第二结合成员特异性结合到分析物且其中第二结合成员包含适体；(c)去除未结合到分析物的适体，所述分析物结合到固体衬底；(d)解离结合到分析物的适体；和(e)使经解离适体移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的适体，其中移位通过所述层的每一个适体为移位事件，其中测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中通过以下来确定样品中存在的分析物量：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准，其中小节i)中的标准曲线通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件的数量来确定；其中小节ii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现一定数量的移位事件所需要的时间来确定；且其中小节iii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。
在又一方面中，本发明涉及一种用于测量生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员固定于固体载体上且其中结合成员特异性结合到分析物；(b)使样品与经标记分析物接触，其中经标记分析物用可裂解标签标记；(c)去除未结合到结合成员的经标记分析物；(d)裂解附着于经标记分析物的标签，所述经标记分析物结合到结合成员；(e)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的标签，其中移位通过所述层的每一个标签为移位事件，其中测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中通过以下来确定样品中存在的分析物量：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准，其中小节i)中的标准曲线通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件的数量来确定；其中小节ii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现一定数量的移位事件所需要的时间来确定；且其中小节iii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。
在另一方面中，本发明涉及一种用于测量生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员固定于固体载体上且其中结合成员特异性结合到分析物；(b)使样品与经标记分析物接触，其中经标记分析物包含适体；(c)去除未结合到结合成员的经标记分析物；(d)解离结合到经标记分析物的适体并使经解离适体移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的适体，其中移位通过所述层的每一个适体为移位事件，其中测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中通过以下来确定样品中存在的分析物量：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准，其中小节i)中的标准曲线通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件的数量来确定；其中小节ii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现一定数量的移位事件所需要的时间来确定；且其中小节iii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。
在又一方面中，本发明涉及一种用于测量生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员特异性结合到分析物且其中结合成员用可裂解标签标记；(b)使样品与经固定分析物接触，其中经固定分析物固定于固体载体上；(c)去除未结合到经固定分析物的结合成员；(d)裂解附着于结合成员的标签，所述结合成员结合到经固定分析物；(e)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的标签，其中移位通过所述层的每一个标签为移位事件，其中测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中通过以下来确定样品中存在的分析物量：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准，其中小节i)中的标准曲线通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件的数量来确定；其中小节ii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现一定数量的移位事件所需要的时间来确定；且其中小节iii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。
在又一方面中，本发明涉及一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员特异性结合到分析物且其中结合成员包含适体；(b)使样品与经固定分析物接触，其中经固定分析物固定于固体载体上；(c)去除未结合到经固定分析物的结合成员；(d)解离结合到结合成员的适体，所述结合成员结合到经固定分析物，并使经解离适体移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的适体，其中移位通过所述层的每一个适体为移位事件，其中测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中通过以下来确定样品中存在的分析物量：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准，其中小节i)中的标准曲线通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件的数量来确定；其中小节ii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现一定数量的移位事件所需要的时间来确定；且其中小节iii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。
在又一方面中，本发明涉及一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员固定于固体载体上，结合成员包含与其连接的可裂解标签且结合成员特异性结合到分析物；(b)去除为结合到分析物的结合成员；(c)裂解附着于结合成员的标签，所述结合成员结合到分析物；(d)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的标签，其中移位通过所述层的每一个标签为移位事件，其中测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中通过以下来确定样品中存在的分析物量：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考。
在又一方面中，本发明涉及一种集成数字微流体纳米孔启用装置，其包含：微流体模块和纳米孔启用模块；微流体模块，包含与单电极隔开的电极阵列，所述单电极大小设定成与电极阵列的至少一部分重叠，其中电极阵列和单电极将至少一滴流体传输到电极阵列中的转移电极，其中转移电极定位于微流体模块与纳米孔启用模块之间的接口处；纳米孔启用模块包含：第一微通道，其定位于第一衬底的第一表面上；第二微通道，其定位于第二衬底的第一表面上；其中第一衬底的第一表面与第二衬底的第一表面接触进而包封第一微通道和第二微通道以分别提供第一毛细管通道和第二毛细管通道，其中至少第一毛细管通道延伸到微流体模块与纳米孔启用模块之间的接口且与转移电极邻接，并且定位成接收定位于转移电极上的流体液滴；其中第一毛细管通道与第二毛细管通道相交，其中层定位于第一衬底与第二衬底之间的第一毛细管通道和第二毛细管通道相交的位置处，其中所述层不含纳米孔且将第一毛细管通道和第二毛细管通道中存在的离子液隔开，其中第一毛细管通道和第二毛细管通道与电极电连接以用于驱动第一毛细管通道到第二毛细管通道的电压或反之用于在第一毛细管通道和第二毛细管通道的交叉点处的层中产生纳米孔。
在又一方面中，本发明涉及一种用于在集成数字微流体纳米孔启用装置中产生纳米孔的方法，所述方法包含：提供如本文先前描述的集成数字微流体纳米孔启用装置；在第一毛细管通道和第二毛细管通道中施加电压以驱动电流通过层；测量在层两端的电导；在检测到指示在层中产生纳米孔的电导时终止施加电压。
在又一方面中，本发明涉及一种集成数字微流体纳米孔装置，其包含：第一衬底，包含电极阵列；第二衬底，与第一衬底隔开；开口，在与包含纳米孔的纳米孔层流体连通的第一衬底或第二衬底中；和一对电极，配置成通过纳米孔施加电场，其中电极阵列配置成将至少一滴流体传输到所述开口。
在又一方面中，本发明涉及一对集成数字微流体纳米孔装置，其包含：本文中先前描述的第一集成数字微流体纳米孔装置，其中单电极为第一单电极，且毛细管通道为第一毛细管通道；和第二集成数字微流体纳米孔装置，其包含：第三衬底，包含第五侧面和与第五侧面相反的第六侧面，其中第五侧面包含电极阵列；第四衬底，与第三衬底隔开，其中第四衬底包含面对第三衬底的第五侧面的第七侧面和与第七侧面相反的第八侧面，其中第七侧面包含第二单电极且其中纳米孔层安置于第八侧面上，其中第四衬底包含从第四衬底的第七侧面延伸到第八侧面的第二毛细管通道，其中纳米孔层定位于毛细管通道的开口上方，其中纳米孔层插入于第二衬底与第四衬底之间以使得纳米孔在第一毛细管通道与第二毛细管通道之间提供电渗管道，其中所述检测电极对包含为第二单电极的第二检测电极。
在又一方面中，本发明涉及一种集成数字微流体纳米孔启用装置，其包含：第一衬底，包含第一侧面和与第一侧面相反的第二侧面，其中第一侧面包含电极阵列；第二衬底，与第一衬底隔开，其中第二衬底包含面对第一衬底的第一侧面的第三侧面和与第三侧面相反的第四侧面；纳米孔启用层，不含纳米孔且安置于装置的外侧面上，其中外侧面选自第二侧面或第四侧面，其中包含外侧面的第一衬底或第二衬底中的一个包含从第一衬底的第一侧面延伸到第二侧面，或从第二衬底的第三侧面延伸到第四侧面的毛细管通道，其中纳米孔启用层定位于毛细管通道的开口上方；和一对电极，配置成在纳米孔启用层两端施加电场，其中电极阵列配置成将至少一滴流体传输到毛细管通道。
在又一方面中，本发明涉及一种用于在集成数字微流体纳米孔启用装置中产生纳米孔的方法，所述方法包含：提供本文中先前描述的集成数字微流体纳米孔启用装置；将纳米孔启用层的两侧浸没在离子液中以使得所述层的每一侧上的离子液与所述检测电极对中的任一个电接触；在所述检测电极对之间施加电压以驱动电流通过所述层；测量所述层两端的电导；在检测到指示在所述层中产生纳米孔的电导时终止施加电压。
在另一方面中，本发明涉及一种包含结合成员、标签和间隔物的组合物。
在又一方面中，本发明涉及一种集成数字微流体纳米孔装置，其包含：第一衬底，包含电极阵列；第二衬底，与第一衬底分隔开；和具有第一表面和第二表面的纳米孔层，安置在第一衬底与第二衬底之间，其中电极阵列配置成将第一液滴定位在纳米孔层的第一表面处，其中电极阵列中的至少两个电极定位在纳米孔层两端，其中两个电极形成阳极和阴极并在液体液滴定位在纳米孔层的第一表面处时用以驱动电流通过纳米孔层中的纳米孔。
在又一方面中，本发明涉及一种集成数字微流体纳米孔装置，其包含微流体模块和纳米孔模块；微流体模块包含电极阵列，其中电极阵列将至少一滴流体传输到电极阵列中的转移位置，其中转移位置在微流体模块与纳米孔模块之间的接口处；纳米孔模块包含从转移位置延伸到纳米孔层的第一毛细管通道。
在又一方面中，本发明涉及一种集成数字微流体纳米孔装置，其包含：第一衬底，包含电极阵列；第二衬底，与第一衬底隔开；第一纳米孔层，其中具有一个或多个纳米孔；第二纳米孔层，其中具有一个或多个纳米孔；和至少两个电极，其用于产生电场以驱动标签通过第一纳米孔层和第二纳米孔层中的纳米孔。
在又一方面中，本发明涉及一种用于前述方法中的任一个的包含前述装置中的任一个的试剂盒。
在又一方面中，本发明涉及一种使用前述装置中的任一个以测量或检测生物样品中存在的分析物或诊断患者或筛检血液供给源的方法。
在又一方面中，本发明涉及一种测量或检测生物样品中存在的所关注分析物的方法，所述包含(a)使样品与固体载体、结合成员和用可裂解标签标记的经标记分析物接触，其中固体载体包含固定剂，结合成员包含用于固定剂的配位体，且结合成员特异性结合所关注分析物以形成固体载体/结合成员/所关注分析物复合物或固体载体/结合成员/经标记分析物复合物；(b)去除固体载体/结合成员/经标记分析物复合物中未结合到结合成员的经标记分析物；(c)裂解附着于经标记分析物的标签，所述经标记分析物结合到固体载体/结合成员/经标记分析物复合物中的结合成员；(d)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
在又一方面中，本发明涉及一种用于测量或检测生物样品中存在的所关注分析物的方法，所述方法包含(a)使样品与固体载体、结合成员和外源性分析物接触，其中固体载体包含固定剂，外源性分析物包含用于固定剂的配位体并结合固体载体以便形成固体载体/经固定分析物复合物，且结合成员包含可裂解标签并特异性地结合所关注分析物以形成固体载体/所关注分析物/结合成员复合物或固体载体/经固定分析物/结合成员复合物；(b)去除固体载体/经固定分析物/结合成员复合物或固体载体/所关注分析物/结合成员复合物中未结合的结合成员；(c)裂解固体载体/经固定分析物/结合成员复合物中附着于结合成员的标签；(d)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
在又一方面中，本发明涉及一种测量或检测生物样品中存在的所关注分析物的方法，所述包含(a)使样品与固体载体、结合成员和用可裂解标签标记的经标记分析物接触，其中固体载体包含固定剂，结合成员包含用于固定剂的配位体，且结合成员特异性结合所关注分析物以形成固体载体/结合成员/所关注分析物复合物或固体载体/结合成员/经标记分析物复合物；(b)去除固体载体/结合成员/经标记分析物复合物中未结合到结合成员的经标记分析物；(c)裂解附着于经标记分析物的标签，所述经标记分析物结合到固体载体/结合成员/经标记分析物复合物中的结合成员；(d)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
在又一方面中，本发明涉及一种用于测量或检测生物样品中存在的所关注分析物的方法，所述方法包含(a)使样品与固体载体、结合成员和外源性分析物接触，其中固体载体包含固定剂，外源性分析物包含用于固定剂的配位体并结合固体载体以便形成固体载体/经固定分析物复合物，且结合成员包含可裂解标签并特异性地结合所关注分析物以形成固体载体/所关注分析物/结合成员复合物或固体载体/经固定分析物/结合成员复合物；(b)去除固体载体/经固定分析物/结合成员复合物或固体载体/所关注分析物/结合成员复合物中未结合的结合成员；(c)裂解固体载体/经固定分析物/结合成员复合物中附着于结合成员的标签；(d)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
在又一方面中，本发明涉及一种测量或检测生物样品中存在的所关注分析物的方法，所述包含(a)使样品与固体载体、结合成员和用适体标记的经标记分析物接触，其中固体载体包含固定剂，结合成员包含用于固定剂的配位体，且结合成员特异性结合所关注分析物以形成固体载体/结合成员/所关注分析物复合物或固体载体/结合成员/经标记分析物复合物；(b)去除固体载体/结合成员/经标记分析物复合物中未结合到结合成员的经标记分析物；(c)解离附着于经标记分析物的适体，所述经标记分析物结合到固体载体/结合成员/经标记分析物复合物中的结合成员；(d)使经解离适体移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的适体，其中测量移位通过所述层的适体数测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中。
在又一方面中，本发明涉及一种用于测量或检测生物样品中存在的所关注分析物的方法，所述方法包含(a)使样品与固体载体、结合成员和外源性分析物接触，其中固体载体包含固定剂，外源性分析物包含用于固定剂的配位体并结合固体载体以便形成固体载体/经固定分析物复合物，且结合成员包含适体并特异性地结合所关注分析物以形成固体载体/所关注分析物/结合成员复合物或固体载体/经固定分析物/结合成员复合物；(b)去除固体载体/经固定分析物/结合成员复合物或固体载体/所关注分析物/结合成员复合物中未结合的结合成员；(c)解离固体载体/经固定分析物/结合成员复合物中结合到结合成员的适体；(d)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
本文还提供程序化以操作料筒的仪器，所述料筒包括用于致动液滴的电极阵列且进一步包括电化学物质感测区。所述仪器可以用于分析料筒中的样品，所述料筒包括用于致动液滴的电极阵列且进一步包括用于检测分子移位通过纳米孔的纳米孔层。公开一种配置成操作以下的仪器：第一料筒，其包括用于致动液滴的电极阵列且进一步包括电化学物质感测区；和第二料筒，其包括用于致动液滴的电极阵列且进一步包括用于检测分子移位通过纳米孔的纳米孔层。公开一种配置成操作以下的仪器：料筒，其包括用于致动液滴的电极阵列、电化学物质感测区，和用于检测分子移位通过纳米孔的纳米孔层。
附图说明
本文中列举的主题的细节(均关于其结构和操作)可以通过对附图的研究显而易见，在所述附图中，类似附图标号是指类似的部分。图中的组件未必按比例绘制，而是侧重于说明主题的原理。此外，所有说明意欲表达概念，其中相关的尺寸、形状和其它详细的属性可以示意性地而非字面上地或精确地说明。
图1A和图1B描绘了与纳米孔装置15结合使用的微流体装置10。
图2A和图2B描绘了可逆集成装置的示意图，所述可逆集成装置具有通过通道40与纳米孔模块30组合的微流体模块20。图2C到图2L描绘示范性集成装置的示意图，在所述示范性集成装置中，微流体模块流体地连接到纳米孔模块。纳米孔模块包括在两个微流体通道相交的位置处物理地分离两个微流体通道的层中的纳米孔。
图3示出了包括微流体模块300和纳米孔模块325的示范性集成装置。
图4提供了一种集成装置400，其中数字微流体模块包括内置式纳米孔模块。
图5A示出了集成装置的顶视图。图5B示出图5A的集成装置的侧视图。
图6描绘了本公开的示范性装置和方法。
图7描绘了本公开的示范性装置和方法。
图8描绘了本公开的示范性集成装置的侧视图。
图9描绘了本公开的示范性系统。
图10描绘了低成本DMF芯片的制造程序的示意图。
图11描绘了根据图10中的示意图制造的单柔性DMF芯片。
图12描绘了根据本公开的实施例的DMF芯片中液滴的致动。
图13A到图13E描绘了根据本公开的实施例的DMF芯片中免疫测定的性能。
图14A到图14C描绘了根据本公开的实施例的纳米孔模块的制造和设计。
图15A示出了实时测量的泄漏电流的曲线图。图15B描绘纳米孔的电流-电压(I-V)曲线。
图16A到图16C示出了根据本公开的实施例的集成DMF纳米孔模块装置中毛细管通道的填充。
图17示出了根据本公开的实施例的集成DMF纳米孔模块装置中在模块之间的液滴转移的示意图。
图18示出了根据本公开的实施例的纳米孔模块设计的示意图。
图19示出了根据本公开的实施例的调适成通过被动传输在模块之间进行液滴转移的集成DMF纳米孔模块装置的示意图。
图20示出了根据本公开的实施例的调适成通过被动传输在模块之间进行液滴转移的集成DMF纳米孔模块装置的示意图。
图21为根据本公开的实施例的允许通过被动传输来使液体液滴被动移动的含有硅微通道的硅微流体装置的示意图。
图22为根据本公开的实施例的允许通过被动传输来使液滴被动移动的硅微流体装置的硅微通道的图像。
图23A和图23B示出了根据本公开的实施例的集成纳米孔传感器的制造方法的示意图。
图24A到图24C呈现了利用通过以下显示移位事件而获得的曲线的散点图(水平持续时间与阻塞水平)：(图24A)由普通双链DNA(“dsDNA”)构成的纳米孔；(图24B)由经DBCO修饰的dsDNA构成的纳米孔；和(图24C)由dsDNA星形构成的纳米孔。
图25示出了经硫醇介导的化学裂解的示意图。
图26A和图26B示出了在磁性微颗粒进行的光裂解实验的示意图。
图27示出了DMF芯片上试剂放置的示意图。
图28显示了样品相对于以sec-1为单位的纳米孔通量(DMF裂解)的条形图。
图29显示了确定数字信号计数的阈值的方式。
图30A到图30C示出了对于三种标准94nM(图30A)、182nM(图30B)和266nM(图30C)，在不同时间段上的电流阻塞。
图31示出了事件数量对于固定时间量(5分钟)的剂量反应曲线。
图32示出了固定数量事件所需时间的剂量反应曲线。
图33示出了每单位时间的事件的剂量反应曲线。
图34示出了使用Seq31-SS生物素的每单位时间的事件的剂量反应曲线。
图35示出了根据本公开的实施例的硅纳米孔模块中纳米孔腔室设计的示意图。
图36示出了根据本公开的实施例的列出用于硅纳米孔模块的纳米孔腔室中的COMSOL电场模拟的物理参数的图表。
图37为示出了根据本公开的实施例的硅纳米孔模块中纳米孔附近的相对离子浓度梯度的模拟结果的图像集合。
图38为示出了根据本公开的实施例的在具有纳米孔的纳米孔膜上制得的SiO2通孔的直径对通过纳米孔的电渗流的影响的图式。
图39为示出了根据本公开的实施例的在具有纳米孔的纳米孔膜上制得的SiO2通孔的直径对通过纳米孔的电导的影响的图式。
图40示出了根据本公开的实施例的具有定位于DMF模块的一侧上的纳米孔模块的集成DMF纳米孔模块装置的示意图。
图41为示出了根据本公开的实施例的通过毛细管力使液体从DMF模块移动通过DMF模块衬底中的孔洞的图像集合。
图42为示出了根据本公开的实施例的具有定位于DMF模块的一侧上的纳米孔模块和配置用于纳米孔制造的电极的集成DMF纳米孔模块装置的图像集合。
图43为根据本公开的实施例的具有定位于DMF模块的一侧上的纳米孔模块的集成DMF纳米孔模块装置的示意图。
图44为根据本公开的实施例的具有定位于两个DMF模块之间的纳米孔模块的集成DMF纳米孔模块装置的示意图。
图45为示出了根据本公开的实施例通过在纳米孔膜两端施加电压且如通过介电击穿证实而在纳米孔膜(透射电子显微镜(TEM)窗)中制造纳米孔的图示。
图46A和图46B为示出了根据本公开的实施例的在调整程序之前和之后的形成于膜中的纳米孔的电流-电压(I-V)曲线的图式集合。
图47示出了在计数标签平均直径与纳米孔尺寸之间绘制的比率平均值相对于信噪比(signal to noise ratio；SNR)的散点图。
图48A到图48F提供了根据一个实施例的分析物检测芯片的示意图。
图49A到图49C提供了根据另一实施例的分析物检测芯片的示意图。
图50提供了根据一个实施例的分析物检测芯片的示意图。
图51A和图51B示出了示范性分析物检测芯片的侧视图。
图52A到图52E示出了包含DMF电极和光学检测室的料筒。
图53示出了根据另一实施例的分析物检测芯片的顶视图的示意图。
图54示出了替代性示范分析物检测芯片的示意图。
图55提供了示范性血液学芯片的示意图。
图56和图57示出了具有多个检测区的DMF芯片的替代实施例。
图58A和图58B示出了示范性分析物检测装置的示意图。图58C为与A和B中的分析物检测装置兼容的料筒的示意图。图58D和图58E示出了允许将不同类型的料筒插入同一凹槽中的料筒适配器。
图59A和图59B描绘了料筒(A)和与所述料筒兼容的分析物检测装置(B)的实施例。
图60A和图60B示出了具有用于实施多种分析的多个仪器的示范性分析物检测系统。
具体实施方式
本公开的实施例涉及用于分析样品中一种或多种分析物的方法、系统和装置。在某些实施例中，样品可为生物样品。
1.定义
在描述本公开的实施例之前，应理解，本发明不限于所描述的特定实施例，因而当然可变化。还应理解，本文中所用的术语仅仅是为了描述具体实施例且并不意图为限制性的。
如本文中所使用的术语“包含”、“包括”、“具有(having/has)”、“可以”、“含有”以及它们的变体意欲是开放性过渡短语、术语或措辞，其不排除额外动作或结构的可能性。除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一”、“和”以及“所述”包括多个参考物。本公开还涵盖其它实施例“包含本文提出的实施例或元件”、“由本文提出的实施例或元件组成”以及“大体上由本文提出的实施例或元件组成”，而不管是否明确阐述。
为了叙述本文的数值范围，明确涵盖它们之间具有相同精确度的每一个插入数值。举例来说，对于范围6-9，除了6和9之外涵盖数值7和8，并且对于范围6.0-7.0，明确涵盖数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9以及7.0。
如本文中可互换使用的“亲和力”和“结合亲和力”是指结合成员与分析物结合的倾向或强度。举例来说，结合亲和力可以由平衡解离常数(KD)、解离速率(kd)或缔合速率(ka)表示。
如本文所使用的“类似物”是指具有与所关注分子(例如，核苷类似物、核苷酸类似物、糖类磷酸酯类似物、分析物类似物等)类似的结构的分子。分析物类似物为结构上类似于分析物但结合成员对于其具有不同亲和力的分子。
如本文所使用的“适体”是指可以高亲和力和特异性结合到先前选择的靶标(包括小分子、蛋白质和肽等等)的寡核苷酸或肽分子。适体可以由于其倾向于形成螺旋环和单链环而假设各种形状。寡核苷酸或核酸适体可为单链DNA或RNA(ssDNA或ssRNA)分子。肽适体可以包括两端附接于蛋白质骨架的短可变肽域。
“珠粒”和“颗粒”在本文中可互换使用且是指实质上球形的固体载体。
“组分(Component/components)”或“至少一个组分”一般是指根据本文所描述的方法和所属领域中已知的其它方法可以包含于分析测试样品(如患者尿液、血清、全血、组织抽吸物或血浆样品)的试剂盒中的捕捉抗体、检测剂或偶联物、校验仪、对照、敏感组、容器、缓冲液、稀释剂、盐、酶、酶的辅因子、检测剂、预处理试剂/溶液、底物(例如，作为溶液)、停止溶液等。一些组分可以呈溶液形式或冻干用于重构以用于分析中。
如本文所使用的“对照”是指如本领域中已知的或公认的，或使用如通常采用的可接受方式凭经验确定的分析物的参考标准。“参考标准”为用作类似物质的测量基础的标准化物质。举例来说，有美国药典委员会(USP-NF)、美国食品化学法典和膳食补充剂概要(其所有可在http://www.usp.org获得)以及其它众所周知的资源中公布的记录参考标准。用于使参考标准化的方法描述于文献中。另外众所周知的是用于通过使用分析物的校准曲线或通过与替代的参考标准进行比较来量化所存在的分析物的量方式。可以使用分析物的已知浓度的连续稀释液或溶液，通过质谱法、重力法以及通过所属领域中已知的其它技术来产生标准曲线。已描述于文献中的替代的参考标准包括标准叠加(又称为标准叠加方法)或数字聚合酶链反应。
如本文中可互换所使用的“数字微流体(DMF)”、“数字微流体模块(DMF模块)”或“数字微流体装置(DMF装置)”是指利用数字或基于液滴的微流体技术提供对离散且小体积呈液滴形式的液体的操控的模块或装置。数字微流体使用乳液科学的原理以创建进入通道的流体-流体分散体(主要油包水乳液)。其允许产生单分散液滴/气泡或具有极低多分散性的液滴/气泡。数字微流体是基于可再配置网络内的不连续流体液滴的微操控。复杂指令可以通过组合液滴形成、移位、分开和合并的基本操作来编程。
数字微流体在离散体积的液体上操作，可以通过二元电信号来操作。通过使用离散单位体积的液滴，微流体操作可以定义为重复基本操作的集合，即，移动一个单位的流体通过一个单位的距离。可以使用液体的表面张力属性来形成液滴。液滴的致动是基于由放置于底表面下方的电极产生的静电力的存在，液滴位于所述底表面上。不同类型的静电力可用于控制液滴的形状和运动。可用于创建前述静电力的一种技术是基于介电泳，所述介电泳依赖于液滴与周围介质之间的电容率差且可利用高频AC电场。可用于创建前述静电力的另一种技术是基于电润湿，所述电润湿依赖于表面上存在的液体液滴与施加到表面的电场上的表面之间的表面张力的依赖性。
“阻力标签(Drag-tag)”是指迁移率调节剂。阻力标签可为经基因改造的高度重复多肽(“蛋白质聚合物”)，所述多肽设计成为较大的水可溶且完全单分散的。可以将带正电精氨酸以每隔一定距离故意引入到氨基酸序列中以增加流体动力阻力而不增加阻力标签长度。阻力标签描述于美国专利公开号20120141997中，所述公开以引用的方式并入本文中。
如本文所使用的“酶可裂解序列”是指可以通过酶来裂解的任何核酸序列。举例来说，酶可为蛋白酶或核酸内切酶，如限制性核酸内切酶(也被称为限制酶)。限制核酸内切酶能够识别且在预定核苷酸之间的特异性DNA裂解位点处裂解DNA分子。一些核酸内切酶(如Fokl)包含在特定位置处非特异性地裂解DNA而不管这个位置处存在的核苷酸如何的裂解域。在一些实施例中，特异性DNA裂解位点和限制性核酸内切酶的DNA识别位点是相同的。
“球状蛋白质”是指具有大致球形形状的水溶性蛋白质。球状蛋白质的实例包括(但不限于)卵白蛋白、β-球蛋白、C-反应蛋白、血纤维蛋白、血红蛋白、IgG、IgM和凝血酶。
如本文中可互换所使用的“标记”或“可检测标记”是指通过可裂解连接子附着于特异性结合成员或分析物的标签。
“纳米颗粒”和“纳米珠粒”在本文中可互换地使用且是指大小设定成移位通过或跨过纳米孔以用于计数穿越通过所述纳米孔的纳米珠粒/纳米颗粒数量的纳米珠粒或纳米颗粒。
“核碱基”或“碱基”意思指天然存在的那些碱基和在用于产生聚合物的核酸或多核苷酸技术或肽核酸技术的领域中通常已知的合成性杂环部分。合适核碱基的非限制性实例包括：腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、5-丙炔基-尿嘧啶、2-硫基-5-丙炔基-尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶、假异胞嘧啶、2-硫尿嘧啶和2-硫代胸腺嘧啶、2-氨基嘌呤、N9-(2-氨基-6-氯嘌呤)、N9-(2,6-二氨基嘌呤)、次黄嘌呤、N9-(7-脱氮-鸟嘌呤)、N9-(7-脱氮-8-氮杂-鸟嘌呤)以及N8-(7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤)。核碱基可以与其它部分连接以形成核苷、核苷酸，和核苷/核苷酸类似物。
“核苷”是指由在1'位置处与戊糖(如核糖、2'-脱氧核糖或2',3'-双脱氧核糖)的异头碳连接的嘌呤、脱氮嘌呤或嘧啶核碱基组成的化合物，例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶、7-脱氮腺嘌呤、7-脱氮鸟苷。
如本文所使用的“核苷酸”是指核苷的磷酸酯，例如单磷酸酯、双磷酸酯、三磷酸酯，其中酯化的最常见位点是附接到戊糖的C-5位置上的羟基。
“核碱基聚合物”或“核碱基寡聚物”是指通过键连接以形成寡聚物的两个或更多个核碱基。核碱基聚合物或寡聚物包括(但不限于)多核苷酸和寡核苷酸(例如，DNA和RNA聚合物以及寡聚物)、多核苷酸类似物和寡核苷酸类似物以及多核苷酸和寡核苷酸模拟物，如聚酰胺或肽核酸。核碱基聚合物或寡聚物可以在大小上从几个核碱基变成数百个核碱基或数千个核碱基。核碱基聚合物或寡聚物可以包括约2个到100个核碱基或约8000个到10000个核碱基。举例来说，核碱基聚合物或寡聚物可具有至少约2个核碱基、至少约5个核碱基、至少约10个核碱基、至少约20个核碱基、至少约30个核碱基、至少约40个核碱基、至少约50个核碱基、至少约60个核碱基、至少约70个核碱基、至少约80个核碱基、至少约90个核碱基、至少约100个核碱基、至少约200个核碱基、至少约300个核碱基、至少约400个核碱基、至少约500个核碱基、至少约600个核碱基、至少约700个核碱基、至少约800个核碱基、至少约900个核碱基、至少约1000个核碱基、至少约2000个核碱基、至少约3000个核碱基、至少约4000个核碱基、至少约5000个核碱基、至少约6000个核碱基、至少约7000个核碱基、至少约8000个核碱基、至少约9000个核碱基，或至少约10000个核碱基。
“层中的一个或多个纳米孔”意思指在单膜结构或多膜结构中，存在一个纳米孔或存在彼此紧邻(例如，并排)的多个纳米孔(例如，两个或更多个)。当存在一个或多个纳米孔(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个或如技术上可行的其它数量的纳米孔)时，任选地其并排(例如，彼此紧邻)或串联(例如，一个层中的一个纳米孔与另一层中的另一纳米孔隔开存在或一个层中的一个纳米孔堆叠于另一层中的另一纳米孔上(例如，上方或顶部)等)存在，或在替代结构中对于本领域技术人员将是显而易见的。任选地，这类纳米孔例如通过每一个在其自身的单独隔室(例如，与任何其它纳米孔分隔开)内来独立地定址或替代地可以通过独立检测电路来定址。
“聚合物刷子”是指用一个端部附接到表面的聚合物层。聚合物紧靠在一起且形成层或形成其自身环境的涂层。刷子可以在悬挂链浸没于溶剂中时呈溶剂状态，或在悬挂链完全地填满可用空间时呈熔融状态。另外，在聚合物链本身携带静电电荷时，存在个别类别的聚电解质刷子。刷子的特征可在于接枝链的高密度。随后有限的空间导致所述链的强延伸和系统的异常属性。刷子可用于稳定胶体、减少表面之间的摩擦并提供人工关节中的润滑。
“多核苷酸”或“寡核苷酸”是指其中核碱基通过糖类磷酸酯键(糖类-磷酸酯主链)来连接的核碱基聚合物或寡聚物。示范性多核苷酸和寡核苷酸包括2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)的聚合物和核糖核苷酸(RNA)的聚合物。多核苷酸可以完全由核糖核苷酸构成，完全由2'-脱氧核糖核苷酸构成或其组合。“核酸”涵盖“多核苷酸”和“寡核苷酸”且包括核苷酸单体的单链和双链聚合物。
“多核苷酸类似物”或“寡核苷酸类似物”是指其中核碱基通过包含一个或多个糖类磷酸酯类似物的糖类磷酸酯主链来连接的核碱基聚合物或寡聚物。典型的糖类磷酸酯类似物包括(但不限于)糖类烷基磷酸酯、糖类氨基磷酸酯、糖类烷基磷酸酯或经取代的烷基磷酸酯、糖类硫代磷酸酯、糖类二硫代磷酸酯、糖类磷酸酯和糖类磷酸酯类似物，其中糖类为除2'-脱氧核糖或核糖外的具有带正电的糖类-胍基互连键的核碱基聚合物，如美国专利第6,013,785号和美国专利第5,696,253号中描述的那些核碱基聚合物。
如本文中所使用，“孔”(或者在本文中称作“纳米孔”)或“通道”(或者在本文中称作“纳米孔”或“纳米通道”)是指膜/层中的腔道、间隙、管道或沟槽，其中孔隙或通道具有足够的维度允许(例如，标签)一次(例如逐个，如一系列)通过或分析单分子。
如本文所使用的“受体”是指识别并对内源性化学信号起反应的蛋白质分子。当这类内源性化学信号结合到受体时，其引起某一形式的细胞/组织反应。受体的实例包括(但不限于)神经受体、激素受体、养分受体和细胞表面受体。
如本文中所使用，“间隔物”是指延伸特异性结合成员的可裂解基团，或提供结合成员与载体之间的键或延伸可光裂解部分的标记物/标签的化学部分。在一些实施例中，一个或多个间隔物可包括在多肽或基于核苷酸的标签或标记物的N端或C端处以与特异性结合成员的序列距离最佳。间隔物可以包括(但不限于)6-氨基己酸(6-aminocaproic acid/6-aminohexanoic acid)；1,3-二氨基丙烷、1,3-二氨基乙烷；聚乙二醇(PEG)聚合物基团、短氨基酸序列，以及如具有1到5个氨基酸的聚甘氨酸序列。在一些实施例中，间隔物为硝基苯甲基、二巯基乙基氨基、6碳间隔物、12碳间隔物，或3-(9-((3-羧丙基)(甲苯磺酰基)氨基甲酰基)吖啶-10-鎓-10-基)丙烷-1-磺酸酯。
如本文中可互换所使用的“特异性结合配偶体”或“特异性结合成员”是指相比于其它分子的实质上更低的认知度而特异性地识别另一分子的两种或更多种不同分子中的一种。两种不同分子中的一种在表面上或在空腔中具有一个区域，所述区域特异性结合到另一分子的特定空间和极性组织且进而定义为与另一分子的特定空间和极性组织互补。所述分子可为特异性结合对的成员。举例来说，特异性结合成员可包括(但不限于)蛋白质，如受体、酶和抗体。
如本文中所使用，“标签”或“标签分子”均是指移位通过或跨过纳米孔且提供样品中分析物含量的指示的分子(例如，从第二结合成员裂解或从目标分析物解离的适体)。这些术语是指单一标签分子或多种相同的标签分子。同样地，除非另外规定，否则“标签”是指一个标签或一个或多个标签。
如本文所使用的“阈值”是指凭经验确定且主观的截止水平，高于所述截止水平，所获取的数据被认为是“信号”，且低于所述截止水平，所获取的数据被认为是“噪声”。阈值对于数字信号计数的使用描绘于图29中。基于累积和算法(Cumulative Sums Algorithm；CUSUM)的计算机程序用于处理所获取的数据并基于用户的阈值输入来检测事件。通过检测任何尽可能多的事件，接着出于特定目的过滤数据来避免用户之间的差异。举例来说，如从这个图可见，高于设定阈值的经检测事件影响了作为信号计数的事件总数。在“宽松”阈值的情况下，将更少数量的事件计数为信号。在“紧密”阈值的情况下，将更多数量的事件计数为信号。将阈值设定为宽松或紧密是基于分析的所需敏感性或特异性的主观选择，且在给定评估中，是否优选假阳性或假阴性。DNA移位的电流阻塞标记计算为1.2nA，这是基于将电流变化与DNA直径和纳米孔膜厚度相关联的经验公式(H.Kwok,等人，《科学公共图书馆综合卷(PLoS ONE)，9(3),392880,2014》)。
如本文中所使用，提及(例如，纳米颗粒、标签、标签分子或其它)移动“通过或跨过”纳米孔意思指替代地(换句话说)从纳米孔的一侧通过或跨过到另一侧，例如从顺侧到反侧，或反过来也如此。
如本文所使用的“示踪剂”是指偶联到标签或标记物的分析物或分析物片段，其中偶联到标签或标记物的分析物可以有效地与分析物竞争对所述分析物具有特异性的抗体上的位点。举例来说，示踪剂可为分析物或分析物的类似物，如环孢菌素或其类似物ISA247、维生素D和其类似物、性激素和其类似物等。
如本文所使用的“移位事件”是指其中标签移位通过或跨过(例如，从顺侧到反侧或反过来也如此)层或纳米孔的事件。
除非另外定义，否则本文中所用的全部技术和科学术语具有与所属领域普通技术人员通常所理解相同的含义。在有矛盾的情况下，将以本文档(包括定义)为准。下文描述优选方法和材料，但与本文所述的那些类似或等效的方法和材料可用于实施或测试本发明。本文中提到的所有公开案、专利申请、专利和其它参考文献以全文引用的方式并入以公开且描述与引用的公开案相关的方法和/或材料。本文公开的材料、方法和实例仅仅是说明性的并且不打算是限制性的。
2.用于分析物分析的方法
本文提供用于分析物分析的方法。所述方法可涉及单分子计数。在某些实施例中，用于分析物分析的方法可涉及评定样品中存在的分析物。在某些实施例中，评定可以用于确定样品中分析物的存在和/或浓度。在某些实施例中，方法还可以用于确定样品中存在的多种不同分析物的存在和/或浓度。
本文提供用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法。所述方法包括：使样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；使分析物与第二结合成员接触，其中第二结合成员特异性结合到分析物且其中第二结合成员包括与其连接的可裂解标签；去除未结合到分析物的第二结合成员，所述分析物结合到第一结合成员；裂解附着于结合到分析物的第二结合成员的标签，所述分析物结合到第一结合成员；使经裂解标签移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；检测或测量移位通过所述层的标签；和评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。在一些实施例中，对测量移位通过所述层的标签进行评定，其中移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量。在一些实施例中，对检测移位通过所述层的标签进行评定，其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
本文提供用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法。所述方法包括使样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；使分析物与第二结合成员接触，其中第二结合成员特异性结合到分析物且其中第二结合成员包括适体；去除未结合到分析物的适体，所述分析物结合到固体衬底；解离结合到分析物的适体并使经解离适体移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；和评定移位通过所述层的适体，其中测量移位通过所述层的适体数量测量了样品中存在的分析物量，或检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中。在一些实施例中，对测量移位通过所述层的适体进行评定，其中移位通过所述层的适体数量测量了样品中存在的分析物量。在一些实施例中，对检测移位通过所述层的适体进行评定，其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
在一些实施例中，每一个标签，如适体移位通过所述层为移位事件。测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量。在一些实施例中，样品中存在的分析物量可以通过在设定时间段期间计数移位事件的数量并所移位事件的数量与对照相关联来确定。标准曲线可以通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件数量来确定。在一些实施例中，样品中存在的分析物量可以通过测量发生一定数量的移位事件的时间量并与对照相关联来确定。标准曲线可以通过测量对于对照分析物浓度发生一定数量的移位事件所需要的时间来确定。在一些实施例中，样品中存在的分析物量可以通过测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联来确定。标准曲线可以通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。在一些实施例中，对照可为包含校准曲线、标准叠加或聚合酶链反应的参考标准。
在示范性情况下，所述方法可以包括：使样品与第一结合成员(“结合成员”替代地称作“特异性结合成员”且如下文节段c)中所描述)接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；使分析物与第二结合成员接触，所述第二结合成员特异性结合到分析物且所述第二结合成员包括与其连接的可裂解标签(如本文所定义和下文节段d)中所描述的“标签”)；去除未结合到分析物的第二结合成员，所述分析物结合到第一结合成员；裂解附着于结合到分析物的第二结合成员的标签，所述分析物结合到第一结合成员；使标签移位通过层中的纳米孔；确定移位通过所述层的标签数量；基于移位通过所述层的标签数量确定样品中分析物的浓度。在某些实施例中，分析物浓度可以通过计数每单位时间移位通过所述层的标签数量来确定。在其它实施例中，分析物浓度可以通过确定移位通过所述层的标签数量达到阈值时的时间来确定。
样品可为含有或疑似含有所关注分析物的任何测试样品。如本文中所使用，“分析物”、“目标分析物”、“所关注分析物”可互换地使用且是指将在本文公开的方法和装置中测量的分析物。所关注分析物进一步描述于下文。
如本文所使用的“接触”和其语法等效物是指将结合成员充分地引入与样品中的所关注分析物紧密近接以使得若对结合成员具有特异性的所关注分析物存在于样品中时将发生结合相互作用的任何类型的组合操作。接触可以多种不同方式实现，包括将样品与结合成员组合，通过将结合成员引入非常接近于分析物来使目标分析物暴露于结合成员等。
在某些情况下，第一结合成员可以固定于固体载体上。如本文中所使用，“固定”是指第一结合成员与固体载体的表面的稳定缔合。通过“稳定缔合”意思指两个实体之间的物理性缔合，其中缔合的平均半衰期例如在生理条件下为一天或大于一天。在某些方面，在4℃下在PBS中，两个实体之间的物理性缔合具有两天或大于两天、一周或大于一周、一个月或大于一个月，包括六个月或大于六个月，例如1年或大于1年的平均半衰期。根据某些实施例，稳定缔合由两个实体之间的共价键、两个实体之间的非共价键(例如，离子或金属键)，或其它形式的化学吸引，如氢键结、范德华力(Van der Waals force)等引起。
表面上固定有结合试剂的固体载体可为呈平面或非平面构形的任何适宜表面，如微流体芯片的表面、腔室的内表面、珠粒的外表面(如本文所定义)或多孔性珠粒的内表面和/或外表面。举例来说，第一结合成员可以共价地或非共价地附著于珠粒，例如乳胶、琼脂糖、琼脂糖凝胶、抗生蛋白链菌素、甲苯磺酰基活化的(tosylactivated)、环氧化物、聚苯乙烯、氨基珠粒、胺珠粒、羧基珠粒或类似物。在某些实施例中，珠粒可为颗粒，例如微颗粒。在一些实施例中，微颗粒可以介于约0.1nm与约10μm之间、介于约50nm与约5μm之间、介于约100nm与约1μm之间、介于约0.1nm与约700nm之间、介于约500nm与约10μm之间、介于约500nm与约5μm之间、介于约500nm与约3μm之间、介于约100nm与700nm之间，或介于约500nm与700nm之间。举例来说，微颗粒可为约4-6微米、约2-3微米或约0.5-1.5微米。小于约500nm的颗粒有时认为是纳米颗粒。因此，微颗粒任选可为介于约0.1nm与约500nm之间、介于约10nm与约500nm之间、介于约50nm与约500nm之间、介于约100nm与约500nm之间、约100nm、约150nm、约200nm、约250nm、约300nm、约350nm、约400nm、约450nm或约500nm的纳米颗粒。
在某些实施例中，珠粒可为磁性珠粒或磁粒。磁性珠粒/磁粒可为铁磁性的、亚铁磁性的、顺磁性的、超顺磁的或铁磁流体的。示范性铁磁性材料包括Fe、Co、Ni、Gd、Dy、CrO2、MnAs、MnBi、EuO、NiO/Fe。亚铁磁性材料的实例包括NiFe2O4、CoFe2O4、Fe3O4(或FeO.Fe2O3)。珠粒可以具有为磁性的且被一个或多个非磁性层包围的实芯部分。替代地，磁性部分可为非磁性芯体周围的层。其上固定有第一结合成员的固体载体可以干燥形式或以液体形式存储。在使样品与磁性珠粒接触之间或之后，可以使磁性珠粒经历磁场，第一结合成员固定在所述磁性珠粒上。
在接触步骤之后，可以将样品和第一结合成员孵育足够的时间段以允许发生结合成员与分析物之间的结合相互作用。另外，孵育可以在结合缓冲液中进行以促进特异性结合相互作用。可以在分析中通过改变结合缓冲液来调节或改变第一结合成员和/或第二结合成员的结合亲和力和/或特异性。在一些实施例中，可以通过改变结合缓冲液来增加结合亲和力和/或特异性。在一些实施例中，可以通过改变结合缓冲液来减少结合亲和力和/或特异性。
可以使用下文所描述的所公开方法和装置来测量第一结合成员和/或第二结合成员的结合亲和力和/或特异性。在一些实施例中，使用一组条件检定样品的一个等分试样且与使用不同组的条件所检定的样品的另一等分试样相比较，进而确定所述条件对结合亲和力和/或特异性的影响。举例来说，改变或更改条件可为以下中的一个或多个：从样品中去除目标分析物、添加与用于结合的目标分析物或配位体竞争的分子，以及改变pH、盐浓度或温度。另外地或可替代地，时长可为可变的且改变条件可以包括在再次进行检测方法之前等待的时长。
在一些实施例中，在标签或适体通过纳米孔装置的孔之后，可以重新配置装置以逆转标签或适体的移动方向以使得标签或适体可以再次通过所述孔且并在感染性疾病检定的确认检定中重新测量或重新检测以确认所测量的结果。
结合缓冲液可以包括抗原-抗体结合缓冲剂的分子标准物，例如白蛋白(例如，BSA)、非离子清洁剂(Tween-20、Triton X-100)和/或蛋白酶抑制剂(例如，PMSF)。在某些情况下，在添加样品之前或之后，可以将结合缓冲液添加到微流体芯片、腔室等中。在某些情况下，第一结合成员在与样品接触之前可以存在于结合缓冲液中。结合成员与分析物之间的结合相互作用发生的时间长度可以凭经验确定且可以视结合成员与分析物之间的结合亲和力(binding affinity/binding avidity)而定。在某些实施例中，接触或孵育可以持续以下时段：5秒到1小时，例如10秒到30分钟，或1分钟到15分钟，或5分钟到10分钟，例如10秒、15秒、30秒、1分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟、45分钟、1小时或2小时。用于结合相互作用的其它条件，例如温度、盐浓度，也可以凭经验确定或可基于制造商的指示。举例来说，接触可以在室温(21℃-28℃，例如23℃-25℃)、37℃或4℃下执行。在某些实施例中，样品与第一结合成员的任选混合可以在接触步骤期间执行。
在经固定第一结合成员与分析物之间形成复合物之后，任何未结合的分析物可以从第一结合成员以及样品的附近去除同时第一结合成员与分析物的复合物可由于其与固体载体缔合而保留。任选地，固体载体可以与洗涤缓冲液接触以去除未特异性结合到固体载体的任何分子。
在第一接触步骤和任选的去除样品和/或任选的洗涤步骤之后，第一结合成员与分析物的复合物可以与第二结合成员接触，进而导致形成其中分析物与两个结合成员结合的夹心复合物。任选的将第二成员与第一结合成员-分析物复合物混合可在第二接触步骤期间执行。在一些实施例中，分析物分子相对于表面的固定可有助于从溶液中去除任何过量的第二结合成员而不担心从表面移走分析物分子。在一些实施例中，第二结合成员可以包括与其连接的标签，如可裂解标签。
如上文所提及，第二接触步骤可以在足以用于分析物与第二结合成员之间的结合相互作用的条件下执行。在第二接触步骤之后，可以去除任何未结合的第二结合成员，接着任选的洗涤步骤。可以通过合适的方式从第一结合成员-分析物-第二结合成员的复合物中分离任何未结合的第二结合成员，所述方式例如液滴致动、电泳、电润湿、介电泳、静电致动、电场介导、电极介导、毛细管力、色谱法、离心或抽吸。在从第一结合成员-分析物-第二结合成员的复合物附近去除任何未结合的第二结合成员之后，可以通过合适的方式分离附着于第一结合成员-分析物-第二结合成员的复合物中存在的第二结合成员的标签。在一些实施例中，标签从去除未结合反应剂之后保留的复合物中裂解或解离。举例来说，标签可以通过可裂解连接子(如下文节段f)中所描述的“可裂解连接子”)附着于第二结合成员。第一结合成员-分析物-第二结合成员的复合物可以暴露于介导可裂解连接子裂解的裂解剂。
在某些实施例中，标签从第一结合成员-分析物-第二结合成员复合物中分离是在不导致复合物破坏的条件下执行，进而引起仅标签从复合物中释放。在其它情况下，标签从第一结合成员-分析物-第二结合成员复合物中分离是在可导致复合物破坏的条件下执行，进而引起标签，以及第二结合成员、分析物、第一结合成员中的一个或多个从复合物中释放。在某些实施例中，用于计数标签的纳米孔的大小可以预防第二结合成员、分析物、第一结合成员移位通过纳米孔。在其它实施例中，在第二结合成员、分析物、第一结合成员的复合物保留在固体载体上时，纳米孔可不被大小设定成不包括第二结合成员、分析物和第一结合成员。
分离步骤导致产生游离标签，所述游离标签可在电场的影响下致使移位通过或跨过纳米孔或纳米孔层(如下文节段f)中所描述)。在某些情况下，裂解步骤可以导致附着于第一结合成员-分析物-第二结合成员复合物中的每一个第二结合成员的大体上所有标签分子的分离。标签分子数量可以与复合物中分析物分子的数量相关，所述标签数量与样品中的分析物浓度成比例。在某些实施例中，可以推导出经计数标签与分析物浓度之间的相关性(较高数量的标签分子与较高分析物浓度相关)。在经标记竞争对手或标记分析物，如示踪剂(如本文所定义)与样品组合的实施例中，所述标记竞争对手或标记分析物与样品中的分析物竞争以结合到第一结合成员，经计数标签与分析物浓度之间的相关性可为相反的(较低数量的标签分子与较高分析物浓度相关)。标签分子数量与分析物浓度之间的相关性无论是直接的或相反的，仍可为线性的或对数的。因此，移位通过纳米孔的标签分子数量可用于确定样品中的分析物浓度。在某些实施例中，分析物浓度可以通过计数每单位时间移位通过所述层的标签数量来确定。在其它实施例中，分析物浓度可以通过确定移位通过所述层的标签数量达到阈值时的时间来确定。在某些实施例中，移位通过或跨过纳米孔的标签分子数量可以通过每单位时间纳米孔处的电流阻塞频率来确定。信号检测进一步描述于下文节段g)中。如下文节段d)中所描述，标签分子可为纳米颗粒或纳米珠粒(如本文所定义的“纳米颗粒”和“纳米珠粒”)。
并入在第二结合成员中的标签数量(即，标签/第二结合成员结合物种的标签数量)提供与分析物定义的化学计量。在某些实施例中，标签可以使用产生附着于每一个第二结合成员的一致数量的标签的程序附着于第二结合成员。标签数量可以基于计数速度来优化。由于计数速率取决于浓度，所以可以通过在结合成员上包括更多标签来获得更快的读取速率。标签数量可以基于标签并入的化学计量，例如1:1或1:4并入速率来优化。在一些实施例中，存在1:5并入速率。举例来说，一个第二结合成员可以具有与其连接的1个标签分子、2个标签分子、3个标签分子、4个标签分子或多达10个标签分子。在一些实施例中，一个第二结合成员可以具有与其连接的5个标签分子。用于将标签结合到第二结合成员(例如，肽、多肽、核酸)的多种结合方法为已知的，其中的任一个可用于制备经标记的第二结合成员以用于本发明方法和装置中。举例来说，标签与分析物特异性抗体的位点特异性结合可以使用硫醇-马来酰亚胺化学方法、胺-丁二酰亚胺基化学方法、THIOBRIDGETM技术，使用具有C端或N端六组胺酸标签的抗体、具有醛标签的抗体、不含铜的点击反应等来执行。
在一些实施例中，方法可以通过确定移位事件数来测量分析物量。在一些实施例中，一个或多个移位事件可以根据并入特异性结合成员中的标签的化学计量对应于结合成员与分析物之间的结合事件。举例来说，若每个结合成员并入一个标签，则一个移位事件代表结合成员与分析物的结合；若每个结合成员并入两个标签，则两个移位事件代表结合成员与分析物的结合；若每个结合成员并入三个标签，则三个移位事件代表结合成员与分析物的结合等。
在另一实施例中，第二结合成员可为特异性结合到分析物的适体。在这个实施例中，标签可不附着于适体。相反地，在适体移位通过或跨过纳米孔时计数所述适体，即，适体具有作为第二结合成员和作为标签的双重功能。在这些实施例中，第一结合成员-分析物-适体复合物中的适体可以通过任何合适的方法从复合物中解离。举例来说，在移位通过或跨过纳米孔之前，结合到第一结合成员-分析物复合物的适体可以通过变性步骤解离。变性步骤可以涉及暴露于离液试剂、高盐溶液、酸性试剂、碱性试剂、溶剂或加热步骤。适体可随后移位通过或跨过纳米孔且移位通过或跨过纳米孔的适体分子数量可用于确定样品中的分析物浓度。
如在本文中所提及，标签或适体可以包括核酸。在某些实施例中，使用纳米孔的计数步骤不包括通过确定标签/适体中存在的核酸序列的至少一部分的标识来确定标签或适体的标识。举例来说，计数步骤可不包括确定标签/适体的序列。在其它实施例中，可不对标签/适体进行测序，但可以确定标签/适体的标识，使得可以基于与标签/适体因其大小、构形、电荷、电荷量等相关联的可区分信号将一个标签/适体与另一个标签/适体区分开。标签/适体的识别可适用于涉及同时分析样品中的多种不同分析物，例如样品中的两种、三种、四种或更多种不同分析物的方法。
在某些实施例中，同时分析单一样品中的多种分析物可以通过使用多种不同的第一结合成员和第二结合成员来进行，其中一对第一结合成员和第二结合成员对于样品中的单一分析物具有特异性。在这些实施例中，与对单一分析物具有特异性的第一对第一结合成员和第二结合成员中的第二结合成员相关的标签可以与对不同分析物具有特异性的第二对第一结合成员和第二结合成员中的第二结合成员相关的标签区分开。如上文所提及，可以基于维度、电荷等的差异将第一标签与第二标签区分开。
在一些实施例中，可实质上精确确定的流体样品中的分析物浓度小于约5000飞摩尔(fM)、小于约3000fM、小于约2000fM、小于约1000fM、小于约500fM、小于约300fM、小于约200fM、小于约100fM、小于约50fM、小于约25fM、小于约10fM、小于约5fM、小于约2fM、小于约1fM、小于约500aM(aM)、小于约100aM、小于约10aM、小于约5aM、小于约1aM、小于约0.1aM、小于约500仄摩尔(zM)、小于约100zM、小于约10zM、小于约5zM、小于约1zM、小于约0.1zM或更小。
在一些情况下，检测极限(例如，可以在溶液中确定的分析物的最低浓度)为约100fM、约50fM、约25fM、约10fM、约5fM、约2fM、约1fM、约500阿摩尔(aM)、约100aM、约50aM、约10aM、约5aM、约1aM、约0.1aM、约500仄摩尔(zM)、约100zM、约50zM、约10zM、约5zM、约1zM、约0.1zM或更小。在一些实施例中，可以实质上精确确定的流体样品中的分析物浓度介于约5000fM与约0.1fM之间、介于约3000fM与约0.1fM之间、介于约1000fM与约0.1fM之间、介于约1000fM与约0.1zM之间、介于约100fM与约1zM之间、介于约100aM与约0.1zM之间或更小。
检测上限(例如，可在溶液中确定的分析物的上限浓度)为至少约100fM、至少约1000fM、至少约10皮摩尔(pM)、至少约100pM、至少约100pM、至少约10纳摩尔(nM)、至少约100nM、至少约1000nM、至少约10μM、至少约100μM、至少约1000μM、至少约10mM、至少约100mM、至少约1000mM或更大。
在一些情况下，可通常在小于约1小时，例如45分钟、30分钟、15分钟、10分钟、5分钟、1分钟或30秒内快速地检测样品中的分析物的存在和/或浓度。
在某些实施例中，本文所描述的方法中的至少一些步骤可以在数字微流体装置，如下文节段3中所描述的装置上执行。在某些实施例中，本公开的方法使用数字微流体装置连同纳米孔装置来执行。举例来说，数字微流体装置和纳米孔装置可为单独的装置且含有一个或多个裂解标签或解离适体的液滴可以在微流体装置中产生并传输到纳米孔装置。在某些实施例中，含有所述裂解标签或解离适体的液滴可以使用由用户或机器人操作的移液管从微流体装置中抽吸并传输到纳米孔装置
在某些实施例中，本公开的方法使用其中数字微流体模块与纳米孔模块集成的装置，如下文所描述的装置来执行。在某些实施例中，数字微流体模块和纳米孔模块可以逆转地集成。举例来说，两种模块可以物理地组合以形成集成装置且所述装置可随后分离成单独的模块。在某些实施例中，本公开的方法使用包括微流体模块和内置式纳米孔模块的一次性料筒来执行。用于进行本文所提供的方法的装置的示范性实施例进一步描述于以下节段中。
在某些情况下，与纳米孔模块集成的微流体装置或装置的微流体模块可以包括以间隔开的方式布置的第一衬底和第二衬底，其中第一衬底与第二衬底被间隙/间距分开，且其中至少以下步骤在第一衬底与第二衬底之间的间距/间隙中执行：使样品与第一结合成员接触、使分析物与第二结合成员接触、去除未结合到分析物的第二结合成员(所述分析物结合到第一结合成员)，和裂解附着于第二结合成员(仍与结合到第一结合成员的分析物结合)的标签。
本发明方法的示范性实施例包括产生样品的液滴和将样品液滴与含有第一结合成员的液滴组合以产生单一液滴。第一结合成员可以固定于固体衬底，如珠粒(例如，磁性珠粒)上。可将单一液滴孵育一段足以允许第一结合成员结合到样品液滴中存在的分析物的时间。任选地，可搅动单一液滴以促进样品与第一结合成员混合。可以通过来回移动单一液滴、围绕在多个电极上方移动单一液滴、分裂液滴且随后合并液滴，或使用SAW等来实现混合。接着，单一液滴可以经受磁力以将珠粒保留在装置中的某一位置处，同时可移走液滴且被含有第二结合成员的液滴替换。在添加第二结合成员之前，可通过将洗涤缓冲液的液滴移动到使用磁力保留珠粒的位置来进行任选的洗涤步骤。在足以使第二结合成员结合与第一结合成员结合的分析物的时段之后，可移走含有第二结合成员的液滴，同时使珠粒保留在第一位置处。可使用洗涤缓冲液的液滴洗涤珠粒，接着使珠粒与含有裂解试剂的液滴接触以裂解附着于第二结合成员的标签。在标签经由可光裂解连接子附接到第二结合成员的实施例中，可使珠粒暴露于适当波长的光以裂解连接子。在某些情况下，珠粒可以在裂解可光裂解连接子之前暴露于缓冲液液滴。任选地，在用以去除任何未结合的第二结合成员的洗涤步骤之后，可以留下覆盖珠粒的含有缓冲液的液滴，可以去除将珠粒保留在第一位置处的磁力且可以将含有珠粒的缓冲液液滴移动到可执行光裂解的第二位置。可随后将含有经裂解标签的液滴移动到纳米孔装置或集成装置的纳米孔模块部分。在使用适体作为第二结合成员的实施例中，在用以去除任何未结合的适体的洗涤步骤之后，可留下覆盖珠粒的含有缓冲液的液滴，可去除将珠粒保留在第一位置处的磁力并可将含有珠粒的缓冲液液滴移动到可执行适体解离的第二位置。在其它实施例中，在洗涤步骤之后，珠粒可以暴露于用于使结合到分析物的适体解离的试剂的液滴中。可将含有经解离适体的液滴移动到纳米孔同时可使用磁体将珠粒保留在适当位置。可以将含有经解离适体的液滴移动到纳米孔装置或集成装置的纳米孔模块部分。
在一替代实施例中，第一结合成员可以固定于间隙/间距中的某一位置处的第一衬底或第二衬底的表面上。使样品与第一结合成员接触的步骤可以包括将样品液滴移动到固定第一结合成员的间隙/间距中的位置处。后续步骤可大体类似于上文对于第一结合成员固定于磁性珠粒上所描述的那些步骤。
在裂解/解离步骤之后，含有经裂解标签/经解离适体的液滴可以移动到纳米孔装置或集成装置的纳米孔模块。如上文所提及，可以使用液体转移系统，如移液管来移动液滴。在某些情况下，微流体模块可流体地连接到纳米孔模块。流体连接可经由通道将微流体模块连接到纳米孔模块或通过可逆地将纳米孔模块放置在微流体模块内或在集成装置的制造过程期间来实现。这类装置进一步描述于以下节段中。
在以上实施例中，任选地，在组合之后，可操控(例如，来回移动、以环形方向移动、来回变化、分裂/合并、暴露于SAW等)液滴以促进样品与测定试剂，如第一结合成员、第二结合成员等混合。
集成微流体纳米孔装置中的液滴移动可以使用电力(例如，电润湿、介电泳、电极介导的、光电润湿、电场介导以及静电致动)压力、表面声波等来执行。用于移动液滴的力可以基于装置的特异性来确定，这描述于下文节段a)到g)中，针对具体装置描述于节段3中。
a)多重
方法可包括在多重分析中检测样品中的一种或多种(或替代地两种或更多种)目标分析物的一个或多个(或替代地两个或更多个)特异性结合成员。一个或多个(或替代地两个或更多个)特异性结合成员中的每一个结合到不同的目标分析物且每一个特异性结合成员用不同的标签和/或适体标记。举例来说，第一特异性结合成员结合到第一目标分析物，第二特异性结合成员结合到第二目标分析物，第三特异性结合成员结合到第三目标分析物等，且第一特异性结合成员用第一标签和/或适体标记，第二特异性结合成员用第二标签和/或适体标记，第三特异性结合成员用第三标签和/或适体标记等。在一些实施例中，第一条件使得第一特异性结合成员用标签标记时裂解或释放第一标签或第一特异性结合成员用适体标记时解离或释放第一适体，第二条件使得第二特异性结合成员用标签标记时裂解或释放第二标签或第二特异性结合成员用适体标记时解离或释放第二适体，第三条件使得第三特异性结合成员用标签标记时裂解或释放第三标签或第三特异性结合成员用适体标记时解离或释放第三适体等。在一些实施例中，样品情况可以在分析期间在不同时间处改变，从而允许检测第一标签或适体、第二标签或适体、第三标签或适体等，进而检测一种或多种(或替代地两种或更多种)目标分析物。在一些实施例中，基于在纳米孔中的滞留时长、电流阻抗的量值或其组合来同时检测通过孔的一个或多个(或替代地两个或更多个)经裂解标签和/或经解离适体。
b)示范性目标分析物
如所属领域的普通技术人员将了解，可以使用本公开的方法和装置检测到并任选地量化可由第一结合成员和第二结合成员特异性结合的任何分析物。
在一些实施例中，分析物可为生物分子。生物分子的非限制性实例包括巨分子，如蛋白质、脂质和碳水化合物。在某些情况下，分析物可为激素、抗体、生长因子、细胞因子、酶、受体(例如，神经受体、激素受体、营养素受体和细胞表面受体)或其配位体、癌症标记物(例如，PSA、TNF-α)、心肌梗塞标记物(例如，肌钙蛋白、肌酸激酶等)、毒素、药物(例如，成瘾药物)、代谢剂(例如，包括维生素)等。蛋白质分析物的非限制性实施例包括肽、多肽、蛋白质片段、蛋白质复合物、融合蛋白质、重组蛋白、磷蛋白、糖蛋白、脂蛋白或类似物。
在某些实施例中，分析物可为翻译后修饰蛋白质(例如，磷酸化蛋白质、甲基化蛋白质、糖基化蛋白质)且第一结合成员或第二结合成员可为对于翻译后修饰具有特异性的抗体。经修饰蛋白质可以结合到固定于固体载体上的第一结合成员，其中第一结合成员结合到经修饰蛋白质而非未经修饰的蛋白质。在其它实施例中，第一结合成员可结合到未经修饰蛋白质和经修饰蛋白质，且第二结合成员可对翻译后修饰蛋白质具有特异性。
在一些实施例中，分析物可为细胞，如循环肿瘤细胞、病原菌、病毒(包括逆转录病毒、疱疹病毒、腺病毒、慢病毒、线状病毒(埃博拉(ebola))、肝炎病毒(例如，A、B、C、D和E))；HPV等；芽孢等。
可以通过本文中提供的方法来分析的分析物的非限制性清单包括Aβ42淀粉样β-蛋白质、胎球蛋白-A、tau蛋白、分泌粒蛋白II、朊病毒蛋白、α-突触核蛋白、tau蛋白质、神经丝轻链、帕金蛋白(parkin)、PTEN诱导的假定激酶1、DJ-1、富含白氨酸的重复激酶2、突变ATP13A2、Apo H、铜蓝蛋白、过氧化物酶体增殖剂活化的受体γ辅活化子-1α(PGC-1α)、甲状腺素运载蛋白、维生素D-结合蛋白、促凋亡激酶R(PKR)及其磷酸化PKR(pPKR)、CXCL13、IL-12p40、CXCL13、IL-8、Dkk-3(精液)、p14内皮细胞特异性分子片段、血清、ACE2、CD25的自身抗体、hTERT、CAI25(MUC 16)、VEGF、sIL-2、骨桥蛋白(Osteopontin)、人类附睾蛋白质4(HE4)、α-胎蛋白、白蛋白、白蛋白尿、微白蛋白尿、嗜中性白细胞明胶酶相关的脂质运载蛋白(NGAL)、白介素18(IL-18)、肾脏损伤分子-1(KIM-1)、肝脂肪酸结合蛋白(L-FABP)、LMP1、BARF1、IL-8、癌胚抗原(CEA)、BRAF、CCNI、EGRF、FGF19、FRS2、GREB1，以及LZTS1、α-淀粉酶、癌胚抗原、CA125、IL8、硫氧还蛋白、β-2微球蛋白含量-监测病毒的活性、肿瘤坏死因子-α受体-监测病毒的活性、CA15-3、毛囊刺激激素(FSH)、促黄体激素(LH)、T细胞淋巴瘤侵入及癌转移1(TIAM1)、N-钙黏素、EC39、双调蛋白、dUTP酶、分泌性凝溶胶蛋白(pGSN)、前列腺特异性抗原(prostate specific antigen；PSA)、胸腺素βl5、胰岛素、血浆C-肽、糖基化血红蛋白(HBA1c)、C-反应蛋白(CRP)、白细胞介素-6(IL-6)、Rho GDP-解离抑制剂2(ARHGDIB)、切丝蛋白-1(CFL1)、肌动蛋白抑制蛋白-1(PFN1)、谷胱甘肽S转移酶p(GSTP1)、蛋白质S100-A11(S100A11)、过氧化物还原酶-6(PRDX6)、HSPE1(10kDa热冲击蛋白质，线粒体)、溶菌酶C前驱体(LYZ)、葡萄糖-6-磷酸酯异构酶(GPI)、组蛋白H2A2型-A(HIST2H2AA)、甘油醛-3-磷酸酯去氢酶(GAPDH)、基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白前驱体(HSPG2)、半乳糖凝集素-3-结合蛋白前驱体(LGALS3BP)、组织蛋白酶D前驱体(CTSD)、载脂蛋白E前驱体(APOE)、RasGTP酶活化类蛋白质IQGAP1(IQGAP1)、铜蓝蛋白前驱体(CP)，以及IGLC1蛋白质(IGLC2)、PCDGF/GP88、EGFR、HER2、MUC4、IGF-IR、p27(kip1)、Akt、HER3、HER4、PTEN、PIK3CA、SHIP、Grb2、Gab2、3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(PDK-1)、TSC1、TSC2、mTOR、受体反馈抑制剂1(MIG-6)、S6K、src、KRAS、MEK丝裂原活化蛋白激酶1、cMYC、TOPO II拓扑异构酶(DNA)IIα170kDa、FRAP1、NRG1、ESR1、ESR2、PGR、CDKN1B、MAP2K1、NEDD4-1、FOXO3A、PPP1R1B、PXN、ELA2、CTNNB1、AR、EPHB2、KLF6、ANXA7、NKX3-1、PITX2、MKI67、PHLPP、脂联素(ADIPOQ)、血纤维蛋白原α链(FGA)、瘦素(LEP)、晚期糖基化最终产物-特异性受体(AGER又名RAGE)、α-2-HS-醣蛋白(AHSG)、血管生成素(ANG)、CD14分子(CD14)、铁蛋白(FTH1)、胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGFBP1)、白介素2受体、α(IL2RA)、血管细胞黏附分子1(VCAM1)和血管性血友病因子(VWF)、髓过氧物酶(MPO)、IL1α、TNFα、核周抗嗜中性白细胞细胞质抗体(p-ANCA)、乳铁传递蛋白、钙卫蛋白、韦母氏瘤-1蛋白质(Wilm's Tumor-1 protein)、水通道蛋白-1、MLL3、AMBP、VDAC1、大肠杆菌肠毒素(热量不稳定外毒素、热量稳定肠毒素)、流感HA抗原、破伤风毒素、白喉毒素、肉毒杆菌毒素、志贺毒素(Shiga toxin)、志贺样毒素I、志贺样毒素II、艰难梭菌毒素(Clostridiun difficile toxins)A和艰难梭菌毒素B等。
可以使用本方法和装置在样品，如环境样品、从有需要的患者或个体中获得的生物样品中测量的核酸适体的示范性目标包括：滥用药物(例如可卡因)、蛋白质生物标记物(包括(但不限于)核仁素、核因子-kB必需调节剂(NEMO)、CD-30、蛋白质酪氨酸激酶7(PTK7)、血管内皮生长因子(VEGF)、MUC1糖型、免疫球蛋白μ重链(IGHM)、免疫球蛋白E、αvβ3整合素、α-凝血酶、HIV gp120、NF-κB、E2F转录因子、HER3、纤维蛋白溶酶原活化剂抑制剂、腱生蛋白C、CXCL12/SDF-1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、胃癌细胞、HGC-27)；细胞(包括(但不限于)非小细胞肺癌(NSCLC)、结肠直肠癌细胞、(DLD-1)、H23肺腺癌细胞、拉莫斯细胞(Ramos cell)、T细胞急性淋巴母细胞性白血病(T-ALL)细胞、CCRF-CEM、急性骨髓白血病(AML)细胞(HL60)、小细胞肺癌(SCLC)细胞、NCIH69、人类胶质母细胞瘤细胞、U118-MG、PC-3细胞、HER-2-过表达人类乳癌细胞、SK-BR-3、胰脏癌细胞系(Mia-PaCa-2))；和感染剂(包括(但不限于)结核分枝杆菌、金黄色酿脓葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、痢疾志贺杆菌、大肠杆菌(Escherichia coli)O157:H7、空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、沙门氏菌(Salmonella)O8、沙门氏菌肠炎)。
可以使用本方法和装置在从有需要的患者或个体中获得的样品中测量蛋白质或肽适体的示范性目标包括(但不限于)：HBV核衣壳蛋白、CDK2、E2F转录因子、胸苷酸合成酶、Ras、EB1和晚期糖化最终产物的受体(RAGE)。适体和其用途以及制备方法综述于例如Shum等人，《癌症治疗学杂志(J Cancer Ther)》.2013 4:872；Zhang等人，《现代医药化学(CurrMed Chem)》.2011；18:4185；Zhu等人，《化学通讯(Camb)》.2012 48:10472；Crawford等人，《简要的功能基因组蛋白质组学(Brief Funct Genomic Proteomic)》.2003 2:72；Reverdatto等人，《科学公共图书馆综合卷》.2013 8:e65180。
c)样品
如本文中所使用，“样品”、“测试样品”、“生物样品”是指含有或疑似含有所关注分析物的流体样品。样品可来源于任何合适的来源。在一些情况下，样品可包含液体、流态微颗粒固体，或固体颗粒的液体悬浮液。在一些情况下，可在本文中所描述的分析之前加工样品。举例来说，样品可在分析之前从其来源中分离或纯化；然而，在某些实施例中，可直接检定含有分析物的未加工样品。分析物分子的来源可为合成的(例如，在实验室中产生)、环境(例如，空气、土壤、流体样品，例如供水系统等)、动物(例如哺乳动物)、植物或其任何组合。在一个特定实例中，分析物的来源为人体物质(例如，体液、血液、血清、血浆、尿液、唾液、汗液、痰液、精液、粘液、泪腺流体、淋巴流体、羊水、肺灌洗液、脑脊髓液、粪便、组织、器官或类似物)。组织可包括(但不限于)骨骼肌组织、肝组织、肺组织、肾组织、心肌组织、脑组织、骨髓、子宫颈组织、皮肤等。样品可为液体样品，或固体样品的液体提取物。在某些情况下，样品的来源可为器官或组织，如活检样品，其可通过组织分解/细胞裂解而溶解。
可分析各种体积的流体样品。在几个示范性实施例中，样品体积可为约0.5nL、约1nL、约3nL、约0.01μL、约0.1μL、约1μL、约5μL、约10μL、约50μL、约100μL、约1mL、约5mL、约10mL等。在一些情况下，流体样品的体积介于约0.01μL与约10mL之间、介于约0.01μL与约1mL之间、介于约0.01μL与约100μL之间、介于约0.1μL与约10μL之间、介于约1μL与约100μL之间、介于约10μL与约100μL之间，或介于约10μL与约75μL之间。
在一些情况下，流体样品可在用于分析之前经过稀释。举例来说，在其中分析物分子的来源为人类体液(例如，血液、血清)的实施例中，流体可用适当溶剂(例如，缓冲液，如PBS缓冲液)稀释。流体样品可在使用前稀释约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约10倍、约100倍或更多倍。
在一些情况下，样品可经历预分析加工。预分析加工可以提供额外的功能性，如非特异性蛋白质去除和/或有效又便宜的可实施混合功能性。预分析加工的通用方法可包括使用电动捕获、AC电动、表面声波、等速电泳、介电泳、电泳或所属领域中已知的其它预浓缩技术。在一些情况下，流体样品可以在用于分析之前经过浓缩。举例来说，在其中分析物分子的来源为人类体液(例如，血液、血清)的实施例中，流体可以通过沉淀、蒸发、过滤、离心或其组合来浓缩。流体样品可以在使用前浓缩约1倍、约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约6倍、约10倍、约100倍或更多倍。
在某些实施例中，在测量分析物之前，不使分析物扩增(即，不增加分析物的拷贝数)。举例来说，在分析物为DNA或RNA的情况下，不复制分析物以增加分析物的拷贝数。在某些情况下，分析物为蛋白质或小分子。
d)特异性结合成员
如所属领域的技术人员将了解，结合成员将由待分析的分析物确定。广泛多种目标分子的结合成员为已知的且可易于使用已知的技术发现或开发。举例来说，当目标分析物为蛋白质时，结合成员可包括蛋白质，特别是抗体或其片段(例如，抗原结合片段(Fab)、Fab'片段、F(ab')2片段、重组抗体、嵌合抗体、单链Fvs(“scFv”)、单链抗体、单结构域抗体，如来源于骆驼家族动物的可变重链结构域(“VHH”；又称为“VHH片段”)(VHH和其制造方法描述于Gottlin等人，《生物分子筛检杂志(Journal of Biomolecular Screening)》，14:77-85(2009)中)、重组型VHH单结构域抗体、以及VNAR片段、二硫键连接的Fvs(“sdFv”)，和抗个体基因型(“anti-Id”)抗体，以及以上任一种的功能上活化的表位结合片段、全长多克隆或单克隆抗体、抗体样片段等)，其它蛋白质，如受体蛋白质、蛋白质A、蛋白质C或类似物。在分析物为小分子，如类固醇、后胆色素(bilin)、类视黄醇和脂质的情况下，第一结合成员和/或第二结合成员可为支架蛋白质(例如，脂质运载蛋白(lipocalin))或受体。在一些情况下，蛋白质分析物的结合成员可为肽。举例来说，当目标分析物为酶时，合适的结合成员可以包括酶底物和/或酶抑制剂，其可为肽、小分子和类似物。在一些情况下，当目标分析物为磷酸化物质时，结合成员可包含磷酸盐结合剂。举例来说，磷酸盐结合剂可以包含金属-离子亲和介质，如美国专利第7,070,921号和美国专利申请案第20060121544号中所描述的那些介质。
在某些情况下，结合成员中的至少一者可为适体，如美国专利第5,270,163号、第5,475,096号、第5,567,588号、第5,595,877号、第5,637,459号、第5,683,867号、第5,705,337号中描述的那些适体。核酸适体(例如，单链DNA分子或单链RNA分子)可开发用于捕获几乎任何目标分子。适体以高度特异性、配置依赖性方式，通常以极其高亲和力结合目标分子，但可选择具有低结合亲和力的适体。适体可以基于极小的结构差异(如甲基或羟基的存在或不存在)区别目标分析物分子，且特定适体可以区别D-对映异构体和L-对映异构体以及非对映异构体。适体可结合较小分子目标，包括药物、金属离子和有机染料、肽、生物素以及蛋白质。适体可以在生物素化、荧光标记之后且在附着于玻璃表面和微球粒时保持功能活性。
核酸适体为寡核苷酸，所述寡核苷酸可为单链寡脱氧核苷酸、寡核糖核苷酸或经修饰的寡脱氧核苷酸或寡核糖核苷酸。“经修饰”涵盖核苷酸和经共价修饰的碱类和/或糖类。举例来说，经修饰核苷酸包括具有糖的核苷酸，所述核苷酸共价连接到除3′位置处的羟基外且除5′位置处的磷酸基外的低分子量有机基团。因此经修饰核苷酸还可包括2'经取代糖，如2'-O-甲基-；2-O-烷基；2-O-烯丙基；2'-S-烷基；2'-S-烯丙基；2'-氟-；2'-卤基或2-叠氮基-核糖，碳环糖类似物a-变旋异构糖；差向异构糖，如阿拉伯糖(arabinose)、木糖(xylose)或来苏糖(lyxose)、哌喃糖(pyranose sugar)、呋喃糖(furanose sugar)和景天庚醛糖(sedoheptulose)。在一些实施例中，结合成员包含核酸，所述核酸包含阐述于SEQID NO:1-11中的任一个中的核苷酸序列。
肽适体可设计成干扰蛋白质相互作用。肽适体可基于其上连接可变肽环的蛋白质支架，进而限制适体的构形。在一些情况下，肽适体的支架部分来源于细菌性硫氧还蛋白A(TrxA)。
当目标分子为碳水化合物时，可能合适的捕获组件(如本文所定义)包括例如抗体、凝集素和选择素。如所属领域的普通技术人员将了解，可特异性与所关注目标分子相关联的任何分子可潜在地用作结合成员。
对于某些实施例，合适的目标分析物/结合成员复合物可包括(但不限于)抗体/抗原、抗原/抗体、受体/配位体、配位体/受体、蛋白质/核酸、酶/底物和/或抑制剂、碳水化合物(包括糖蛋白和糖脂)/凝集素和/或选择素、蛋白质/蛋白质、蛋白质/小分子等。
在一特定实施例中，第一结合成员经由键附着于固体载体上，其可包含促进结合成员与载体附接的载体和/或结合成员的任何部分、功能化或修饰。结合成员与载体之间的键可以包括一个或多个化学或物理(例如，经由范德华力、氢键结、静电相互作用、疏水/亲水相互作用等的非特异性附接)键和/或提供这类键的化学间隔物。
在某些实施例中，固体载体还可包含在分析期间可以消除或最小化非捕获组分(例如，分析物分子、结合成员)与结合表面的非特异性附接的保护层、阻挡层或钝化层，这可导致在检测期间的伪阳性信号或导致信号丢失。可用于某些实施例以形成钝化层的材料实例包括(但不限于)：排斥蛋白质非特异性结合的聚合物，如聚(乙二醇)；具有此属性的天然存在的蛋白质，如血清白蛋白和酪蛋白；表面活性剂，例如两性离子表面活性剂，如磺基甜菜碱；天然存在的长链脂质；聚合物刷子和核酸，如鲑精子DNA。
某些实施例利用是蛋白质或多肽的结合成员。如所属领域中已知，许多技术可用于将多肽着于广泛多种固体载体上。已知广泛多种技术以将反应性部分添加到蛋白质中，例如美国专利第5,620,850号中概述的方法。此外，蛋白质附着于表面的方法为已知的，例如参见Heller，《化学研究述评(Acc.Chem.Res.)》.23:128(1990)。
如本文中所解释，结合成员与分析物之间的结合为特异性的，例如在结合成员和分析物是结合对的互补序列部分时。在某些实施例中，结合成员特异性结合到分析物。“特异性结合”或“结合特异性”意思指结合成员以足以区分测试样品中的分析物分子与其它组分或污染物的特异性结合分析物分子。举例来说，根据一个实施例的结合成员可为特异性结合到分析物上的表位的抗体。根据一个实施例的抗体可为能够特异性结合到所关注分析物的任何抗体。举例来说，适当的抗体包括(但不限于)单克隆抗体、双特异性抗体、微型抗体、域抗体(dAb)(例如如Holt等人(2014)《生物技术趋势》21:484-490中所描述)，且包括天然存在的单结构域抗体sdAb，例如在软骨鱼和骆驼科中，或其为合成的，例如纳米抗体、VHH或其它结构域结构)、合成性抗体(有时称作抗体模拟物)、嵌合抗体、人类化抗体、抗体融合体(有时称作“抗体偶联物”)，以及各别每一种的片段。作为另一实例，分析物分子可为抗体且第一结合成员可为抗原且第二结合成员可为特异性结合到目标抗体的次级抗体或第一结合成员可为特异性结合到目标抗体的次级抗体且第二结合成员可为抗原。
在一些实施例中，结合成员可为化学编程的抗体(cpAb)(描述于Rader(2014)《生物技术趋势》32:186-197中)；双特异性cpAb；抗体募集分子(ARM)(描述于McEnaney等人(2012)《ACS化学生物学(ACSChem.Biol.)》7:1139-1151中)；分支链捕获剂，如三配位体捕获剂(描述于Millward等人(2011)《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》133:18280-18288中)；来源于非抗体支架的经工程改造的结合蛋白，如单功能抗体(来源于人类纤维结合蛋白的第十纤维结合蛋白III型结构域)、亲和抗体(来源于免疫球蛋白结合蛋白A)、达尔潘蛋白(DARPin)(基于锚蛋白重复模块)、抗运载蛋白(来源于脂质运载蛋白后胆色素-结合蛋白和人类脂质运载蛋白2)和半胱胺酸结肽(打结素)(描述于Gilbreth和Koide，(2012)《结构生物学新观点(Current Opinion in Structural Biology)》22:1-8；Banta等人(2013)《生物医学工程年评(Annu.Rev.Biomed.Eng.)》15:93-113中)、WW结构域(描述于Patel等人(2013)《蛋白质工程设计及选择(Protein Engineering,Design&Selection)》26(4):307-314中)、再利用受体配位体、affitin(描述于Béhar等人(2013)26:267-275中)，和/或Adhiron(描述于Tiede等人(2014)《蛋白质工程设计及选择》27:145-155中)。
根据分析物为生物细胞(例如，哺乳动物、禽类、爬行动物胞、其它脊椎动物、昆虫、酵母菌、细菌、细胞等)的一个实施例，结合成员可为对于细胞表面抗原(例如，细胞表面受体)具有特异性亲和力的配位体。在一个实施例中，结合成员可为黏附分子受体或其部分，其对靶细胞型表面上表达的细胞黏附分子具有结合特异性。在使用中，黏附分子受体与靶细胞的胞外表面上的黏附分子结合，进而固定或捕获细胞，结合细胞可随后通过使用第二结合成员来检测，所述第二结合成员可与第一结合成员相同或可以结合到细胞表面上表达的不同分子。
在一些实施例中，分析物分子与结合成员之间的结合亲和力应足以在分析条件下保持结合，所述分析包括去除未特异性结合的分子或颗粒的洗涤步骤。在一些情况下，例如在检测某些生物分子中，分析物分子与其互补结合成员的结合常数可介于至少约104与约106M-1之间，至少约105与约109M-1之间，至少约107与约109M-1之间，大于约109M-1或更大。
e)标签或标记物
本文所描述的方法可以包括结合到标签，如标记物的特异性结合成员，以通过阻抗分析分析物。并入标签或标记物并不实质上干扰反应流程的实施。举例来说，并入标签或标记物并不干扰分析物与其互补结合成员之间的结合常数或相互作用。并入标签或标记物的大小和数量可能与捕获速度和读取速率相关。捕获速度和读取速率可以通过增加并入标签或标记物对大小和/或数量来增加。举例来说，并入标签或标记物的大小和数量可以增加电荷并增加纳米孔的捕获区。并入标签或标记物并不改变结合成员动力学，例如抗体动力学或反应流程。示范性标签包括聚合物，如阴离子聚合物或阳离子聚合物(例如，具有净正电荷的多肽，如聚组氨酸或聚赖氨酸)，其中聚合物的长度为约5-1000个残基；不与结合成员交叉反应和/或干扰分析的蛋白质(例如，球状蛋白质)、树枝状聚合物(例如DNA树枝状聚合物)；和带电的纳米颗粒，例如纳米珠粒。聚合物标签可包括核酸，如脱氧核糖核酸或核糖核酸。聚合物标签可包括核碱基聚合物。在某些情况下，标签可为DNA或RNA适体，其中适体不结合到分析物。在标签为适体的情况下，其可在移位通过纳米孔之前任选地改性。聚合物标签或纳米颗粒(例如，纳米珠粒)可充分地较大以在其移位通过或跨过纳米孔时产生可再生信号。适体的长度可为20-220个碱基，例如20-60个碱基长。纳米颗粒(例如，纳米珠粒或树枝状聚合物)的大小可介于约1nm到约950nm直径，例如10nm-900nm、20nm-800nm、30nm-700nm、50nm-600nm、80nm-500nm、100nm-500nm、200nm-500nm、300nm-500nm，或400nm-500nm直径范围内，例如10nm、20nm、30nm、50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm或900nm。当用作标签时，纳米颗粒的优选大小为可以通过或跨过纳米孔的一种大小(如本文进一步描述)。在某些情况下，纳米珠粒/纳米颗粒可由具有净负或正电荷的材料组成或可处理成具有净负或正电荷。示范性纳米珠粒/纳米颗粒包括由有机或无机聚合物制备的那些。有机聚合物包括如聚苯乙烯、碳、聚丙烯酰胺等的聚合物。无机聚合物包括硅或金属纳米珠粒/纳米颗粒。在某些情况下，纳米珠粒/纳米颗粒可不为磁性的。
在某些情况下，标签可为单链DNA或RNA。单链DNA或RNA可在移位通过或跨过纳米孔之前与探针分子杂交。在某些情况下，方法可以包括分析单一样品中的多种分析物。结合到样品中不同分析物的第二结合成员可包括与其连接的不同单链DNA或RNA，因为标签和不同的单链DNA或RNA可以在其穿越通过纳米孔时与进一步区分彼此不同的单链DNA或RNA的不同探针杂交。在其它实施例中，附着于不同第二结合成员的标签可具有在标签通过或跨过纳米孔时可区别的不同发夹结构(例如，发夹结构的长度)。在又另一实施例中，附着于不同第二结合成员的标签可具有在标签穿越通过或跨过纳米孔时可区别的不同长度，例如，标签可为具有不同长度的双链DNA(例如，25bp、50bp、75bp、100bp、150bp、200bp或更多)。在某些情况下，附着于不同第二结合成员的标签可具有不同长度的聚乙二醇(PEG)或可为经PEG差异修饰的DNA或RNA。
应注意提及标签或标签分子涵盖单一标签或单一标签分子以及多个标签(全部可为相同的)。还要注意纳米孔涵盖单层(如衬底、膜和类似物)中存在的单纳米孔以及多个纳米孔。因此，计数移位通过或跨过层/薄片/膜中纳米孔的标签数量是指计数移位通过或跨过层/薄片/膜中一个或多个纳米孔的多个标签。纳米孔可存在于单层，如衬底或膜中，所述层可由电绝缘的或具有高电阻的任何合适材料组成，如脂质双层、介电材料(例如氮化硅和硅石)、原子级薄膜(如石墨烯、硅、硅烯、二硫化钼(MoS2)等)或其组合。
标签可为任何大小或形状。在一些实施例中，标签可为以下纳米颗粒或纳米珠粒：直径为约10与950nm之间，例如直径为20-900nm、30-800nm、40-700nm、50-600nm、60-500nm、70-400nm、80-300nm、90-200nm、100-150nm、200-600nm、400-500nm、2-10nm、2-4nm或3-4nm。标签可实质上为球形，例如球形珠粒或纳米珠粒，或半球形。标签可为大小为约0.5kDa到约50kDa的蛋白质，例如大小为约0.5kDa到约400kDa、约0.8kDa到约400kDa、约1.0kDa到约400kDa、约1.5kDa到约400kDa、约2.0kDa到约400kDa、约5kDa到约400kDa、约10kDa到约400kDa、约50kDa到约400kDa、约100kDa到约400kDa、约150kDa到约400kDa、约200kDa到约400kDa、约250kDa到约400kDa、约300kDa到约400kDa、约0.5kDa到约300kDa、约0.8kDa到约300kDa、约1.0kDa到约300kDa、约1.5kDa到约300kDa、约2.0kDa到约300kDa、约5kDa到约300kDa、约10kDa到约300kDa、约50kDa到约300kDa、约100kDa到约300kDa、约150kDa到约300kDa、约200kDa到约300kDa、约250kDa到约300kDa、约0.5kDa到约250kDa、约0.8kDa到约250kDa、约1.0kDa到约250kDa、约1.5kDa到约250kDa、约2.0kDa到约250kDa、约5kDa到约250kDa、约10kDa到约250kDa、约50kDa到约250kDa、约100kDa到约250kDa、约150kDa到约250kDa、约200kDa到约250kDa、约0.5kDa到约200kDa、约0.8kDa到约200kDa、约1.0kDa到约200kDa、约1.5kDa到约200kDa、大小为约2.0kDa到约200kDa、约5kDa到约200kDa、约10kDa到约200kDa、约50kDa到约200kDa、约100kDa到约200kDa、约150kDa到约200kDa、约0.5kDa到约100kDa、约0.8kDa到约100kDa、约1.0kDa到约100kDa、约1.5kDa到约100kDa、约2.0kDa到约100kDa、约5kDa到约100kDa、约10kDa到约100kDa、约50kDa到约100kDa、约0.5kDa到约50kDa、约0.8kDa到约50kDa、约1.0kDa到约50kDa、约1.5kDa到约50kDa、约2.0kDa到约50kDa、约5kDa到约50kDa、约10kDa到约50kDa、约10kDa到约90kDa、约10kDa到约80kDa、约10kDa到约70kDa、约10kDa到约60kDa、约20kDa到约90kDa、约20kDa到约80kDa、约20kDa到约70kDa、约20kDa到约60kDa、约40kDa到约90kDa、约40kDa到约80kDa、约40kDa到约70kDa或约40kDa到约60kDa。
在某些实施例中，标签可为纳米颗粒。如在本文中所提及，纳米颗粒可逆转地(例如，可裂解地)附着于第二结合成员。在某些方面，纳米颗粒可为具有规定直径的纳米珠粒，其可为通过纳米孔层测量的纳米珠粒属性。在某些情况下，本公开的方法、系统和装置可用于同时分析样品中的多种不同分析物。对于这类分析，可使用各自特异性结合到同源分析物的多种第二结合成员。不同第二结合成员中的每一个可附着于不同大小的纳米珠粒，所述纳米珠粒可用于识别第二结合成员。举例来说，不同的纳米珠粒标签可具有不同的直径，如1nm、2nm、4nm、6nm、8nm、10nm、12nm、14nm或更大，如多达20nm、30nm、50nm、100nm、200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm、800nm、900nm、950nm或990nm。
在某些实施例中，具有不同直径的纳米珠粒可全部移位通过具有单一直径的纳米孔的纳米孔层，其中不同大小的纳米珠粒可基于在纳米孔中的滞留时长、电流阻抗的量值或其组合来识别。在某些情况下，含有多个纳米孔层的堆叠纳米孔层装置可用于检测且计数移位通过或跨过纳米孔的纳米珠粒，其中第一层可具有第一直径的纳米孔且第二层可具有第二直径的纳米孔。多个纳米孔层可以使得具有较大直径的纳米孔的层放置在具有较小直径的纳米孔的层的上游的方式来布置。示范性堆叠纳米孔层公开于US20120080361中。
可用作本发明方法中的标签的示范性纳米颗粒包括直径范围介于5nm到950nm的金纳米颗粒或聚苯乙烯纳米颗粒。
在某些情况下，标签可为聚合物，如核酸。标签的存在可以通过检测标签的信号特征，如与聚合物标签的大小或长度相关的信号来确定。聚合物标签的大小或长度可通过测量其在孔或通道中的滞留时间，例如通过测量电流的瞬时阻塞时长来确定。
可部分、全部与标签或标记物结合或附着于标签或标记物的成员包括：纳米颗粒、金颗粒、银颗粒、银、铜、锌，或其它金属涂层或沉积物；聚合物；阻力-标签(如本文所定义)；磁性颗粒；漂浮颗粒；金属颗粒；带电部分；介电泳标签；二氧化硅；存在和不存在杂质(例如，石英、玻璃等)；聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)；聚酰亚胺；氮化硅；金；银；量子点(包括CdS量子点)；碳点；荧光团；抑止剂；聚合物；聚苯乙烯；詹纳斯颗粒(Janus particle)；散射颗粒；荧光颗粒；磷光颗粒；球形；立方体；绝缘体；导体；条形码或标记颗粒；多孔性颗粒；固体颗粒；纳米外壳；纳米棒；微球；分析物，如病毒、细胞、寄生虫和生物体；核酸；蛋白质；分子识别元素；间隔物；PEG；树枝状聚合物；电荷改质剂；磁性材料；酶；包括适体序列的DNA；可扩增DNA；DNA的重复序列；可检测元素与分子识别元素的融合物或结合物(例如，经工程改造结合成员)；抗抗体适体；针对抗体结合蛋白的适体；经吸收或吸附可检测化合物；血红素；荧光素；磷光体；叠氮基或炔烃(例如，封端或非封端炔烃)或其它点击化学参与者。
在某些实施例中，可选择标签以提供足够高以实现样品的快速分析的捕获速率。在某些实施例中，标签的捕获速率可为每10秒约1个事件、每5秒1个事件、每秒1个事件或更高。在某些实施例中，可使用线性聚合物标签，例如核糖聚合物、脱氧核糖聚合物、寡核苷酸、DNA或RNA。通常对于1nM DNA溶液，使用固态纳米孔(Si3N4)的捕获速率为大致每秒1个事件，不具有盐梯度，电压为200-800mV，且盐(KCl)浓度为1M。
在某些情况下，可不使用线性聚合物标签，例如核糖聚合物、脱氧核糖聚合物、寡核苷酸、DNA或RNA，因为这些标签的捕获速率对于某些应用来说可能太低。形状为半球形、球形或实质上球形的标签快速移位通过纳米孔且由此减少分析时长可用于需要更快标签计数的应用中。在某些情况下，可基于分析所需的捕获速率选择球形或半球形标签的大小。举例来说，对于较高捕获速率，可选择较大大小的球形或半球形标签。在某些情况下，标签可为球形标签，如在相同测量条件下具有比线性标签(如DNA标签)的捕获速率快约10倍、30倍、50倍、100倍、300倍、500倍或1000倍的捕获速率的纳米颗粒/纳米珠粒。
在一些实施例中，标签可偶联到抗体，例如CPSP抗体偶联物。在一些实施例中，标签可以偶联到具有间隔物的抗体，例如，具有间隔物的CPSP抗体偶联物。在一些实施例中，标签可以偶联到寡核苷酸和抗体，例如CPSP寡核苷酸-抗体偶联物。在一些实施例中，标签可偶联到具有间隔物的寡核苷酸和抗体，例如具有间隔物的CPSP寡核苷酸-抗体偶联物。在一些实施例中，标签可以偶联到寡核苷酸，例如CPSP寡核苷酸偶联物。在一些实施例中，间隔物包括硝基苯甲基、二巯基乙基氨基、6碳间隔物、12碳间隔物，或3-(9-((3-羧丙基)(甲苯磺酰基)氨基甲酰基)吖啶-10-鎓-10-基)丙烷-1-磺酸酯。在一些实施例中，间隔物包含硝基苯甲基，且标签为DNA分子。在一些实施例中，间隔物为二巯基乙基氨基且标签为羧化纳米颗粒。在一些实施例中，间隔物为3-(9-((3-羧丙基)(甲苯磺酰基)氨基甲酰基)吖啶-10-鎓-10-基)丙烷-1-磺酸酯且标签为寡核苷酸。在一些实施例中，间隔物包含6碳间隔物或12碳间隔物且标签为生物素。
f)可裂解连接子
本文所描述的方法中使用的标签可通过一般连接子附着于特异性结合成员。可裂解连接子确保标签可被去除。一般连接子可为可裂解连接子。举例来说，标签可经由可裂解连接子附着于第二结合成员。第一结合成员-分析物-第二结合成员的复合物可暴露于介导可裂解连接子裂解的裂解剂。连接子可通过任何合适的方法来裂解，包括暴露于酸、碱、亲核试剂、亲电子试剂、自由基、金属、还原或氧化剂、光、温度、酶等。合适的连接子可从标准化学封端基团调整而来，如公开于Greene&Wuts,《有机合成中的保护基(ProtectiveGroups in Organic Synthesis)》，约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons)。用于固相合成的其它合适的可裂解连接子公开于Guillier等人(《化学评论(Chem.Rev.)》100:2092-2157,2000)中。连接子可为可酸裂解、可碱裂解或可光裂解。氧化还原反应可为裂解流程的部分。可裂解连接子可为带电聚合物。
连接子可为可光裂解连接子、可化学裂解连接子或可热裂解连接子。在实施例中，连接子可为热敏感可裂解连接子。在连接子为可光裂解基团时，裂解剂可为干扰或裂解可光裂解基团的具有适当波长的光。在多个实施例中，用于裂解可光裂解连接子的光波长介于约180nm到400nm，例如约250nm到400nm或约300nm到400nm范围内。优选的是用于激活裂解的光不影响分析物的其它组分。合适的连接子包括基于O-硝基苯甲基化合物和硝基藜芦基化合物的那些连接子。还可使用基于苯偶姻类化学方法的连接子(Lee等人，《有机化学杂志(J.Org.Chem.)》64:3454-3460,1999)。在一些实施例中，可光裂解连接子可来源于以下部分：
Figure BDA0002017627730000641
替代地，在裂解连接子为可化学裂解基团时，裂解剂可为能够裂解基团的化学剂。可化学裂解连接子可通过基于氧化/还原的裂解、酸催化裂解、碱催化裂解或亲核置换来裂解。举例来说，在连接子为二硫化物时，硫醇介导的用二硫苏糖醇或β巯基乙醇的裂解可用于释放标签。在又其它实施例中，在连接子为限制位点时，试剂为催化剂，如酶，所述酶可为裂解连接子的水解酶、限制酶或其它酶。举例来说，限制酶可为I型、II型、IIS型、III型和IV型限制酶。
在一些实施例中，裂解连接子为可酶裂解的序列。在本文中任一实施例的一个方面中，可酶裂解的序列为长度为2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个核苷酸的核酸序列。在一个实施例中，可酶裂解的序列包含具有至少10个核苷酸的序列。在一个实施例中，可酶裂解的序列包含具有2个与20个核苷酸之间的序列。在一个实施例中，可酶裂解的序列包含具有2个与15个核苷酸之间的序列。在一个实施例中，可酶裂解的序列包含具有4个与10个核苷酸之间的序列。在一个实施例中，可酶裂解的序列包含具有4个与15个核苷酸之间的序列。
举例来说，可裂解连接子可为可通过酸性或中性还原条件(例如，过氧化氢以产生吖啶酮和磺酰胺)来裂解的吖锭、醚(如经取代的苯甲基醚或其衍生物(例如，苯甲氢基醚、茚满基醚等))；使用P消除产生的带电聚合物，其中弱碱可用以释放产物、缩醛，包括其硫代类似物，其中通过弱酸，尤其在捕获羰基化合物的存在下来完成脱离；光不稳定性键(例如，O-硝基苯甲酰基、7-硝基茚满基、2-硝基二苯甲基醚或酯等)；或肽连接子，其进行酶水解(例如，可酶裂解的连接子)，具体地说其中酶识别特异性序列，如因子Xa或肠激酶的肽。连接子的实例包括(但不限于)二硫化物连接子、酸不稳定连接子(包括二烷氧基苯甲基连接子)、西贝尔连接子(Sieber linker)、吲哚连接子、叔丁基西贝尔连接子、亲电子可裂解连接子、亲核可裂解连接子、可光裂解连接子，在还原条件、氧化条件下的裂解，经由使用安全捕获连接子的裂解，和通过消除机制的裂解。
亲电子裂解连接子通常通过质子来裂解且包括对酸敏感的裂解。合适的连接子包括修饰的苯甲基系统，如三苯甲基、对烷氧基苯甲基酯和对烷氧基苯甲基酰胺。其它合适的连接子包括叔丁氧基羰基(Boc)和缩醛系统。亲硫金属，如镍、银或汞在硫缩醛或其它含硫保护基的裂解中的用途还可以考虑用于制备合适的连接子分子。
对于亲核裂解，可使用在水中不稳定的基团(如，酯)(即，仅在碱性pH下就可裂解)和对于非水性亲核试剂不稳定的基团。氟离子可用于裂解如三异丙基硅烷(TIPS)或叔丁基二甲基硅烷(TBDMS)的基团中的硅-氧键。
可以使用易受还原裂解影响的连接子，如二硫键还原。使用基于钯的催化剂的催化氢化反应已用以裂解苯甲基和苯甲氧羰基。
基于氧化的途径在所属领域中是众所周知的。这些包括对烷氧基苯甲基的氧化以及硫和硒连接子的氧化。还可使用裂解二硫化物和其它硫或基于硒的连接子的水性碘。
安全捕获连接子为以两个步骤裂解的那些连接子。在优选系统中，第一步骤为产生反应性亲核中心，接着第二步骤涉及导致裂解的分子内环化。举例来说，乙酰丙酯键可经酰肼或光化学处理以释放活化胺，其随后可经过环化以裂解分子中其它处的酯(Burgess等人，《有机化学杂志》62:5165-5168,1997)。
还可使用消除反应。举例来说，可使用如Fmoc和氰基乙基的基团的碱催化消除，和烯丙基系统的钯催化还原消除。
在连接子为可热裂解的连接子或热敏感连接子时，裂解剂可经局部温度升高超过阈值以干扰或裂解可热裂解基团。在一些实施例中，温度可以使用微波照射在局部区域中升高以诱导颗粒热疗。可使用颗粒热疗方法，如综述于Dutz和Hergt(《纳米技术(Nanotechnology)》25:452001(2014))且描述于美国专利第7,718,445号、美国专利公开案第20030082633号、国际专利公开案第WO 2002029076号和美国专利公开案第20020197645号中的那些，所述文献各自以引入的方式并入本文中。在一些实施例中，温度升高可以通过将光的能量转移到吸收目标，如染料、颜料或水来光热地实现。在一个方面中，光源为激光。在一些实施例中，高温可导致双链DNA的热分离。
g)纳米孔层
在本公开中，检测和/或计数标签(例如，聚合物、适体、纳米颗粒)可以通过使标签移位通过或跨过纳米孔或纳米通道来执行。在一些实施例中，检测和/或计数标签(例如，聚合物、适体、纳米颗粒)可以通过使标签移位通过或跨过至少一个或多个纳米孔或纳米通道来执行。在一些实施例中，并排或串联地提供至少两个或更多个纳米孔或纳米通道。在一些实施例中，纳米孔或纳米通道经设定尺寸以一次移位不超过一个标签。因此，在一些实施例中，纳米孔的尺寸将通常视待检测的标签的尺寸而定。具有双链区域的标签可需要大于足以移位完全为单链的标签的那些尺寸的纳米孔尺寸。另外，如纳米珠粒标签发纳米颗粒标签可需要比寡聚物标签更大的孔或通道。通常，具有约1nm直径的孔可准许单链聚合物通过，而具有2nm直径或更大的孔尺寸将准许双链核酸分子通过。在一些实施例中，纳米孔或纳米通道对于单链标签(例如，约1nm到小于2nm直径)具有选择性，而在其它实施例中，纳米孔或纳米通道具有准许双链多核苷酸通过的足够直径(例如，2nm或更大)。所选择的孔径提供所关注分析物的最优信噪比。
在一些实施例中，孔的直径可介于约0.1nm与约1000nm之间、介于约50nm与约1000nm之间、介于约100nm与1000nm之间、介于约0.1nm与约700nm之间、介于约50nm与约700nm之间、介于约100nm与700nm之间、介于约0.1nm与约500nm之间、介于约50nm与约500nm之间，或介于约100nm与500nm之间。举例来说，孔的直径可为约0.1nm、约0.2nm、约0.3nm、约0.4nm、约0.5nm、约0.6nm、约0.7nm、约0.8nm、约0.9nm、约1.0nm、约1.5nm、约2.0nm、约2.5nm、约3.0nm、约3.5nm、约4.0nm、约4.5nm、约5.0nm、约7.5nm、约10nm、约15nm、约20nm、约25nm、约30nm、约35nm、约40nm、约45nm、约50nm、约55nm、约60nm、约65nm、约70nm、约75nm、约80nm、约85nm、约90nm、约95nm、约100nm、约150nm、约200nm、约250nm、约300nm、约3500nm、约400nm、约450nm、约500nm、约550nm、约600nm、约650nm、约700nm、约750nm、约800nm、约850nm、约900nm、约950nm或约1000nm。
一般来说，纳米孔的长度比纳米通道短。纳米通道实质上比纳米孔长且可适用于需要增加分子移位通过其所需要的时间(相比于移位通过或跨过具有相同直径的纳米孔的时间)的应用中。纳米孔的长度可介于约0.1nm到小于约200nm范围内。纳米通道的长度可介于约500nm到约100μm，或更长范围内。纳米孔和纳米通道的直径可类似。
各种类型的纳米孔可以用于分析标签/适体。这些包括尤其采用内嵌于膜中的生物孔或通道的生物纳米孔。另一类型的纳米孔层为固态纳米孔，其中通道或孔全部或部分由制造或雕刻的固态组分，如硅制得。在一些实施例中，纳米孔为使用受控的介电击穿产生的固态纳米孔。在一些实施例中，纳米孔为通过除受控的介电击穿以外的方法来产生的固态纳米孔。
在某些实施例中，纳米孔的长度可高达约200nm，例如约0.1nm到约30nm、约10到约80nm、约1到约50nm、约0.1nm到约0.5nm、约0.3nm到约1nm、约1nm到约2nm、约0.3nm到约10nm或约10到约30nm。纳米孔层中的纳米孔数可为约1、2、3、4、5、10、30、100、300、1000、3000、10000、30000、100000、300000、或更多。中心到中心之间的层中纳米孔之间的距离可为约100nm到约300nm、约300nm到约500nm、约500nm到约1000nm，例如100nm、150nm、200nm或300nm。
在某些实施例中，各自含有一个或多个纳米孔的多个纳米孔层可彼此串联布置，以用于检测和/或计数标签(例如，聚合物、适体、纳米颗粒)。在这种情况下，检测和/或计数标签可以通过使标签移位通过或跨过每一个纳米孔层来执行。因此，计数移位通过或跨过层/薄片/膜中纳米孔的标签数量是指计数移位通过或跨一个或多个过层/薄片/膜中的一个或多个纳米孔的多个标签。在某些实施例中，当存在超过一个纳米孔层(例如，一个、二个、三个、四个、五个、六个或技术上可行的其它数量的纳米孔层)时，任选其串联存在，其中一个层中的至少一个纳米孔与另一层中的另一纳米孔分离或堆叠于另一层中的另一纳米孔上(例如，上方或顶部上)等。在纳米孔层为串联的时，至少两个电极可用于创建电场以驱动标签通过孔且任选地，位于纳米孔层之间的其它电极可进一步提供驱动电流。
i)生物孔
对于检测且任选地计数标签/适体，可使用具有准许标签移位的通道尺寸的任何生物孔。两大类生物通道适用于本文公开的方法。非电压门控通道允许分子通过孔而不需要膜电势变化以启用或打开通道。在另一方面，电压门控通道需要特定范围的膜电势以启用通道开口。对生物纳米孔的最多研究已使用在金黄色葡萄球菌中发现的长度为约10nm的α-溶血素、蘑菇形同型寡聚七聚通道。每一个亚基贡献两个β链以形成14链反平行β桶。由β折叠桶桶结构形成的孔具有直径为大约2.6nm的进口，所述进口含有一圈赖氨酸残基且通向直径为约3.6nm的内腔。穿透脂质双层的溶血素孔茎具有约2.0nm的平均内径，前庭与茎之间的具有1.5nm的收缩。茎的尺寸足以使单链核酸而非双链核酸通过。因此，α-溶血素孔可以用作对单链多核苷酸和其它类似尺寸的聚合物具有选择性的纳米孔。
在其它实施例中，生物纳米孔具有足够使大于单链核酸的聚合物通过的尺寸。示范性孔为线粒体孔蛋白蛋白质，一种位于线粒体外膜中的电压依赖性负离子通道(VDAC)。孔蛋白蛋白质可以纯化形式得到且在重构到人造脂质双层中时，产生能够准许双链核酸通过的功能性通道(Szabo等人，1998，《美国实验生物学学会联合会杂志(FASEB J.)》12:495-502)。结构研究提出孔蛋白还具有含13或16链的β-桶型结构(Rauch等人，1994，《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem Biophys Res Comm)》200:908-915)。孔蛋白显示相比于由α-溶血素、麦芽糖膜孔蛋白(LamB)和短杆菌肽形成的孔的电导更大的电导。孔蛋白的更大电导属性支持展示孔蛋白通道的尺寸足够使双链核酸通过的研究。孔蛋白分子的孔径估量为4nm。未卷绕双链核酸的直径估量为约2nm。
可适用于扫描双链多核苷酸的其它生物通道为枯草杆菌(B.subtilis)中发现的通道(Szabo等人，1997，《生物化学杂志》272:25275-25282)。由枯草杆菌制备且并入人造膜中的质膜囊泡允许双链DNA通过所述膜。由枯草杆菌膜制剂形成的通道的电导类似于线粒体孔蛋白的那些电导。尽管存在这些通道的不完全表征(例如，纯化形式)，但出于本文中的目的，不必具有纯化形式。通过溶解在适当清洁剂中或并入到具有足够表面积的人造脂质膜中来稀释质膜制剂可在检测设备中分离单一通道。通过适当地定时洗涤来限制膜制剂(或蛋白质制剂)与人造膜的接触时长提供了将单一通道并入到人造脂质双层中的另一种方法。电导属性可用于表征并入到双层中的通道。
在某些情况下，纳米孔可为杂交纳米孔，其中生物孔被引入到固态纳米孔，例如以非生物材料制造的纳米孔中。举例来说，α溶血素孔可以插入到固态纳米孔中。在某些情况下，纳米孔可为描述于Hall等人，《自然·纳米技术(Nature Nanotechnology)》2010年11月28日，第5卷，第874-877页中的杂交纳米孔。
ii)固态孔
在其它实施例中，标签的分析通过使标签移位通过或跨过由非生物材料制造的纳米孔或纳米通道来执行。纳米孔或纳米通道可使用多种不同的技术由各种固态材料制备，所述技术包括尤其化学沉积、电化学沉积、电镀、电子束塑形、离子束塑形、纳米光刻、化学蚀刻、激光切除、聚焦离子束、原子层沉积和所述领域中众所周知的其它方法(参见例如Li等人，2001，《自然》412:166-169；和WO 2004/085609)。
在特定实施例中，纳米孔可为WO13167952A1或WO13167955A1中描述的纳米孔。如WO13167952A1或WO13167955A1中所描述，具有精确且均一孔径的纳米孔可以通过将膜中形成的纳米孔精确地增大来形成。方法可涉及通过以下来增大纳米孔：在纳米孔上施加高电势；测量流经纳米孔的电流；部分地基于所测量的电流来确定纳米孔的大小；和在纳米孔的大小对应于所需大小时去除施加到纳米孔的电势。在某些情况下，所施加的电势可具有在高值与低值之间振荡的脉冲波形，可以测量流经纳米孔的电流同时以低值将电势施加到纳米孔。
固态材料包括(借助于实例而非限制)任何已知的半导体材料、绝缘材料和涂覆有绝缘材料的金属。因此，至少一部分纳米孔可包含(但不限于)硅、硅石、硅烯、氧化硅、石墨烯、氮化硅、锗、砷化镓、或金属、金属氧化物以及涂覆有绝缘材料的金属胶体。
为制备纳米尺寸的孔，不同的反馈程序可以用于制造工艺。在离子通过孔洞的实施例中，检测通过固态材料的离子提供了一种测量在制造期间产生的孔径的方式(参见例如美国公开申请案第2005/0126905号)。在其它实施例中，在电极限定孔的大小时，电极之间的电子隧穿电流给出关于电极之间的间隙的信息。隧穿电流增大指示电极之间的间隙空间减小。其它反馈技术对于所属领域的技术人员是显而易见的。
在一些实施例中，纳米孔使用离子束塑形来制造，如Li等人，2003，《自然材料(Nature Materials)》2:611-615中所描述。在一些实施例中，纳米孔使用高电流来制造，如WO13167952A1或WO13167955A1中所描述。在其它实施例中，纳米孔可以通过电子束光刻和高能电子束塑形的组合来制得(参见例如Storm等人，2003，《自然材料》2:537-540)。通过离子束溅镀技术来产生合适纳米孔的类似途径描述于Heng等人，2004，《生物物理学杂志(Biophy J)》87:2905-2911中。使用光刻法在金属氧化物半导体(CMOS)上用集中的高能电子束，并结合用于产生超薄膜的一般技术来形成纳米孔。在其它实施例中，如美国专利第6,627,067号；第6,464,842号；第6,783,643号；和美国公开案第2005/0006224号中所提供通过塑形氮化硅来构造纳米孔。
在一些实施例中，纳米通道可构造为金或银纳米管。这些纳米通道使用多孔材料模板(如使用跟踪蚀刻方法制备的聚碳酸酯过滤器)和将金或其它合适的金属沉积在多孔材料的表面上来形成。跟踪蚀刻的聚碳酸酯膜通常通过将固体膜材料暴露于高能核颗粒中来形成，这样在膜材料中产生轨迹。化学蚀刻随后用于将蚀刻轨迹转换成孔。所形成的孔具有约10nm和更大的直径。调节核颗粒的密度来控制膜中形成的孔密度。经由无电极电镀方法将金属(通常为金或银)沉积到跟踪蚀刻孔中来在蚀刻膜上形成纳米管(Menon等人，1995，《分析化学》67:1920-1928)。这种金属沉积方法使用沉积在孔材料的表面上的催化剂，随后将其浸没到含有Au(I)和还原剂的溶液中。Au(I)还原成金属Au发生在含有催化剂的表面上。所沉积的金量取决于孵育时间以使得增加孵育时间减小了过滤材料中孔的内径。因此，孔径可以通过调节沉积在孔上的金属量来控制。所得孔尺寸使用不同的技术，例如使用简单漫射的气体传输属性或通过使用膜片钳式系统测量流经孔的离子来测量。支撑材料保持完整或被去除以留下金纳米管。无电极电镀技术能够视需要形成直径小于约1nm到约5nm，或更大的孔径。具有约0.6nm孔尺寸的金纳米管呈现区别Ru(bpy)2+2和甲基紫精，从而证实金纳米孔的选择性(Jirage等人，1997，《科学(Science)》278:655-658)。金纳米管表面的修饰容易通过将含硫醇化合物附着于金表面或通过衍生具有其它官能基的金表面来完成。这种特征准许孔修饰化合物以及感测标记物的附着，如本文所论述。本文中所描述的用于生物孔的装置(如顺/反设备)可与金纳米孔一起使用以分析单一写码分子。
在检测标签的模式涉及流经标签的电流(例如，电子隧穿电流)时，可以通过不同的技术来使固态膜金属化。导电层可沉积在膜的两侧上以产生适用于沿链的长度探查标签的电极，例如纵向电子隧穿电流。在其它实施例中，导电层可沉积在膜的一个表面上以形成适用于探查跨过孔的标签的电极，例如横向隧穿电流。用于沉积导电材料的各种方法为已知的，包括溅镀沉积(即，物理气相沉积)、非电解沉积(例如，胶状悬浮液)和电解沉积。其它金属沉积技术为热丝蒸发、金属层蒸发、电子束蒸发、闪蒸和感应蒸发，且对所属领域的技术人员将是显而易见的。
在一些实施例中，检测电极通过溅镀沉积来形成，其中离子束轰击一块金属并蒸发金属原子，所述金属原子随后以薄膜形式沉积在晶片材料上。根据所使用的光刻法，金属膜随后借助于反应性离子蚀刻来蚀刻或使用化学机械抛光来抛光。金属膜可沉积在预成型纳米孔上或在制造孔之前沉积。
在一些实施例中，检测电极通过电沉积来制造(参见例如Xiang等人，2005，《应用化学国际版(Angew.Chem.Int.Ed.)》44:1265-1268；Li等人，《应用物理学快报(AppliedPhysics Lett.)》77(24):3995-3997；和美国公开申请案第2003/0141189号)。这个制造工艺适用于产生纳米孔和位于固态膜的一个面上的相应检测电极，如用于检测横向电子隧穿。首先，传统的光刻工艺用于在二氧化硅层上形成一对面对电极，所述二氧化硅层负载于硅晶片上。电解质溶液覆盖电极，且金属离子通过使电流通过电极对而沉积在所述电极中的一个上。随时间推移金属在电极上的沉积减小了电极之间的间隙距离，不仅产生检测电极而且产生用于移位写码分子的纳米尺寸的间隙。电极之间的间隙距离可以通过多种反馈方法来控制。
在检测基于电荷感应场效应的成像的情况下，半导体可以如美国专利第6,413,792号和美国公开申请案第2003/0211502号中所描述来制造。制造这些纳米孔装置的方法可以使用类似于用于制造其它固态纳米孔的那些技术的技术。
如下文进一步描述，执行对标签，如多核苷酸的检测。对于分析标签，纳米孔可以不同形式配置。在一些实施例中，装置包含两个储槽(也称为顺腔室和反腔室)之间容纳有纳米孔的生物或固态膜(参见例如美国专利第6,627,067号)。用于两个腔室之间的电子迁移的管道允许两个腔室的电接触，且两个腔室之间的电压偏压驱动标签移位通过纳米孔。这种配置的变化形式用于分析流经纳米孔的电流，如美国专利第6,015,714号和第6,428,959号以及Kasianowiscz等人，1996，《美国国家科学院院刊》93:13770-13773中所描述，其公开内容以引入的方式并入本文中。
以上装置的变化形式公开于美国申请公开第2003/0141189号中。通过电沉积制造的一对纳米电极定位于衬底表面上。电极彼此面对且具有足以通过单一核酸的间隙距离。绝缘材料保护纳米电极，仅暴露纳米电极的顶端以用于检测核酸。绝缘材料和纳米电极将充当样品储槽的腔室与通过移位传递聚合物的腔室分开。阴极和阳极电极提供用于驱动标签从样品腔室到传递腔室的电泳电场。
用于驱动标签通过纳米孔的电流偏压可通过施加通过纳米孔引导的电场来产生。在一些实施例中，电场为恒定电压或恒定电流偏压。在其它实施例中，通过电泳电场参数的脉冲操作来控制标签的移动(参见例如美国专利申请案第2003/141189号和美国专利第6,627 067号)。电流脉冲可提供一种使寡核苷酸标签的一个或仅几个碱基精确地移位通过孔并持续规定时间段且将标签短暂地保持在孔内的方法，且进而提供对标签的电属性的更好分辨。
纳米孔装置可进一步包含用于限制寡核苷酸标签在通过纳米孔时的方向的电场或电磁场。这个保持场可用于减少寡核苷酸标签在孔内的移动。在一些实施例中，提供与移位方向正交的电场以限制标签分子在纳米孔内的移动。这在美国申请公开第2003/0141189号中通过在样品板上方和下方使用两个平行的导电板来示出。这些电极产生与标签分子的移位方向正交的电场，且由此将所述标签分子保持在样品板中的一个中。DNA带负电主链或修饰以在一个链上具有负电荷的核酸将定向到阳极板上，进而限制标签分子的运动。
在又其它实施例中，通过美国申请公开第2004/0149580号中所描述的方法来执行对标签位置的控制，所述方法采用经由纳米孔附近或纳米孔上的电极系列位置在孔中产生的电磁场。在这些实施例中，一组电极施加直流电电压和射频电势而第二组电极施加相反的直流电电压和相对于由第一组电极产生的射频电势移相180度的射频电势。这个射频四极子将带电颗粒(例如核酸)保持在场中心(即，孔中心)。
在示范性实施例中，纳米孔膜可为导电层和介电层的多层堆叠，其中嵌入的导电层或导电层闸极在标签移位通过的纳米孔中和纳米孔周围提供良好控制且可测量的电场。在一个方面，导电层可为石墨烯。堆叠纳米孔膜的实例发现于例如US20080187915和US20140174927中。
应了解，纳米孔可位于膜、层或其它衬底中，所述术语可互换地使用以描述包含纳米孔的二维衬底。
在某些实施例中，纳米孔形成为用于使用纳米孔检测和/或确定分析物浓度的测定工艺的一部分。具体来说，可首先提供使用纳米孔检测和/或确定分析物浓度的装置而不具有形成于膜或层中的纳米孔。所述装置可以包括将两个腔室(顺腔室和反腔室)分隔在膜的相对侧上的膜。顺腔室和反腔室可包括盐溶液且可连接到电源。当在膜中产生纳米孔时，将电压施加到顺腔室和反腔室中的盐溶液且测量通过膜的电导。在产生纳米孔之前，不存在或存在通过膜的最小测量电流。在产生纳米孔之后，跨过膜的测量电流增加。可施加电压并持续足以产生所需直径的纳米孔的时间量。在产生纳米孔之后，分析物或标签可移位通过纳米孔且检测到移位事件。在某些实施例中，相同的盐溶液可用于产生纳米孔以及用于检测分析物或标签移位通过纳米孔。任何合适的盐溶液可用于产生纳米孔和/或分析物或标签移位通过纳米孔。可使用不损坏计数标记物的任何盐溶液。示范性盐溶液包括氯化锂、氯化钾、氯化钠、氯化钙、氯化镁以及类似物。可基于盐溶液的所需导电率而选择盐溶液的浓度。在某些实施例中，盐溶液可具有范围介于以下的浓度：1mM到10M，例如10mM-10M、30mM-10M、100mM-10M、1M-10M、10mM-5M、10mM-3M、10mM-1M、30mM-5M、30mM-3M、30mM-1M、100mM-5M、100mM-3M、100mM-1M、500mM-5M、500mM-3M或500mM-1M，如10mM、30mM、100mM、500mM、1M、3M、5M或10M。
在一些实施例中，纳米孔可变阻塞，且通过调节由电极施加在纳米孔层或膜上的电压模式来清除阻塞的纳米孔。在一些情况下，通过逆转纳米孔层或膜上的电压极性来清除阻塞的纳米孔。在一些情况下，通过增加施加在纳米孔层或膜上的电压量值来清除阻塞的纳米孔。电压的增加可为瞬时性增加，持续10秒(s)或更少，例如8秒或更少、6秒或更少、5秒或更少、4秒或更少、3秒或更少、2秒或更少、1秒或更少、0.5秒或更少、0.4秒或更少、0.3秒或更少、0.2秒或更少，包括0.1秒或更少。
h)信号检测
探查移位通过或跨过纳米孔的标签/适体且检测可检测的属性产生了可用于计数标签/适体(即，确定量或浓度)和/或识别标签/适体(即，确定其存在)的信号。所采用的检测方法类型可对应于标签待检测的属性。
在一些实施例中，可检测属性为在标签移位通过孔时标签对纳米孔的电属性的影响。纳米孔的电属性尤其包括电流振幅、阻抗、持续时间和频率。在某些情况下，可以通过使用纳米孔力光谱学来识别标签(参见例如TropiniC.和MarzialiA.，《生物物理学杂志》，2007，第92卷，1632-1637)。用于检测孔的电属性的装置可包括并入层(如薄膜或膜)中的纳米孔，其中薄膜或膜将通过导电桥接器连接的顺腔室和反腔室隔开。待分析的标签可呈现于通常包含一种或多种溶解盐(如氯化钾)的水溶液中的纳米孔的顺侧面上。使用位于纳米孔的顺侧面和反侧面中的电极在孔上施加电场引起标签移位通过纳米孔，这影响了离子通过孔的迁移，进而更改了孔的电属性。可以在合适时频下测量电流以获取足够的数据点以检测电流信号模式。所产生的信号模式可随后与参考模式集相比，在所述参考模式中，每一个参考模式由检查与具有已知分析物浓度的样品中的分析物结合的已知标签的单一群体来获得。如前文所述，可以计数每单位时间移位通过纳米孔的相同类型的标签数，如每15分钟、13分钟、10分钟、8分钟、6分钟、4分钟、2分钟、1分钟、30秒，每20秒，每15秒、每10秒、每5秒、每1秒、每100毫秒、每10毫秒或每1毫秒移位通过或跨过纳米孔的相同类型的标签数。在一些情况下，可计数移位通过纳米孔的相同类型的标签数量并持续特定时间段以确定达至阈值数的时间量。电流振幅、电流持续时间、电流频率和电流量值的改变可界定标签的信号模式且可用于区分彼此不同的标签。如通过膜片钳式技术测量纳米孔的电流属性描述于上文所论述的公开案中和不同参考著作中，例如Hille,B，2001，《可激发膜的离子通道(IonChannels of Excitable Membranes)》，第3版，Sinauer Associates,Inc.，桑德兰，马萨诸塞州。在一时间段内测量的计数数值(计数/时间)与移位通过或跨过纳米孔的分子(例如，标签)浓度成比例。可以通过产生标准曲线来确定标签的浓度。举例来说，一系列不同浓度的标准分子可移位通过纳米孔且测量计数/时间以计算对于每一个浓度的计数速率。待测量的标签的计数速率将与标准曲线相比较以计算标签的浓度。
在一些实施例中，标签的可检测属性可为电子的量子隧穿。量子隧穿为经由颗粒的量子波属性过渡到经典禁能态的量子力学效应。电子隧穿发生在供体与受体之间存在电子移动的位垒的情况下。为检测电子隧穿，显微制造的电极顶端可位于标本的约2纳米处。在适当的分离距离处，电子遂穿通过顶端与样品之间的区域，且在顶端与样品之间施加电压时，电子的净电流(即，穿隧电流)沿电压偏压的方向流经间隙。在纳米装置使用测量遂穿电流的检测电极时，电极位于移位标签附近以使得电子隧穿于检测电极与标签之间。如下文进一步论述，电极相对于移位标签的布置可以指示通过标签发生的电子传输类型。
在一些实施例中，标签的分析可涉及检测通过核酸链(即，纵向地沿核酸链)发生的电流(Murphy等人，1994，《美国国家科学院院刊》91(12):5315-9)。电子转移的准确原理是未知的，但将电子隧穿提供为DNA的传输属性的一个解释。然而，通过双链核酸的电子传输的物理基础不限于本文中的目的，并且检测流经核酸的电流用以区分一个聚合物标签与其它聚合物标签。为检测纵向通过标签分子链发生的电子流，检测电极可纵向定位到标签分子移位的方向以使得平行于延伸标签分子的链的电极之间存在间隙。在各种实施例中，检测电极可放置在分隔纳米孔的两侧的层(例如，膜)的相对侧上，而在其它实施例中，检测电极可定位在分隔纳米孔的两侧的层内。
电子流在核酸中的其它模式为跨过核酸发生，例如横向于延伸核酸链的方向(例如，跨过双链核酸的直径)。在双链核酸中，电子传输可以通过成对的碱基发生，而在单链核酸中，电子传输可以通过单个不成对的碱基发生。此外，化学组合物、水合结构、与带电离子的相互作用、每个碱基的空间定向和不同碱基配对组合中的差异可改变横向电子传输特征，且由此提供用于区别序列和/或聚合物主链不同的标签分子。为检测跨过标签分子(即，横向于延伸的核酸链)的电子流，检测电极定位于纳米孔的一侧上以探查跨过而非通过纳米孔的标签分子。
在纵向或横向检测的实施例中，电极的厚度可确定由电极探查的碱基总数。对于横向检测，检测电极的顶端可被定尺寸以探查单一核碱基(如本文所定义)，且进而获取单一碱基分辨率。在其它实施例中，检测电极的尺寸布置成探查超过一个核碱基。因此，在一些实施例中，基于检测标签分子的不同聚合物序列的差异所需要的分辨率，在任一次探查的核碱基数可为约2个或更多、约5个或更多、约10个或更多，或约20个或更多。
在其它实施例中，标签的结构差异可检测为电容差异。这类型的测量示出于US2003/0141189中。电容引起施加的ac电压在规定施加频率和阻抗下的相移。针对已知序列和结构的核酸，确定每个核碱基的相移特征，且用作用于识别个别碱基特征的参考标准。最近邻分析可准许电容测量延伸到多于一个核碱基。
在其它实施例中，检测技术可基于成像电荷感应场，如美国专利第6,413,792号和美国公开申请案第2003/0211502号中所描述，其公开内容以引入的方式并入本文中。为基于电荷感应场检测标签，使用上文所描述的半导体装置。在电流通道形成于半导体中时，在源极区与漏极区之间施加电压导致电流从源极流动到漏极。因为每个核碱基具有相关电荷，所以标签分子通过半导体孔诱导内衬孔的半导体材料的导电率变化，进而诱导特定量值和波形的电流。通过因电荷、电荷分布和碱基大小差异而不同的碱基来产生不同量值和波形的电流。在美国专利第6,413,792号中所公开的实施例中，聚合物通过由p型硅层构成的孔。标签分子的移位可以通过类似于用于使聚合物移动通过其它类型的通道的那些方法的方法来实现，如上文所描述。预期电流的量值将在大约微安范围内，这比由电子隧穿检测的预期微微安电流高得多。因为标签分子中的聚合物嵌段区域包含多于一个核碱基，这些嵌段聚合物区域应产生电荷的独特信号反射和嵌段聚合物区域的电荷分布。
应理解尽管以上描述涉及个别检测技术，但在一些实施例中，可以使用多种不同的技术来检查单一标签分子(参见例如Kassies人，2005，《显微镜杂志(J Microsc)》217:109-16)。多种检测模式的实例尤其包括电流阻塞与电子遂穿电流组合，以及电流阻塞与成像电荷感应场组合。用不同检测模式的并行检测可用于通过将不同检测模式之间的合成信号的检测时间相关联来识别标签分子。
在一些实施例中，测量移位通过层的标签数或检测移位通过层的标签包括观测标签在纳米孔上的电流阻塞效应。在一些实施例中，在电流阻塞效应高于阈值水平时，分析物存在于样品中。
3.用于分析物分析的装置
本公开描述与纳米孔装置结合使用的微流体装置和集成微流体纳米孔装置。与纳米孔装置结合使用的所公开的微流体装置和集成微流体纳米孔装置可用于分析物分析的方法中，如上文所描述。然而，在某些情况下，本文中所描述的装置可用于其它应用。同样地，在某些情况下，本文中所描述的方法可与其它装置一起使用。
与纳米孔装置结合使用的微流体装置描绘于图1A和图1B中。描绘了在纳米孔装置15中具有待分析的流体液滴11的微流体装置10。流体液滴可以包括待使用纳米孔装置计数的标签(例如，经裂解标签或适体)。纳米孔装置15包括第一腔室16、具有纳米孔18的层17，和第二腔室19。图1A和图1B描绘了液体转移步骤1，其中流体液滴11从微流体装置10中去除并放置到纳米孔装置15中。如图1A中所描绘，流体液滴11以使得液滴跨过层17被分裂且位于纳米孔18处的方式沉积在层17上。流体液滴可经由进口端(未示出)引入到纳米孔装置15中。进口端可位于层17的部分上方。举例来说，进口端可位于腔室的壁中的开口中，其中含有纳米孔的层位于所述腔室壁中。在图1B中，液体液滴11沉积在第一腔室16中。缓冲液添加步骤2将缓冲液引入第二腔室19中。在其它实施例中，可在将液体液滴11引入第一腔室16中之前将缓冲液添加到第二腔室19中。在又其它实施例中，可在将缓冲液添加到第一腔室16中之前或之后将液体液滴11沉积在第二腔室19中。在图1A中，不需要将缓冲液添加到任一腔室中的步骤。
在另一实施例中，装置可为集成装置。集成装置可包括可以单独构建且随后组合以形成集成装置的微流体模块和纳米孔模块，或微流体模块和纳米孔模块可以一起内置在单一装置中。
图2A和图2B描绘了具有微流体模块以及纳米孔模块的集成装置的示意图，且所述两个模块通过使用通道将其连接来集成。尽管图2A和图2B描绘了包括组合以产生集成装置的单独模块的装置，但应了解图2A和图2B的装置还可以制造为两个模块已连接的一体式装置。
在图2A和图2B(上部图)中，描绘了在纳米孔装置30中具有待分析的流体液滴25的微流体模块20。纳米孔模块30包括第一腔室31、具有纳米孔33的层32，和第二腔室34。微流体模块20经由通道40与纳米孔模块30结合在一起。通道将两个模块流体地连接且促进液滴25从微流体模块20移动到纳米孔模块30。中部图示出液滴25经由通道40从微流体模块20移动到纳米孔模块30。如图2A中所示，通道可将微流体模块20连接到纳米孔模块30中的进口端。进口端(未示出)可定位成使得流体液滴25以导致液滴跨过层32分裂并位于纳米孔33处的方式沉积在层32上。在转移过程结束时，流体液滴跨过纳米孔33定位(图2A，底部图)。在其它实施例中，通道40可将微流体模块20连接到纳米孔模块30的第一或第二腔室中的进口端。这类实施例示出于图2B中，其中通道40将微流体模块20连接到纳米孔模块30的第一腔室31中的进口端。在将液体液滴25转移到第一腔室31之后或之前，可将缓冲液添加到第二腔室。在图2B的步骤2中，在将液滴25转移到第一腔室31中之后将缓冲液添加到第二腔室34中。任选地，在完成转移之后，可去除通道40且分开两个模块。分别在图1A、图1B、图2A和图2B中示出的微流体装置和纳米孔装置和模块各自为单独地功能性。
图2C到图2H描绘了包括数字微流体模块50和纳米孔模块60的集成装置的实施例。描绘了具有电极阵列49的数字微流体模块，所述电极阵列可操作地连接到用于产生待传输到纳米孔模块的液滴的多个试剂储槽51。一个或多个储槽51可以含有试剂或样品。不同的试剂可存在于不同的储槽中。另外描绘在微流体模块50中的是将电极阵列49连接到电源(未示出)的接触垫53。未描绘将电极阵列49连接到接触垫的迹线。电极阵列49将一个或多个液滴(如缓冲液液滴或含有缓冲液和/或标签(例如，经裂解标签或经解离适体)的液滴)传输到位于数字微流体模块50与纳米孔模块60之间的接口100处的转移电极71和转移电极72中的一个或两个。数字微流体模块50和纳米孔模块60可操作地连接在接口100处。纳米孔模块60包括至少两个在安置纳米孔层70的位置处彼此相交的微流体毛细管通道61和62。两个微流体毛细管通道61和62位于纳米孔模块中的两个不同衬底中(描绘于图2D中)。因此，纳米孔模块包括在第一衬底63的顶表面中包括微流体毛细管通道61的第一衬底63(例如，底部衬底)，且进一步包括在第二衬底的第一表面中具有微流体毛细管通道62的第二衬底64(例如，顶部衬底)。第二衬底64覆盖在微流体毛细管通道61上且第一衬底63垫在微流体毛细管通道62下。毛细管通道62在纳米孔层70的位置处的两个通道的交叉点处覆盖在毛细管通道61上(还是参见图2D，底部图)。两个毛细管通道在交叉点处通过放置在交叉点处的纳米孔层70来物理地分隔开。纳米孔层70包括位于毛细管通道的交叉点处的至少一个纳米孔(未显示)且允许通过纳米孔将分子从一个毛细管通道传输到另一个毛细管通道。毛细管通道61和62在毛细管通道的第一端的接口100处打开且打开到毛细管通道的第二端的储槽/排放口(84和85，如图2C中所见)。图2C中还描绘位于电极阵列49上方的覆盖衬底101。覆盖衬底101在操控液滴的微流体模块中界定间隙。覆盖衬底101可任选地包括安置于覆盖衬底101的底表面上的电极55(例如，参考电极)，从而提供用于在微流体模块50中操控液滴的双平面电极配置。在不存在双平面电极配置的情况下，可在微流体模块50中通过使用共平面电极致动，例如使用电极阵列49或其它共平面电极配置来操控液滴。举例来说，US6911132中描述的共平面电极可用于在微流体模块50中操控液滴。
图2D(顶部图)示出了接口100的横截面的正视图示意图，数字微流体模块50和纳米孔模块60可操作地连接在所述接口处。在图2D的底部图中描绘了转移电极72处的装置的横截面的侧视图示意图。图2D(顶部图)示出了位于两个转移电极71和72上的两个液滴(65a和65b)，所述转移电极位于微流体模块50与纳米孔模块60之间的接口100处。如图2D(顶部图)中所示，位于电极71处的液滴65a与毛细管通道61中的开口对准，而位于电极72处的液滴65b与毛细管通道62中的开口对准。图2D(底部图)示出显示液滴65b放置在转移电极72上的集成装置的横截面侧视图。液滴65b定位以移动到毛细管通道62中，还示出毛细管通道61；然而，毛细管通道与转移电极72相隔一定距离且与转移电极71(未示出)对准。还描绘了具有安置于覆盖衬底101的底表面上的电极55的覆盖衬底101。在图2D到图2H中描绘的集成装置的实施例中，纳米孔模块安置于与微流体模块的电极阵列相同的衬底上。
转移电极的顶表面与毛细管通道的进口之间的竖直距离可通过形成微流体模块和纳米孔模块的下部部分的衬底厚度来确定。竖直距离可基于待转移到纳米孔模块的液滴体积来设定。竖直距离可通过改变衬底的厚度来调节。举例来说，纳米孔模块的衬底(例如，衬底63)可保持相对较薄或可以增大其上安置转移电极的衬底的厚度(例如通过使用较厚衬底)以确保液滴与毛细管通道的进口对准。在图2E中描绘了示范性装置，其中通过使用具有较厚底部衬底的微流体模块将液滴引入与毛细管通道的进口对准。图2E中示出的装置具有与图2C到图2D所描述相同的配置。然而，电极阵列定位于其上的衬底59a的厚度相对于纳米孔模块安置于其上的一部分衬底的厚度增加了。图2E(顶部图)描绘了微流体模块与纳米孔模块之间的接口100处的横截面正视图。图2E(底部图)描绘了转移电极72和毛细管通道62的位置处的横截面侧视图。如图2E中所示，电极阵列49和转移电极71和72安置于其上的衬底59a相比于纳米孔模块安置于其上的衬底59b较厚。如图2E(底部图)中所示，衬底59a具有第一高度H1而衬底59b具有第二高度H2，其中H1大于H2。衬底59a与衬底59b之间的高度差异使得纳米孔模块中的毛细管通道61和62分别与位于电极71和72上的液滴对准。图2E的底部图中还描绘了通道61。如图2C中显而易见，毛细管通道62与毛细管通道61正交于纳米孔层70的位置处。通道61与转移电极71对准且配置成接收位于转移电极71上的液滴65a。虽然描绘两个毛细管通道彼此正交于交叉点处，还设想其中两个通道以除90度以外的角度相交的其它配置。
在与毛细管通道接触时，液滴经由任何合适的方式，例如毛细作用移动到毛细管通道中。可通过其它方法/材料促进液滴移动到毛细管通道中。举例来说，可经由以下将液滴移动到毛细管通道中：扩散、布朗运动(Brownian motion)、对流、泵送、施加的压力、重力驱动流、密度梯度、温度梯度、化学梯度、压力梯度(正或负)、气动压力、产生气体的化学反应、离心流、毛细管压力、芯吸、电场介导、电极介导、电泳、介电泳、磁泳、磁场、磁性驱动流、光学力、趋化性、趋光性、表面张力梯度驱动流、马兰戈尼应力(Marangoni stress)、热毛细管对流、表面能梯度、声泳、表面声波、电渗流、热泳、电润湿、光电润湿或其组合。另外或替代地，可以通过使用例如致动力，如本文公开的那些；使用毛细管中的亲水涂层；改变毛细管通道的大小(例如宽度和/或高度和/或直径和/或长度)来促进液滴移动到毛细管通道中。
在图2C到图2H中描绘的实施例中，流体流动跨过毛细管通道61和62至少部分地通过改变毛细管的横截面来控制-流体首先相对迅速地移动直到其进入毛细管的较窄部分。一个或两个液滴可为含有待检测或计数的分析物(或经裂解标签或经解离适体)或用于通过纳米孔分析的导电溶液(例如，不含有分析物的缓冲液)的液滴。在某些情况下，一个液滴65a可为含有分析物/标签/适体的液滴而另一个液滴65b可为缓冲液液滴。虽然针对每个通道描绘了单一液滴，但实际上，可将多个液滴传输到纳米孔模块中。举例来说，可以连续方式将多个液滴传输到纳米孔模块中。在一些情况下，多个液滴可聚集在一个或两个转移电极处以产生将传输到纳米孔模块的较大液滴。
图2F示出集成装置中使用的不同电极的示范性配置。如上文所提及，单一连续电极55(图2F中未示出)以与电极阵列49间隔开的方式定位于微流体模块60中。电极阵列包括一系列单独可控制的电极。电极55安置于覆盖衬底101的下表面上。电极55和电极阵列将液滴移动到转移电极。虽然描绘了电极55不覆盖转移电极71和72，但在某些示范性装置中，覆盖衬底101和电极55可以延伸通过转移电极。在其中电极55不覆盖转移电极的实施例中，共平面电极可用于将液滴移动到转移电极(例如，US6911132中描述的共平面致动)。如本文所描述，单个电极55可用作参考或接地电极，而电极阵列49可单独地控制(例如电极阵列可为可独立致动的致动电极)。电极对：对80a和80b以及对90a和90b定位于纳米孔模块中。电极对80a、80b和90a、90b用于确定纳米孔层70上的相反极性以驱动带电分子通过纳米孔层70中的一个或多个纳米孔。在一些实施例中，电极对80a和80b可为正电极且电极对90a和90b可为负电极。图2G示出纳米孔模块的替代性电极配置，其中两个电极80和90(而非四个)用于确定纳米孔层70上的极性差。这些实例证实了在纳米孔层上产生电势梯度的对称(四个电极)或不对称(两个电极)电极配置用于使带电分子移位通过纳米孔的用途。
图2H示出毛细管通道的替代性配置，其中仅一个通道61连接到接口100处的微流体模块。另一个通道62连接到可填充有导电液体的两个储槽以促进带电分子跨过纳米孔转移。
在某些情况下，本文中所提供的集成装置可通过在第一衬底的顶表面的第一区域上形成用于数字微流体模块部分的储槽和电极阵列来制造。第二衬底可通过将单电极(例如，电极55)安置于第二衬底的底表面上来制备且以间隔开的方式定位于可单独控制的电极阵列的上方以为双平面液滴致动在单电极与电极阵列之间提供面对取向。如本文中所使用，“液滴致动”是指使用如本文所公开的微流体装置或使用如US6,911,132、US6,773,566或US6,565 727中所公开的液滴致动器操控液滴，其公开内容以引入的方式并入本文中。因此，本文公开的装置的双平面电极或电极阵列的配置可类似于US6,911,132、US6,773,566或US6,565,727中所公开的那些配置。第二衬底上的电极55还可被称作参考电极。微流体模块中的电极可任选地涂覆有介电材料。疏水涂层也可提供于介电质上。
在某些实施例中，微通道可形成于第三衬底上，所述第三衬底可安置于第一衬底的第二区域上，电极阵列49安置于所述第一衬底上。举例来说，第三衬底可结合到第一衬底上的第二区域上，其中微流体电极阵列安置在第一区域中。衬底可具有预先形成的微通道或微通道可在结合步骤之后形成。具有第二微通道的第四衬底可安置于含有微通道的衬底的顶部上以提供如图2C到图2H中所描绘的集成装置。纳米孔层可安置于两个微通道的交叉点位置处的任一微通道上。因此，形成纳米孔模块的衬底可以包括在任一端且在一侧打开的微通道。第四衬底放置在第三衬底上封闭了微通道，进而形成毛细管通道(例如，61和62)。
在某些实施例中，微通道可形成于单独的衬底上，所述单独的衬底可安置于第一衬底上，微流体电极阵列安置于所述第一衬底上。举例来说，另一个衬底可结合到第一衬底上的第二区域上，其中微流体电极阵列安置在第一区域中。衬底可具有预先形成的微通道或微通道可在结合步骤之后形成。具有第二微通道的另一个衬底可安置于含有微通道的衬底的顶部上以提供如图2C到图2H中所描绘的集成装置。纳米孔层可安置于两个微通道61和62的交叉点位置处的任一微通道上。
在一些实施例中，微通道可以引入第一衬底上与第一区域相邻的第二区域中，微流体电极阵列安置于所述第一衬底上。举例来说，微通道可以蚀刻在第二区域中的顶表面上。纳米孔层可以放置在微通道上的一位置处。纳米孔层可以包括一个或多个预成型纳米孔。在替代实施例中，纳米孔可在将所述层定位于微通道上的一位置之后形成。第三衬底可以通过经微通道引入第三衬底的底表面上来制备。第三衬底可定位于第一衬底上的第二区域上方以使得第一衬底的第二区域的顶表面跨过其顶表面与第三衬底的底表面接触，进而产生封闭的毛细管通道61和62。
图2I到图2K描绘了其中数字微流体模块250和纳米孔模块260共用共同的底部(第一)衬底210的装置，微流体模块的电极阵列249(一系列可单独控制的电极)安置于第一区域上且微流体通道261形成于第二区域中。第一衬底中的微流体通道261与转移电极271对准。具有单一连续电极255(例如，参考电极)的第二衬底220以与电极阵列249间隔开的方式安置在数字微流体模块250中。包含形成于第三衬底的下表面中的微流体通道262的第三衬底230放置在第一表面210的第二区域上方，进而覆盖其中形成微流体通道261的第一衬底的顶表面。纳米孔模块中的第一衬底和第三衬底封闭了微流体通道261和262，进而提供毛细管通道261和262，应了解“微流体通道”和“微通道”在本文中可互换使用以指代衬底表面中的通路或切口。在将衬底放置在通路上方时，封闭通路进而形成毛细管通道。类似于图2C，毛细管通道可以流体地连接到微流体模块250与纳米孔模块260之间的接口100处的一端的微流体模块和另一端上的储槽或排放口。在其它实施例中，第二毛细管通道262可类似地配置成图2H中的毛细管通道62，即，第二毛细管通道262可不连接到任一端的微流体模块且可连接到两端的储槽/排放口。装置的顶视图描绘于图2I中且模块之间的接口处的装置的横截面正视图描绘于图2I(续图)中。如正视图显而易见，液滴265a处于比毛细管通道261的进口更高的平面上。为允许液滴265a流入到毛细管通道261中，在第三衬底230的侧边缘中产生凹槽280以提供用于液滴往下移动到微通道261中的空间。因此，微流体模块与纳米孔模块之间的流体连接通过由凹槽280形成的竖直端口来提供，从而将第一毛细管通道261的顶部部分中的开口提供在接口100处的第一毛细管通道261的一端处。应了解，图2I中的凹槽280不按大小绘制且可具有允许转移电极271与接口100处的第一毛细管通道261之间流体连通的任何合适的大小。此外，凹槽的大小可改变。举例来说，凹槽可为沿着接口100处的第三衬底230的侧边缘长度延伸的切口且可成比例以匹配转移电极271的宽度或毛细管通道261的宽度或其间的长度。切口可沿第三衬底230的宽度标称地延伸以使得毛细管通道261的相对较小区域未被覆盖。在其它实施例中，切口可延伸通过毛细管通道261的大体长度。含有纳米孔的层270跨过第一毛细管通道261定位于两个毛细管通道相交的位置处。层270定位于支撑衬底275中。在某些情况下，第一衬底210可为玻璃衬底且支撑衬底275可为PDMS衬垫。
图2I中示出的装置的横截面侧视图描绘于图2J中。横截面位于装置中第一毛细管通道261与第一转移电极271对准的区域中。另外描绘了具有电极阵列249的微流体模块250的一部分、以与电极阵列249间隔开的方式定位的具有单电极255(例如，参考电极)的第二衬底220。如图2J中所示，单电极255不覆盖转移电极。虽然不在这些图中示出，但第二衬底220和单电极255(其可为参考电极)可以覆盖转移电极271和272，从而提供双平面电极配置。在这个实施例中，液滴可以使用双平面电极移动到转移电极271和272。第一毛细管261定位于第一衬底210中且位于比液滴265a存在于其上的平面更低的平面中。包括第二微通道(其由第一衬底210的顶表面封闭以提供毛细管通道262)的第三衬底230安置于第一衬底上。第三衬底230包括与接口100处的微流体模块邻接的侧边缘处的凹槽280(或切口)。凹槽280在毛细管通道261的末端打开顶部上的毛细管261，从而提供进入毛细管通道261的竖直端口。如箭头的方向所示，液滴向下行进到毛细管261且随后继续朝向第一和第二毛细管通道的交叉点流动。第二毛细管通道262与第一毛细管261相交于纳米孔层270的位置处。描绘了定位于第一毛细管通道261上方(和第二毛细管通道262下方)的支撑衬底275。支撑衬底275包括纳米孔层270。如插图中所示的纳米孔层的顶视图中所示，支撑衬底275包围纳米孔层。在一些实施例中，支撑衬底可为中心具有切口的第一层和中心具有切口的第二层。纳米孔层可安置于第一层与第二层之间的切口处。支撑衬底中的纳米孔层可用于中其中底部衬底210由玻璃组成的装置中。
图2K示出图2I中所示的装置的横截面的额外侧视图。在图2J中，横截面位于第一转移电极271的位置处。在图2K中，横截面位于第二转移电极272的位置处。如图2K中所示，第二毛细管通道262的进口与第二转移电极272上存在的液滴265b的位置对准。图2K中还描绘了在纳米孔层270的位置处与第二毛细管通道262相交的第一毛细管通道261。
在另一实施例中，如图2L中所示，第一衬底210可包括电极阵列249和转移电极271和272安置于其上的第一部分210a和含有毛细管通道261a的衬底290安置于其上的第二部分210b。类似于图2I到图2K中所示的装置，毛细管通道261a低于转移电极位于其上的平面。毛细管通道262位于衬底230中，其中毛细管通道262的进口处于与微流体模块250中的转移电极相同的平面。此外，类似于图2I到图2K，毛细管通道262的进口与转移电极272对准。因此，位于电极272上的液滴可大体上水平地行进到毛细管通道262。类似于图2I到图2K中所示的装置，衬底230包括在衬底230的侧边缘中的凹槽280以提供用于位于转移电极271上的液滴向下行进到位于衬底290中的毛细管261a的空间。图2L中还描绘纳米孔层270。在这个实施例中，在不存在支撑层275的情况下，纳米孔层直接安置于衬底290上。举例来说，在含有通道的两个衬底由PDMS形成的实施例中，在不存在支撑衬底的情况下，纳米孔层可直接安置在衬底之间。图2L(顶部图)描绘了在转移电极271和毛细管通道261a所位于的位置处通过装置的横截面侧视图。图2L(底部图)描绘了在转移电极272和毛细管通道262所位于的位置处通过装置的横截面侧视图。从上看，装置看起来与图2I中所示的装置相同。因此，转移电极271和272与图2I中所示的装置中的转移电极71和72一样间隔开。
用于经由纳米孔将分子传输跨过纳米孔层的纳米孔模块中的电极可以在将纳米孔层定位于装置中之后制造。举例来说，电极可安置在引入衬底中且位于毛细管通道中的开口中以使得其暴露于毛细管通道且将与毛细管通道中存在的流体接触。电极与纳米孔的距离可基于毛细管通道的电阻、宽度、直径和/或长度凭经验来确定。
纳米孔层可安置于任一通道上。可以等离子体结合或经由可压缩元件(如衬垫)将纳米孔层粘附到含有微通道的衬底表面。在某些情况下，含有第一通道的衬底可为玻璃衬底。在这个实施例中，支撑衬底，如PDMS层可以用于定位纳米孔层。举例来说，纳米孔层可具有PDMS衬垫。
可使用任何合适的方法以在衬底上形成通道。在某些情况下，可使用光刻法或压印来创建纳米孔模块的通道。在其它实施例中，通道可以蚀刻到衬底中。在某些实施例中，可以使用合适方法的组合在衬底中形成通道。举例来说，可使用蚀刻工艺在玻璃衬底中形成通道且可使用适当的方法在PDMS衬底中形成其它通道，所述方法如软光刻法、纳米印刷光刻法、激光切除或压印(例如，软压印)。微通道的高度/宽度/直径可以凭经验来确定。微通道的高度/宽度/直径可在0.5μm到约50μm，例如0.5μm-40μm、1μm-30μm、2μm-20μm、3μm-10μm、5μm-10μm的范围内，如0.5μm、1μm、2μm、3μm、4μm、5μm、6μm、7μm、8μm、9μm、10μm、15μm、20μm、30μm、40μm或50μm。如在本文中所提及，通道的高度/宽度/直径可沿通道的长度改变。
在某些实施例中，纳米孔层(例如，70或270)可包括在纳米孔层的一侧或两侧上的绝缘材料涂层。绝缘材料可减少接触电容且减少与检测分子移位通过纳米孔层中的纳米孔相关的噪声。在另一个实施例中，可减少暴露于与纳米孔层(例如，毛细管通道61和62或261和262)流体接触的毛细管通道中的流体中的纳米孔层的表面积。减少与含有待由纳米孔检测或计数的分子的流体接触的纳米孔层的表面积可最小化接触电容且减少背景噪声。与毛细管通道中的流体接触的纳米孔层的表面积可通过减小纳米孔层位置处的毛细管通道的大小来减小。举例来说，可减小纳米孔层位置处的毛细管通道的高度或宽度或这两个(例如，直径)。在另一个实施例中，可减小纳米孔层的表面积。在某些装置中，可包括减小接触电容的这些实施例的组合。举例来说，在某些实施例中，如本文所公开的集成装置可包括在纳米孔层位置处具有减小尺寸的毛细管通道和/或可以包括在纳米孔层的一侧或两侧上涂覆有绝缘材料(例如，PDMS)的纳米孔层和/或可包括具有最小表面积的纳米孔层。
图3示出包括微流体模块300和纳米孔模块325的另一个示范性集成装置。与图1A、图1B、图2A和图2B中的纳米孔模块相比，纳米孔模块325不充当独立装置但充当与微流体模块300集成的纳米孔。微流体模块300包括大小设定成允许插入纳米孔模块325的开口302。如图3中所描绘，微流体模块包括待使用纳米孔模块325分析的流体液滴301，其含有具有纳米孔305的层311。在将纳米孔模块325插入到微流体模块300中之后，产生由层311分隔开的第一腔室306和第二腔室307。层311还将流体液滴301分裂在纳米孔305两端。
图4提供一种集成装置400，其中数字微流体模块包括内置式纳米孔模块。在图4中，纳米孔模块定位于微流体模块中产生流体液滴401的区域的下游。微流体模块将液滴401移动到纳米孔模块以使得液滴401分裂在层402两端且位于纳米孔403中。图4示出装置的顶视图。为了清楚起见，尚未示出顶部衬底。虽然已描绘纳米孔层402中的纳米孔403，但从顶视图看，将不可见到纳米孔403。纳米孔层402可附着于底部衬底或顶部衬底。
在图1A、图1B、图2A、图2B、图3和图4中，尽管示出单纳米孔，但应了解所述层可包括一个或多个纳米孔。另外，超过一个液滴可定位于纳米孔模块或装置中。可通过在纳米孔上施加电压来分析液滴。施加电压可使得带电分子移动跨过纳米孔。当标签移位通过纳米孔时，跨过纳米孔的电流减少提供了移位的指示。在某些实施例中，纳米孔模块的腔室可不填充有导电溶液(例如，缓冲液)-导电溶液可在其跨过纳米孔层定位时通过流体液滴来提供。在某些情况下，施加电压以测量流体液滴中存在的标签/适体的移位的第一腔室和第二腔室可由纳米孔装置的壁和纳米孔层界定(例如，参见图1B和图2B)。第一腔室和第二腔室在引入流体液滴之前可为空的或可含有导电流体。在其它情况下，第一腔室和第二腔室可界定微流体模块的壁和纳米孔层(例如，见图3)。在其它情况下，第一腔室和第二腔室可由分裂在纳米孔层两端的流体液滴界定(例如，参见图1A、图2A和图4)。在某些情况下，可将用于引导带电分子跨过纳米孔的电压施加到流体液滴，例如在导电溶液不存在于腔室中的实施例中。可经由与流体液滴直接或间接接触的电极将电压施加到流体液滴。应了解纳米孔层的尺寸大于液滴的尺寸以使得液滴分开在层两端并仅经由纳米孔来连接。
图5A、图5B、图6和图7示出了具有数字微流体模块和纳米孔层的装置中的液滴的移动。在图5A中，描绘了集成数字微流体/纳米孔装置450的组件。顶视图示出待使用纳米孔层402中的纳米孔403分析的液滴401跨过纳米孔层402定位。出于说明的目的在此处示出纳米孔403，但从顶视图来看，不可见纳米孔。装置450包括电极阵列405安置于其上的衬底411。电极阵列用于通过使液滴分裂在纳米孔层402两端来定位液滴401。箭头451和452描绘了液滴401可跨过电极阵列移动到纳米孔层402的方向。在将液滴401定位在纳米孔层402上之后，可启用位于液滴401下方的电极404和406以提供纳米孔层402上的差分电压，进而促进液滴401中的分子(例如，经裂解标签或适体)移动跨过纳米孔403。电极404和406是双重功能电极，其用以将液滴移动到纳米孔层并驱动标签/适体跨过纳米孔403。
图5B描绘了装置450的侧视图，本文描绘了图5A中示出的顶视图中省去的顶部衬底412。示出包括电极414的顶部衬底412。电极414可为单电极或电极阵列。纳米孔层从顶部衬底延伸到底部衬底。液滴401被分裂在纳米孔层402两端。尽管双平面电极描述于图5B中，但装置在两个衬底中可不包括电极；而顶部或底部衬底可包括共平面电极。液滴401附近的电极404和406具有相反极性且驱动标签/适体跨过纳米孔403。
图6示出了液滴401分裂在具有纳米孔403的纳米孔层402两端。1a描绘了由电极405沿箭头指示的方向朝向纳米孔层402移动的液滴。在2a中，液滴401已由纳米孔层402分裂且定位以使得液滴经由纳米孔403连接。在3a中，跨过纳米孔层402定位于液滴401下方的电极被启用以提供正极(-)和负极(+)。经启用的电极驱动液滴401中存在的带负电分子(包括待计数的标签/适体)通过纳米孔403。当标签/适体移位通过纳米孔403时，标签/适体数量可如本文中所解释来计数。当在液滴的一侧中分裂液滴时，步骤3a用以收集分裂跨过纳米孔层的所有标签/适体。
在大体上所有标签/适体已移位到纳米孔膜的一侧之后，可逆转电极的极性，如4a中所示，且标签/适体移位到纳米孔层402的另一侧并计数。在步骤3a中计数的标签数量应为步骤4a中所得的计数的大致一半。逆转电极的极性并计数标签/适体的步骤可重复多次以获得液滴中标签/适体数量的多个读数。
图7，1b和2b示出了沿箭头指示的方向移动到纳米孔层604的两个液滴600a和600b。在处于纳米孔层604时，液滴使纳米孔层润湿且经由纳米孔605来流体连通(3b)。在步骤4b中，启用位于液滴600a下方的电极以用作负极且启用位于液滴600b下方的电极以用作正极并将带负电的裂解标签/解离适体驱动到液滴600a并计数。在步骤5b中，逆转电极的极性且将存在于液滴600a中的带负电裂解标签/解离适体驱动到液滴600b并计数。逆转电极的极性并计数裂解标签/解离适体的步骤可重复多次以获得液滴中裂解标签/解离适体数的多个读数。两个液滴600a和600b可都是样品液滴(例如，含有待计数分子的液滴)或缓冲液液滴(例如，在将样品液滴定位于纳米孔之前用于湿润纳米层)。在一些实施例中，液滴中的一个可为缓冲液液滴而另一液滴可为样品液滴。标签/适体可计数一次或多次。
图8从侧视图示出了集成数字微流体和纳米孔装置。衬底91和92以间隔方式定位。衬底92包括电极97且衬底91包括电极阵列95。支撑结构98将纳米孔层94附着于衬底92。在其它实施例中，支撑结构98可附着于底部衬底91。电极阵列95用于将液滴99移动到纳米孔层94，其中纳米孔层将液滴分裂且经由纳米孔93将液滴的两侧流体地连接。电极96和97用以驱动液滴99中的标签/适体通过纳米孔93。如上文所提及，可以转电极96和97的极性以使标签/适体移位通过纳米孔多次。
尽管图描绘了单个纳米孔，但应了解超过一个纳米孔可存在于纳米孔层中。侧接纳米孔层且用于在纳米孔层上提供电压差的电极可或可不与位于纳米孔层处的液滴直接接触。
微流体和纳米孔装置、模块和集成装置中的流体液滴的移动可经由任何合适的方式进行。用于移动不同装置/模块和通道中的流体液滴的方式(如果可适用)可为相同或不同的。举例来说，可使用流体操控力使流体液滴在微流体装置或模块中移动，如电润湿、介电泳、光电润湿、电极介导、电场介导、静电致动等或其组合。可经由以下使流体液滴从微流体模块通过流体连接(如通道)移动到纳米孔模块：扩散、布朗运动、对流、泵送、施加的压力、重力驱动流、密度梯度、温度梯度、化学梯度、压力梯度(正或负)、气动压力、产生气体的化学反应、离心流、毛细管压力、芯吸、电场介导、电极介导、电泳、介电泳、磁泳、磁场、磁性驱动流、光学力、趋化性、趋光性、表面张力梯度驱动流、马兰戈尼应力、热毛细管对流、表面能梯度、声泳、表面声波、电渗流、热泳、电润湿、光电润湿或其组合。可经由流体操控力使流体液滴在纳米孔模块中移动且跨过纳米孔层定位，如电润湿、介电泳、光电润湿、电极介导、电场介导、静电致动及类似方法或其组合。可使用以下使液滴中的标签/适体移位通过纳米孔：电势、静电势、电动流、电渗透流、压力诱发流、电泳、电泳传输、电渗透传输、扩散传输、电场介导流、介电泳介导的标签/适体传输，和所属领域技术人员已知的其它方法或其组合。
本公开的示范性实施例包括通过将大体上所有标签第一次移位到纳米孔层的同一侧以收集顺或反腔室中的所有标签来计数跨过纳米孔层定位的存在于液滴中的标签数，接着将标签移位到纳米孔层的另一侧并计数穿越通过纳米孔层中的纳米孔的标签数。如本文中所使用，在纳米孔层的上下文中的“顺”和“反”是指纳米孔层的相对侧。这些术语用于纳米孔层的一侧的背景中并且用于纳米孔层的一侧的腔室背景中。如处装置的描述中理解，顺和反腔室可由壁、衬底等界定的物理结构来界定。在一些情况下，顺和反腔室可由放置在纳米孔层上的液滴界定。液滴可与液滴的一个或多个侧面上的壁或衬底接触。在某些情况下，顺和反腔室可由液滴界定，顺腔室可从纳米孔层的顺侧面延伸到顺侧面上的液滴部分的周边，且反腔室可从纳米孔层的反侧面延伸到反侧面上的液滴部分的周边。顺和反侧面中的每一个上的液滴部分可与衬底接触。因此，顺和反腔室可由液滴周边、衬底的一部分和纳米孔层的组合界定。
在某些情况下，微流体装置和/或微流体模块可包括与样品液滴和试剂液滴不混溶的惰性流体。举例来说，惰性流体可为比水更稠密的重流体，如与微流体模块中产生且加工的流体液滴不混溶的油。惰性流体可促使形成流体液滴以及增加流体液滴的形状稳定性且可进一步适用于保持不同液滴在空间上彼此分隔。示范性惰性流体包括极性液体、硅油、氟硅酮油、碳氢化合物、烷烃、矿物油和石蜡油。在某些情况下，微流体装置或模块和惰性流体可公开于US20070242105中，其以全文引用的方式并入本文中。在其它实施例中，不可混溶的流体不包括在装置中。在这些实施例中，环境空气填满了装置中的空间。
如本文中所使用，“液滴”和“流体液滴”可互换地使用以指代形状大致为球形且由微流体装置、纳米孔装置、微流体模块或纳米孔模块的壁或衬底在至少两个侧面上界定的精密体积的液体。在液滴的情形下大致球形是指例如球形、部分地扁平球形，例如圆盘形、段塞形、截断形、椭圆形、半球形或卵形的形状。本文公开的微流体和纳米孔模块和装置中的液滴体积可介于约10μL到约5pL，如10μL到1pL、7.5μL到10pL、5μL到1nL、2.5μL到10nL或1μL到100nL范围内，例如10μL、1μL、800nL、400nL、100nL、10nL或更小。
在某些实施例中，集成装置可包括具有内置式纳米孔模块的微流体模块。集成装置可以包括第一衬底和第二衬底，以及分隔第一衬底和第二衬底的间隙，所述间隙(其可以填充有空气或不可混溶的液体)提供样品液滴与第一结合成员接触的空间(所述第一结合成员固定于磁性珠粒上或两个衬底中的一个上)；任选进行洗涤步骤；接着使结合到第一结合成员的分析物与第二结合成员接触；可进行任选的混合和洗涤步骤；以及使附着于第二结合成员的标签裂解以产生含有经裂解标签的液滴。含有经裂解标签的液滴可随后跨过位于第一衬底与第二衬底之间的间隙中的纳米孔层来定位。
如在本文中所提及，液滴可经由大量方式，如使用可编程流体操控力(例如，电润湿、介电泳、静电致动、电场介导力、电极介导力、SAW等)在集成装置中移动。在某些情况下，微流体装置和模块可以过使用电极移动用于进行分析物分析的样品液滴和试剂。电极可为共平面的，即，存在于相同衬底上或呈面对取向(双平面)，即，存在于第一衬底和第二衬底上。在某些情况下，微流体装置或模块可具有如美国专利第6,911,132号中描述的电极配置，所述专利以全文引用的方式并入本文中。在某些情况下，装置可包括与第二衬底由间隙分离的第一衬底；所述第一衬底可包括位于上表面上的电极系列；介电层可安置于第一衬底的上表面上并覆盖所述电极系列以提供用于移动液滴的大体平坦的表面。任选地，疏水材料层可放置在介电质的上表面上以提供大体平坦的表面。在某些情况下，第一衬底可包括共平面电极-例如存在于单个衬底上的驱动/对照和参考电极。在其它情况下，位于第一衬底上方的第二衬底可包括在第二衬底的下表面上的电极，其中第二衬底的下表面面向第一衬底的上表面。第二衬底上的电极可用绝缘材料覆盖。所述电极系列可沿微流体模块的长度以纵向方向或沿微流体模块的宽度以横向方向或两种(例如，二维阵列或栅)布置。在某些情况下，可通过可操作地耦接到用于移动液滴的装置的计算机的处理器以可编程方式来启用(例如，打开或关闭)电极阵列。用于在微流体装置中致动液滴的装置和方法为已知的。在示范性情况下，微流体模块可类似于所属领域中已知的液滴致动器。举例来说，第一(底部)衬底可含有图案化的可单独控制的电极阵列，且第二(顶部)衬底可包括连续的接地电极。涂覆有疏水的介电绝缘体可以涂覆在电极上以降低表面的可湿性且增加液滴与控制电极(图案化电极阵列)之间的电容。为移动液滴，可将控制电压施加到与液滴邻近的电极(电极阵列中)且同时停用仅在液滴下方的电极。通过改变沿直线电极阵列的电势，可使用电润湿以使液滴沿这个电极线移动。
第一和第二衬底可由任何合适的材料制得。合适的材料包括(但不限于)纸、薄膜聚合物、硅石、硅、经过加工的硅、玻璃(刚性或柔性)、聚合物(刚性、柔性、不透光或透明的)(例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)和环烯烃共聚物(COC)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、印刷电路板和聚二甲基硅氧烷(PDMS))。在某些情况下，至少第一或第二衬底可为大体上透明的。大体透明的衬底可用于装置中，在所述装置中进行附着于第二结合成员的标签的光裂解。在共平面电极存在于衬底中的一个中的实施例中，电极可或可不为透明的。在其它实施例中，如在电极呈面对取向的情况下(存在于两个衬底中)，所述衬底中的至少一个上的电极可为大体透明的，例如电极可由氧化铟锡制得。电极可由任何合适的材料制得。电极可由任何导电材料(如纯金属或合金，或其它导电材料)制得。实例包括铝、碳(如石墨)、铬、钴、铜、镓、金、铟、铱、铁、铅、镁、汞(如汞齐)、镍、铌、锇、钯、铂、铼、铑、硒、硅(如高度掺杂的多晶硅)、银、钽、锡、钛、钨、钒、锌、锆，其混合物，以及这些元素的合金或金属化合物。在某些实施例中，导电材料包括碳、金、铂、钯、铱或这些金属的合金，这是因为这类贵金属和其合金在水性环境中不起反应。
在某些情况下，第一衬底或第二衬底可以具有间隙中的固定于其上第一结合成员。举例来说，与第二衬底的表面呈面对关系的第一衬底的表面可以包括第一结合成员安置于其上的区域。如在本文中所提及，第一结合成员(例如，多肽，例如受体、抗体或其功能片段)可使用任何传统方法固定于固体衬底的表面上。在某些情况下，在间隙中第一或第二衬底的表面上的第一位置可仅包括一种类型的结合成员(例如，单型抗体)。在其它实施例中，在间隙中第一或第二衬底的表面上的第一位置可仅包括用于分析多个分析物的多个不同的结合成员。替代地，装置可包括第一或第二衬底的表面上的多个位置，其中每个位置可包括固定于其上的不同第一结合成员。
在间隙中第一衬底或第二衬底的表面具有固定不同第一结合成员的多个位置的实施例中，所述位置可沿装置的长度线性地布置。样品液滴可以线性地移动以依序地接触多个位置中的每一个。在另一个实施例中，样品可分裂成多个液滴且所述液滴中的每一个可独立地接触多个位置中的每一个。如本文中所提及，第一结合成员可不附着于第一或第二衬底且可附着于能够作为例如液滴引入微流体装置中的珠粒。
如在本文中所提及，样品和用于分析样品的任何试剂可操控为离散体积的流体，可使用可编程的流体操控力(例如，电润湿、介电泳、静电致动、电场介导、电极介导力等)使所述流体在第一衬底与第二衬底之间移动。举例来说，第一和第二衬底中的至少一个可包括用于操控离散体积流体的电极阵列，例如使液滴从第一衬底与第二衬底之间的一个位置移动到另一位置、混合、合并分裂、稀释等。在另一个实例中，表面声波可用于移动液滴以用于分析物分析方法。
在另一个实施例中，微流体模块可通过使用表面声波移动用于进行分析物分析的样品液滴和试剂。在这些实施例中，第一衬底可为有益于传播表面声波的薄平面材料。第一衬底可为压电晶体层，如铌酸锂(LiNbO3)、石英、LiTaO3晶片。在某些情况下，压电晶片能够可拆卸地耦接到超衬底，其中由转换器产生的表面声波(SAW)经由安置在压电晶体层与超衬底之间的连接介质传输到超衬底。超衬底的上表面可由第二衬底覆盖且可经由由连接到压电晶体层的交叉指形转换器产生的SAW使液滴在第二衬底与超衬底的上表面之间的空间中移动。在某些情况下，微流体模块可为描述于WO2011/023949中的SAW微流体装置，其以引用的方式并入本文中。
在替代实施例中，微流体模块可包括第一表面，所述第一表面与第二表面由第一表面与第二表面之间的空间分离，其中样品和试剂液滴被操控以进行本文公开的样品分析。微流体装置可进一步包括耦接到第一表面的表面声波(SAW)产生材料层；和布置在SAW产生材料层处以在第一表面处提供传输到第一表面上的液滴的表面声波(SAW)的转换器电极结构，其中第一表面具有影响SAW在第一表面处传输、分布和/或表现的至少一个SAW散射元素，且其中SAW产生材料选自由以下组成的组：多晶材料、纹理化的多晶材料、双轴向纹理化的多晶材料、微晶材料、纳米晶材料、非晶形材料和复合材料。在某些情况下，SAW产生材料可为铁电材料、热电材料、压电材料或磁力控制材料。SAW散射元素的布置可实际上提供声子晶体结构，所述声子晶体结构与第一表面处的声场相互作用或影响第一表面处的声场进而影响液滴在第一表面上的移动。在某些情况下，微流体模块可为描述于US20130330247中的SAW微流体装置，其以引用的方式并入本文中。SAW微流体装置可与纳米孔装置结合使用或可具有与其集成的纳米孔模块。
本文所描述的装置可与另一个或多个装置(如电源、声波产生器等)结合使用。
可用于执行本文中所描述的方法步骤的装置还可包括用于供应试剂并收集废料的构件。这类构件可包括腔室、吸附衬垫、储槽等。这些构件可以流体地连接到装置。
微流体模块可以流体地连接到用于供应样品分析试剂(如第一结合成员、第二结合成员、洗涤缓冲液、裂解诱发剂以及类似物)的储槽。纳米孔模块可流体地连接到用于收集废料的储槽、用于将导电溶液供应到顺和反腔室的储槽，以及类似物。
集成装置可为自动的或半自动的且可拆卸地耦接到外壳，所述外壳包含用于将电压供应到电极的电源和用于存储以下指令的随机存取存储器：使样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；使分析物与第二结合成员接触，其中第二结合成员特异性结合到分析物且其中第二结合成员包含与其连接的可裂解标签；去除未结合到分析物的第二结合成员，所述分析物结合到第一结合成员；裂解附着于结合到分析物的第二结合成员的标记物，所述分析物结合到第一结合成员；使标签移位通过或跨过层中的纳米孔；确定移位通过所述层的标签数；基于移位通过所述层的标签数或以固定间隔时间移位已知数量的标签的时间来测量样品中的分析物。如在本文中所提及，可使用控制装置的处理器来执行分析物分析方法。举例来说，装置可编程以进行如本文所公开的分析物分析，包括如本文所公开的任何任选的混合、孵育和洗涤步骤。外壳可进一步包括用于执行存储在存储器中的指令的处理器。本文中所描述的装置可包括用于处理来自纳米孔装置或模块的电信号的数据获取模块(DAQ)。在某些情况下，还可包括用于处理电信号并实现最优信噪比的膜片钳放大器。
在某些情况下，本文中所描述的装置可结合用于自动进行分析物分析方法中的至少一些步骤的系统。这类系统的实例展示于图9中。示范性系统包括处理组件60，所述处理组件包括具有处理器和存储器的数据处理单元63，所述数据处理单元可操作地耦接到显示器61；和与本公开的装置68的接收器/传输器单位69通信64的传输器/接收器单元62。装置68由执行指令(程序步骤)的处理组件60控制以进行本文公开的分析物分析方法中的至少一些步骤。在某些情况下，处理组件60可为计算机，具有用于插入集成装置的开口(所述开口可为大小和形状设定成容纳装置且可操作地连接到装置的凹槽)的仪表，或其组合。处理组件60与装置68之间的通信64可为有线或无线的。装置68可为本文中所描述的具有微流体66和纳米孔67功能的任何装置。在某些情况下，本文公开的装置中的液滴移动可如美国专利第6,294,063号中公开来程序化，其以全文引用的方式并入本文中。
结合本文中的实施例描述的各种说明性方法可以使用以下来实施或进行：通用处理器、数字信号处理器(Digital Signal Processor；DSP)、专用集成电路(applicationspecific integrated circuit；ASIC)、场可编程门阵列(field programmable gatearray；FPGA)或其它可编程逻辑装置、离散门或晶体管逻辑、离散硬件组件或其设计成执行本文中所描述的功能的任何组合。通用处理器可为微处理器，但在替代方案中，处理器可为任何的常规处理器、控制器、微控制器或状态机。处理器可为还具有与用户界面通信的用户界面端口的计算机系统的部分，且所述处理器接收由用户输入的命令，具有存储电子信息的至少一个存储器(例如，硬盘驱动器或其它相当的存储器，和随机存取存储器)，所述电子信息包括在处理器的控制下操作且经由用户界面端口通信的程序，和经由任何类别的视频输出格式产生其输出的视频输出，例如VGA、DVI、HDMI、DisplayPort或任何其它形式。
处理器还可实施为计算装置的组合，例如，DSP与微处理器的组合、多个微处理器的组合、一个或多个微处理器与DSP核心结合，或任何其它此类配置。这些装置还可用以选择如本文所描述的装置的值。摄像机可为基于光电管、光电二极管、有源像素传感器传感器(CMOS)、CCD、光敏电阻、光伏打电池或其它数字图像捕获技术的摄像机。
结合本文中所公开的实施例描述的方法或算法的步骤可直接体现于硬件、由处理器执行的软件模块或两个的组合中。软件模块可驻存在随机存取存储器(RAM)、快闪存储器、只读存储器(ROM)、电可编程ROM(EPROM)、电可擦除可编程ROM(EEPROM)、寄存器、硬盘、可移除式磁盘、CD-ROM、云端或所属领域中已知的任何其它形式的存储媒体中。示范性存储媒体耦接到处理器，使得处理器可从存储媒体读取信息和将信息写入到存储媒体。在替代例中，存储媒体可与处理器成整体。处理器和存储媒体可驻存在ASIC中。ASIC可驻存在用户终端中。在替代例中，处理器和存储媒体可作为离散组件驻存在用户终端中。
在一个或多个实例实施例中，所描述的功能可以在硬件、软件、固件或其任何组合中实施。如果在软件中实施，那么功能可作为一个或多个指令、代码或其它信息存储于计算机可读媒体上，在其上传输或产生分析/计算数据输出。计算机可读媒体包含计算机存储媒体与包含促进计算机程序从一处传送到另一处的任何媒体的通信媒体两者。存储媒体可为可由计算机接入的任何可用非暂时性媒体。借助于实例，这类计算机可读媒体可包括RAM、ROM、EEPROM、CD-ROM或其它光盘存储器、磁盘存储器或其它磁性存储装置，或可用于携带或存储呈计算机可存取的指令或数据结构形式的所需程序代码的任何其它媒体。存储器存储装置还可为旋转磁性硬盘驱动器、光碟驱动器或基于快闪存储器的存储驱动器或其它这类的固态、磁性或光学存储装置。如本文所使用的磁盘及光盘包括压缩光盘(CD)、激光光盘、光学光盘、数字多功能光盘(DVD)、软磁盘及蓝光光盘，其中磁盘通常是以磁性方式再现数据，而光盘是用激光以光学方式再现数据。以上各项的组合也应包括在计算机可读媒体的范围内。
如果本文中所公开的实施例包括以下或结合以下来操作：存储器、存储装置和/或计算机可读媒体，那么所述存储器、存储装置和/或计算机可读媒体为非暂时性的。因此，如果存储器、存储装置和/或电脑可读媒体被一项或多项申请专利范围涵盖，那么所述存储器、存储装置和/或电脑可读媒体仅为非暂时性的。
在某些情况下，装置可为微流体装置，如芯片上实验室装置、连续流动的微流体装置或基于液滴的微流体装置，其中分析物分析可以含有或疑似含有分析物的样品液滴中执行。可用于本发明方法中的示范性微流体装置包括WO2007136386、US8287808、WO2009111431、WO2010040227、WO2011137533、WO2013066441、WO2014062551或WO2014066704中描述的那些。在某些情况下，装置可为数字微流体装置(DMF)、基于表面声波的微流体装置(SAW)、完全集成的DMF和纳米孔装置，或完全集成的SAW和纳米孔装置。在一些实施例中，DMF元件和纳米孔元件可操作地耦接在完全集成的DMF和纳米孔装置中或SAW元件和纳米孔元件可操作地耦接在完全集成的SAW和纳米孔装置中。在一些实施例中，通过基于辊对辊的印刷电子方法(roll to roll based printed electronic method)来制造DMF装置或SAW装置。在一些实施例中，通过基于辊对辊的印刷电子方法来制造DMF元件或SAW元件。在一些实施例中，完全集成的DMF和纳米孔装置或完全集成的SAW和纳米孔装置包含微流体管道。在一些实施例中，微流体管道将DMF元件耦接到纳米孔元件，且微流体管道包含由被动力或主动力诱导的流体流动。
示范性电润湿技术可发现于US8637242中。还可使用如WO2011057197中所描述的微观尺度的电泳。示范性介电泳技术描述于US6294063中。
本公开的装置一般不含外部泵和阀且因此是制造和使用低成本的。本文中所公开的装置和相关系统以及本文中所公开的所有方法适用于如在样品源处(如护理点处(例如，在诊所、医院、医师办公室、核心实验室工厂中、家里及类似场所))分析样品的领域中应用。在一些情况下，本公开的装置或系统(例如，另外如本文中所公开的方法中所使用的)包括热源或光源，在启用所述热源或光源时，热源或光源配置成诱导将标签连接到分析物的可热裂解或可光裂解连接子的裂解，如本文所描述。
本公开还描述了结合纳米孔启用装置使用的微流体装置和集成微流体纳米孔启用装置。纳米孔启用装置是指包括可产生纳米孔的层或膜的装置。本公开的纳米孔启用装置包括由层或膜分离的两个腔室，其中两个腔室包括用于传导电流的离子液(例如，盐溶液，具有或不具有所关注分析物)。可通过在腔室中使用离子液(例如，盐溶液，具有或不具有所关注分析物)在层上施加电压来在纳米孔启用装置层中产生纳米孔。将理解，本文中所描述的(结合微流体装置使用或与微流体模块集成)纳米孔装置中的任一个可首先提供为包括其中可形成纳米孔但不含纳米孔的层的纳米孔启用装置。纳米孔可在使用期间，如在使用纳米孔以检测标签移位之前产生于纳米孔启用装置中。在某些实施例中，含有待由纳米孔检测的标签的离子液，例如盐溶液可用于产生纳米孔和用于使标签移位跨过所形成的纳米孔两者。
在一些实施例中，如上文所描述，通过在层上施加电压产生的纳米孔质量由在将基础电压施加于纳米孔层或膜上时所测量的电流中的噪声等级来评定。
在一些情况下，如上文所描述，通过在层上施加电压产生的纳米孔可调节成物理地改变纳米孔并获取所需对电渗属性，例如增大孔径和/或减少在纳米孔层或膜上施加电压时在所测量的跨过纳米孔的电流中的噪声。因此，在一些实施例中，在集成数字微流体纳米孔启用装置中产生纳米孔的方法可包括调节纳米孔。调节可包括：在纳米孔层或膜上替代地施加具有第一极性的第一电压和具有与第一极性相反的第二极性的第二电压，其中第一和第二电压各自施加至少一次；且测量与纳米孔大小相关的电渗属性。在一些情况下，在调节之前测量与纳米孔大小相关的电渗属性以获取纳米孔大小的初始估测。
电渗属性可为提供对纳米孔大小估测的任何合适的属性。在一些情况下，电渗属性由通过一系列电压(-1V到1V，例如-500mV到500mV、-250mV到250mV、-200mV到200mV、10mV到500mV、10mV到250mV、10mV到200mV，包括15mV到200mV的范围)获得的电流-电压曲线表示。在一些情况下，电渗属性为在纳米孔层或膜上测量的电导或电阻。
第一和第二电压可具有修改纳米孔并获得所需电渗属性的任何合适量值。在一些情况下，第一和第二电压具有100mV或更大，例如200mV或更大、500mV或更大、750mV或更大、1.0V或更大、2.0V或更大、3.0V或更大，包括4.0V或更大的量值，且在一些情况下，具有10V或更小，例如9.0V或更小、8.0V或更小、6.0V或更小，包括4.0V或更小的量值。在一些实施例中，第一和第二电压具有在100mV到10V，例如200mV到9.0V、250mV到9.0V、500mV到9.0V、1.0V到8.0V，包括2.0V到6.0V范围内的量值。
第一和第二电压可各自施加任何合适的时间长度以修改纳米孔并获得所需的电渗属性。在一些情况下，第一和第二电压各自施加10毫秒(ms)或更长，例如100毫秒或更长、200毫秒或更长、500毫秒或更长、1秒(s)或更长、2秒或更长，包括3秒或更长，且在一些情况下，施加10秒或更短，5秒或更短、4秒或更短、3秒或更短、2秒或更短、1秒或更短，500毫秒或更短200毫秒或更短，包括100毫秒或更短。在一些情况下，第一和第二电压各自施加在10毫秒到100毫秒、100毫秒到200毫秒、200毫秒到500毫秒、500毫秒到1秒、1秒到2秒、2秒到3秒、3秒到4秒、3秒到5秒或3秒到10秒范围内的时长。
第一和第二电压可各自施加任何合适的次数以修改纳米孔并获得所需的电渗属性。在一些情况下，第一和第二电压各自施加两次或更多次、三次或更多次、4次或更多次、5次或更多次、7次或更多次、10次或更多次、20次或更多次、30次或更多次、50次或更多次、100次或更多次、200次或更多次，包括500次或更多次，且在一些实施例中，施加10,000次或更少次，例如5,000次或更少次、1,000次或更少次、500次或更少次、400次或更少次、200次或更少次、100次或更少次，包括50次或更少次。在一些实施例中，第一和第二电压各自施加两次到50次、10到50次、30到50次、50到100次、100到200次、100到500次、500到1,000次、500到1,000次或500到10,000次。
4.纳米孔模块在DMF模块的一个侧面上的集成
本公开的一方面包括一种集成装置，其包括数字微流体(DMF)模块和位于DMF模块的一个外侧面上的纳米孔层(图40)。DMF模块的内部空间中的液滴可通过存在于DMF模块的第一(例如，顶部)或第二(例如，底部)衬底中的孔洞(也称为“开口”)或通过第一与第二衬底之间的DMF模块的一侧进入纳米孔层中的纳米孔。如上文所描述，纳米孔层可包括纳米孔膜或衬底，其在一些情况下可为可商购的透射电子显微镜(TEM)窗中的氮化硅(SiNx)膜。纳米孔层在孔洞上形成封口，在不存在纳米孔的情况下(即，在制造如本文所描述的纳米孔之前)，DMF模块中一定体积的液体与纳米孔层的外部上或周围的任何体积的液体物理地隔离。在一些情况下，纳米孔层为纳米孔模块的一部分，其中纳米孔层将纳米孔模块内的隔室与DMF模块中一定体积的液体(例如，如上文所描述的衬底的孔洞中的液滴)分离。将纳米孔层或模块密封到衬底的外表面以使得一定体积的液体(例如，衬底的孔洞中的液滴)与外部环境物理地隔离。
DMF中的液体液滴进入纳米孔层所通过的衬底中的孔洞可被定尺寸以适用于通过毛细作用使液滴移动通过所述孔洞。因此，衬底中的孔洞可为毛细管通道。孔洞可具有任何合适的横截面形状和尺寸以支持例如通过毛细作用被动地使液滴移动通过所述孔洞。在一些情况下，DMF侧面上的孔洞的直径比外侧面(即，面对纳米孔层的侧面)上的孔洞的直径更宽。在一些情况下，衬底底表面与孔洞壁之间的角度为直角或钝角(例如，90°或更大，例如95°或更大，包括100°或更大)。
集成DMF纳米孔模块装置可以包括一对电极，其可用于在纳米孔层中制造纳米孔和/或用于检测已由DMF模块加工的所关注分析物，如本文中其它处所描述。电极对可由任何合适的材料制得，包括(但不限于)氧化铟锡(ITO)。所述电极对可以任何合适的方式配置。在一些实施例中，一个电极定位于纳米孔模块中的隔室中，且第二电极定位于DMF模块中，通过物理地穿透衬底以获取纳米孔层的另一侧上的一定体积液体(图40)。
在一些实施例中，第一电极可为与DMF模块中使用的单一连续电极(例如，参考电极)相同的电极，且第二电极可安置于与第一电极所位于的底表面相反的衬底的顶表面(即，外表面)上(图43)。在这类情况下，顶表面可以与底表面类似的方式处理(例如，涂覆有电极材料，如氧化铟锡，和聚合物，如聚四氟乙烯(包括
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))。因此，在一些情况下，在第二电极为纳米孔层/模块所附着的衬底的顶表面上的电极时，纳米孔层相对于DMF模块的外表面上的一定体积的液体与第二电极电接触。用于纳米孔制造的电路径可表示为：第二电极-＞液体(外部)-＞纳米孔膜(无纳米孔)-＞液体(DMF模块内部)-＞第一电极(与DMF的单一连续电极相同)。第二电极还可不存在于纳米孔层/模块所附着的区域以便促使电流到纳米孔膜外部上的液体中，所述纳米孔膜在一些情况下可包含于纳米孔模块内。
在一些实施例中，如图44中所示，第一电极为与第一DMF模块(例如，图44中的“底部DMF芯片”)中使用的单一连续电极(例如，参考电极)相同的电极，且第二电极可由与第二DMF模块的单一连续电极缔合的相应顶部衬底中具有孔洞的第二DMF模块(例如，图44中的“顶部DMF芯片”)提供，且纳米孔层插入于对应衬底中孔洞之间的两个DMF模块之间。因此，第一和第二DMF模块可以在方向上彼此逆转以使得与第一DMF模块的单一连续电极缔合的顶部衬底邻近且面向与第二DMF模块的单一连续电极缔合的顶部衬底。两个DMF模块可相对于彼此定位以使得，在纳米孔层中存在纳米孔时，两个DMF模块通过纳米孔膜流体地且电耦接在一起。在形成纳米孔之前，两个DMF模块中的两个体积的流体可彼此隔离。在一些情况下，结构层插入于两个DMF模块之间以提供结构支撑且减少弯曲。
本文还提供一种在纳米孔启用层中，在集成DMF纳米孔模块装置中制造纳米孔的方法，如上文所描述。所述方法的实施方案可包括使用如本文所描述的任何合适方法将离子液，例如盐溶液(例如，LiCl、KCl等)定位到DMF模块中的孔洞，且允许毛细作用将液体移动通过孔洞(参见例如图40)。离子液，例如盐溶液可定位于纳米孔启用层(即，制造纳米孔之前的纳米孔膜)的另一侧上。使用任何合适的方法将纳米孔模块与DMF模块密封，如(但不限于)PDMS、压力、蜡、粘附剂等，以使得孔洞中的液体体积与纳米孔膜另一侧上的液体体积隔离。在纳米孔启用层上施加电场，如电压导致最终形成纳米孔，其可容易地检测到，例如电流迹线中的介电击穿。
在纳米孔层中产生纳米孔之后，在一些情况下，可执行调节工艺以物理地改变纳米孔且清除信号。在一些情况下，调节包括随时间推移改变施加在纳米孔上的电压。
在纳米孔制造之后，可重新启用DMF模块以完成用于移位的任何液体预处理步骤(例如，替换DMF中的溶液，如用LiCl替换KCl)。在预处理之后，DMF液体体积，例如含有所关注分析物的液体样品可定位于孔洞中。随后可停用DMF系统且可启用纳米孔模块以允许并检测移位事件。
5.方法和装置用途的改变
确定所关注分析物的存在或其在样品中存在的量的公开方法和微流体装置的用途可如上文所描述。还可鉴于分析分析物的其它方法调整所述方法和所公开微流体装置的用途。众所周知的变化形式的实例包括(但不限于)免疫测定，如夹心免疫测定(例如，单克隆-多克隆夹心免疫测定)，包括酶检测(酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)、竞争性抑制免疫测定(例如，正向和反向)、酶倍增免疫测定技术(EMIT)、竞争性结合测定、生物发光共振能量转移(BRET)、一步抗体检测测定、均相测定、非均相测定、运行捕获测定(capture on the fly assay)等)。在一些情况下，下文的描述可与上文所描述的方法重叠；在其它情况下，下文的描述可提供替代例。
a)免疫测定
所关注分析物和/或肽或其片段可使用免疫测定来分析。可使用本文中描述的抗体且检测特异性结合到所关注分析物来确定所关注分析物的存在或量。可利用任何免疫测定。免疫测定可为例如酶联免疫测定(ELISA)、竞争性抑制测定(如正向或反向竞争性抑制测定)或竞争性结合测定。在一些实施例中，一个标签附着于捕捉抗体和检测抗体。替代地，用于捕获的微颗粒或纳米颗粒还可用于检测(例如，在其以某种方式附着或缔合到可裂解连接子的情况下)。
可使用非均相格式。举例来说，在从个体获得测试样品之后，制备第一混合物。混合物含有待评定所关注分析物和第一特异性结合配偶体的测试样品，其中包含于测试样品中的第一特异性结合配偶体和任何所关注的分析物形成第一特异性结合配偶体-所关注分析物复合物。优选地，第一特异性结合配偶体为抗所关注分析物的抗体或其片段。添加测试样品和第一特异性结合配偶体以形成混合物的顺序不是关键的。优选地，第一特异性结合配偶体固定于固相上。免疫测定中所有的固相(第一特异性结合配偶体和任选的第二特异性结合配偶体)可为所属领域中已知的的任何固相，例如(但不限于)磁性颗粒、珠粒、纳米珠粒、微珠粒、纳米颗粒、微颗粒、膜、支架分子、膜、滤纸、磁盘或芯片(例如，微流体芯片)。
在形成含有第一特异性结合配偶体-所关注分析物复合物的混合物之后，使用所属领域中已知的任何技术从复合物中去除任何未结合的所关注分析物。举例来说，未结合的所关注分析物可通过洗涤来去除。然而，合乎需要地，第一特异性结合配偶体的存在里超过测试样品中存在的任何所关注分析物，以使得测试样品中存在的所有所关注分析物与第一特异性结合配偶体结合。
在去除任何未结合的所关注分析物之后，将第二特异性结合配偶体添加到混合物中以形成第一特异性结合配偶体-所关注分析物-第二特异性结合配偶体复合物。第二特异性结合配偶体优选地为结合到所关注分析物上的表位的抗所关注分析物抗体，所述表位不同于第一特异性结合配偶体所结合的所关注分析物上的表位。此外，另外优选地，第二特异性结合配偶体用可检测标记物标记或含有可检测标记物(例如，可裂解连接子附着的标签，如上文所描述)。
固定抗体或其片段的用途可并入到免疫测定中。抗体可固定于各种载体上，如磁性颗粒或色谱基质颗粒、乳胶颗粒或改质表面乳胶颗粒、聚合物或聚合物膜、塑料或塑料膜、平面衬底、微流体表面、固体衬底材料段以及类似物。
b)夹心免疫测定
夹心免疫测定测量两层抗体(即，捕捉抗体(即，至少一个捕捉抗体)与检测抗体(即至少一个检测抗体)之间的抗原量。捕捉抗体和检测抗体结合到抗原(例如，所关注分析物)上的不同表位。合乎需要地，捕捉抗体与表位的结合并不干扰检测抗体与表位的结合。单克隆或多克隆抗体可用作夹心免疫测定中的捕获和检测抗体。
一般来说，至少两个抗体用于分离并定量测试样品中的所关注分析物。更具体来说，至少两个抗体结合到所关注分析物的特定表位或所关注分析物片段，从而形成称为“夹心”的免疫复合物。一个或多个抗体可用于捕获测试样品中的所关注分析物(这些抗体常常称作一个或多个“捕获”抗体)，且另外结合所关注分析物的具有可检测标记(例如，由可裂解连接子附着的标签)的一个或多个抗体(这些抗体常常称作一个或多个“检测”抗体)可用于完成夹心。在一些实施例中，适体可用作第二结合成员且可用作可检测标签。在夹心测定中，抗体与其表位的结合适宜地不被测定中的任何其它抗体与其对应表位的结合减弱。换句话说，选择抗体以使得与疑似含有所关注分析物的测试样品接触的一个或多个第一抗体并不结合到由第二抗体或后续抗体识别的全部或部分表位，进而干扰一个或多个第二检测抗体结合到所关注分析物的能力。
在一优选实施例中，疑似含有所关注分析物的测试样品可同时或依序地与至少一个捕捉抗体(或抗体)和至少一个检测抗体接触。在夹心测定形式中，疑似含有所关注分析物(膜相关的所关注分析物、可溶的所关注分析物、膜相关的所关注分析物的片段、可溶的所关注分析物的片段、所关注分析物(膜相关或可溶的所关注分析物)的变体或其任何组合)的测试样品首先与至少一个捕捉抗体接触，所述捕捉抗体在允许形成抗体-所关注分析物复合物的条件下特异性结合到特定表位。如果使用超过一个捕捉抗体，那么形成多种捕捉抗体-所关注分析物复合物。在夹心测定中，以超过测试样品中预期的所关注分析物或所关注分析物片段的最大量的摩尔量使用抗体，优选地至少一个捕捉抗体。
任选地，在使测试样品与至少一个第一捕捉抗体接触之前，至少一个捕捉抗体可结合到固体载体，这促进抗体-所关注分析物复合物从测试样品中分离。可使用所属领域中已知的任何固体载体，包括(但不限于)由聚合材料以平面衬底或珠粒形式制成的固体载体等。一个或多个抗体可以通过吸附，通过共价结合使用化学偶合剂或通过所属领域中已知的其它方式结合到固体载体，前提是这类结合不干扰抗体结合所关注分析物或所关注分析物片段的能力。此外，必要时，固体载体可衍生以允许与抗体上的不同官能基具有反应性。这类衍生化需要使用某些偶合剂，例如(但不限于)顺丁烯二酸酐、N-羟基丁二酰亚胺、叠氮基、炔基和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺。
在使疑似含有所关注分析物的测试样品与至少一个捕捉抗体接触之后，孵育测试样品以允许形成一个或多个捕捉抗体-所关注分析物复合物。可在约4.5到约10.0的pH下、在约2℃到约45℃的温度下执行孵育并持续至少约一(1)分钟到约十八(18)小时、约2-6分钟或约3-4分钟的时间段。
在形成一个或多个捕捉抗体-所关注分析物复合物之后，复合物随后与至少一个检测抗体(在允许形成一个或多个捕捉抗体-所关注分析物-一个或多个检测抗体复合物的条件下)接触。如果捕捉抗体-所关注分析物复合物与超过一个检测抗体接触，那么形成一个或多个捕捉抗体-所关注分析物-一个或多个检测抗体检测复合物。如同捕捉抗体一样，当至少一个检测(和后续)抗体与捕捉抗体-所关注分析物复合物接触时，需要在类似于上文所描述的那些条件下孵育一段时间以形成一个或多个捕捉抗体-所关注分析物-一个或多个检测抗体复合物。优选地，至少一个检测抗体含有可检测标记物(例如，由可裂解连接子附着的标签)。在形成一个或多个捕捉抗体-所关注分析物-一个或多个检测抗体复合物之前、同时或之后，可检测标记物可结合到至少一个检测抗体。可使用所属领域中已知的任何可检测标记物，例如，如本文所论述的可裂解连接子和所属领域中已知的其它。
添加测试样品和特异性结合配偶体以形成用于测定的混合物的顺序不是关键的。如果第一特异性结合配偶体是可检测标记的(例如，与可裂解连接子附接的标签)，那么形成可检测标记的第一特异性结合配偶体-所关注分析物复合物。替代地，如果使用第二特异性结合配偶体且第二特异性结合配偶体是可检测标记的(例如，与可裂解连接子附接的标签)，那么形成第一特异性结合配偶体-所关注分析物-第二特异性结合配偶体的可检测标记复合物。任何未结合的特异性结合配偶体(无论是经标记的或未标记的)可使用所属领域中已知的任何技术，如洗涤从混合物中去除。
接着，产生指示所关注分析物或其片段存在的信号。基于所产生的信号参数，可定量样品中的所关注分析物的量。任选地，可使用所关注分析物的已知浓度的连续稀释液或溶液，通过质谱法、重力法和所属领域中已知的其它技术来产生标准曲线。
c)正向竞争性抑制
在正向竞争性形式中，使用已知的浓度的经标记所关注分析物的等分试样(例如，具有与可裂解连接子附接的标签的分析物)以与测试样品中的所关注分析物竞争以结合到所关注分析物抗体。
在正向竞争测定中，固定的特异性结合配偶体(如抗体)可以序地或同时与测试样品和经标记的所关注分析物、所关注分析物片段或其所关注分析物变体接触。所关注分析物肽、所关注分析物片段或所关注分析物变体可用任何可检测标记，包括由与可裂解连接子附接的标签构成的可检测标记标记。在这个测定中，抗体可固定于固体载体上。替代地，抗体可耦接到已固定于固体载体(如微颗粒或平面衬底)上的抗体，如抗物种抗体。
本文提供用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法。所述方法包含使样品与结合成员接触，其中结合成员固定于固体载体上且其中结合成员特异性结合到分析物；使可能含有结合到结合成员的分析物的样品与经标记分析物接触，其中经标记分析物用可裂解标签标记；去除未结合到结合成员的经标记分析物；裂解附着于经标记分析物的标签，所述经标记分析物结合到结合成员；使经裂解裂解移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；和评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了在样品中存在的分析物量，或检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。在一些实施例中，对测量移位通过所述层的标签进行评定，其中移位通过所述层的标签数测量了样品中存在的分析物量。在一些实施例中，对检测移位通过所述层的标签进行评定，其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
本文提供用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法。所述方法包含使样品与结合成员接触，其中结合成员固定于固体载体上且其中结合成员特异性结合到分析物；使可能含有结合到结合成员的分析物的样品与经标记分析物接触，其中经标记分析物包含适体；去除未结合到结合成员的经标记分析物；解离结合到经标记分析物的适体，所述经标记分析物结合到结合成员；和使经解离适体移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；和评定移位通过所述层的适体，其中测量移位通过所述层的适体数量测量了样品中存在的分析物量，或检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中。在一些实施例中，对测量移位通过所述层的适体进行评定，其中移位通过所述层的适体数量测量了样品中存在的分析物量。在一些实施例中，对检测移位通过所述层的适体进行评定，其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
在类似于上文所描述的那些条件下结合夹心测定形式孵育经标记的所关注分析物、测试样品和抗体。随后可产生抗体-所关注分析物复合物的两种不同物质。具体来说，所产生的抗体-所关注分析物复合物中的一种含有可检测标记物(例如，标签)而另一抗体-所关注分析物复合物不含可检测标记物。在量化可检测标记之前，抗体-所关注分析物复合物可以(但不必须)从测试样品的剩余部分中分离。不管抗体-所关注分析物复合物是否从测试样品的剩余部分中分离，但随后量化抗体-所关注分析物复合物中可检测标记的量。随后可例如如上文所描述来确定测试样品中所关注分析物(如膜相关的所关注分析物、可溶性所关注分析物、可溶性所关注分析物的片段、所关注分析物的变体(膜相关或可溶性的所关注分析物)或其任何组合)的浓度。如果有帮助，可通过将抗体-所关注分析物复合物中可检测标记的量与标准曲线进行比较来完成确定。标准曲线可以使用已知浓度的所关注分析物(如膜相关的所关注分析物、可溶性所关注分析物、可溶性所关注分析物的片段、所关注分析物(膜相关或可溶性的所关注分析物)的变体或其任何组合)的连续稀释液来产生，其中通过质谱法、重力方式和通过所属领域中已知的其它技术来确定浓度。
任选地，抗体-所关注分析物复合物可通过结合夹心测定形式将抗体结合到固体载体(如上文所论述的固体载体)且随后去除测试样品的剩余部分以以避免与固体载体接触来从测试样品中分离。
d)反向竞争测定
在反向竞争测定中，固定的所关注分析物可依序地或同时与测试样品和至少一个经标记抗体接触。
本文提供用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法。所述方法包括使样品与结合成员接触，其中结合成员特异性结合到分析物，且结合成员用可裂解标签标记；使可能含有结合到结合成员的分析物的样品与经固定分析物接触，其中经固定分析物固定于固体载体上；去除未结合到经固定分析物的结合成员；裂解附着于结合成员的标签，所述结合成员结合到经固定分析物；使经裂解标签移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；和评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了在样品中存在的分析物量，或检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。在一些实施例中，对测量移位通过所述层的标签进行评定，其中移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量。在一些实施例中，对检测移位通过所述层的标签进行评定，其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
本文提供用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法。所述方法包括使样品与结合成员接触，其中结合成员特异性结合到分析物且结合成员包含适体；使可能含有结合到结合成员的分析物的样品与经固定分析物接触，其中经固定分析物固定于固体载体上；去除未结合到经固定分析物的结合成员；解离结合到结合成员的适体，所述结合成员结合到经固定分析物；和使经解离适体移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；和评定移位通过所述层的适体，其中测量移位通过所述层的适体数测量了样品中存在的分析物量，或检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中。在一些实施例中，对测量移位通过所述层的适体进行评定，其中移位通过所述层的适体数测量了样品中存在的分析物量。在一些实施例中，对检测移位通过所述层的适体进行评定，其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
所关注分析物可结合夹心测定形式结合到固体载体，如上文所论述的固体载体。
固定的所关注分析物、测试样品和至少一个标记抗体在类似于上文所描述的那些条件下结合夹心测定形式孵育。随后产生两种不同物种的所关注分析物-抗体复合物。具体来说，所产生的所关注分析物-抗体复合物中的一个被固定且含有可检测标记物(例如，与可裂解连接子附接的标签)而另一所关注分析物-抗体复合物不固定且含有可检测标记物。通过所属领域中已知的技术，如洗涤将未固定的所关注分析物-抗体复合物和测试样品的剩余部分从固定的所关注分析物-抗体复合物的存在中去除。在去除未固定的所关注分析物抗体复合物之后，随后在裂解标签之后量化固定的所关注分析物-抗体复合物中的可检测标记的量。测试样品中所关注分析物的浓度可随后通过比较如上文所描述的可检测标记的量来确定。如果有帮助，这可使用标准曲线来完成。可使用已知浓度的所关注分析物或所关注分析物片段的连续稀释液来产生标准曲线，其中通过质谱法、重力分析和所属领域中已知的其它技术来确定浓度。
e)一步免疫测定或运行捕获测定
在一步免疫测定或运行捕获测定中，固体衬底预涂覆有固定剂。将捕获剂、分析物和检测剂一起添加到固体衬底中，接着在检测之前进行洗涤步骤。捕获剂可结合分析物且包含固定剂的配位体。捕获剂和检测剂可为如本文所描述或所属领域中已知的抗体或能够捕获或检测的任何其它部分。配位体可包含肽标签且固定剂可包含抗肽标签抗体。替代地，配位体和固定剂可为能够结合在一起的任何试剂对以便用于运行捕获测定中(例如，特异性结合对和如所属领域中已知的其它试剂对)。可测量超过一个分析物。在一些实施例中，固体衬底可以涂覆有抗原且待分析的分析物为抗体。
在一些实施例中，使用预涂覆有固定剂(如生物素、抗生蛋白链菌素等)的固体载体(如微颗粒)和至少一种第一特异性结合成员和第二特异性结合成员(其分别充当捕获剂和检测剂)。第一特异性结合成员包含用于固定剂的配位体(例如，如果固体载体上的固定剂为抗生蛋白链菌素，那么第一特异性结合成员上的配位体可为生物素)且还结合到所关注分析物。第二特异性结合成员包含可检测标记物且结合到所关注分析物。可将固体载体和第一特异性结合成员和第二特异性结合成员添加到测试样品中(依序地或同时地)。第一特异性结合成员上的配位体结合到固体载体上的固定剂以形成固体载体/第一特异性结合成员复合物。样品中存在的任何所关注分析物结合到固体载体/第一特异性结合成员复合物以形成固体载体/第一特异性结合成员/分析物复合物。第二特异性结合成员结合到固体载体/第一特异性结合成员/分析物复合物且检测到可检测标记。可以在检测之前采用任选的洗涤步骤。在某些实施例中，在一步测定中可测量超过一个分析物。在某些其它实施例中，可采用超过两个特异性结合成员。在某些其它实施例中，可添加多个可检测标记物。在某些其它实施例中，可检测多个所关注分析物。
可以如本文所描述且所属领域中已知的各种形式完成一步免疫测定或运行捕获测定的使用。举例来说，形式可为如上文所描述的夹心测定，但替代地可为竞争测定，可采用单一特异性结合成员或使用如已知的其它变化形式。
f)组合测定(用Ag/Ab共涂覆微颗粒)
在组合测定中，固体衬底(如微颗粒)共涂覆有抗原和抗体以从样品中分别捕获抗体和抗原。固体载体可共涂覆有两种或更多种不同的抗原以从样品中捕获两种或更多种不同的抗体。固体载体可共涂覆有两种或更多种不同的抗体以从样品中捕获两种或更多种不同的抗原。
另外，本文所描述的方法可使用阻断剂以预防测定化合物之间的特异性或非特异性结合反应(例如，HAMA问题)。在试剂(和任选地，任何对照)固定于载体上之后，可在载体上阻断试剂的其余结合位点。可使用所属领域的一般技术人员已知的任何合适的阻断剂。举例来说，可采用牛血清白蛋白(“BSA”)、酪蛋白于PBS中的磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)溶液、Tween20TM(西格玛化学公司(Sigma Chemical Company)，圣路易斯，密西根州(St.Louis,Mo.))，或其它合适的界面活性剂以及其它阻断剂。
如从本公开显而易见，本文中所公开的方法和装置(包括变化形式)可用于诊断疑似患有疾病、病症或病况的个体的疾病、病症或病况。举例来说，样品分析可适用于检测疾病标记物(如癌症标记物、心脏病标记物)、毒素、病原体(如病毒、细菌或其部分)。方法和装置还可用于测量生物样品中存在的分析物。方法和装置还可用于血液筛检测定中以检测目标分析物。血液筛检测定可用于筛检血液供应源。
6.计数和数据分析
移位事件的数量可使用所属领域中已知的任何程序技术来定性或定量地确定。在一些实施例中，移位事件的数量可通过使用以下等式首先计算在实验性测试条件下在双链DNA移位事件中发现的预见电流变化来确定：
Figure BDA0002017627730001181
如参考Kwok等人，“由受控的介电击穿制造纳米孔”补充信息第8段和Kwok,H.；Briggs,K.；和Tabard-Cossa,V.；“由受控的介电击穿制造纳米孔”-《科学公共图书馆综合卷》9(3):e92880(2014)中。使用这个预见的电流阻塞值，可视觉地或人工地扫描实验纳米孔输出的二进制文件数据以得到可接受的预见电流阻塞事件。使用这些事件，可以应用和执行CUSUM纳米孔软件所需要的阈值和滞后参数。可以使用cusumtools readevents.py软件且过滤大于1000pA(如由第一计算值确定)的阻塞事件进一步分析由这个软件得到的输出。可以由readevents.py分析工具确定通量事件、事件之间的时间和其它计算。可以使用JMP软件(SAS研究所(SAS Institute)，凯里，北卡罗莱纳州(Cary，North Carolina))对CUSUM产生的数据进行其它计算。可以使用所属领域中已知的针对数据分析进行阈值设置的其它方法。
7.定性分析
可使用如本文所描述的方法和步骤工艺进行定性测定。可使用如实例17中描述的可裂解连接子偶联物，在如图25所示的基于硫醇的裂解步骤下进行直接分析。应了解实施这类测定的其它可裂解连接子方式还可以包括(但不限于)裂解连接子以便允许计数如本文所描述的不同标签的各种其它方法。另外，可采用适体。举例来说，除了实例17中描述的方法之外，这类其它替代性裂解方法和/或试剂可包括实例16、实例18、实例19、实例20和实例21中描述的那些，以及本文中所描述且所属领域的技术人员已知的其它裂解方法。还应理解虽然在这个实例(实例24)中证实的测定形式代表直接测定，但如夹心免疫测定形式和/或各种竞争性测定形式且包括如所属领域的技术人员已知的运行捕获形式的其它形式可以良好实施以使用所描述的方法进行测定。
举例来说，如实例9中所描述的用于检测TSH(促甲状腺激素)的夹心免疫测定形式证实了在低成本DMF芯片上实施这类测定的能力。另外，可使用各种异双官能可裂解连接子(如实例1、实例2、实例3、实例4、实例5和实例6中所描述的那些)以及所属领域的技术人员以其它方式已知的其它可裂解连接子合成适用于产生具有可裂解连接子的免疫偶联物或其它活性特异性结合成员的多种不同的生物偶联试剂。可通过如实例3、实例4、实例5和实例6中的描述的那些方法以及通过所属领域的技术人员已知的其它方法来合成适用于本发明的实践的免疫偶联物。另外，实例8示出了各种流体液滴在低成本芯片上操纵的功能性，其可促进实施各种测定形式所需要的各种步骤，所述测定形式包括夹心和竞争性测定形式，且包括运行捕获形式，以及其所属领域的技术人员已知的其它变化形式。实例11示出了在分析中可用于计数可裂解标记物的纳米孔制造，但应了解所属领域的技术人员已知的其它纳米孔制造方法也可以用于这个目的。实例16也代表了适用于实施进行裂解的测定的其它构建体，由此导致可计数的标记物释放以便使用如这个实例内所描述的纳米孔计数法来计数。对所属领域的技术人员显而易见的这类构建体和其它构建体可用于如本文所描述的测定中。
实例22示出了一般可完成如何计数以便能够测量与穿越纳米孔的各种标记物的存在相关的移位事件。图29示出了信号的阈值处理概念以便能够操控计数测定中数据的质量。图28示出了可用于使用如这个实例内所描述的这类测定方法确定分析物的存在的表示数据类型的定性分析数据。还应理解虽然dsDNA用作这个特定实例中的标记物，但还可使用其它标记物，如实例5和/或实例22中描述的标记物，包括(但不限于)纳米珠粒、树枝状聚合物以及类似物。此外，还可采用其它已知的标记物。可通过在本申请案中所描述的各种实例，或通过所属领域的技术人员已知的方法以其它方式合成按需要以产生适当反应剂的这类构建体。
8.定量分析
可使用如本文所描述的方法和步骤程序进行定量分析。可使用如实例17中描述的可裂解连接子偶联物，在如图25所示的基于硫醇的裂解步骤下进行直接测定。应了解实施这类测定的其它可裂解连接子方式还可包括(但不限于)裂解连接子以便允许使用如本文所描述的纳米孔计数不同标签的各种其它方法。另外，可采用适体。举例来说，除了实例17中描述的方法之外，这类其它裂解方法可包括(但不限于)实例18、实例19、实例20和实例21中描述的那些，以及本文中所描述且所属领域的技术人员已知的其它方法。还应理解虽然在这个实例(实例25)中证实的测定形式代表直接测定，但如夹心免疫测定形式和/或各种竞争性测定形式且包括如所属领域的技术人员已知的运行捕获形式的其它形式可以良好实施以进行测定。
举例来说，如实例9中所描述的用于检测TSH(促甲状腺激素)的夹心免疫测定形式证实了在低成本DMF芯片上实施这类测定的能力。另外，可使用由如实例1、实例2、实例3、实例4、实例5和实例6中所描述的那些方法合成的各种异双官能可裂解连接子和偶联物，以及可由所属领域的技术人员已知的方法合成的其它可裂解连接子或偶联物由所属领域的技术人员合成适用于产生具有可裂解连接子的免疫偶联物或其它活性特异性结合成员的多种不同的生物偶联试剂。另外，实例8示出了各种流体液滴在低成本芯片上操纵的功能性，其可促进执行各种测定形式所需要的各种步骤，所述测定形式包括夹心和竞争性测定形式，且包括运行捕获形式，以及其所属领域的技术人员已知的其它变化形式。实例16也代表适用于实施进行裂解的测定的其它构建体，由此导致可计数的标记物释放以便使用如这个实例内所描述的纳米孔计数法来计数。对所属领域的技术人员显而易见的这类构建体以及其它构建体可用于如本文所描述的测定中。
实例22示出了一般可进行如何计数以便能够测量与穿越纳米孔的各种标记物的存在相关的移位事件。图29示出了信号的阈值处理概念以便能够操控计数测定中数据的质量。图31、图32和图33示出了可用于使用如这个实例内所描述的这类测定方法确定分析物的量的表示数据类型的定量测定数据。图34示出了由已使用化学法裂解的构建体产生的标准曲线。还应理解虽然dsDNA用作这个特定实例中的标记物，但还可使用其它标记物，如实例5中描述的标记物，包括(但不限于)纳米珠粒、树枝状聚合物等。此外，还可采用其它已知的标记物。可如本文中所描述或经由所属领域的技术人员已知的方法合成按需要以产生适当试剂的这类构建体。
9.试剂盒和料筒
本文还提供了在具有或不具有所公开装置的情况下用于进行上文所描述的方法的试剂盒。试剂盒可包括用所公开的装置分析分析物的说明书。试剂盒中包括的说明书可粘附到包装材料或可包括为包装插页。说明书可为书写或打印的材料，但不限于这类材料。本公开涵盖能够存储这类说明书并且将它们传达给最终用户的任何媒体。这类媒体包括(但不限于)电子存储媒体(例如，磁性光盘、磁带、料筒、芯片)、光学媒体(例如，CD ROM)以及类似物。如本文中所使用，“说明书”可包括提供所述说明书的因特网网点的地址。
试剂盒可包括如上文所描述的包括微流体模块及内置式纳米孔模块的料筒。在一些实施例中，微流体模块和纳米孔模块可为一起可逆集成的单独的组件或可完全地或不可逆地集成在料筒中。料筒可为一次性的。料筒可包括适用于实践上文公开方法的一种或多种试剂。料筒可包括一个或多个容纳试剂的容器，作为一种或多种单独组合物或任选地，作为试剂的兼容性将允许的掺合物。料筒还可包括用户角度适宜的其它材料，如缓冲液、稀释剂、标准物(例如，校验仪和对照物)，和/或适用于样品处理、洗涤或进行分析的任何其它步骤的任何其它材料。料筒可包括上文所描述的特异性结合成员中的一个或多个。
替代地或另外地，试剂盒可包含校验仪或对照物，例如纯化的，和任选地冻干的所关注分析物或在料筒上呈液体、凝胶或其它形式或单独地，和/或与上文所描述的装置和方法一起使用的至少一个容器(例如，管、微量滴定板或条)，和/或缓冲液，如测定缓冲液或洗涤缓冲液，且中的任一种可提供为浓缩溶液。在一些实施例中，试剂盒包含执行测定所必需的所有组分，即，试剂、标准剂、缓冲剂、稀释剂等。说明书还可包含用于生成标准曲线的说明书。
试剂盒可进一步包含用于量化所关注分析物的参考标准。参考标准可用于建立用于内插和/或外推所关注分析物浓度的标准曲线。试剂盒可包括在浓度水平方面不同的参考标准。举例来说，试剂盒可包括具有高浓度水平、中等浓度水平或低浓度水平的一种或多种参考标准。在参考标准的浓度范围方面，这可根据分析来优化。参考标准的示范性浓度范围包括(但不限于)例如：约10fg/mL、约20fg/mL、约50fg/mL、约75fg/mL、约100fg/mL、约150fg/mL、约200fg/mL、约250fg/mL、约500fg/mL、约750fg/mL、约1000fg/mL、约10pg/mL、约20pg/mL、约50pg/mL、约75pg/mL、约100pg/mL、约150pg/mL、约200pg/mL、约250pg/mL、约500pg/mL、约750pg/mL、约1ng/mL、约5ng/mL、约10ng/mL、约12.5ng/mL、约15ng/mL、约20ng/mL、约25ng/mL、约40ng/mL、约45ng/mL、约50ng/mL、约55ng/mL、约60ng/mL、约75ng/mL、约80ng/mL、约85ng/mL、约90ng/mL、约95ng/mL、约100ng/mL、约125ng/mL、约150ng/mL、约165ng/mL、约175ng/mL、约200ng/mL、约225ng/mL、约250ng/mL、约275ng/mL、约300ng/mL、约400ng/mL、约425ng/mL、约450ng/mL、约465ng/mL、约475ng/mL、约500ng/mL、约525ng/mL、约550ng/mL、约575ng/mL、约600ng/mL、约700ng/mL、约725ng/mL、约750ng/mL、约765ng/mL、约775ng/mL、约800ng/mL、约825ng/mL、约850ng/mL、约875ng/mL、约900ng/mL、约925ng/mL、约950ng/mL、约975ng/mL、约1000ng/mL、约2μg/mL、约3μg/mL、约4μg/mL、约5μg/mL、约6μg/mL、约7μg/mL、约8μg/mL、约9μg/mL、约10μg/mL、约20μg/mL、约30μg/mL、约40μg/mL、约50μg/mL、约60μg/mL、约70μg/mL、约80μg/mL、约90μg/mL、约100μg/mL、约200μg/mL、约300μg/mL、约400μg/mL、约500μg/mL、约600μg/mL、约700μg/mL、约800μg/mL、约900μg/mL、约1000μg/mL、约2000μg/mL、约3000μg/mL、约4000μg/mL、约5000μg/mL、约6000μg/mL、约7000μg/mL、约8000μg/mL、约9000μg/mL或约10000μg/mL。
试剂盒中提供的任何特异性结合成员可并入有标签或标记物，如荧光团、酶、适体、树枝状聚合物、珠粒、纳米颗粒、微颗粒、聚合物、蛋白质、生物素/抗生物素蛋白标记物或类似物，或试剂盒可包括用于标记特异性结合成员的试剂或用于检测特异性结合成员和/或标记分析物的试剂或用于检测分析物的试剂。如果需要，试剂盒可含有一种或多种不同的标签或标记物。试剂盒还可包括诱发裂解的组分，如裂解介导剂。举例来说，裂解调节剂可包括还原剂，如二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧基乙基)膦(TCEP)。特异性结合成员、校验仪和/或对照可提供于单独的容器中或预分配到适当的测定格式或料筒中。可以使用所公开的装置来检测标签。
试剂盒可包括一种或多种特异性结合成员，例如以在多路复用测定中检测样品中的一种或多种目标分析物。试剂盒中不同类型的特异性结合成员的数量可根据试剂盒的既定用途广泛地变化。试剂盒中特异性结合成员的数量可介于1到约10，或更高的范围内。举例来说，试剂盒可包括1到10个特异性结合成员、1到9个特异性结合成员、1到8个特异性结合成员、1到7个特异性结合成员、1到6个特异性结合成员、1到5个特异性结合成员、1到4个特异性结合成员、1到3个特异性结合成员、1到2个特异性结合成员、2到10个特异性结合成员、2到9个特异性结合成员、2到8个特异性结合成员、2到7个特异性结合成员、2到6个特异性结合成员、2到5个特异性结合成员、2到4个特异性结合成员、3到10个特异性结合成员、3到9个特异性结合成员、3到8个特异性结合成员、3到7个特异性结合成员、3到6个特异性结合成员、3到5个特异性结合成员、3到4个特异性结合成员、4到10个特异性结合成员、4到9个特异性结合成员、4到8个特异性结合成员、4到7个特异性结合成员、4到6个特异性结合成员、5到10个特异性结合成员、5到9个特异性结合成员、5到8个特异性结合成员、5到7个特异性结合成员、5到6个特异性结合成员、6到10个特异性结合成员、6到9个特异性结合成员、6到8个特异性结合成员、6到7个特异性结合成员、7到10个特异性结合成员、7到9个特异性结合成员、7到8个特异性结合成员、8到10个特异性结合成员、8到9个特异性结合成员，或9到10个特异性结合成员。一种或多种特异性结合成员中的每一个可结合到不同的目标分析物且每一个特异性结合成员可用不同的标签和/或适体标记。举例来说，试剂盒可以包括结合到第一目标分析物的第一特异性结合成员、结合到第二目标分析物的第二特异性结合成员、结合到第三目标分析物的第三特异性结合成员等，且第一特异性结合成员用第一标签和/或适体标记，第二特异性结合成员用第二标签和/或适体标记，第三特异性结合成员用第三标签和/或适体标记等。除了一种或多种特异性结合成员之外，试剂盒可进一步包含一种或多种额外的测定组分，如合适的缓冲液介质以及类似物。试剂盒还可包括用于检测且测量标签和/或适体的装置，如上文所描述的那些。最后，试剂盒可包含在根据本发明的分析物检测方法中使用特异性结合成员的说明书，其中这些使用说明书可以呈现在试剂盒包装上和/或包装插页上。
任选地，试剂盒包括质量控制组件(例如敏感性板、校验仪和阳性对照)。质量控制试剂的制备为所属领域中已知的且描述于各种免疫诊断产品的插页上。敏感性板构件任选地用于建立测定性能特征，且进一步任选为试剂盒试剂的完整性和测定标准化的有用指示器。
试剂盒还可任选地包括实施诊断测定或促进质量控制评估所需要的其它试剂，如缓冲剂、盐类、酶、酶辅因子、底物、检测试剂以及类似物。其它组分，如缓冲剂和用于分离和/或处理测试样品的溶液(例如，预处理试剂)还可包括于试剂盒中。试剂盒可另外包括一个或多个其它对照。试剂盒中的一种或多种组分可以冻干，在此情况下，试剂盒还可包含适用于复原冻干组分的试剂。组分中的一种或多种可以呈液体形式。
试剂盒中的各种组分按需要任选地提供于合适的容器中。试剂盒进一步可包括用于容纳或存储样品的容器(例如，用于尿液、唾液、血浆、脑脊髓液或血清样品的容器或料筒，或用于存储、运输或处理组织以便产生组织抽吸物的适当容器)。适当时，试剂盒任选地还可含有反应容器、混合容器和促进制备试剂或测试样品的其它组件。试剂盒还可包括用于辅助获得测试样品的一个或多个样品收集/获取仪器，如各种血液收集/转移装置，如微采样装置、微针状物或其它无痛微创血液收集方法；血液收集管；刺血针；毛细血液收集管；其它单指尖-刺血收集方法；口腔拭子、经鼻/喉拭子；16号或其它大小的针、用于穿刺活检的圆形刀片(例如，1-8mm或其它适当大小)、手术刀或激光器(例如，具体地说手持式)、注射器、无菌容器或用于获得、存储或抽吸组织样品的插管；或类似物。试剂盒可包括用于辅助关节抽吸、锥形活检、穿孔活检、细针抽吸活检、图像引导式经皮针抽吸活检、支气管肺泡灌洗、内窥镜活检和腹腔镜活检的一个或多个仪器。
如果标签或可检测标记物是或包括至少一种吖锭化合物，那么试剂盒可包含至少一种吖锭-9-甲酰胺、至少一种吖锭-9-甲酸酯芳基酯或其任何组合。如果标签或可检测标记物是或包括至少一种吖锭化合物，那么试剂盒还可包含过氧化氢源，如缓冲液，溶液和/或至少一种碱性溶液。如果需要，试剂盒可以含有固相，如磁性颗粒、珠粒、膜、支架分子、膜、滤纸、磁盘或芯片。
如果需要，试剂盒可进一步包含单独的或与说明书进一步组合的一种或更多种组分用于测定测试样品的其它分析物，其可为生物标记，如疾病病况或病症的生物标记，如感染性疾病、心脏疾病、代谢疾病、甲状腺疾病等。
本发明具有多个方面，通过本文中所提供的非限制性实例示出。
集成DMF-电化学/电学/光学检测芯片、装置和系统
如前述文段中所提到，公开一种配置成操作分析物检测芯片以制备样品且检测来自所述分析物检测芯片中的所制备样品的分析物相关信号的分析物检测装置。分析物检测芯片可以包括数字微流体(DMF)区和可以与DMF区重叠或可以在空间上从DMF区中分离的分析物检测区。如前述文段中所描述，DM区域和纳米孔区可分离成可操作地连接或可集成到单个料筒中的单独装置。本文还提供一种在部分或完全集成装置的DMF区和纳米孔区上操作以影响液滴的移动并检测来自纳米孔的电信号的仪器。这个仪器详细地描述于前述文段中。这个仪器可进一步包括用于操作不同类型的分析物检测装置的组件，所述装置可为用于进行临床化学的料筒。
在某些情况下，临床化学可涉及检测由酶对衬底的作用所产生的电化学物质或显色反应产物。举例来说，衬底可为样品中存在的分析物且酶可对分析物具有特异性且可催化地与分析物反应以产生电化学物质或有色反应产物。在其它情况下，临床化学可涉及使用第一结合成员捕获分析物以产生包含分析物和第一结合成员的第一复合物；使所述复合物与结合到分析物的第二结合成员接触，以产生包含分析物、第一结合成员和第二结合成员的第二复合物。第二结合成员在暴露于合适底物之后偶联到产生电化学物质或显色反应产物的酶。
在某些实施例中，用于进行临床化学的料筒的分析物检测区可包括用于检测在分析物存在于样品中时所产生的电化学物质的电极。这类料筒本文中还称为DMF电化学芯片。在其它实施例中，用于进行临床化学的料筒的分析物检测区可配置成用于检测在分析物存在于样品中时所产生的光信号。这类料筒在本文中还称为DMF光学芯片。应注意用于进行临床化学的料筒可以称为DMF电化学芯片。
在又其它实施例中，料筒可为配置成进行电化学检测和使用纳米孔层检测的多功能性。因此，本文中所公开的仪器可以在多个单功能料筒上以及多功能料筒上操作。
DMF区可用于将分析用液滴转移到检测区，其中液滴将进行电力地(例如，纳米孔)、电化学地(例如，使用临床化学)和/或光学地(例如，使用临床化学)分析。光学检测可为色度检测、浊度检测、荧光检测和/或图像分析。图像分析可包括检测来自分析物检测料筒的光信号。光信号可为光信号，如色度、浊度或荧光信号。电化学检测可包括电流确定法、电量分析、电势确定法、电压确定法、电阻法或其组合。
词组“分析物检测芯片”、“分析物检测料筒”和术语“芯片”和“料筒”在本文中可互换地使用以指代与本文中所公开的分析物检测仪器兼容的一次性或可再使用的样品处理装置。本文中所公开的分析物检测仪器还称为分析物检测装置，其用于在这里提供的芯片中处理样品。在某些实施例中，分析物检测芯片可以包括第一衬底和第二衬底，其中第二衬底定位于第一衬底上方且通过间隙与第一衬底分隔开。第一衬底或第二衬底可以包括多个DMF电极。多个DMF电极可为可单独地控制以启用和停用的电极阵列或电极系列。多个DMF电极可以用绝缘材料覆盖以电隔离DMF电极。在某些实施例中，第一衬底与第二衬底之间的空间/间隙可填充有空气或惰性流体，如油。在某些实施例中，DMF电极可如本文中对前述文段中所描述来布置。在示范性实施例中，DMF电极系列可安置于第一衬底上且单电极以与第一衬底上的电极系列面对的配置安置于第二衬底上。电极系列和单电极可以用绝缘层覆盖。在其它情况中，第一衬底上的电极系列或多个电极可以配置成为共平面电极且第二衬底可不包括电极。各种配置的DMF电极描述于描述集成微流体和纳米孔装置的前述文段中。DMF电极的这些配置中的任一个可以存在于本文所公开的其它料筒中。
如前述文段中所描述，第一层和/或第二层中存在的电极可由大体透明的材料，如氧化铟锡、氟掺杂的氧化锡(FTO)、掺杂氧化锌等制造。另外，为促进光探查，一个或两个衬底可为大体透明的。
分析物检测装置可含有用于在插入到装置中的分析物检测芯片中检测光信号、电化学信号、电信号的光学、电化学和/或电力构件。另外，分析物检测装置包括由于操作分析物检测芯片中存在的DMF电极的构件。本文中所公开的分析物检测装置可以包括与料筒交互的一个或多个接口。在某些情况下，料筒接口可为插入区，如凹槽。在其它情况下，接口可为用于接受料筒的凹部且可以由门或盖子密封。分析物检测装置可包括可与多个分析物检测芯片兼容的单接口。举例来说，插入凹槽可与检测电化学信号的分析物检测芯片、检测光信号的分析物检测芯片，和/或检测电信号的分析物检测芯片兼容。在某些实施例中，分析物检测装置可配置成用于同时操作多个分析物检测芯片，例如，使用多个芯片检测不同样品中的相同分析物或使用多个不同芯片同时检测相同样品中的多个不同分析物。在这类实施例中，装置可以包括多个接口，如插入区。
本公开的分析物检测芯片可任选地包括血浆分离组件。在某些实施例中，血浆分离组件可包括捕获全血样品中存在的细胞的过滤器，从而允许血浆过滤通过且可用于处理成样品液滴以供分析。在其它实施例中，血浆分离组件可为流体分离元件。下文公开分析物检测芯片的实施例。下文所描述的分析物检测芯片中的任一个可以任选地包括血浆分离组件。在某些情况下，血浆分离组件可为可商购的膜。在某些实施例中，可商购的膜，如购自国际护理点有限公司(International Point of Care,Inc.)(例如，PrimecareTM亲水的不对称膜)或颇尔公司(Pall Corporation)(例如，VividTM血浆分离隔膜)的那些，可以用于分离血浆。在某些情况下，膜可整合到本公开的料筒中。在其它实施例中，本公开的芯片、仪器和系统可配置成检测全血样品中的分析物。
i.DMF-电化学检测料筒
在某些实施例中，本文中所公开的料筒包括DMF区和可重叠或在空间上隔离的分析物检测区。DMF区可用于将分析用液滴转移到检测区，其中液滴将进行电化学分析(用于检测临床化学分析中产生的电化学物质)。通过利用工作电极来进行电化学分析，所述工作电极检测由样品中分析物存在产生的电活性物种所产生的电信号。由于电信号与样品中存在的分析物量成比例，可量化检测到的电信号以确定样品中分析物的存在或浓度。电化学检测可涉及由本公开中提供的仪器进行的电流确定法、电量分析、电势确定法、电压确定法、电阻法或其组合。
在某些实施例中，电化学物质可由分析物-特异性酶对分析物的作用产生。在其它实施例中，电化学物质可由酶对底物的作用产生。在这类实施例中，酶对分析物不具有特异性。相反地，酶偶联到特异性结合到分析物的结合成员。在某些实施例中，可包括氧化还原介体以放大由电化学物质产生的电信号。分析物特异性酶和氧化还原介体是众所周知的且可基于所需敏感性和/或特异性而选择。
用于检测电化学物质的电极可以多个配置提供。这类电极可与DMF电极分离或可为已修改成用于电化学感测的电极的DMF电极。本文中所提供的仪器包括控制施加到电极阵列以及用于电化学感测的电极的电力的电路。含有DMF电极和用于电化学感测的电极的分析物检测芯片的示范性配置如下文进一步描述。
图48A到图48F提供了本公开的芯片中存在的电极的示意图。图48A描绘了用于将液滴转移到芯片的传感器区511的DMF电极510。传感器区511包括工作电极512和参考电极513。图48B描绘了位于传感器区511上的液滴514。图48C示出了传感器区511、工作电极512和参考电极513，其中电极是半圆形的且以共平面配置提供。虽然这里未示出，但电极中的一个可以与另一电极面对的配置来放置。在这类实施例中，用于电化学检测的传感器区可包括将工作电极和参考电极分离的间隙，其中电极在液滴移位到传感器区中时进入电连接。工作和参考电极经由引线515连接到接触垫516和517。接触垫可操作地连接到操作芯片的装置。用于电化学检测所关注分析物的电极的额外配置示出于图48D到图48E中。在图48D中，工作电极512是环形的而参考电极513是弧形的且与工作电极同心并包围工作电极。在图48E中，传感器区包括三个电极-工作电极512、参考电极513和对立电极518。液滴和电极大小设定成使得液滴与工作和参考电极(和对立电极，如果存在)接触。图48F描绘了液滴和工作电极的相对大小且电极的大小和形状配置成符合液滴大小。应注意在这个实施例中，参考电极以面对工作电极的配置存在。工作电极513具有小于具有第二直径B的液滴514的第一直径(A)。第一直径A可为约50μm到1.9mm。第二直径B可为约100μm到2mm。在本公开的芯片中还可使用电极直径与液滴直径的其它比率。在实施例中，在工作电极和参考电极(和对立电极，如果存在)呈共面配置的情况下，电极的总面积(包括电极之间的任何间隙)可以大小设定成符合液滴直径(参见图48B)。
在某些实施例中，电化学传感器，如图48A到图48F中描绘的那些，可在与DMF表面相反的表面上，如在单个顶部电极上。以这种方式，DMF电极可使得样品液滴移动以与电化学传感器接触，其中样品液滴可以被探查同时也可与DMF电极接触。
图49A到图49C描绘了包括DMF电极(510)的分析物检测芯片，其中DMF电极经修改成适用于电化学检测的感测电极(510A、510B或510C)。在图49A中，通过在安置于DMF电极上的绝缘层中形成开口来改变DMF电极510A，所述开口提供液滴与用于电化学感测的经修改DMF电极510A之间的接触区。在图49B中，经修改的DMF电极510B在覆盖DMF电极的绝缘层中包括多个插销孔开口以用于液滴与经修改DMF电极之间的接触。在图49C中，DMF电极覆盖有可以通过暴露于光来去除的绝缘层。一个或多个DMF电极可暴露于光511以去除绝缘层，进而产生不被绝缘层覆盖且可由此接触液滴的经修改的DMF电极。在图49C中，电极510C暴露于光以去除光敏感性绝缘层并暴露电极。以与DMF电极510面对的配置安置的DMF电极还可以暴露以提供参考电极。举例来说，DMF电极可修改成在与电极510A、510B或510C呈面对配置的区域中包括一开口或多个开口。
在另一个实施例中，DMF电极可安置于第一衬底上且用于电化学感测的电极中的至少一个可安置于第二衬底上。在一些实施例中，DMF电极可安置于第一衬底上且用于电化学感测的工作和参考电极可安置于第二衬底上。
在某些实施例中，DMF-电化学芯片可包括毛细管区域且用于电化学感测的电极可安置于毛细管区域上。毛细管区域可促进液滴移动到电化学感测的毛细管区域中。
在某些实施例中，本公开的分析物检测芯片可包括如美国专利第5,200,051号中公开的感测区。如美国专利第5,200,051号中所描述，提供适用于确定所关注分析物的存在和/或浓度的感测电极。感测电极通过酶对分析物的作用来检测响应于分析物而产生的电化学物质。感测电极也称为工作电极。如文献中所已知，电化学物质的产生可涉及使用氧化还原介体。此外，酶和/或氧化还原介体可存在在位于感测电极处的试剂混合物中。在其它情况下，可使用DMF电极将酶和/或氧化还原介体引入到芯片中以从连接到芯片的储槽中传输含有酶和/或氧化还原介体的液滴。
在其它实施例中，可使用免疫测定。简单来说，在示范性免疫测定中，分析物可由结合到分析物的第一结合成员(例如，受体、适体或抗体)捕获。在任选的洗涤步骤之后，结合到分析物的第二抗体可用于产生复合物。第二结合成员(例如，抗体或适体)可偶联到酶，所述酶可作用于底物以产生通过工作电极检测的电化学物质。在某些情况下，酶可以水解底物。这类水解底物可随后经历在电活性物质(例如，分子氧和过氧化氢)的浓度中产生改变的反应，所述电活性物质用本公开的分析物检测芯片来电化学地检测。这类免疫测定还通过偶联到第二结合成员的碱性磷酸酶来示范。碱性磷酸酶与底物(磷酸5-溴-4-氯-3-吲哚酚)反应以在电活性物质(分子氧和过氧化氢)的浓度中产生改变，所述电活性物质用DMF-电化学检测芯片来电化学地检测。夹心和竞争性测定两者可使用美国专利第5,200,051号中描述的程序来实现。在这些测定中，除了DMF电极，可包括工作(或感测)电极和任选的参考电极。生物活性层可固定于工作电极上，所述生物活性层包括结合到所关注分析物的第一特异性结合成员(例如，受体或抗体)。在其它实施例中，样品可使用DMF电极来处理且传输到用于检测电化学物质的工作/参考电极。
在本公开的一实施例中，分析物检测芯片可用于制备包括电化学物质的液滴。举例来说，将样品液滴与含有作用于分析物的酶的液滴混合以产生电化学物质的步骤可以通过芯片的DMF电极来实施且含有电化学物质的液滴(或其部分)移动到用于检测且任选地测量电化学物质的工作电极和参考电极。
在其它实施例中，DMF电极可进行将样品液滴与含有偶联到磁性珠粒的第一结合成员(例如，受体或抗体)的液滴进行混合的步骤。所得液滴可与含有偶联到酶的第二抗体的其它液滴混合。所得液滴可随后与缓冲液液滴混合以洗涤掉任何未结合的第二抗体且液滴与含有酶的底物的液滴混合且所得液滴移动到用于检测通过酶对底物的作用而产生的电化学物质的工作/参考电极。在这类实施例中，由于工作电极不需要通过结合成员(例如，受体、适体，或结合到分析物的抗体)的附接来官能化，所以相同的分析物检测芯片可用于通过仅仅装载含有对待检测/测量分析物具有特异性的结合成员的液滴来检测不同类型的分析物。可使用任何免疫测定形式，如前述文段中描述的那些。DMF电极可用于实施免疫测定的样品制备，如以前述文段中描述的方式。
通过所公开的分析物检测芯片来实现类似优势，其中分析物通过酶的作用来直接地检测。举例来说，并非将酶(和其它试剂，如氧化还原介体)定位于工作/感测电极上，可将含有试剂的液滴与样品液滴混合且将所得液滴移动到用于检测在分析物存在于样品中时由酶产生的电化学物质的工作/感测电极。因此，相同的芯片可用于通过来仅仅装载含有作用于待检测/测量分析物的酶的液滴来检测不同的分析物。举例来说，如葡萄糖氧化酶或去氢酶的酶可用于检测葡萄糖；乳酸脱氢酶用于检测乳酸盐；肌酸酐酰胺水解酶、肌酸酶或肌酸激酶用于检测肌酸；以及类似物。在一些实例中，葡萄糖去氢酶可为烟碱酰胺二核苷酸葡萄糖去氢酶(NAD-GDH)、吡咯喹啉醌葡萄糖去氢酶(PQQ-GDH)或黄素-腺嘌呤二核苷酸葡萄糖去氢酶(FAD-GDH)。在其它实例中，分析物可为β-羟基丁酸酯(酮)且酶可为羟基丁酸酯去氢酶。
用于检测电化学物质所需要的电极的大小和形状(例如，工作和参考电极)可凭经验确定或可基于文献。举例来说，电极可类似于美国专利第5,200,051号中公开的那些，其以全文引用的方式并入本文中。电极材料可为有益于电化学感测的任何材料。示范性电极材料包括碳、铂、金、银、铑、铱、钌、汞、钯和锇。在某些情况下，工作电极可以由银制得且参考电极可为银/卤化银(例如氯化银)。
在某些实施例中，工作电极(和任选的参考电极)可以用选择穿透性层覆盖。选择穿透性层可大体上不包括具有约120kDa或更大分子量的分子，同时允许具有约50kDa或更小分子量的分子自由穿透。
在某些实施例中，干扰具有大于所需阈值(例如，大于120kDa)的分子量的电活性物质可通过使用美国专利第5,200,051号中描述的选择穿透性硅烷层来有效地排除与工作电极表面相互作用。然而，此类选择透过性层允许降低电活性物质的分子量，如分子氧和过氧化氢，以经历与下面的电极表面的氧化还原反应。此类选择透过性层可特别适用于电流测量。
在电势测量中，具有有益于进一步并入某些离子载体化合物的官能基和化学属性的聚合材料可用作半透性离子敏感膜，其建立在分析物检测芯片的工作电极上。电极-膜界面处的电势的发展取决于一些预选的离子物质在平衡时建立的电荷密度。这类离子物质的标识通过选择并入在半透性膜中的离子载体来确定。继而固定于本文中所描述的生物层中的酶催化样品中存在的特定分析物转化成预选的离子物质。如在本文中所提及，酶可不固定于生物层中但实际上通过将含有酶的液滴运输到样品液滴和两个液滴的融合物的DMF电极来使其接近分析物。
在另一方面中，本公开的分析物检测芯片可包括用于传输且任选的处理样品液滴的DMF电极和用于检测分析物，如离子，例如Na2+、K+、Ca2+以及类似物的经修改DMF电极。对于检测样品中的离子，经修改DMF电极可覆盖有离子选择性膜而非覆盖DMF电极的离子不透性绝缘层。
氧化还原介体
可存在于本公开的芯片中或经由液滴引入到本公开的芯片中的氧化还原介体的代表性实例包括有机金属氧化还原物质，如包括二茂铁的金属茂或无机氧化还原物质，如六氰化铁(III)、钌六胺等。在本发明的传感器中可用作氧化还原介体的其它合适的电子转移剂为具有一种或多种配位体的锇过渡金属复合物，每一个配位体具有含氮杂环，如2,2'-联吡啶、1,10-啡啉、1-甲基、2-吡啶基联咪唑或其衍生物。电子转移剂还可具有共价结合到聚合物中的一种或多种配位体，每一个配位体具有至少一个含氮杂环，如吡啶、咪唑或其衍生物。电子转移剂的一个实例包括(a)具有吡啶或咪唑官能基的聚合物或共聚物和(b)与两个配位体复合的锇阳离子，每一个配位体含有2,2'-联吡啶、1,10-啡啉或其衍生物，两个配位体不一定相同。用于与锇阳离子复合的2,2'-联吡啶的一些衍生物包括(但不限于)4,4'-二甲基-2,2'-联吡啶和单烷氧基-2,2'-联吡啶、二烷氧基-2,2'-联吡啶和聚烷氧基-2,2'-联吡啶，包括4,4'-二甲氧基-2,2'-联吡啶。用于与锇阳离子复合的1,10-啡啉的衍生物包括(但不限于)4,7-二甲基-1,10-啡啉和单烷氧基-1,10-啡啉、二烷氧基-1,10-啡啉和聚烷氧基-1,10-啡啉，如4,7-二甲氧基-1,10-啡啉。与锇阳离子复合的聚合物包括(但不限于)聚(1-乙烯基咪唑)(称作“PVI”)和聚(4-乙烯基吡啶)(称作“PVP”)的聚合物和共聚物。聚(1-乙烯基咪唑)的合适共聚物取代基包括丙烯腈、丙烯酰胺和经取代的或季胺化的N-乙烯基咪唑，例如锇电子转移剂与聚(1-乙烯基咪唑)的聚合物或共聚物复合。实施例可以采用具有范围介于约-200mV到约+200mV的氧化还原电势的电子转移剂与标准甘汞电极(SCE)。
酶
结合本公开的分析物检测芯片使用的酶可基于待检测的分析物或待使用的底物来选择(例如，在免疫测定中)。分析物-特异性酶的非限制性实例包括以下中的一种或多种：葡萄糖氧化酶、葡萄糖去氢酶、NADH氧化酶、尿酸酶、尿素酶、肌酸酶、肌氨酸氧化酶、肌酸酶、肌酸激酶、肌酸酰胺水解酶、胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、丙三醇激酶、己糖激酶、丙三醇-3-磷酸酯氧化酶、乳酸脱氢酶、碱性磷酸酶、丙胺酸转氨酶、天冬胺酸酯转氨酶、淀粉酶、脂肪酶、酯酶、γ-谷氨酰转肽酶、L-麸胺酸酯氧化酶、丙酮酸酯氧化酶、心肌黄酶胆红素氧化酶和其混合物。
ii.DMF-光学芯片
在某些实施例中，分析物检测芯片可用于产生指示通过芯片分析到分析物在样品中存在的光信号。光信号可为例如色度信号、浊度信号和/或荧光信号。光信号的量值可与分析物的量成比例且可用于确定分析物在样品中的存在或浓度。
在某些实施例中，分析物检测芯片的衬底中的至少一个可为透明的以促进光信号的检测。另外，DMF电极可为透明的。
DMF电极可用于处理样品液滴以产生指示分析物在样品中存在的光信号。光信号可由酶对底物的作用而产生。任何测定形式可用于产生光信号，如色度测定(例如，检测临床化学测定中产生的显色反应物)、免疫测定、夹心免疫测定(例如，单克隆-多克隆夹心免疫测定)，包括酶检测(酶免疫测定(EIA)或酶联免疫吸附分析(ELISA)、竞争性抑制免疫测定(例如，正向和反向)、酶倍增免疫测定技术(EMIT)、颗粒增强的浊度抑制免疫测定(PETINIA)、均相酶免疫测定(HEIA)、竞争性结合测定、生物发光共振能量转移(BRET)、一步抗体检测测定、均相测定、非均相测定、运行捕获测定等。本文中描述示范性测定形式。
可测量的光信号包括荧光、化学发光、色度、浊度等。在某些实施例中，光信号可使用分光光度计来检测。举例来说，光信号可如《分析化学与生物分析化学(Anal BioanalChem)》(2015)407:7467-7475中所描述來检测，其以全文引用的方式并入本文中。在这个技术中，定制歧管将光纤与数字微流体芯片对准，允许在装置平面中进行光学测量。由于装置上液滴的宽度比厚度更大，所以这个技术的平面内对准使其在数字微流体(DMF)装置上的性能优于竖直吸光度测量的敏感性。在其它实施例中，光信号可在与芯片正交的平面处测量。
在某些实施例中，DMF-光学料筒可包括用于照射料筒中的液滴的内置式或独立组件。内置式或独立组件还可用于检测来自照射液滴的光。举例来说，波导可用于照射料筒中的液滴。波导还可用于检测来自液滴的光信号。在某些情况下，DMF-光学料筒的区域可由波导材料制成。在某些情况下，DMF-光学料筒的一个或两个衬底可为波导管。可以最小耗损传播光的任何合适的波导管可用于这类料筒中。
光信号产生可涉及用光源照射液滴且使用检测器，如光谱仪或CMOS检测器测量来自液滴的光。
用于光学检测由酶的作用产生的信号的示范性芯片示出于《化学分析与生物化学分析》(2015)407:7467-7475中的图7中。图7在本文中再现为图50。如图50中所示，DMF芯片包括PPM光盘，分析物在其上被吸收。DMF芯片用于提取反应区中PPM光盘的分析物荧光素且移动到检测区域并定位成邻近于光纤。激光器用于激发荧光素且使用光纤测量其传输光。
在某些实施例中，DMF-光学芯片可不配置有光纤。在这些实施例中，液滴可从垂直方向探查且测量来自液滴的反射光、传输光或吸光度。
iii.DMF-电学检测芯片
本文还提供配置成使用如前述文段中所描述的纳米孔层进行分析物分析的DMF芯片。这类芯片可使用包括电路的仪器来处理，所述电路配置成操作用于处理样品且测量纳米孔层处的信号的电极的启用和停用，所述信号在标签或分析物-特异性结合成员(例如，适体)横穿通过纳米孔时产生且所述信号指示分析物在样品中的存在且可与样品中分析物的浓度成比例。
iv.DMF-成像芯片
本文还提供配置成用于图像分析的DMF芯片。DMF芯片可以包括第一衬底上的电极阵列(单独地或共同通电)，所述电极用绝缘层覆盖。第一衬底可与第二衬底分隔开。在某些情况下，第二衬底可包括与电极阵列面对配置的接地电极。
两个衬底由间隙分离。在某些情况下，衬底由约5μm或更小，如1μm的狭窄间隙分离。在某些情况下，DMF芯片的一部分可以包括衬底被约5μm或更小，如1μm的狭窄间隙分隔开的区域。举例来说，引入样品的区域中衬底之间的间隙可相对更宽(约100μm)，而使样品液滴(或经处理的样品液滴)成像的间隙较窄。较小间隙高度使得产生可以成像且分析的单层颗粒，因此使得单颗粒的分析更直接。
图51A示出了红细胞(RBC)由椭圆表示的可能呈现。间隙高度限制RBC在间隙内形成多层。位于DMF芯片上方的图像传感器用于收集分析用光学数据。在这个实施例中，照射与图像传感器协同定位。顶部衬底必须对于照射和成像为光学透明的。DMF芯片的平面外是用于收集分析用光学数据的成像检测器。成像器技术可包括(但不限于)CMOS和CCD技术。
图51B描绘了芯片的一部分包括由较大间隙分隔开的衬底的DMF-成像芯片，所述间隙连接到毛细流动区域，所述毛细流动区域具有尺寸设定成将颗粒分散到单层中的间隙。芯片的DMF部分适用于有效地控制流体流动、混合流体、移动或将颗粒分隔到芯片上的不同活性试剂区域或适用于分析型操作的其它动作(稀释等)，而毛细流动区域是通过芯片的DMF部分上存在的液滴由于毛细管力到狭窄毛细管间隙的流动间隙转变来形成颗粒单层的通道。这允许经由成像检测器分析液滴中存在的材料，所述成像检测器位于且聚焦在毛细管流动区域上。芯片的DMF部分控制流体且毛细流动区域形成用于色度、吸光度、透射、荧光颗粒计数和成像(如细胞)的分析型区域。毛细管通道中的计数和成像可以在颗粒的静态定位下或随着颗粒流动穿过通道来完成。
图51B的芯片中的DMF区域内的间隙不需要限制成单层颗粒物质的间隙高度，而由于成像检测器聚焦在毛细管流动区域上，毛细管流动区域的间隙保持在防止形成多层的值下。成像检测器组合件可具有多个视野深度和镜片的移动以聚焦于毛细管通道内的内含物上或适应不同的毛细管高度。
图52A和图52B描绘了集成样品制备和样品分析料筒的实施例。具有DMF元件和成像腔室的料筒1000的示意图提供于图52A中。包括DMF电极1003的第一衬底1001以与第二衬底1002间隔开的方式安置。第一衬底与第二衬底之间的空间变化以使得料筒的第一区域包括具有高度h1的第一腔室且第二区域包括具有高度h2的第二腔室。如图52A中所描绘，h1大于h2。在某些实施例中，h1可介于20到200微米(μm)，例如50-200微米、75-200微米、100-200微米、125-200微米、100-175微米范围内，例如150微米且h2可介于2-10微米(μm)，例如2-8微米、2-6微米、3-6微米范围内，例如4微米。所公开料筒1000的方面包括其中第一腔室配置成用于致动样品液滴，例如血液液滴以移动第一腔室中的血液液滴以使得液滴接触安置于第一腔室中的试剂，进而促进在第二腔室中处理样品且准备后续分析的实施例。举例来说，第一腔室可包括用于染色血液样品中存在的细胞以促进细胞检测/计数、全血细胞计数和/或其它血液学测量(例如细菌、RBC、WBC和/或血小板等的染色、计数和/或形态分析)的试剂。如本文所公开的，可以操作DMF电极以将样品液滴移动到第一腔室中具有以干燥形式或以液滴形式安置的反应剂(例如，染色反应剂，如结合到核酸对染料，例如吖啶橙、溴化乙锭、TOTO、TO-PRO，或SYTOX)的区域。样品液滴可与试剂混合以提供试剂在样品液滴中的均一分布。可通过分裂且合并样品液滴直到至少80％的染色试剂均匀地分分布于样品液滴内来进行混合。第二腔室至少在成像区1004中可为透明的以促进从第二腔室换位到第一腔室的样品的光学分析。如所示出，第二腔室可配置成促进样品中存在的细胞作为单层分布，避免重叠细胞，这往往会在细胞的光学分析中引入误差。第二衬底1002可包括由引入肩部的倾斜区域分隔开的第一平面区域和第二平面区域或改变第一平面区域相对于第二平面区域的平面高度的阶梯元件1006。两层第二衬底安置于实质上为平面的第一衬底上以提供包括具有不同高度的两个腔室的料筒。如本文所论述，样品可以通过毛细作用、DMF电极、SAW或其它方法从第一腔室移动到第二腔室中。
图52B提供了包含由通过具有高度h3的间隔物间隔开的第一衬底2002和第二衬底2003界定的第一腔室2001的料筒2000的实施例的示意图。料筒2000还包括由通过具有高度h4的珠粒2007间隔开的第三衬底2006和第四衬底2005界定的第二腔室2004。第一衬底描绘了具有DMF电极2008，但DMF电极可存在于第二衬底上或两个衬底上，如本文所描述。类似于图52A中的料筒，第一腔室具有大于第二腔室的高度的高度。在某些实施例中，h3可介于20-200微米(μm)，例如50-200微米、75-200微米、100-200微米、125-200微米、100-175微米范围内，例如150微米，且h4可介于2-10微米(μm)，例如2-8微米、2-6微米、3-6微米范围内，例如4微米。图52B中描绘的料筒包括分散在用于界定第二腔室的均一高度以促进细胞作为单层分布的第三与第四衬底之间的聚苯乙烯珠粒。第二腔室的的至少一部分可为透明的以促进光学装置2010进行探查。类似于图52A中的料筒，第一腔室致动样品2012以准备在第二腔室中分析(例如，通过与染色试剂混合)。还描绘了以单层分散于第二腔室中的细胞2015。光学装置可定位成通过第三或第四衬底探查样品。在某些实施例中，第一衬底2002和第三衬底2006可由单衬底形成以使得料筒具有共同的底部衬底。第一和第二腔室可配置成利用毛细作用、DMF电极、SAW或其它方法使得样品从第一腔室移动到第二腔室。
DMF腔室和成像腔室的其它配置包括图52C到图52E中描绘的实施例。料筒可包括DMF腔室，所述DMF腔室包括可操作地连接到成像腔室的用于样品制备(例如，将样品液滴与染色试剂混合)的DMF电极。如图52A和52B的描述中所提到，DMF腔室的高度(h1)可介于20-200微米(μm)，例如50-200微米、75-200微米、100-200微米、125-200微米、100-175微米范围内，例如150微米，且成像腔室的高度(h2)可介于2-10微米(μm)，例如2-8微米、2-6微米、3-6微米范围内，例如4微米。图52C描绘了包含由安置于第二衬底1102上的第一衬底1101界定的DMF腔室的料筒1100a。DMF电极未示出且可呈现于第一和/或第二衬底上。第二衬底1102延伸到由第二衬底1102和第三衬底1104界定的成像腔室。间隔物1103界定DMF腔室的远端。间隔物1103可接触第一衬底1101的下表面和衬底1104的上表面。图52D描绘了其中成像腔室通过两部分间隔物1103a和1103b可操作地连接到DMF腔室的料筒1100b，其中第一部分间隔物(1103a)安置在第一衬底1101与第三衬底1104之间且第二部分间隔物(1103b)安置在第二衬底1102与第四衬底1105之间。图52E描绘了其中成像腔室安置在DMF腔室的远侧区中的料筒1100c。DMF腔室由衬底1101和1102界定。成像腔室由衬底1101和衬底1104界定。间隔物1103支撑衬底1104。
如在本文中所提及，DMF腔室可逆地耦接到分析物检测区(电化学检测、电学检测、光学检测等)以形成集成或半集成料筒。DMF腔室和分析物检测区的耦接可如本文所描述来进行。
在某些实施例中，料筒可包括用于分析血液样品的试剂且可以如美国专利第6,004,821号或美国专利第8,367,012号中所公开来配置，其以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，用于样品制备的DMF电极和腔室可以如WO2016/161400、WO2016/161402或US2015/0298124中所公开来配置，其以全文引用的方式并入本文中。应了解，并非或除了DMF电极以外，料筒可配置成用于通过SAW致动样品液滴。
v.具有多个检测区的DMF芯片
本文还提供了允许在单DMF芯片上使用多个分析和技术的DMF芯片。图53示出了其中已形成特异性检测区的DMF芯片布局，不利用单检测技术，而是创建配置成用于检测技术本身的区域。举例来说，区域550a可形成且配置成允许电化学检测；区域550b特定针对成像分析，腔区域550c用于基于吸光度的测量。
图53中描绘的芯片提供了小型DMF芯片，在其上可利用不同的检测技术执行多个典型的诊断测试。举例来说，血液学测量通常依赖于成像分析，而临床化学或免疫测定测量通常依赖于基于电化学或光学的检测。使用这个芯片，用户可以在多个诊断分析装置上利用单血液收集，由此极大地为用户简化了诊断工艺和时间以得到结果。
图54示出了由成像、光子和电化学感测构成的DMF芯片布局。DMF配置可根据诊断要求是任何组合和/或数量的感测区。可利用如CMOS技术的成像传感器。在需要较高敏感性的情况下，可使用CCD或增强的CCD(eCCD)。CMOS检测器是多功能的以使得其可用作具有恰当涂层的电化学传感器。在需要高敏感性光子感测的情况下，可使用(从最高到最低列举)光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管检测器(APD)或光电二极管。可通过使用发光二极管(LED)或固态型激光器来实现照射。所示的照射配置解决了明视场和荧光激发。二色性或光束分光器反映了荧光激发波长且传输发射波长。二向色中的带通波长将允许所传输的明视场波长传输到传感器。二向色光学组件不需要用于透射光分析，仅荧光。不同的测定可能需要额外激发和传输过滤器且可包括于个别光学路径中。与这种芯片兼容的分析物检测仪器可被配置成包括用于检测光学信号和电信号的构件。举例来说，分析物检测仪器可包括成像传感器，例如CMOS、CCD或增强的CCD(eCCD)摄像机、PMT、APD。另外，分析物检测仪器可包括用于样品照射的构件，如LED、激光器以及类似物。
具有多检测区的DMF芯片的实施例示出于图55中。图55中的芯片包括样品获取端口，通过所述端口将20-80微升全血样品装载到芯片上且紧接着输送到样品可驻留至多1/2小时或更长时间的再悬浮区。再悬浮区用于在血液分成为0.5-1微升体积的5个等分试样之前再悬浮血液。可通过使血液样品往复运动来实现再悬浮，使得流体路径允许血液完全倒置，流体路径>血液段塞的2倍长度。
再悬浮血液被输送且划分成若干等分试样。单独地，将每个等分试样输送到通过反应剂部分的感测/成像区域，以染色、球化或裂解细胞。混合通过等分试样在这个区域中的往复运动来实现。图式示出用于血液学测量的不同反应剂和成像区域。干燥消耗品中的所有反应剂。流体路径中的其它涂层提供用于操纵液体的疏水和亲水表面。可包括替代性配置以用于进行电化学感测和光学感测。血小板(PLT)、网织红细胞(RETC)和成核红血细胞(NRBC)可在与红血细胞(RBC)和白血细胞(WBC)相同的成像区域中成像。DMF可用于收集获取端口中的样品，再悬浮样品，任选地包括等分试样分割，且染色全部样品。这类芯片可用于分析血液凝集，例如确定血液类型。
图56和图57示出了能够电化学和光学检测的DMF芯片。在填充端口处从患者获得20-80微升的全血样品且紧接着输送到样品可滞留至多半小时或更长时间的再悬浮区。再悬浮区域用于在分布血液之前再悬浮血液。可通过使血液样品往复运动来实现再悬浮，使得流体路径允许血液完全倒置，流体路径>血液段塞的2倍长度。样品被输送且划分成两个等分试样；一个用于血浆分离且另一个用于全血分析。血浆分离可用分离介质实现；即过滤，或通过利用DMF能力的流体方法进行。消耗品利用与图55中的血液学构建相同的成像传感器布局。每一个成像区域具有用于反应剂混合的相应区域。干燥“染色和混合区域”中的所有反应剂。为提供样品洗涤，可将用于洗涤的反应剂包装添加到流体学设计(图56)。
vi.分析物检测装置
如在本文中所提到，提供了包括用于与分析物检测芯片交互的料筒接口的分析物检测装置。在某些实施例中，分析物检测装置可与仅一种类型的分析物检测芯片兼容。这种分析物检测装置可包括单料筒接口，例如单插入槽，且可在插入到所述槽中的单芯片上操作。在其它实施例中，分析物检测装置可包括多个料筒接口，例如可用于操作多个(例如，相同类型的，装载有不同样品)芯片的插入槽。在又其它实施例中，分析物检测仪器可包括单分析物检测芯片可插入的单料筒接口。在一些实施例中，分析物检测装置可为可在多个不同类型的分析物检测芯片上操作的多功能仪器或通用仪器，例如DMF-电化学检测芯片(例如用于临床化学)；DMF-光学检测芯片(例如，用于临床化学)；DMF-电学芯片(例如，纳米孔层)；和具有多个检测区域的DMF芯片中的两个或更多个。在一些实施例中，通用仪器可包括用于每个不同分析物检测芯片的单独的插入槽。在其它实施例中，通用仪器可具有与不同类型的分析物检测芯片兼容的单一插入槽。多功能或通用分析物检测仪器可包括光学检测和电学检测单元。
分析物检测装置可包括用于致动DMF电极的电源和电路。取决于装置操作的分析物检测芯片，分析物检测装置可以包用于检测来自工作电极的电信号的电路(用于电化学检测)；用于检测来自纳米孔的电信号的电路；可包括用于检测光信号的传感器和/或用于成像的摄像机的光学检测；和其组合。分析物检测装置可包括存储器或可操作地连接到存储用于操作分析物检测芯片的指令的存储器。在某些情况中，可通过运行用于执行产生分析物相关信号和检测信号所需的步骤的程序的处理器来操作装置。分析物检测装置还可包括算法以基于检测到的电或光信号计算分析物的浓度。
本文中所公开的分析物检测装置还可以配置成操作DMF-纳米孔装置，如PCT/US2016/025787中公开的那些，其以全文引用的方式并入本文中。在某些实施例中，DMF-电化学检测芯片、DMF-光学检测芯片以及类似物中的DMF部分可如PCT/US2016/025785或PCT/US2016/025787中所公开来配置且形成。
图58A和图58B描绘了分析物检测装置。图58A中的分析物检测装置410a与单一类型的分析物检测芯片兼容。图58A中的装置410a可包括单接口，如用于单一类型的分析物检测芯片的单凹槽411a。在某些情况下，图58A中的装置410a可包括多个接口，如各自接受相同类型的分析物检测芯片的凹槽(411a、411b、4111c、411d)。图58A中的装置410a可用于针对分析物的存在同时分析多个样品。在某些实施例中，图58A中的装置可外壳，所述外壳包括处理器413，所述处理器可操作地连接到含有使用检测芯片的程序的存储器。凹槽411a和其它凹槽(如果存在)可全部包含于外壳中。在其它实施例中，外壳可仅包括处理器且可任选地包括显示屏或监视器和足以连接到单独装置且操作单独装置的硬件和软件，所述单独的装置包含一个或多个凹槽，如凹槽411a-411d。因此，在一些实施例中，装置的操作系统可以与料筒放置于其中的凹槽物理地分隔开。
图58B中的装置410b包括多个凹槽412a、412b、412c和412d。凹槽412a与DMF-电化学检测芯片兼容。凹槽412b与DMF-光学检测芯片兼容。凹槽412c和412d分别与DMF-纳米孔和DMF-临床化学芯片兼容。DMF-临床化学芯片可具有电化学检测区或光学检测区。装置410a和410b还包括可操作地连接到存储器的处理器413，所述存储器含有使用检测芯片的程序。类似于装置410a，装置410b可包括含有处理器413的外壳、任选的显示屏或监测器和凹槽412a-412d，或外壳可不包括凹槽412a-412d，所述凹槽可存在于连接到装置410b的单独装置中。
图58C描绘了与图58A和58B中示出的分析物检测装置兼容的分析物检测芯片。在某些实施例中，本文中所描述的装置和系统可以包括可用于使单个凹槽适应不同类型的料筒的料筒适配器。举例来说，料筒适配器1可以包括用于连接到凹槽1的第一接口和用于连接到料筒1的第二接口，料筒适配器2可以包括用于连接到凹槽1的第一接口和用于连接到料筒2的第二接口。料筒适配器和与料筒调适器兼容的料筒描绘于图58D和图58E中。图58D示出包括第一接口的料筒适配器5812a，所述第一接口包含与装置中存在的凹槽兼容的插脚5810a和5810b，所述装置包括处理器或可连接(物理地或以无线方式)到具有执行在料筒的DMF区域中制备样品和/或分析所制备的样品(例如，检测分析物相关信号)所需步骤的指令的处理器。料筒适配器5812a的第二接口包括于料筒5814(例如，免疫测定料筒)上存在的插销5813配合的端口5811。图58E示出与同一凹槽兼容的料筒适配器5812b，由于插脚5810a和5810b的存在所述凹槽也与料筒适配器5812a兼容。然而，料筒适配器5812b的第二接口包括容纳且可连接到料筒5815(例如，血液学料筒)而非料筒5814的空腔。因此，料筒适配器可用于适配凹槽以连接多种不同类型的料筒。
图59A描绘了可用于根据本文所描述的方法进行样品分析的分析物检测芯片。分析物检测芯片包括远侧区中的开口，所述开口提供用于将样品引入到分析物检测芯片中的入口(在图59A中用箭头标记)。如在本文中所提到，在某些情况中，样品可为全血样品。在某些实施例中，样品可被吸取到分析物检测芯片的开口中。在其它实施例中，可将样品液滴从皮肤的切开区域(例如指尖)直接地装载到分析物检测芯片中。分析物检测芯片的远侧区可包括用于处理样品和/或将样品转移到分析物检测芯片中的合适区域以用于检测样品中存在的一个或多个分析物的元件。可将分析物检测芯片的近侧区插入到用于样品分析的分析物检测装置中。在某些情况中，分析物检测芯片可包括盖板，芯片的近侧区处的盖板的一部分可移动以暴露近侧区的内部。盖板的可移动部分可铰接地连接到芯片的盖板且可向上枢转以暴露芯片的内部。在其它情况中，盖板的可移动部分可朝向远侧区滑动以暴露近侧区处的芯片的内部。在某些情况中，分析物检测芯片可与图59B中示出的分析物检测装置兼容。如在本文中所提到，芯片可包括纳米孔和/或纳米井。另外，芯片可包括电极，例如用于数字微流体的电极阵列。
图59B描绘了与如本文中所描述的分析物检测芯片兼容的分析物检测装置。举例来说，分析物检测装置可与图59A中显示的分析物检测芯片兼容。图59B的分析物检测装置包括单一插入槽(通过箭头指示)，至少分析物检测芯片的近侧区插入所述槽中。在某些情况中，整个或大体上整个芯片插入到插入槽中。在一些情况中，这种分析物检测装置还可配置成包括多个接口，例如多个插入槽。如图59B中所描绘，分析物检测装置具有高度在约12英寸范围内的台式装置的理想大小。
本文公开的芯片、装置和系统在样品分析领域中提供许多优点。这些芯片和装置甚至对于小的样品体积为高度可靠的且为其它样品分析装置的低成本替代物。除装置的小占据面积以外，这些装置易于使用且可用于进行多核心实验室测试，包括免疫测定和/或临床化学。如本文中所阐释，所公开的芯片、装置和系统提供使得能够分析小样品体积的高敏感性。此外，芯片和装置的配置需要极少用户输入且使得能够最低限度地训练用户操作装置和芯片以用于分析样品。本公开的芯片和装置不具有或具有极少还降低制造和/或维护成本且同时增加装置寿命的移动部件。
分析物检测仪器可包括成像传感器，如CMOS、CCD或增强的CCD(eCCD)摄像机、PMT、APD。另外，分析物检测仪器可以包括用于样品照射的构件，如LED、激光器以及类似物。分析物检测仪器还可包括用于操作DMF芯片和用于操作DMF-电化学/电芯片的电路。
在一些实施例中，分析物检测可需要某一水平的敏感性。根据所需敏感性，可使用DMF-光学芯片(例如，DMF-临床化学芯片)或DMF-电化学(例如，DMF-临床化学芯片)或DMF-电学(例如，DMF-纳米孔芯片)芯片。在用于分析物检测的又其它测定中，例如当光学探查存在于DMF电极上的液滴时(例如使用分光光度计)，可使用DMF-成像芯片。
vii.分析物检测系统
本文还公开包括分析物检测芯片和与所述芯片兼容的分析物检测仪器的系统。如本公开所提到，仪器可使用单一多功能芯片或使用不同芯片进行多个测定。举例来说，仪器可检测电信号(例如来自与DMF-电化学芯片中的工作和参考电极接触的电化学物质或来自穿过DMF-纳米孔芯片中的纳米孔的标签/分析物-特异性结合成员的那些信号)和包括成像DMF-光学芯片的光学信号，从而检测来自DMF-光学芯片的分析物相关信号，和/或使液滴在DMF-成像芯片上成像。如在本文中所提到，在DMF-电化学芯片中，DMF电极可邻近单一衬底上的工作和参考电极或可将工作和参考电极安置于流体地连接到含有DMF电极的芯片区域的毛细管中。在一些情况下，参考纳米孔层的位置，DMF电极阵列在DMF-电学芯片中的位置可如前述文段中所描述。
本公开的系统可进行编程以用于进行测试菜单以供分析样品中的分析物。举例来说，仪器可检测放置于仪器中的芯片类型且可选择待在芯片上进行的测定。仪器可启用和停用DMF电极以处理样品液滴且产生可电性或光学探查的液滴。举例来说，仪器可检测液滴中的电化学物质和/或液滴中的光学活性分子(例如，显色分子、荧光分子以及类似物)。另外，仪器可将液滴定位于纳米孔层处且测量标签或分析物-特异性结合成员(例如，适体)通过纳米孔层的移位。
系统可进一步包括具有在包括于系统中(例如包括于仪器中)的处理器上执行的指令的存储器，所述系统用于控制DMF电极且用于控制电化学检测用电极或控制光学检测单元等。
在某些实施例中，本公开的分析物检测系统可包括分析物检测装置，所述分析物检测装置包括用于执行具有用于首先启用DMF电极以供移动样品液滴/缓冲液液滴/反应剂液滴以及类似物的指令的程序的处理器。指令可进一步包括停用DMF电极且测量来自工作电极的电信号以用于检测响应于样品中分析物的存在而产生的电化学物质。系统可进一步包括用于标准化由芯片记录的信号，例如以在确定分析物浓度之前去除噪声的算法。算法可包括有助于确定分析物浓度的校准曲线。
本文中所公开的系统可用于处理样品液滴以产生指示样品中分析物的存在的电信号(例如，来自使用工作和参考电极测量的电化学物质或来自标签或分析物-特异性结合成员通过纳米孔的移位)和/或光信号。电和/或光信号可通过临床化学测定中酶对底物的作用来产生。电信号可通过标签或分析物-特异性结合成员通过纳米孔的移位来产生。可利用本公开中所描述的任何测定形式处理样品。
本公开的系统可用于电化学检测样品中的分析物的方法中。所述方法可包括(a)将样品引入到料筒中，所述料筒包含：第一衬底；第二衬底；将第一衬底与第二衬底分离的间隙；在液滴上产生电学致动力的多个电极；和包含工作电极和参考电极的电化学物质感测区；(b)致动多个电极以提供包含分析物的第一液体液滴；(c)致动多个电极以提供包含对分析物具有特异性的酶的第二液体液滴；(d)致动多个电极以将第一和第二液滴合并以产生混合物；(e)致动多个电极以将全部或一部分混合物移动到电化学感测区；(f)经由工作和参考电极检测由酶对分析物的作用而产生的电化学物质的电信号。
在一些情况中，第二液滴还可包括氧化还原介体。在一些情况中，系统可基于电信号确定分析物的浓度。在一些情况中，电化学感测区位于料筒中的毛细管区域中。
在某些实施例中，所述方法可包括(a)将样品引入到料筒中，所述料筒包含：第一衬底；第二衬底；将第二衬底与第一衬底分离的间隙；在液体液滴上产生电学致动力的多个电极；和包含工作电极和参考电极的电化学物质感测区；(b)致动多个电极以提供包含分析物的第一液体液滴；(c)致动多个电极以提供包含固体衬底的第二液滴，所述固体衬底包含特异性结合到分析物的第一结合成员；(d)致动多个电极以将第一和第二液滴合并以产生混合物；(e)致动多个电极以将全部或一部分混合物与包含特异性结合到分析物的第二结合成员的第三液体液滴合并；(f)将固体衬底保持在适当位置同时致动多个电极以去除任何未结合的分析物和/或第二结合成员；(g)致动多个电极以使固体衬底与偶联到第二结合成员的酶的底物分子接触；和(h)经由工作和参考电极检测由酶对底物分子的作用而产生的电化学物质的电信号。
在一些情况下，所述方法可包括在步骤(g)和(h)之前使来自步骤(f)的包含固体第二衬底的液体液滴移动到电化学感测区。在其它情况下，所述方法可包括将来自步骤(g)的包含固体第二衬底和酶底物的液体液滴移动到电化学感测区。
在一些情况下，第二液体液滴还可包括氧化还原介体。在一些情况下，系统可基于电信号确定分析物的浓度。在一些情况中，电化学感测区位于料筒中的毛细管区域中。如在本文中所提及，系统和仪器可使用多功能性料筒或使用多个单独的单测定料筒进行两个或更多个单独的测定。
在某些实施例中，公开使用仪器进行分析物检测的方法。所述方法可包括提供分析物检测仪器，所述分析物检测仪器包含可操作连接到一个或多个分析物检测料筒的料筒接口；提供多个具有多个电极的料筒以在液体液滴上产生电学致动力：将第一料筒与仪器连接且检测来自料筒中的液滴的分析物相关信号；和将第二料筒与仪器连接且检测来自移位通过料筒中纳米孔层的孔的标签/分析物-特异性结合成员的分析物相关信号。
在某些情况下，系统可包括使其与多个仪器连接的程序，其中多个仪器中的每一个实施多个测定，其中多个仪器是不同的或相同的。举例来说，如图60A中所描绘的系统可包括控制单元，所述控制单元包含可操作地连接到多个装置411的处理器413，所述多个装置可各自包括至少一个凹槽(411a-411d)，其中料筒可通过所述处理器来插入并操作。装置411可为相同的且可提供用于增加可同时处理的样品数的构件。在某些实施例中，系统可包括程序或可升级成包括使其在可用时与额外或备用仪器连接的程序。如图60B中所描绘的系统可包括可操作地连接到多个不同装置414a-414d的处理器413，所述多个装置可各自包括至少一个凹槽(412a-411d)，其中不同类型的料筒可通过所述处理器来插入并操作。举例来说，第一装置可配置成用于实施免疫测定，第二装置可配置成用于实施电化学测定，第三装置可配置成用于实施血液学测定以及类似情况。在这种实施例中，装置和与所述装置兼容的料筒可包括用于样品制备和检测分析物相关信号(用于样品分析)的构件。通过处理器413执行的程序可包括被传达到装置以执行实施测定所需要的步骤的指令，如致动DMF电极或产生用于样品制备的SAW且控制用于检测所制备样品的信号的检测模块，如摄像机、显微镜、电化学传感器等。系统可另外包括用于在提供测定结果之前分析收集到的数据的算法。系统可装备成用于无线通信以提供无线地连接到系统的远程装置上的测定结果。在某些情况中，远程装置可接受实时结果。在某些情况中，印刷机也可连接到系统以提供测定结果的印刷输出。
图60A和60B中描绘的系统的模块化允许增加或去除系统的功能，以为消费者，例如在护理点设施处提供灵活性。
分析物
可通过本文中提供的方法、芯片、仪器和方法来分析的分析物的非限制性清单包括生物样品，如血液样品(或其部分，例如血清或血浆)中存在的分子。所关注示范性分析物包括核酸，低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)、胆固醇、三酸甘油酯、葡萄糖、血红蛋白(Hb)、HbA1c、白蛋白、微白蛋白、总蛋白质、钠(Na+)、钾(K+)、氯(Cl-)、二氧化碳、氧、肌酸酐、钙(Ca2+)、血液脲氮(BUN)、pH、乳酸酯、酮体、丙胺酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸酯转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、胆红素、铁蛋白、醇(血液醇)、安非他明、甲基苯丙胺、大麻、鸦片剂、巴比妥酸盐(barbituarate)、苯并二氮、三环酸、可卡因和苯环利定(PCP)中的一种或多种。可使用本文公开的DMF-电化学/电学/光学检测芯片检测和任选地测量的额外分析物包括在前述文段中检测的分析物中的一种或多种。可使用本公开的方法、装置和系统检测并测量的分析物的其它实例包括血细胞、流感病毒、链球菌细菌、劳氏肉瘤病毒、腺病毒、单核细胞增多症、结核、B-HCG、HIV、HCV、HBV、梅毒、疱疹、肌钙蛋白、BNP、CK-MB、肌血球素、D-二聚体、PSA、TSH、T3、T4、FSH、LH、雌二醇、睾酮、维生素D、B12和幽门螺杆菌(H.Pylori)。
其中分析物待检测的样品可为本文公开的任何样品，例如血液样品、固体组织、另一种体液，如尿液、痰液、唾液、脑脊髓液，以及环境样品，例如水、土壤、食物样品以及类似物。
10.实例
实例1
可光裂解2-硝基苯甲基丁二酰亚胺基/马来酰亚胺基双官能连接子的合成。
Figure BDA0002017627730001521
*在以上合成中，DMF为二甲基甲酰胺。
化合物2的合成.可光裂解磺基丁二酰亚胺基/马来酰亚胺基连接子的合成来源于Agasti等人，《美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)》，134(45)，18499-18502，2012中。简单来说，在氩气氛围下将起始物质4-[4-(1-羟基乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基]丁酸(0.334毫摩尔)溶解于无水二氯甲烷(DCM)中。通过将烧瓶放置在冰浴中使烧瓶冷却到0℃。将化合物六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲(HBTU)(0.368毫摩尔)和三甲胺(TEA)(0.835毫摩尔)添加到溶液中。在0℃下搅拌反应混合物5分钟且随后添加N-(2-氨基乙基)马来酰亚胺三氟乙酸盐(0.368毫摩尔)。在0℃下搅拌15分钟之后，使反应混合物上升到室温(RT)且再搅拌18小时。在用DCM(45毫升)稀释反应混合物之后，有机相用水(2×)、饱和NaCl溶液(1×)洗涤且经硫酸钠干燥。在减压下浓缩有机层且通过快速色谱使用SiO2柱(洗脱剂：100％DCM到含3％甲醇的DCM，v/v)来纯化。将化合物1(0.024毫摩尔)溶解于无水二甲基甲酰胺(1毫升)中。将N,N'-二磺基丁二酰亚胺基碳酸酯(DSC)(0.071毫摩尔)和TEA(0.096毫摩尔)连续添加到溶液中。在室温下搅拌反应混合物18小时。反应混合物通过直接装载到C18逆相柱(洗脱剂：含5％乙腈的水到含95％乙腈的水，v/v)上来纯化。用于合成的起始物质和其它化学物质可购自西格玛-阿尔德里奇(Sigma-Aldrich)。
实例2
可光裂解丁二酰亚胺基/DBCO 2-硝基苯甲基双官能连接子的合成。
Figure BDA0002017627730001531
图中的连接基团应该改为连接子
*在以上合成中，DMF为二甲基甲酰胺。
化合物4的合成.可光裂解磺基丁二酰亚胺基/二苯并环辛基(DBCO)炔基连接子的合成来源于Agasti等人，《美国化学学会杂志》，134(45)，18499-18502，2012中描述的类似程序。简单来说，在氩气氛围下将起始物质4-[4-(1-羟基乙基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基]丁酸(0.334毫摩尔)溶解于无水二氯甲烷(DCM)中。通过将烧瓶放置在冰浴中使烧瓶冷却到0℃。将化合物六氟磷酸2-(1H-苯并三唑-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲(HBTU)(0.368毫摩尔)和三甲胺(TEA)(0.835毫摩尔)添加到溶液中。在0℃下搅拌反应混合物5分钟且随后添加DBCO-胺(0.368毫摩尔)。在0℃下搅拌15分钟之后，使反应混合物上升到室温且再搅拌18小时。在用DCM(45毫升)稀释反应混合物之后，有机相用水(2×)、饱和NaCl溶液(1×)洗涤且经硫酸钠干燥。在减压下浓缩有机层且通过快速色谱使用SiO2柱(洗脱剂：100％DCM到含3％甲醇的DCM，v/v)来纯化。将化合物3(0.024毫摩尔)溶解于无水二甲基甲酰胺(1毫升)中。将N,N'-二磺基丁二酰亚胺基碳酸酯(DSC)(0.071毫摩尔)和TEA(0.096毫摩尔)连续添加到溶液中。在室温下搅拌反应混合物18小时。反应混合物通过直接装载到C18逆相柱(洗脱剂：含5％乙腈的水到含95％乙腈的水，v/v)上来纯化。用于合成的起始物质和其它化学物质可购自西格玛-阿尔德里奇。
实例3
使用磺基丁二酰亚胺基/马来酰亚胺基2-硝基苯甲基双官能连接子进行抗体-DNA偶联物的偶合和光化学裂解。
Figure BDA0002017627730001551
DNA-丁二酰亚胺剂连接子
Ab-DNA偶联物
抗体和DNA的生物偶联和裂解.DNA分子可使用以下流程偶联到抗体。可通过使用两个PCR引物在PCR反应中重复DNA序列使DNA在5'末端硫醇化，其中一个或两个引物用5'-硫醇基标记。在搅拌下将经标记DNA(100微摩尔最终浓度)溶解于50mM HEPES(pH＝7.0)中。添加化合物2(2mM)且在室温下进行反应2小时。在偶合之后，用过量二硫苏糖醇(DTT)淬灭过量未反应的马来酰亚胺基团。偶联物在凝胶过滤柱(葡聚糖凝胶G-25)上或通过在4℃下在适当偶联物存储缓冲剂中大规模透析来纯化。在搅拌下将纯化对DNA-丁二酰亚胺基连接子(50微摩尔最终浓度)溶解于100mM PBS(pH＝7.5)中。添加天然抗体(50微摩尔最终浓度)且在室温下进行反应2小时。Ab-DNA偶联物使用葡聚糖凝胶柱(葡聚糖凝胶G25)在100mMPBS、pH 7.5或BioGel P-30凝胶过滤介质下操作来纯化。
可通过用365纳米的UV灯照射进行纳米孔检测之前裂解偶联物。这个实例还可用于使用相同的生物偶联化学方法的DNA树枝状聚合物上。
实例4
使用磺基丁二酰亚胺基/DBCO2-硝基苯甲基双官能连接子进行抗体-DNA偶联物的偶合和光化学裂解。
Figure BDA0002017627730001571
DNA-DBCO连接子
抗体-DNA偶联物
抗体和DNA的生物偶联和裂解.DNA分子可使用以下流程偶联到抗体。可通过使用两个PCR引物在PCR反应中重复DNA序列使DNA在5'末端胺化，其中一个或两个引物用5'-胺基标记。在搅拌下将经标记DNA(100微摩尔最终浓度)溶解于100mM PBS(pH＝7.5)中。添加化合物4(2微摩尔最终浓度)且在室温下进行反应2小时。DNA-DBCO连接子在凝胶过滤柱(葡聚糖凝胶G-25)上或通过在4℃下在适当偶联物存储缓冲剂中大规模透析来纯化。在搅拌下将纯化DNA-DBCO连接子(50微摩尔最终浓度)溶解于50mM Tris(pH＝7.0)中。无铜点击化学用于将DNA-DBCO连接子偶合到抗体。添加叠氮基标记的抗体(Kazane等人，《美国国家科学院院刊》，109(10)，3731-3736，2012)(25微摩尔最终浓度)且在室温下进行反应6-12小时。Ab-DNA偶联物使用葡聚糖凝胶柱(葡聚糖凝胶G25)在100mM PBS、pH 7.5或BioGel P-30凝胶过滤介质下操作来纯化。
可通过用365纳米的UV灯照射进行纳米孔检测之前裂解偶联物。这个实例还可用于使用相同的生物偶联化学方法的DNA树枝状聚合物上。
实例5
用于数字免疫测定(纳米孔计数)的纳米颗粒-抗体偶联物。
这个实例描述抗体与26纳米羧化聚苯乙烯纳米颗粒(NP，PC02N)的共价偶联，如可以从Bangs Labs(Fishers，IN，USA)获得的那些。26纳米NP具有528.7μeq/g的表面电荷和68.4平方埃/基团的排列区(parking area)(根据制造商信息)。
Figure BDA0002017627730001581
羧基纳米颗粒(NP)
羧基-聚苯乙烯纳米颗粒的活化：用10毫升0.1M内消旋(2-[N-吗啉基]乙烷磺酸，pH 4.5-5.0洗涤1.0毫升(100毫克/毫升)26纳米羧化的NP。在洗涤之后，对于1.0mg/mL NP浓度(0.1％固体)，将集结粒再悬浮于100mL 0.1M内消旋pH 4.5-5.0中。将10.0mL纳米颗粒悬浮液(10mg NP，5.28μeq羧基)转移到小瓶中且在室温下在连续混合下与10μL(5.28微摩尔，1.0当量/CO2H当量)的新制备的10mg/mL EDC水溶液(1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳化二亚胺盐酸盐)和17μL(7.93微摩尔，1.5当量/1当量EDC)的磺基-NHS溶液于水中的10mg/mL溶液(N-羟基硫代琥珀酰亚胺，西格玛，目录号56485)反应15分钟。反应的悬浮液在6,500g下离心且舍弃溶液。集结粒用20mL的20mM PBS/5mM EDTA，pH 7.5洗涤且通过在6,500g下离心来快速离心。移除上清液。将丁二酰亚胺活化对羧基-NP集结粒再悬浮于50mM PBS pH7.5中且紧接着添加9.8μL(52.8纳摩尔，0.01当量/1CO2H当量)的1.0mg/mL吡啶二硫乙基胺水溶液且使其在室温下在连续搅拌下反应2-4小时。吡啶基衍生的羧基-NP用10mL的20mMPBS/5mM EDTA，pH 7.5洗涤且再悬浮于10.0mL相同缓冲液中。使用UV-Vis光谱分析(600nm，散射)使用羧基-NP校准曲线来确定纳米颗粒浓度。通过用10mM TCEP或DTT使规定量的NP还原，通过离心去除还原剂，将吡啶基活化的NP集结粒再悬浮于PBS/EDTA pH 7.2中并与埃尔曼试剂(Ellman reagent)反应来确定装载于NP上的吡啶基-配位体(测量上清液的A412)。如果不在抗体偶联的同一天使用，则将活化NP存储在4℃下。
评估EDC/NHS和吡啶二硫乙基胺摩尔输入范围以确定制备不同抗体-纳米颗粒偶联物所需的化学计量。评定反应参数(pH、温度、时间)以获得所需的NP活化最终结果。
Figure BDA0002017627730001591
抗体还原：将1.0mL的10mg/mL抗体溶液(10mg)与38μL的新制备第30mg/mL 2-MEA溶液(10mM反应物浓度)(2-巯基乙基胺盐酸盐)充分混合，随后封盖且放置在37℃下90分钟。将溶液引入室温且用脱盐柱去除过量的2-MEA，在20mM PBS/5mM EDTA pH 7.5中预平衡。经还原抗体的浓度使用A280(蛋白质吸光度)和A320(散射校正)下的UV-Vis吸光度来确定。游离硫醇的数量使用埃尔曼测试(Ellman test)来确定。按需要优化条件以产生2个或4个游离硫醇(抗体铰链区中的Cys)。经还原抗体紧接着用于偶合到吡啶基衍生的羧基-NP。
Figure BDA0002017627730001601
NP-Ab偶联物
经还原抗体与活化纳米颗粒的偶合：假定制得：(1)抗体排列区为45nm2；(2)26nm纳米颗粒表面积为2,120nm2；(3)47个抗体分子理论上适应于26nm NP表面上。
程序：向10mL(10mg)的吡啶基-活化羧基-纳米颗粒于20mM PBS/5mM EDTA(pH7.5)中的0.1％溶液中添加0.10mg(0.66纳摩尔，0.10毫升)经还原抗体，在含有缓冲液的相同EDTA中为1.0mg/mL。使混合物在室温下在混合下反应2小时，离心以去除未结合的分子且抽吸。集结粒用10mL的PBS pH7.2洗涤，离心并抽吸。将抗体-NP偶联物悬置于10.0mL的PBSpH 7.2中。偶联物NP浓度(固体％)使用UV-Vis光谱分析(600nm)来确定。通过SEM来检测颗粒偶联物且使用泽塔斯则(ZetaSizer)确定大小/电荷分布。尺寸排阻色谱可用于从偶联物群的可能分布中隔离不同的偶联物。可通过流式细胞测量术使用荧光标记的抗原偶联物或使用Micro BCA(uBCA)测定来确定抗体比NP并入率。可评估抗体比NP摩尔输入以及偶联温度和pH的范围以产生不同偶联物的均质群(即，NP并入率为2或4)。
纳米孔计数免疫测定
Figure BDA0002017627730001611
以上流程示出利用经还原抗体-活化纳米颗粒偶联物的纳米孔计数测定，所述偶联物的制备描述于上文中。免疫测定过程中形成的免疫复合物可通过还原双硫键连接子以形成游离抗体-分析物-抗体复合物和游离纳米颗粒标签来裂解，这准许纳米颗粒标签在通过纳米孔之后被计数。
实例6
CPSP偶联物的合成
A.CPSP抗体偶联物。
Figure BDA0002017627730001621
*在以上合成中，DMF为二甲基甲酰胺。
3-(9-((4-侧氧基-4-(全氟苯氧基)丁基)(甲苯磺酰基)氨基甲酰基)吖啶-10-鎓-10-基)丙烷-1-磺酸酯(2)：将配备有电磁搅拌器和氮气入口的25mL圆底烧瓶装填3-(9-((3-羧丙基)(甲苯磺酰基)氨基甲酰基)吖啶-10-鎓-10-基)丙烷-1-磺酸酯(CPSP)(1)(1mmol)、吡啶(5mmol)和二甲基甲酰胺(10mL)。在冰浴中冷却溶液且逐滴添加三氟乙酸五氟苯基酯(1.3mmol)。移开冰浴，并且将反应物在室温下搅拌3小时。在真空中从反应物中移除挥发性组分且将残余物溶解在甲醇中并通过逆相HPLC来纯化，得到标题化合物。
CPSP抗体偶联物(3)：将2的溶液(1μL的10mM溶液于DMSO中)添加到抗体溶液(100μL的10μM溶液于水中)和碳酸氢钠水溶液(10μL的1M溶液)。将所得混合物在室温下搅拌4小时。在离心柱上实现产物的纯化，得到CPSP抗体偶联物3。“n”值以抗体依赖性方式改变。可通过升高或降低活性酯浓度(即，化合物2、5、9和13)和/或通过升高或降低反应期间的pH来在一定程度上控制并入，但始终得到并入值的分布。在反应之后以实验方式确定平均并入率(“I.R.”)。通常，“n”为1与10之间的任何值。
B.具有间隔物的CPSP抗体偶联物。
Figure BDA0002017627730001631
*在以上合成中，DMF为二甲基甲酰胺。
3-(9-((4-5-羧基戊基)氨基)-4-氧代丁基)(甲苯磺酰基)氨基甲酰基)吖啶-10-鎓-10-基)丙烷-1-磺酸酯(4)：将配备有电磁搅拌器和氮气入口的25mL圆底烧瓶装填3-(9-((3-羧丙基)(甲苯磺酰基)氨基甲酰基)吖啶-10-鎓-10-基)丙烷-1-磺酸酯CPSP(1)(1mmol)、吡啶(5mmol)和二甲基甲酰胺(10mL)。在冰浴中冷却溶液且逐滴添加三氟乙酸五氟苯基酯(1.3mmol)。移开冰浴，并且将反应物在室温下搅拌3小时。随后将6-氨基己酸(1.3mmol)以小份添加到反应物中，接着添加N,N-二异丙基乙胺(5mmol)，且在室温下搅拌反应物1小时。此后，在真空中从反应物中移除挥发性组分且通过逆相HPLC来纯化残余物，得到标题化合物。
3-(9-((4-侧氧基-4-((6-侧氧基-6-(全氟苯氧基)己基)氨基)丁基)(甲苯磺酰基)氨基甲酰基)吖啶-10-鎓-10-基)丙烷-1-磺酸酯(5)：将配备有电磁搅拌器和氮气入口的25mL圆底烧瓶装填4(1mmol)、吡啶(5mmol)和二甲基甲酰胺(10mL)。在冰浴中冷却溶液且逐滴添加三氟乙酸五氟苯基酯(1.3mmol)。移开冰浴，并且将反应物在室温下搅拌3小时。此后，在氮气流下从反应物中移除挥发性组分且通过逆相HPLC来纯化残余物，得到标题化合物。
具有间隔物的CPSP抗体偶联物(6)：将5的溶液(1μL的10mM溶液于DMSO中)添加到抗体溶液(100μL的10μM溶液于水中)和碳酸氢钠水溶液(10μL的1M溶液)。所得混合物在室温下搅拌4小时。在离心柱上实现产物的纯化，得到具有间隔物的CPSP抗体偶联物6。通常，“n”为1与10之间的任何值。
C.CPSP寡核苷酸-抗体偶联物。
Figure BDA0002017627730001651
*在以上合成中，DMF为二甲基甲酰胺。
9-((3-羧丙基)(甲苯磺酰基)氨基甲酰基)-10-(丙-2-炔-1-基)吖啶-10-鎓(8)：将配备有电磁搅拌器和氮气入口的100mL圆底烧瓶装填炔丙醇(10mmol)、2,6-二-叔丁基吡啶(10mmol)和氯化甲烷(50mL)且冷却到-20℃。随后将三氟甲磺酸酐逐滴添加到溶液中且在-20℃下搅拌反应物2小时。将戊烷(25mL)添加到反应物中且通过过滤来分离所得沉淀的盐类。在真空中蒸发挥发性组分且将残余物再溶解于100mL圆底烧瓶中的氯化甲烷(25mL)中。以小份添加4-(N-甲苯磺酰基吖啶-9-甲酰胺基)丁酸(CP-吖啶)(7)(1mmol)且将反应物在室温下搅拌18小时。在真空中蒸发挥发性组分且将残余物溶解在甲醇(5mL)中并通过逆相HPLC来纯化，得到标题化合物。
9-((4-侧氧基-4-(全氟苯氧基)丁基)(甲苯磺酰基)氨基甲酰基)-10-(丙-2-炔-1-基)吖啶-10-鎓(9)：将配备有电磁搅拌器和氮气入口的25mL圆底烧瓶装填8(1mmol)、吡啶(5mmol)和二甲基甲酰胺(10mL)。在冰浴中冷却溶液且逐滴添加三氟乙酸五氟苯基酯(1.3mmol)。移开冰浴，并且将反应物在室温下搅拌3小时。在真空中从反应物中移除挥发性组分且将残余物溶解在甲醇中并通过逆相HPLC来纯化，得到标题化合物。
CPSP抗体偶联物(10)：将9的溶液(1μL的10mM溶液于DMSO中)添加到抗体溶液(100μL的10μM溶液于水中)和碳酸氢钠水溶液(10μL的1M溶液)。所得混合物在室温下搅拌4小时。在离心柱上实现产物的纯化，得到CPSP抗体偶联物10。通常，“n”为1与10之间的任何值。
CPSP寡核苷酸-抗体偶联物(11)：将寡聚叠氮化物(10nmol于5μL水中)、CPSP抗体偶联物10(10nmol于10μL水中)和新制备的0.1M“点击溶液”(3μL-参见下文)的混合物在室温下振荡4小时。用0.3M乙酸钠(100μL)稀释反应物且通过添加EtOH(1mL)来沉淀DNA偶联物。移除上清液且用冷EtOH(2×1mL)洗涤残余物2次。将残余物溶解于水(20μL)中且CPSP寡核苷酸-抗体偶联物11的溶液不经进一步纯化即使用。通常，“n”为1与10之间的任何值。
“点击溶液”：将CuBr(1mg)溶解于70μL DMSO/t-BuOH 3:1中以形成0.1M溶液。(这种溶液必须新制备且不能存储。)将三(苯甲基三唑基甲基)胺(TBTA)(54mg)溶解于1mLDMSO/t-BuOH 3:1中以形成0.1M溶液。(这种溶液可存储于-20℃下。)将1体积的0.1M CuBr溶液添加到2体积的0.1M TBTA溶液中以得到“点击溶液”。
D.具有间隔物的CPSP寡核苷酸-抗体偶联物。
Figure BDA0002017627730001671
*在以上合成中，DMF为二甲基甲酰胺。
9-((4-((5-羧基戊基)氨基)-4-氧代丁基)(甲苯磺酰基)氨基甲酰基)-10-(丙-2-炔-1-基)吖啶-10-鎓(12)：将配备有电磁搅拌器和氮气入口的25mL圆底烧瓶装填8(1mmol)、吡啶(5mmol)和二甲基甲酰胺(10mL)。在冰浴中冷却溶液且逐滴添加三氟乙酸五氟苯基酯(1.3mmol)。移开冰浴，并且将反应物在室温下搅拌3小时。随后将6-氨基己酸(1.3mmol)以小份添加到反应物中，接着添加N,N-二异丙基乙胺(5mmol)，且在室温下搅拌反应物1小时。此后，在真空中从反应物中移除挥发性组分且通过逆相HPLC来纯化残余物，得到标题化合物。
9-((4-侧氧基-4-((6-侧氧基-6-(全氟苯氧基)己基)氨基)丁基)(甲苯磺酰基)氨基甲酰基)-10-(丙-2-炔-1-基)吖啶-10-鎓(13)：将配备有电磁搅拌器和氮气入口的25mL圆底烧瓶装填12(1mmol)、吡啶(5mmol)和二甲基甲酰胺(10mL)。在冰浴中冷却溶液且逐滴添加三氟乙酸五氟苯基酯(1.3mmol)。移开冰浴，并且将反应物在室温下搅拌3小时。此后，在氮气流下从反应物中移除挥发性组分且通过逆相HPLC来纯化残余物，得到标题化合物。
具有间隔物的CPSP抗体偶联物(14)：将13的溶液(1μL的10mM溶液于DMSO中)添加到抗体溶液(100μL的10μM溶液于水中)和碳酸氢钠水溶液(10μL的1M溶液)。将这种混合物在室温下搅拌4小时。在离心柱上实现产物的纯化，得到具有间隔物的CPSP抗体偶联物14。通常，“n”为1与10之间的任何值。
CPSP寡核苷酸-抗体偶联物(15)：将寡聚叠氮化物(例如，如可商购的)(10nmol于5μL水中)、具有间隔物的CPSP抗体偶联物14(10nmol于10μL水中)和新制备的0.1M“点击溶液”(3μL-参见实例6.C)的混合物在室温下振荡4小时。通常，“n”为1与10之间的任何值。用0.3M乙酸钠(100μL)稀释反应物且通过添加EtOH(1mL)来沉淀DNA偶联物。移除上清液且用冷EtOH(2×1mL)洗涤残余物2次。将残余物溶解于水(20μL)中且具有间隔物的CPSP寡核苷酸-抗体偶联物15的溶液不经进一步纯化即使用。
具有或不具有间隔物的CPSP抗体偶联物和具有或不具有间隔物的CPSP寡核苷酸-抗体偶联物的裂解.如所描述的具有或不具有间隔物的CPSP抗体偶联物和具有或不具有间隔物的CPSP寡核苷酸-抗体偶联物使用碱性过氧化氢溶液来裂解或“触发”。在
Figure BDA0002017627730001681
系统中，激发态吖啶酮中间产物产生光子，测量所述光子。另外，裂解产物为吖啶酮和磺酰胺。通过计数吖啶酮和/或磺酰胺分子，将实例6.A-D的偶联物与所公开的装置一起使用。
E.不具有抗体的CPSP寡核苷酸偶联物。
Figure BDA0002017627730001691
不具有抗体的CPSP寡核苷酸偶联物(16)：将寡聚叠氮化物(例如，如可商购的)(10nmol于5μL水中)、炔丙基-CPSP 8(10nmol于10μL水中)和新制备的0.1M“点击溶液”(3μL-参见实例6.C)的混合物在室温下振荡4小时。可用0.3M乙酸钠(100μL)稀释反应物且通过添加EtOH(1mL)来沉淀DNA偶联物。可移除上清液且用冷EtOH(2×1mL)洗涤残余物2次。将残余物溶解于水(20μL)中且具有间隔物的CPSP寡核苷酸-抗体偶联物16的溶液可不经进一步纯化即使用。
实例7
低成本DMF底部芯片的制造。
使用辊到辊(R2R)柔性印刷法与润湿剥离工艺组合来制造低成本柔性DMF芯片以用于通过使用Lo C-Y等人，《微电子工程(Microelectronic Engineering)》86(2009)979-983中描述的具有一些修改的工艺进行电极图案化。制造工艺的示意图描绘于图10中。
Figure BDA0002017627730001692
ST506聚对苯二甲酸伸乙酯(PET)5.0mil衬底(1)的辊用作DMF电极印刷的起始物质。在网纹辊组合件上，使用1.14mm厚的印刷板(Flint MCO3)，以10米/分钟的速率，使用3.8ml/m2的油墨转移体积将黄色油墨层(太阳化学(Sun Chemical))柔性印刷(2)于PET衬底上。DMF电极图案的负像由柔性版印刷步骤(3)产生。在金属沉积之前，在热气烘箱(2×100℃)中将油墨干燥两次。EVA R2R金属蒸发器用于将银金属层沉积到印刷的PET衬底上以形成厚度呈80nm的均匀银涂层(4)。金属化油墨膜衬底(5)使用丙酮加超声波在超声处理浴液中的组合以1米/分钟的速度进行润湿剥离工艺(6)。这种化学/物理处理允许银油墨层溶解，同时保持仅银层完整。去除油墨银层产生由具有50或140μm电极间隙间隔的80个致动电极(2.25×2.25mm)组成的DMF印刷电极图案(7)。作为QC检查，针对电极间隙间隔和连接件引线宽度变化视觉上检查到来自单一辊的总共80到90个随机芯片。确定具有可接受间隙规格的芯片通常产率接近100％。单个制造的柔性芯片描绘于图11中。所制造的柔性芯片测量3"×2"且包括电极、储槽、接触垫和引线。
通过使用旋转丝网印刷或凹版印刷将介电涂层施加到电极和储槽。对于旋转丝网印刷，Henkel EDAC PF-455B通过用Gallus NF(400L)筛以2米/分钟的印刷速度和50％的UV固化速率印刷而用作介电涂层。通常的介电厚度是10-15μm。对于凹版印刷，圆筒被设计成以2米/分钟的速度使用50ml/m2的油墨体积印刷高黏度介电油墨，例如IPD-350(Inkron)。用于凹版印刷的通常的介电厚度是7-8μm。最终疏水层使用Millidyne Avalon 87或Cytonix Fluoropel PFC 804 UC涂料用凹板圆筒(140-180L)印刷，印刷速度为8米/分钟，随后为四个连续的烘箱干燥步骤(4×140℃)。通常的疏水厚度是40-100nm。
替代地，对于小批量的单个芯片，可分别使用化学气相沉积(CVD)和旋涂施加介电和疏水涂层。
实例8
低成本DMF芯片的功能性测试
测试如实例7中所概述制造的基于3"×2"PET的DMF底部芯片的致动能力。图12描绘了其上安置0.7mm厚的玻璃衬底(3)的基于3"×2"PET的DMF芯片(1)。玻璃衬底(3)包括玻璃衬底的下部表面上的透明的氧化铟锡(ITO)电极和ITO电极上的铁氟龙涂层。DMF芯片包括80个具有直边电极设计和电极之间50μm间隙的银致动电极，以及8个缓冲液储槽(参见以上的实例7)。
底部电极分别通过CVD和旋涂涂布有介电聚对二甲苯基-C层(6-7μm厚)和铁氟龙的最终涂层(50nm厚)。将具有0.1％表面活性剂的大约50μl PBS缓冲液(2)吸取到底部DMF芯片上的四个相邻储槽中。液滴大小范围介于700-1,500nL(一个或两个液滴)且除混合所需的圆形扫动图案以外还检查竖直和水平横向移动(4)。使用90Vrms的电压实现液滴致动。对芯片上大约90％的致动电极进行测试且发现其功能齐全。
实例9
对低成本DMF芯片的TSH免疫测定
使用化学发光检测，测试用如以上实例8中所描述的玻璃衬底覆盖的基于3'×2"PET的DMF芯片执行促甲状腺激素(TSH)免疫测定的能力。包括TSH校准物质的模拟样品添加到含有封闭剂和表面活性剂的tris缓冲生理盐水(TBS)缓冲液中。测试三个样品-0μIU/ml、4μIU/ml、40μIU/ml。将涂布于5μm磁性微颗粒(3×108个颗粒/毫升)上的2μl的抗βTSH捕获抗体从微颗粒储槽分配到DMF电极阵列的中部中。磁性微颗粒通过接合DMF芯片下的钕磁铁棒(3英寸×1/2英寸×1/4英寸厚，相对渗透性μr＝1.05，残余部分场强度Br＝1.32T)与缓冲液分离(图13A)。将5μL样品移动到微颗粒段塞，随后将四个电极正方形配置上的微颗粒悬浮液(图13B)混合5分钟。通过磁体将微颗粒从样品中分离，并且将上清液移动到废液储槽(图13C和13D)。将偶联到辣根过氧化物酶(HRP)的2μL的1μg/mL抗TSH检测抗体移动到微颗粒段塞中并混合2分钟。微颗粒由磁体分离，并且将上清液移动到废液储槽。含有免疫测定夹心复合物的微颗粒用含有0.1％表面活性剂的4×2μl的PBS洗涤缓冲液洗涤总共四次。在步骤完成之后将来自每个洗涤步骤的洗涤缓冲液移动到废料中。化学发光底物由1μLSuperSignal H2O2和1μL鲁米诺(luminol)(赛默飞世尔科学(ThermoFisher Scientific))组成，将所述底物移动到微颗粒粒段塞，接着混合6分钟。使用具有5V DC源极的集成Hamamatsu H10682-110 PMT在427nm传输光(347nm激发)下测量化学发光信号。针对相对发光绘制剂量反应曲线(参见图13E)。
实例10
纳米孔模块制造
使用标准软光刻制造方法结合可商购的内嵌于TEM窗(Norcada)中的氮化硅(SiNx)膜的集成来制造纳米孔模块。所述模块由四个独立的PDMS层(含有转移微通道的顶部和底部PDMS衬底)和两个任选的密封TEM窗的中间产物PDMS层组成。
SU8母模制造：用光致抗蚀剂(SU8-50)将干净、干燥的玻璃衬底旋涂到所需的厚度。随后使用光遮罩将经过涂布的衬底的区域选择性地曝光于近似UV光。遮罩仅在保持转移微通道和储槽形状的区域中将光致抗蚀剂曝光于UV光。曝光之后进行烘烤以交联曝光的光致抗蚀剂区域。SU8显影剂随后用于从衬底中去除剩余的未曝光的光致抗蚀剂。最终产品为母模-一种具有图案化转移微通道和硬质光致抗蚀剂储槽的玻璃衬底。
中间PDMS层制造：对于制造中间PDMS层，将以7:1PDMS单体:固化剂的比率含有PDMS单体和其固化剂(Sylgard 184硅酮弹性体)的溶液旋涂在玻璃载片上，接着在加热板上在70℃下加热30分钟。将PDMS层剥离玻璃衬底且穿过PDMS层冲压出1.25mm切口以提供允许进入TEM窗的开口。通过使用电晕处理器在8mm的距离处等离子处理30秒来使PDMS层的表面为亲水的。在结合两个中间PDMS层之间的SiNx TEM窗之前，使用第二次等离子处理(5秒)以处理PDMS层和TEM窗的表面。
顶部和底部PDMS制造：如图14B所示，通过以7:1PDMS单体:固化剂的比率混合PDMS单体和固化剂并倾倒在含有图案化有转移微通道和储槽的SU8图案化模(6)的玻璃上来制造含有微通道的顶部和底部PDMS衬底(参见上文所描述的SU8母模制造)。测量微通道的宽度大致为110到135μm且深度为50μm。在脱气15分钟之后，在70℃下在加热板上加热SU8模60分钟(7)。在固化之后，将PDMS衬底剥离SU8模(8)并切割，得到具有大致尺寸为30mm长度×20mm宽度×3mm深度的矩形PDMS衬底。穿过PDMS衬底冲压出接入孔(直径为1.25mm)以允许电极随后插入到微通道中。最终组合件示出于图14A中且从底部到顶部包括含有一个微通道的底部PDMS衬底(1)、含有位于微通道上方的切口的第一中间PDMS层(2)、TEM窗中的SiNx膜(3)、同样含有切口的第二中间PDMS层(4)，和含有第二微通道的顶部PDMS衬底(5)。
顶部和底部PDMS衬底的对准：PDMS底部衬底(如上文“顶部和底部PDMS制造”中概述所制备)被等离子体处理30秒，接着将第一中间PDMS层(如上文“中间PDMS层制造”中概述所制备)结合到PDMS底部衬底上。类似地，PDMS顶部衬底被等离子体处理30秒，接着将第二中间PDMS层结合到PDMS顶部衬底上。中间层中的切口与微通道对准。顶部和底部PDMS段两者均被氧等离子体处理30秒，接着将SiNx膜窗放置在顶部与底部段之间并与中间PDMS层中的切口对准。与SiNx膜(其与底部段对准)对准的顶部段按压在一起直到所有气泡被释放。最终纳米孔PDMS组合件在100℃下在加热板上加热30分钟并且被等离子体处理5分钟。图14C中所示的最终模块组合件(9a)含有两个通道(一个笔直和一个“L形”通道)，每一个均结束在溶液(例如，缓冲液)储槽中。含有SiNx膜的TEM窗定位于两个垂直微通道的交叉点处(图14C，9b)。
实例11
纳米孔制造
通过使容纳于两个PDMS层之间的SiNx TEM窗经历电势偏压直到发生介电击穿，进而在膜中打开小直径的孔洞来完成纳米孔制造。这允许在检测分析物之前在微流体装置内原位形成孔。通过介电击穿形成纳米孔先前已示出适用于在固态介电膜中快速制造较小直径孔(H.Kwok,K.Briggs,V.Tabard-Cossa，《科学公共图书馆综合卷》，9(3)，2014)。
可商购的作为透射电子显微镜(TEM)窗(Norcada)的SiNx膜内嵌于如以上实例10中概述的组合PDMS模块中且用于产生纳米孔。将SiNx TEM窗的横截面积(50μm×50μm)暴露于盐溶液(1M KCl)的垂直微通道接合部安置于所述膜的相对侧上(顺和反)。将Ag/AgCl电极放置于距离SiNx TEM窗中心大致3mm的每一个微通道中，进入通过PDMS衬底冲压的孔洞。含有钝针的注射器用于通过将乙醇添加到两个储槽中来填充顺和反微通道两个，直到观测到从模块边缘上的通道开口中出现液体。测量电阻以检查恰当的密封且确保TEM-SiNx膜是完整的。数量级为MΩ的电阻指示良好的密封和完整并未受损的膜。用去离子水从微通道中冲洗出乙醇，并且通过注入两个储槽中用1M KCl溶液替换。再次测量电阻以检查恰当的密封。
将4.4V恒定电压施加到膜组合件且实时监测泄漏电流。实时测量的泄漏电流绘制于图15A中。图15A示出了在纳米孔产生之前的泄漏电流(1)。将>5nA的临限值用作截止值，即表示孔产生。在大致10分钟之后，观测到泄漏电流增加(2)。断开电压紧接着检测泄漏电流的增加。所产生孔的直径是6.9nm，如由以下关系式确定：
Figure BDA0002017627730001741
其中G＝电导率，σ＝体电导率(对于KCl测量的12.35S/m)，L＝膜的厚度(10nm)，d＝孔径(S.Kowalczyk,A.Grosberg,Y.Rabin,C.Dekker，《纳米技术(Nanotech.)》，22，2011)。
在孔产生之后，电流-电压(I-V)曲线(参见图15B)用于验证纳米孔所显示的欧姆行为，指示纳米孔在形状上对称且电阻与所施加的电压或电流无关。相同的1M KCl溶液用于孔制造和I-V曲线两个。
实例12
干燥微通道填充
测试经组合PDMS模块(即，包括DMF模块和纳米孔模块的集成装置)中所含有的毛细管导管从DMF电极组合件自发地填充高盐溶液的能力(图16A-16C)。填充经由自发性毛细流动(SCF)来实现。不包括纳米孔膜以允许更好的观测微通道。参考图16A，含有80个致动电极(1)(2.25mm×2.25mm，Cr-200nm厚度)的玻璃DMF芯片(3"×2"×0.0276")用于移动3.6MLiCl液滴(2)、0.05％Brij 35和蓝染料(以辅助观测)。PDMS模块(3)含有两个面对DMF电极阵列(4)的开口、两个储槽(5)和两个微通道-一个笔直通道(6)和一个L形通道(7)。模块组合件放置在DMF玻璃表面上以使得两个通道开口面对DMF电极阵列的内部。由于不使用顶部接地电极，因此可通过使用共平面底部电极来实现液滴移动以产生驱动电势。
将蓝色LiCl盐溶液的10μL液滴放置在DMF电极阵列中间的电极上。100Vrms电压(10kHz)用于将液滴移动到邻近笔直微通道开口的转移电极。如图16B所示，在液滴接触PDMS表面(8)之后，测量填充130μm直径的笔直通道(9)并且达到储槽所需的时间。如图16C所示，在大致30秒之后，液滴体积明显地较小(10)且通道是半填充的(11)。需要总时间53秒以填充整个干燥的微通道(130μm直径)。
润湿微通道填充：将蓝色LiCl盐溶液的10μL液滴放置在DMF电极阵列中间的电极上。100Vrms电压(10kHz)用于将液滴移动到邻近笔直微通道开口的转移电极。通道预填充有乙醇以模拟经预湿的通道。在液滴接触PDMS表面之后，需要<1秒的时间以填充通道直到储槽。这与干燥通道相比显著更快，从而表明用亲水的溶液预湿提高了微通道填充速率。
实例13
集成硅NP装置中的DMF液滴转移
除了柔性衬底，如PDMS之外，可使用刚性衬底(例如硅)以制造纳米孔模块。图17示出了含有致动电极(4)的数字微流体(DMF)芯片(1)，液滴从所述致动电极被转移到含有纳米孔传感器的硅微流体芯片(2)。液滴通过含有纳米孔传感器的微流体芯片的顶表面中的接入端口(3)在两个组件芯片之间转移。接入端口通过微流体通道(6)连接到纳米孔传感器(5)。液滴从接入端口移动，通过毛细管力通过微流体通道，且可通过由微柱阵列(7)构成的被动式纸泵来辅助移动(图18)。被动泵还可从微通道中去除流体，从而实现依序使用不同的流体溶液而无污染(例如用于纳米孔形成与纳米孔感测的溶液之间)。
硅纳米孔模块的制造可包括使用标准的CMOS光刻法和蚀刻工艺。图18示出了硅纳米孔模块设计的实例，其中大致的模大小为10mm×10mm，具有用于填充纳米孔缓冲液的前侧通道(顺)和后侧通道(反)。前侧通道具有30μm的宽度和深度，且长11mm。后侧通道具有50μm的宽度、200μm的深度，且长11mm。微柱尺寸为30μm的柱直径，30μm的间距和200μm的深度。
DMF和纳米孔模块可使用由模制塑胶构成的接口或通过直接结合来接合(图19和图20)。位于与接入端口对准的DMF芯片内的电极(4)上的液滴通过毛细管力来转移，通过插入器(7)促进。替代地，DMF芯片上的顶部电极(8)可修改成进一步通过引入连接致动电极(4)与插入器(8)的孔洞来促进这个工艺(图20)。
实例14
通过毛细管力使液滴在DMF与纳米孔模块之间转移。
在硅微流体芯片中测试将DMF芯片的高盐转运缓冲液移动到含有合适纳米孔膜的模块的能力。使用自发性毛细管流动(SCF)作为单一驱动力测试蛇形微通道被动移动1MKCl液滴(pH＝8)的能力。完整的微通道在硅中制造且在基于CMOS的硅环境中充当流体转移用模型。蛇形微通道设计成具有两个接入端口(用于流体装载)。通道尺寸经测量直径为160μm，具有2.5cm的大致长度。经证实适用于通过介电击穿形成纳米孔的溶液液滴使用被动毛细管力来填充硅微流体结构。
参考图21，将1M KCl溶液的个别液滴(pH＝8.0)放置在连接到传输微流体通道(2)的入口端(1)中的一个中，从而产生长度为2.5cm的蛇形通道(3)。端口(未显示)处端接的通道(4)暴露于常压。蛇形通道的放大图像示出于图22中。使用安装到光学显微镜的sCMOS摄像机来监测毛细管填充。盐溶液沉积到入口端中使得通过被动毛细管力以几毫米/秒的速率自发性填充微通道，进而证实将微通道中的流体转移到纳米孔膜的能力。
作为转移速率的另一测试，使通道排空KCl溶液且在氮气流下干燥。将1M KCl溶液的其它液滴(pH＝8.0)放置在经干燥微通道的入口端中且使用光学显微镜监测毛细管填充。相比于“干燥”通道(即，相比于第一次将KCl溶液引入到通道中)，观测到更快的填充速率，进而示出用亲水的溶液预填充硅微通道增强了后续的流体填充。
实例15
制造具有流体微通道的集成纳米孔传感器
使用光刻法和蚀刻工艺制造流体微通道内的集成纳米孔传感器以改变氧化硅(SOI)晶片(图23A-23B)。
SOI晶片(1)经受光刻法和蚀刻(2)以产生适用于移动较小流体体积的具有尺寸为30μm宽度和10-30μm通道深度的结构(3)。
通过蒸发(4)将氮化硅(SiN)材料(5)沉积于图案化SOI晶片上。
通过蒸发(6)将氧化物材料层(7)沉积于氮化硅(5)上。通过使用光刻法和蚀刻的组合(6)选择性地去除覆盖微观结构中的一个的上覆氧化物和氮化物材料来暴露下面的硅(1)。这个结构将形成用于致动较小体积流体的微通道。
通过仅使用光刻法和蚀刻的组合(8)去除上覆氧化物层来选择性地暴露第二微结构内的下面的氮化硅。
暴露的微观结构永久性地结合到载体晶片(9)且倒转结构以用于进一步加工(10)。使用光刻法和蚀刻的组合使SOI晶片的相反侧上的氧化物材料选择性图案化以暴露每一个微结构的背侧(11)。
实例16
可裂解DNA-生物素构建体的合成。
非生物素标记的双链DNA的合成(NP1)：使用标准的亚磷酰胺化学方法(集成DNA技术)合成两个单链50聚体。由5'末端上含有氨基的50个核苷酸DNA序列组成的寡核苷酸NP1-1S由C-12碳间隔物(SEQ ID NO:1)(1，MW＝15,522.3克/摩尔，ε＝502,100M-1cm-1)与DNA分离。由50个核苷酸DNA序列组成的寡核苷酸NP1-2AS与NP1-1S(SEQ ID NO:2)(2，MW＝15,507.1克/摩尔，ε＝487,900M-1cm-1)互补。在后续操控之前定量且冻干两种寡核苷酸。
Figure BDA0002017627730001781
非生物素标记的双链50-bp DNA构建体的合成：将NP1-2AS(1.44mg，93.4纳摩尔)在0.5mL蒸馏水中复水，得到187μM溶液。将NP1-1S(1.32mg，85.3纳摩尔)在0.5mL的50mM磷酸酯、75mM氯化钠缓冲液pH 7.5中复水，得到171μM溶液。通过用40μL NP1-2AS溶液(7.47微摩尔)使60μL的NP1-1S溶液(10.2微摩尔)退火制得双链构建体(3)(SEQ ID NO:1-正向链(顶部)；SEQ ID NO:2-反向链(底部))。将混合物放置在85℃下的加热块中30分钟，接着历经2小时缓慢冷却到室温。通过在用10mM PBS缓冲液，pH 7.2平衡的TosoH G3000SW柱(7.8mm×300mm)上注入总退火体积(100μL)来纯化双链材料。在260nm和及280nm下监测柱洗脱液。双链材料(3)在7.9分钟处洗脱(大致20分钟)。使用0.5mL Amicon过滤器浓缩器(MW截止值10,000Da)使DNA浓缩到150μL。最终DNA浓度计算为40.5μM，如通过A260吸光率确定。
Figure BDA0002017627730001791
单链5'-氨基寡核苷酸的生物素化：通过将6mg粉末溶解于0.099mL无水DMSO(西格玛阿尔德里奇)中来制得100mM磺基-NHS-SS-生物素溶液(4，赛默飞世尔科学)。使溶液涡旋且紧接着用于使5'-氨基-DNA生物素化。将大致100μL的含ssDNA(1，171μM，17.1微摩尔，0.265mg)(SEQ ID NO:1)溶液的50mM PBS，pH 7.5与3.4μL的含0.1mM生物素化试剂的DMSO(34.1微摩尔，摩尔量超过ssDNA的20倍)混合。使混合物混合且使其在室温下反应2小时。两个0.5mL Zeba离心脱盐柱(MW截止值7,000Da，赛默飞世尔科学)在10mM PBS，pH 7.2中平衡。将粗制生物素标记的ssDNA溶液添加到一个Zeba柱且在4,600rpm下洗脱1.3分钟。将洗脱液转移到第二个Zeba柱且如描述来洗脱。经纯化NP1-1S-SS-生物素(5)(SEQ ID NO:1)的浓度通过测量A260吸光率来确定(2.03mg/ml，131μM)。
生物素标记的双链DNA的形成:将大致60μL的NP1-1S-SS-生物素溶液(5，7.85微摩尔，131μM，2.03mg/mL)与42μL的NP1-2AS溶液(2，7.85微摩尔，187μmol/L)(SEQ ID NO:2)混合。将溶液放置在85℃下的加热块中30分钟，接着历经2小时缓慢冷却到室温。在TosoHG3000SW柱(7.8mm×300mm)上通过注入总退火体积(大致100μL)使用10mM PBS，pH 7.2来纯化双链产物。双链生物素标记材料在7.9分钟处洗脱(20分钟运行时间)，如通过A260吸光率监测。使用0.5mL Amicon过滤器浓缩器(MW截止值10,000Da)使洗脱液体积减少到480μL。最终NP1-二硫基生物素(6)(SEQ ID NO:1-正向链(顶部)；SEQ ID NO:2-反向链(底部))浓度计算为16.3μM，如通过A260吸光率确定。
实例17
可裂解DNA-生物素构建体的替代性合成。
互补DNA序列(NP-31a和NP-31b)：使用标准的亚磷酰胺化学方法(集成DNA技术)合成两个单链60聚体。由5'末端上含有氨基的60个核苷酸DNA序列组成的寡核苷酸NP-31a由C-6碳间隔物(SEQ ID NO:3)(1，MW＝18,841.2克/摩尔，1.7μM/OD)与DNA分离。由60个核苷酸DNA序列组成的寡核苷酸NP-31b与NP-31a(SEQ ID NO:4)(2，MW＝18292.8克/摩尔，1.8μM/OD)互补。在后续操控之前定量且冻干两种寡核苷酸。
Figure BDA0002017627730001811
单链5'-氨基寡核苷酸NP-31a的生物素化：通过将15.04mg粉末溶解于2.0mL二甲基甲酰胺(西格玛阿尔德里奇)中来制备10mM NHS-S-S-dPEG4-生物素溶液(4，MW＝751.94克/摩尔，量子生物设计有限公司(Quanta BioDesign,Ltd))。使溶液涡旋且紧接着用于使5'-氨基-DNA生物素化。将大致100μL的含ssDNA(1，100μM，0.01微摩尔，0.188mg)(SEQ IDNO:3)溶液的10mM磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH 7.4与10μL的含10mM生物素化试剂的DMF(0.1微摩尔，摩尔量超过ssDNA的10倍)混合。使混合物混合且使其在室温下反应2小时。两个0.5mL Zeba离心脱盐柱(MW截止值7,000Da，赛默飞世尔科学)在10mM PBS，pH 7.2中平衡。将粗制生物素标记的ssDNA溶液添加到一个Zeba柱且在4,600rpm下洗脱2分钟。将洗脱液转移到第二个Zeba柱且如描述来洗脱。经纯化NP-31-SS-生物素(5)(SEQ ID NO:3)的浓度通过测量A260吸光率来确定(1.45mg/mL，77μM)。
Figure BDA0002017627730001821
生物素标记的双链DNA的形成：将大致60μL的NP-31-SS-生物素溶液(5，77μM)(SEQID NO:3)与50μL的NP-31b溶液(2，100μM)混合。将溶液放置在85℃下的加热块中30分钟，接着历经2小时缓慢冷却到室温。在TosoH G3000SW柱(7.8mm×300mm)上通过注入总退火体积(大致100μL)使用10mM PBS，pH 7.2来纯化双链产物(SEQ ID NO:3-正向链(顶部)；SEQ IDNO:4-反向链(底部))。双链生物素标记材料在7.57分钟处洗脱，如通过A260吸光率监测。使用0.5mL Amicon过滤器浓缩器(MW截止值10,000Da)使洗脱液体积减小。最终dsNP-31-SS生物素(6)(SEQ ID NO:3-正向链(顶部)；SEQ ID NO:4-反向链(底部))浓度计算为11μM，如通过A260吸光率确定。
实例18
可裂解DNA-生物素-硫醇介导的裂解构建体的合成
ssNP-31-SS-生物素与抗生蛋白链菌素涂布的磁性微颗粒(SA-MP)的结合和化学 裂解(TCEP或DTT)：经由以下方法在磁性微颗粒上进行化学裂解实验(参见图25)。在室温下将100μL的含77μM经修饰寡核苷酸ssNP-31-SS-生物素溶液的PBS，pH 7.2与1μL 0.1％抗生蛋白链菌素顺磁性微颗粒一起孵育30分钟。通过将颗粒吸引到磁体并且用PBST缓冲液，pH7.4洗涤10次来移除过量到寡核苷酸。将寡核苷酸结合颗粒与不同浓度的DTT或TCEP一起孵育在PBS，pH 7.4中15分钟。用PBST缓冲液，pH 7.4洗涤微颗粒10次以去除任何裂解的寡核苷酸。将含有荧光团的互补序列NP-31c(SEQ ID NO:5)(7，MW＝7494.6克/摩尔，5.2μM/OD)与微颗粒在PBS，pH 7.4中一起孵育30分钟以与在颗粒上保持完整的任何未裂解的ssNP-31-SS-生物素结合。微颗粒附着到磁体上且用PBST缓冲液，pH 7.4洗涤10次以去除任何过量的NP-31c节段。被洗涤但不经受化学裂解的如上制备的经涂布微颗粒充当对照。通过荧光显微法测量颗粒上的荧光信号。针对DTT和TCEP测量的最大裂解效能为79％和93％，分别如表1中所示。
Figure BDA0002017627730001831
表1
Figure BDA0002017627730001832
Figure BDA0002017627730001841
实例19
可裂解DNA-生物素-可光裂解构建体的合成
可光裂解DNA序列的评估和微颗粒上的裂解效能：使用标准的亚磷酰胺化学方法(集成DNA技术)合成单链DNA的可光裂解序列。组成两个寡核苷酸区段(寡核苷酸8-1(SEQID NO:6)和寡核苷酸8-2(SEQ ID NO:7))的由48个核苷酸组成的寡核苷酸由两个可光裂解部分分离(8，MW＝15,430.1克/摩尔，441800L mol-1cm-1)。5'末端含有由C-6碳间隔物与DNA分离的氨基。合成含有荧光标签的寡核苷酸8-2的互补链(9，MW＝7738.8克/摩尔，212700Lmol-1cm-1)(SEQ ID NO:8)。在后续操控之前定量且冻干两种寡核苷酸。
寡核苷酸8-1(SEQ ID NO:6):5'AAA AAA GGT CCG CAT CGA CTG CAT TCA3'
寡核苷酸8-2(SEQ ID NO:7):5'CCC TCG TCC CCA GCT ACG CCT3'
NP-8(8)(由两个可光裂解部分(“PC”)接合的寡核苷酸8-1(SEQ ID NO:6)和寡核苷酸8-2(SEQ ID NO:7))：
H2N-5'AAAAAAGGTCCGCATCGACTGCATTCA-PC—PC-CCCTCGTCCCCAGCTACGCCT3'
NP-9(9)(SEQ ID NO:8):AlexaFluor546-5'AGG CGT AGC TGG GGA CGA GGG3'
Figure BDA0002017627730001842
可光裂解部分(PC)
经由以下方法在磁性微颗粒上进行可光裂解实验(参见图26A和图26B)。NP-8共价附着于抗体以产生Ab-寡核苷酸复合物(由生物合成有限公司(Biosynthesis Inc.)制备)。将100μL的33nM抗体-寡核苷酸复合物与1μL 0.1％固体山羊抗小鼠微颗粒在室温下一起孵育30分钟。通过将颗粒吸引到磁体并且用PBST缓冲液，pH 7.4洗涤10次来移除过量的抗体-寡核苷酸复合物。将微颗粒复合物溶液在UV光(300-350nm波长)下照射5分钟。微颗粒附着到磁体上且用PBST缓冲液，pH 7.4洗涤10次以去除任何裂解的寡核苷酸区段。在将颗粒再悬浮于PBST缓冲液，pH 7.4中之后，将荧光标记的寡核苷酸9(SEQ ID NO:8)添加到经辐射微颗粒中并在室温下孵育30分钟。被洗涤但不经受UV照射的如上制备的经涂布微颗粒(未裂解寡核苷酸8-2)充当对照。通过荧光显微镜成像颗粒上的荧光信号(
Figure BDA0002017627730001851
546)。在结合到顺磁性微颗粒时的裂解效能测量为74％，如表2中所示。
表2
微颗粒上的荧光信号(相对光单位)
照射 3660
无照射(对照) 13928
裂解效能 74％
实例20
可热裂解连接子
这个实例描述了可热裂解连接子和其裂解。这类可热裂解连接子可用于例如DMF芯片、基于液滴的微流体芯片、SAW芯片或类似物中，如本文所描述。
如在双链DNA的热分离中，通过升高温度超过阈值来裂解可热裂解连接子。可通过将光的能量转移到吸收目标来光热地实现DMF芯片的温度升高。在一个方法中，具有约980nm波长(范围介于约930nm到约1040nm)的光源(如激光器)可施加到流体样品区中的DMF芯片。光可被流体中的水分子吸收，使得温度增加和连接子的裂解。加热的水平和持续时间可通过脉冲长度、脉冲能量、脉冲数量和脉冲重复率来控制。举例来说，描述使用水的吸光带的光热加热，例如美国专利6,027,496。
光热加热还可以通过将光源与含有染料或颜料的目标耦合来实现。在这种情况下，DMF芯片的目标区域经打印有吸收染料或颜料，例如，碳黑。当流体与靶标接触时，将光源，例如，可商购的激光二极管导向光吸收目标处，使得连接子的温度和裂解局部增加。加热的水平和持续时间可通过目标的吸光属性、光波长、脉冲长度、脉冲能量、脉冲数量和脉冲重复率来控制。举例来说，使用光源以及光吸收目标的光热加热描述于美国专利6,679,841中。
在光热加热的第三方法中，可将吸收染料或颜料引入到DMF芯片中的流体中。光随后传输通过DMF芯片且能量转移到经溶解或悬浮的吸收材料，使得连接子的温度和裂解局部增加。加热的水平和持续时间可通过目标材料的吸光属性、光波长、脉冲长度、脉冲能量、脉冲数量和脉冲重复率来控制。在这个方法的一个实施例中，光吸收目标为装置中使用的磁性微颗粒悬浮液。举例来说，在流体液滴中使用悬浮纳米颗粒的光热加热描述于Walsh等人，《分析家(Analyst)》，140(5)，1535-42(2015)中。Walsh等人的参考文学还证实可在光热应用中实现的一些对照。
实例21
经由微波诱导的颗粒热疗完成热裂解
这个实例描述了使用微波诱导的颗粒热疗促进热变性(如dsDNA变性、逆Michael反应、逆狄尔斯阿尔德(retro-Diels-Alder)和其它消除)以经由热敏感性可裂解连接子释放可计数部分，这是因为免疫测定检测可使用低过滤微波辐射来加速。这类热敏感性可裂解连接子可用于例如DMF芯片中，如本文所描述。
在这个实例中，双链Tm在40-55℃范围内的垂直官能化短dsDNA区段(如15bp序列)的形成用作热释放剂。dsDNA区段可经由附接化学方法(如硫氢基-马来酰亚胺相互作用)与抗体反应且经由附接化学方法(如胺活化的甲酸化学方法)与26nm羧化聚苯乙烯纳米颗粒(NP)(如可获自Bangs Labs(Fishers，IN，USA)的那些)反应。26nm NP具有528.7μeq/g的表面电荷和68.4平方埃/基团的排列区(根据制造商信息)。抗体和纳米颗粒通过形成热触发的可释放连接子的dsDNA区段相关联。热连接子可使用如微波辐射以触发颗粒热疗和局部温度梯度的技术来裂解。
DNA序列1(10)(SEQ ID NO:9)：H2N-5'CAA GCC CGG TCG TAA3'
DNA序列1b((11)(SEQ ID NO:10):马来酰亚胺-5'TTA CGA CCG GGC TTG3'
dsDNA序列(12)(SEQ ID NO:9-正向链(顶部)；SEQ ID NO:10-反向链(底部))：
H2N-5'CAA GCC CGG TCG TAA3'
3'GTT CGG GCC AGC ATT5'-马来酰亚胺。
垂直官能化互补DNA序列复合物的退火：可将大致100μM DNA序列1(SEQ ID NO:9)于PBS pH 7.5中的溶液与含1.0摩尔DNA序列1b(根据集成DNA技术寡核苷酸分析器工具，理论Tm为51.6℃)(SEQ ID NO:10)于PBS pH 7.5中的等效物混合并放置在60℃下的加热块中30分钟，接着历经2小时缓慢冷却到室温。在TosoH G3000SW柱(7.8mm×300mm)上通过注入总退火体积使用10mM PBS，pH 7.2来纯化所得的dsDNA产物。使用0.5mL Amicon过滤器浓缩器减小洗脱液体积。最终dsDNA浓度通过A260吸光率来确定。反应流程描绘于下文中(“Mal”为马来酰亚胺)。
Figure BDA0002017627730001881
羧基纳米颗粒(NP)
羧基-聚苯乙烯纳米颗粒的活化和双链DNA添加：羧基纳米颗粒如文段“羧基-聚苯乙烯纳米颗粒的活化”下的实例5中所描述来预活化。NP上装载的DNA通过结合DNA链的热变性、颗粒洗涤、荧光标记的互补DNA序列(如AlexaFluor546-5'-TTA CGA CCG GGC TTG3'(SEQ ID NO:11))退火来确定且使用荧光显微镜来量化。
Figure BDA0002017627730001882
抗体还原和与NP-dsDNA复合物的偶联：如文段“抗体还原”下的实例5中所描述来还原抗体。经还原抗体可紧接着用于偶合到NP-dsDNA复合物。所得偶联物在6,500g下离心且经由倾析移除上清液。用PBS pH 7.5重复洗涤程序5次以从纳米颗粒中去除任何游离抗体。活性抗体比纳米颗粒并入率可使用针对既定抗体的经荧光标记的抗原来量化。偶联物NP浓度(％固体)使用UV-Vis光谱分析(600nm)来确定。通过SEM来检测颗粒偶联物且使用泽塔斯则确定大小/电荷分布。
Figure BDA0002017627730001891
磁性颗粒
NP-Ab偶联物
洗涤，孵育
微波诱导的颗粒热疗和纳米孔计数免疫测定：以上流程示出利用热改性的抗体-纳米颗粒偶联物的纳米孔计数测定，所述偶联物的制备描述于上文中。夹心型免疫测定可使用涂布有分析物捕获剂的磁性微颗粒来制备，所述血液分析物与磁性微颗粒一起孵育，洗涤并用所描述的抗体-纳米颗粒偶联物孵育。颗粒热疗可使用微波照射来诱导以在颗粒表面近似产生局部温度梯度。可使用颗粒热疗方法，如Dutz和Hergt(《纳米技术》，25:452001(2014))中综述的那些。在免疫测定设置中使这些技术适应局部热变性可提供释放计数部分(如纳米颗粒)的方法。在移除磁性微颗粒之后，计数通过纳米孔的计数部分(纳米颗粒)。
实例22
纳米孔计数数据
这个实例描述了各种标签的纳米孔计数数据，例如具有聚乙二醇的ssDNA杂合分子(DNA-STAR)、dsDNA、用DBCO标记的dsDNA和PAMAM丁二酰胺酸树枝状聚合物。使用这些标签以及不同大小的纳米孔以提供纳米孔优化。将不同分子聚合物标记物悬置于适当的盐缓冲液中并且使用标准的流体细胞盒来检测。
使用内部器械记录电流-电压(i-V)记录(伏安数据)和电流-时间(i-t)记录。称作CUSUM的计算机软件程序用于基于用户的阈值输入运行获得的数据和检测事件。通过检测尽可能多的事件并且随后出于特定目的过滤来使评估中主观性的任何影响最小化。
用添加到膜的顺侧面中的标签进行初始实验。将200mV电偏压施加到标记物溶液且使用Axopatch 200B放大器和CUSUM软件监测电流阻塞。
已知除非孔径限制其通道，否则小分子可非常快速的通过纳米孔。由于系统的限制带宽，可使快速事件的电流堵塞变形。更快的分子甚至不可能被特定系统完全地检测到。
在我们的研究中，仅检测到较大聚合物和用较大基团改性剂标记的分子。可检测事件的实验条件和数量示出于表3中。
表3
Figure BDA0002017627730001901
这些数据证实DNA树枝状聚合物、聚合物和PAMAM树枝状聚合物可用作固态纳米孔传感器的检测标记物。
实例23
生物分子的纳米孔分化
在这个实例中，纳米孔用于区分生物分子(例如，dsDNA stars、DBCO修饰的dsDNA和常规dsDNA)。这个方法可用于使用不同标记物类型的多路复用。
这个实例采用在中部(bp#25)中含有分支点的50bp寡核苷酸，其中单链寡核苷酸经共价连接(DNA-Star)；中部(碱基#25)中含有二苯基环辛炔(DBCO)修饰的双链50bp寡核苷酸；和5'-硫醇修饰的双链DNA寡核苷酸。
这些各种修饰的DNA分子使用三种不同的SiNx纳米孔在3.6M LiCl缓冲液中分析。DNA-star分子用4.0nm直径孔分析；经DBCO修饰的DNA用3.7nm直径孔分析；经硫醇修饰的DNA用4.2nm直径孔分析。绘制针对纳米孔持续时间(μsec)的电流阻塞水平(pA)，以便示出纳米孔区分三种不同生物分子的能力。在总体水平上，三种不同的标记物呈现为可区别的，如散点图中不同模式差异所示(图24A-24C)。单独实时事件的识别需要额外水平的阻塞水平和时间信息作为区分信号与噪声的方式。区分不同纳米孔标记物的能力证实纳米孔可在不同测定中多路复用。
实例24
定性分析
以下实例描述一种用于实施定性测定的方法。从根本上，在这个实例中，构建体用于证实对DMF芯片的测定原理且裂解所述构建体并释放标记物且随后使用纳米孔计数以便在其移位纳米孔时产生信号，由此指示两个特异性结合成员对(抗生蛋白链菌素和生物素)的结合，其中dsDNA标记物的这个裂解和后续计数与在测定期间发生的特异性结合相关联。此外，实施适当的对照实验以证实由纳米孔移位测量期间计数的标记物产生的信号是由于测定工艺期间发生的特异性结合事件而非与引入到测定工艺流中的硫醇裂解剂的存在相关联。实验细节在以下实施。
使用DMF的硫醇介导的裂解：含有可裂解双硫键的生物素标记的双链DNA(实例17的(6))用作纳米孔检测/计数的靶标。结合测定由将生物素DNA结合到DMF芯片上的抗生蛋白链菌素磁性微颗粒，接着硫醇介导的化学裂解步骤组成(参见图25)。DMF芯片上的试剂放置示出于图27中。将从结合到抗生蛋白链菌素磁体颗粒的物质中分离的裂解DNA靶标转移到含有固态氮化硅(SiNx)膜的纳米孔流体单元中，所述固态氮化硅膜具有由受控介电击穿产生的预钻孔纳米孔(H.Kwok等人，《公共科学图书馆》，9(3)，2014)。使用开源CUSUM软件分析包(NIST)计数并分析DNA靶材料。
将适当的反应剂装载到含有8个试剂储槽的玻璃DMF芯片(3"×2"×0.0276")上。除废液储槽之外，每一个储槽含有大致5μL的各试剂。试剂的浓度如下：含11μM生物素-SS-DNA的PBS(pH＝7.2)；10mg/mL(w/v)M-2702.7μm抗生蛋白链菌素涂覆的磁性微颗粒(生命技术)；PBS洗涤缓冲液(pH＝7.2)+0.05％ETKT(伸乙基四-KIS(乙氧基化物-嵌段-丙氧基化物)四)、50mM三-(2-羧基乙基)膦(TCEP)。经分配DMF液滴的适当大小为1.5μL。
配制一滴M-270抗生蛋白链菌素涂覆的微颗粒并将其与1滴dsNP-31-SS-生物素混合大致40分钟。通过合并2个液滴来完成混合并在DMF芯片上以环形模式移动通过12个电极(3×4)。接合底部磁体以收集微颗粒并且将上清液移动到废液储槽。接着，分配两滴PBS/ETKT缓冲液并将其移动到微颗粒段塞，随后将其再悬浮于溶液中。在再次接合磁体之前混合悬浮液5分钟并且将上清液移除到废液储槽。重复颗粒洗涤步骤总共11次，同时逐渐增加混合时间多达45分钟。将最后的洗涤上清液移动到空储槽中。将额外5滴PBS/ETKT移动到同一储槽中。使用34-AWG非金属注射器(Microfil 34-AWG)去除储槽中的洗涤液和PBS/ETKT并且转移到1.5mL埃彭道夫管(Eppendorf tube)，准备用于纳米孔分析。通过将2滴TCEP试剂移动到微颗粒段塞并混合45分钟来引发裂解。接合底部磁体并且将上清液(含有经裂解DNA)移动到空储槽中。将额外5滴PBS/ETKT洗涤缓冲液移动到同一储槽中。使用34号非金属注射器从DMF芯片中去除最终提取物并将其转移到1.5mL埃彭道夫管中，准备用于纳米孔分析。经裂解洗脱液离心30秒并放置在磁力架中1分钟，以去除任何迹线微颗粒。
纳米孔分析：使用对内嵌于TEM窗中的10nm厚SiNx膜(0.05μm×0.05μm)(NorcadaNT0052，低应力SiNx)进行受控介电击穿(CBD)来实现纳米孔制造。这种方法能够以高精度和最小成本产生小直径固态孔。将TEM-SiNx膜放置在含有两个缓冲液腔室的聚四氟乙烯(PTFE)流体单元中，并且使用两个硅酮弹性体衬垫密封。流体单元在单元底部中含有16μL体积通道，所述通道使上部腔室中的盐溶液连接到纳米孔膜。对于纳米孔制造，流体单元首先填充有脱气乙醇，与脱气去离子水交换且随后填充有脱气的0.5M KCl，用碳酸氢钠在18MΩ去离子水中缓冲到pH 10。使用放大器使用8V的偏压电压进行制造。使用银/氯化银电线将流体单元的两侧连接。如Kwok等人中所描述，虽然设置8V的固定电压，但电流呈现实时电容(电流减少)。当电流增加时，从单元中移除电源。制造的采样速率＝25KHz。泄漏电流增加指示孔形成，由此断开电压。由以下基于电导率的等式来确定孔径：
Figure BDA0002017627730001931
其中G＝电导率，σ＝体电导率(对于KCl测量的12.35S/m)，L＝膜的厚度(10nm)，d＝孔径(S.Kowalczyk,A.Grosberg,Y.Rabin,C.Dekker，《纳米技术(Nanotech.)》，22，2011)。通过产生I-V曲线来检测纳米孔的欧姆行为。所测量的纳米孔直径确定为4.4nm，且随后用于检测经裂解ds-SS-DNA靶标。
将制造盐缓冲液替换为3.6M LiCl，其用作检测移位事件的感测缓冲液。将前级探头放置在Axopatch 200B放大器与银/氯化银连接件之间，所述连接件与容纳纳米孔膜的流体单元连接。
大致0.2μL的经TCEP裂解的ds-DNA靶标用1.8μL PBS缓冲液稀释(这呈现TCEP裂解洗脱液的10倍稀释液)，且将全部体积装载并混合到纳米孔单元腔室中，所述纳米孔单元腔室含有大致30μL的3.6M LiCl盐溶液。将最后的DMF洗涤洗脱液用作阴性裂解对照(这种不稀释)。测量DNA移位数量并分别针对TCEP洗脱液和阴性对照持续23分钟和65分钟，且转换成通量率(sec-1)。图28中描绘的结果证实使用DMF将ds-SS-DNA靶标从M-270抗生蛋白链菌素颗粒中成功地裂解并使用固态纳米孔作为检测器来检测。SNR确定为21.9，如由纳米孔通量率测量。
数据分析：移位事件的数量可通过使用以下等式首先计算在实验性测试条件下在双链DNA移位事件中发现的预见电流变化来确定
Figure BDA0002017627730001941
如参考Kwok等人，“由受控的介电击穿制造纳米孔”补充信息第8段和Kwok,H.；Briggs,K.；和Tabard-Cossa,V.；“由受控的介电击穿制造纳米孔”-《科学公共图书馆综合卷》9(3):e92880(2014)中。使用这个预见的电流阻塞值，针对可接受的预见电流阻塞事件而人工视觉地扫描实验纳米孔输出的二进制文件数据。使用这些事件，可应用和执行CUSUM纳米孔软件所需的阈值和滞后参数。使用cusumtools readevents.py软件且过滤大于1000pA(如由第一计算值确定)的阻塞事件进一步分析由这个软件得到的输出。由readevents.py分析工具确定通量事件、事件之间的时间和其它计算。使用JMP软件(SAS研究所，凯里，北卡罗莱纳州)对CUSUM产生的数据进行其它计算。应了解这种阈值设置方法是数据分析和设置阈值的一个途径且本发明不限于这种方法且还可使用如对于所属领域的技术人员已知的其它这类方法。
总结：这个实例描述了通过实施如本文所描述的步骤过程进行的定性测定。可使用如实例17中描述的可裂解连接子偶联物，在如图25所示的基于硫醇的裂解步骤下进行直接测定。应了解进行这类测定的其它可裂解连接子方式还可包括(但不限于)裂解连接子以便允许计数如本文所描述的不同标签的各种其它方法。举例来说，除了实例17中描述的方法之外，这类其它替代性裂解方法和/或试剂可包括实例16、实例18、实例19、实例20和实例21中描述的那些，以及本文中所描述且所属领域的技术人员已知的其它裂解方法。还应理解虽然在这个实例(实例24)中证实的测定形式代表直接测定，但如夹心免疫测定形式和/或各种竞争性测定形式，如所属领域的技术人员已知的，可以良好实施以使用所描述的方法进行测定。
举例来说，如实例9中所描述的用于检测TSH(促甲状腺激素)的夹心免疫测定形式证实了在低成本DMF芯片上进行这类测定的能力。另外，可使用除所属领域的技术人员以其它方式已知的的其它可裂解连接子以外的各种异双官能可裂解连接子(如实例1、实例2、实例3、实例4、实例5和实例6中所描述的那些)合成适用于产生具有可裂解连接子的免疫偶联物或其它活性特异性结合成员的多种不同的生物偶联试剂。可以通过如实例3、实例4、实例5和实例6中的描述的那些方法以及通过所属领域的技术人员已知的方法来合成适用于本发明的实践的免疫偶联物。另外，实例8示出各种流体液滴在低成本芯片上操纵的功能性，其可促进实施各种分析形式所需要的各种步骤，所述分析形式包括夹心和竞争性分析形式，以及其所属领域的技术人员已知的其它变化形式。实例11示出了在测定中可用于计数可裂解标记物的纳米孔制造，但应了解所属领域的技术人员已知的其它纳米孔制造方法也可以用于这个目的。实例16亦代表适用于进行实现裂解的测定的其它构建体，由此导致可计数的标记物释放以便使用如这个实例内所描述的纳米孔计数法来计数。
实例22示出了一般可实现如何计数以便能够测量与穿越纳米孔的各种标记物的存在相关的移位事件。图29示出了信号的阈值处理概念以便能够操控计数测定中数据的质量。图28示出了可用于使用如这个实例内所描述的这类测定方法确定分析物的存在的表示数据类型的定性测定数据。还应理解虽然dsDNA用作这个特定实例中的标记物，但还可以使用其它标记物，如实例5和/或实例22中描述的标记物，包括(但不限于)纳米珠粒、树枝状聚合物以及类似物。可通过在本申请案中所描述的各种实例，或经由所属领域的技术人员已知的方法以其它方式合成按需要以产生适当试剂的这类构建体。
实例25
定量分析
以下实例描述一种用于进行定量测定的方法。从根本上，在这个实例中，且作为实例24的延伸，产生标准曲线以便证实在测定(结合)步骤中，计数标记物(在这种情况下可计数标记物为dsDNA分子)的量增加与已结合的特异性结合反应剂的量的标准曲线相关联(其继而与初始样品中现存的分析物量相关联)。针对这个特定实验的标准曲线基于各种不同的数据分析方法可见于图31、图32、图34中或图34依赖于通量以产生标准曲线。在后一种情况下，图34中所示的测量方法基于事件/时间(计数事件的通量)，但应了解其它测量方法也可用于产生与给定样品中测量的分析物浓度的量相关联的标准曲线。所实施的实验细节如下。
纳米孔制造：使用对内嵌于TEM窗中的10nm厚SiNx膜(0.05μm×0.05μm)(NorcadaNT0052，低应力SiNx)进行受控介电击穿(CBD)来实现纳米孔制造，因为这个方法能够以高精度和最小成本产生小直径固态孔。将TEM-SiNx膜放置在含有两个缓冲液腔室的聚四氟乙烯(PTFE)流体单元中，并且使用两个硅酮弹性体衬垫密封。流体单元在单元底部中含有16μl体积通道，所述通道使上部腔室中的盐溶液连接到纳米孔膜。对于纳米孔制造，流体单元首先填充有脱气乙醇，与脱气去离子水交换且随后填充有脱气的0.5M KCl，用碳酸氢钠在18MΩ去离子水中缓冲到pH 10。使用放大器使用8V的偏压电压进行制造。使用银/氯化银电线将流体单元的两侧连接。如Kwok等人中所描述，虽然设置8V的固定电压，但电流呈现实时电容(电流减少)。当电流增加时，从单元中移除电源。制造的采样速率＝25KHz。泄漏电流的突然增加指示孔形成，由此断开电压。0.5M KCl缓冲液用3.6M LiCl(pH＝8.3)替换。
由以下基于电导率的等式来确定孔径：
Figure BDA0002017627730001961
其中G＝电导率，σ＝体电导率(对于KCl测量的16.06S/m)，L＝膜的厚度(10nm)，d＝孔径(S.Kowalczyk,A.Grosberg,Y.Rabin,C.Dekker，《纳米技术》，22，2011)。通过产生I-V曲线来检测纳米孔的欧姆行为。所测量的纳米孔直径确定为4.8nm，且随后用于检测DNA校正标准。
DNA剂量反应：DNA标准用作校验仪以通过确定纳米孔通量率随着DNA浓度增加的变化来观测剂量反应曲线。这样产生标准曲线，其可用于在免疫测定中定量经裂解DNA标记物。将2μl的1.5μM 100bp DNA标准(赛默飞世尔科技公司)吸取到含有30μl的3.6M LiCl盐溶液的PTFE流体单元中，得到94nM DNA的最终浓度。在纳米孔分析之前通过上下移液溶液若干次来混合反应剂。所述单元经受+200mV的DC偏压并监测历经60分钟的电流阻塞。分析软件用于表征电信号和计数速率。重复这个程序两次在标准曲线上得到两个额外点，182nM和266nM。示出了所有三种标准历经不同时段的电流阻塞-对于94nM历经41秒(图30A)；对于182nM历经24秒(图30B)；对于266nM历经8秒(图30C)。对于图30A、图30B和图30C，基线噪声凭经验分别估量为大致900pA、900pA和1,000pA。
运行的数据用于产生三种不同类型的剂量反应曲线-历经固定时间量(5分钟)的事件数(图31)；固定事件数(200个事件)所需的时间(图32)；和每单位时间的事件(图33)。这些曲线中的每一个可用作使用DNA作为标记物的定量的基于纳米孔的免疫测定的标准曲线。类似地，其它标记物可用于定量各种分析物，如树枝状聚合物、聚合物、纳米颗粒等。
Seq31-SS-生物素DNA剂量反应：合成的DNA构建体，Seq31-SS-生物素用作源材料以产生剂量反应曲线(图47)。这个靶标可用于定量经裂解标记物NP-Seq31-SS-生物素，其在定性测定中从抗生蛋白链菌素珠粒中裂解。由于这种材料具有与经裂解标记物Seq31-SS-生物素大致相同的MW和电荷密度，其可在校准曲线中用于使用TCEP和/或DTT定量抗生蛋白链菌素微颗粒的经裂解靶标。
数据分析：移位事件的数量可通过使用以下等式首先计算在实验性测试条件下在双链DNA移位事件中发现的预见电流变化来确定：
Figure BDA0002017627730001981
如参考Kwok等人，“由受控的介电击穿制造纳米孔”补充信息第8段和Kwok,H.；Briggs,K.；和Tabard-Cossa,V.；“由受控的介电击穿制造纳米孔”-《科学公共图书馆综合卷》9(3):e92880(2014)中。使用这个预见的电流阻塞值，针对可接受的预见电流阻塞事件人工视觉地扫描实验纳米孔输出的二进制文件数据。使用这些事件，可应用和执行CUSUM纳米孔软件所需的阈值和滞后参数。使用cusumtools readevents.py软件且过滤大于1000pA(如由第一计算值确定)的阻塞事件进一步分析由这个软件得到的输出。由readevents.py分析工具确定通量事件、事件之间的时间和其它计算。使用JMP软件(SAS研究所，凯里，北卡罗莱纳州)对CUSUM产生的数据进行其它计算。应了解这种阈值设置方法是数据分析的一个途径且本发明不限于这种方法且还可使用如对于所属领域的技术人员已知的其它这类方法。
总结：这个实例描述了通过实施如本文所描述的步骤过程进行的定量测定。可使用如实例17中描述的可裂解连接子偶联物，在如图25所示的基于硫醇的裂解步骤下进行直接测定。应了解进行这类测定的其它可裂解连接子方式还可包括(但不限于)裂解连接子以便允许使用如本文所描述的纳米孔计数不同标签的各种其它方法。举例来说，除了实例17中描述的方法之外，这类其它裂解方法可以包括(但不限于)实例18、实例19、实例20和实例21中描述的那些，以及本文中所描述且所属领域的技术人员已知的其它方法。还应理解虽然在这个实例(实例25)中证实的测定形式代表测定分析，但如夹心免疫测定形式和/或各种竞争性测定形式的其它形式可以良好实施以进行测定。
举例来说，如实例9中所描述的用于检测TSH(促甲状腺激素)的夹心免疫测定形式证实了在低成本DMF芯片上实施这类测定的能力。另外，可使用由如实例1、实例2、实例3、实例4、实例5和实例6中所描述的那些方法合成的各种异双官能可裂解连接子和偶联物，以及可由所属领域的技术人员已知的方法合成的其它可裂解连接子或偶联物由所属领域的技术人员合成适用于产生具有可裂解连接子的免疫偶联物或其它活性特异性结合成员的多种不同的生物偶联试剂。另外，实例8示出了各种流体液滴在低成本芯片上操纵的功能性，其可促进执行各种测定形式所需要的各种步骤，所述测定形式包括夹心和竞争性测定形式，以及其所属领域的技术人员已知的其它变化形式。实例16还代表适用于进行实现裂解的测定的其它构建体，由此导致可计数的标记物释放以便使用如这个实例内所描述的纳米孔计数法来计数。
实例22示出了一般可进行如何计数以便能够测量与穿越纳米孔的各种标记物的存在相关的移位事件。图29示出了信号的阈值处理概念以便能够操控计数测定中数据的质量。图31、图32和图33示出了可用于使用如这个实例内所描述的这类测定方法确定分析物的量的表示数据类型的定量测定数据。图34示出了由已使用化学法裂解的构建体产生的标准曲线。还应理解虽然dsDNA用作这个特定实例中的标记物，但还可使用其它标记物，如实例5中描述的标记物，包括(但不限于)纳米珠粒、树枝状聚合物等。这类构建体可经由所属领域的技术人员已知的方法合成。
实例26
纳米孔电场模拟
对硅模块中使用的所提议纳米孔膜设计进行一系列COMSOL模拟运行，以研究SiO2通孔大小对相对离子浓度和通过理论10nm直径纳米孔的电渗流速率的影响。顶部SiO2层服务多个目的-1)将绝缘层提供带SiNx膜且，进而减少纳米孔的电容噪声；2)增加硅衬底内的SiNx膜的稳固性和强度；3)减少暴露于溶液的SiNx区域的大小，进而改善孔在膜上的定位以避免受控的介电击穿(CBD)工艺。电场模拟用于确定SiO2层对局部相对离子浓度和通过孔的电渗流的干扰。
参考图35，蚀刻硅衬底(1)，得到位于SiNx膜上方和下方的顺腔室和反腔室。SiNx膜(50μm×50μm)(2)层叠在300μm厚SiO2底部层和300μm厚SiO2顶部层(3)之间。制造顶部层以形成SiO2通孔(4)，其允许在CBD期间形成纳米孔。通过模拟来确定SiO2通孔的最优直径。
COMSOL模拟结果：COMSOL电场模拟使用基于材料、静电、分子传输和层流属性的物理模型。电势基于泊松等式(Poisson equation)；离子通量基于能斯特-普朗克等式(Nernst-Planck equation)；流速基于斯托克斯等式(Stokes equation)。用于模拟的物理参数界定在表1中，示出于图36中。
孔附近的相对离子浓度梯度的COMSOL结果示出于图37中，且示出在SiO2通孔直径>50nm时几乎对离子浓度无影响。低于50nm，在孔的开口附近产生净电荷的积聚。在25nm直径处观测到最严重的效应，其中较大离子梯度形成在孔附近。结果示出在纳米孔距离SiO2壁小于25-50nm时对SiO2表面的极大影响。
相对离子通过孔的电渗流速率模拟为确定SiO2层可对纳米孔感测具有任何影响的方式(图38)。最高速率的电渗流发生在较大的通孔直径(100-4,500nm)下。对于50nmSiO2通孔观测到通过孔的流动速率减小，接着对于25nm通孔显著减小。
如图39所示，通过孔的电导对比通孔直径的测量示出高于100nm的饱和曲线，其中随着通孔直径的大小从100nm减小到25nm，电导减小。
实例27
将纳米孔模块集成到数字微流体(DMF)模块中
纳米孔模块位于DMF模块的一侧上。孔洞存在于DMF模块中以允许液体从DMF模块传输到纳米孔模块以用于孔形成和分析物检测(例如，参见图40)。
纳米孔模块的一个电极端接在纳米孔模块中的流体体积内。另一电极端接在DMF模块中的流体体积内。这个电极传送通过DMF模块中的第二孔洞。为证实液体能够移动通过DMF模块内的孔洞，在液体移动到适当位置之后，将一张平纸推按到芯片的外表面上。这种纸的湿润示出液体能够经由毛细管力从DMF模块移动到位于这个孔洞上方的其它模块(图41)。
参考图42，DMF模块配备有用于控制纳米孔制造的Ag/AgCl电极。在这种设置中，纳米孔模块适当液体体积是露天(open-air)的LiCl液滴。将这种液体直接分配到纳米孔模块上且电极终端悬浮于这种液滴内。
使用DMF技术将样品移动到DMF模块中的孔洞中。被动地迁移通过孔洞的样品变成暴露于纳米孔模块以用于纳米孔形成。将纳米孔模块密封到DMF模块(例如使用PDMS、压力、蜡等)，将保存在每个模块内的液体容积分隔开。图45示出了在制造纳米孔期间随时间变化的电流。
在形成纳米孔之后，调节程序(随时间推移改变电压)用于物理地改变纳米孔且清除信号。这个工艺改善了I-V曲线的对称性。之前和之后的I-V曲线分别示出于图46A和图46B中。
实例28
计数标记物和孔径分析
使用双链DNA在各种条件设置下运行一组实验以分析前且证实与孔径和计数标记物大小相关的特定属性。在这些实验中，研究各种参数，包括检测电压、DNA长度、DNA浓度、盐浓度和盐组合物、膜材料、膜厚度、纳米孔直径和其它因素。
随后相对于信噪比分析数据集且将所述因子与相对于计数标记物大小(估量的分子直径)的各种孔径进行比较。举例来说，某些因素，如膜材料和厚度在这组实验中保持恒定，而其它因素改变。
根据合计数据集分析，在计数标记物平均直径和纳米孔大小比实验中确定的SNR(信噪比)之间绘制比率的平均值(图47)。图47总体上表明有用的计数数据可从这类比率范围中获得，在这个特定的数据集中，这类比率在约0.4到0.8之间，假设dsDNA的分子直径大致为2.0nm。从文献中已知关于分子直径的直链dsDNA且分析假设DNA穿过其直链构形中的孔。表4示出所计算的数据。
表4
平均的孔标记分子直径与孔比率 SNR
0.645 27.5
0.556 53.7
0.476 12
0.714 23.7
0.803 17
0.645 22.5
0.8 20.2
0.588 17
0.69 55
0.476 23.5
虽然条件改变，如这个实例中先前所提及，这个数据集的总变化示出可以在此范围内得到具有合理信噪比的计数数据。此外，应注意所属领域的技术人员将认识到其它计数标记物分子直径比纳米孔直径比率可用于获得合理的SNR。另外，所属领域的技术人员将认识到通常标记物应具有其分子直径小于纳米孔大小以便能够通过所述孔的至少一种尺寸，或换句话说，对于能够通过所述孔的标记物，标记物分子直径比纳米孔直径的这个比率应通常小于一，除了在可能使用称作纳米孔力光谱分析的技术中描述的条件的情况下，其中将能量添加到系统以促进标记物中发生构象改变且由此允许其在变形到允许发生这类移位事件的水平之后通过所述孔。
所属领域的技术人员还应了解，除这个实例中描述的dsDNA外，其它标记物也可用于计数，且其可具有与这个图中所示的行为不同的行为。此外，还应了解也有可能从其它分子直径比纳米孔比率中获取可接受的SNR以实现这类标记物的分子计数，且如以下等式中所描述，电流阻塞可与这类计数标记物的分子直径相关：
Figure BDA0002017627730002031
其可见于以下参考文献中：Kwok等人，“由受控的介电击穿制造纳米孔”补充信息第8段和Kwok,H.；Briggs,K.；和Tabard-Cossa,V.；“由受控的介电击穿制造纳米孔”-《科学公共图书馆综合卷》9(3):e92880(2014)。这个等式可用于门控或阈值信号，如本文中实例24和25中所描述。
在纳米孔计数实验的这个合计组内改变的某些具体条件包括：
·离子强度-3M或3.6M
·DNA长度-10kbp、50bp或1kbp
·使用的离子盐-LiCl或KCl
·膜材料-SiNx(在整个数据集中恒定)
·膜厚度-10nm(在整个数据集中恒定)
·DNA浓度-在3nM与约306nM之间改变
·电压-包括在50mV与600mV之间递增改变
·纳米孔直径-各种孔径，包括8.0、1.1、3.6、4.2、2.8、2.5、7.7、3.1、2.7、2.6、2.9和4.2(全部以纳米为单位)。
可获得结论：包括(但不限于)这些的各种条件显示一个结论可在可计数标记物小于孔的直径的情形中获得，可在按照如计算的量施加电压时引起离子电流跨过孔的通量的阻塞，但Kwok等人的这个等式参考这个实例[Kwok等人，“由受控的介电击穿制造纳米孔”补充信息第8段和Kwok,H.；Briggs,K.；和Tabard-Cossa,V.；“由受控的介电击穿制造纳米孔”-《科学公共图书馆综合卷》9(3):e92880(2014)]。
还应了解，可应用这些条件以示出将以除dsDNA以外的其它标记物的合理信噪比起作用的计数标记物分子直径比孔直径，所述标记物包括(但不限于)树枝状聚合物、半树枝状聚合物、纳米珠粒、阴离子或阳离子聚合物、改性的线性化适体、带负电或带正电的聚肽或其它带电聚合物或可计数分子实体等。
最后，尽管已关于本文中的各种实施例和特定实例描述本发明的各种方面和特征，其所有皆可以常规方式制造和实施，但应理解，本发明有权在所附权利要求书的完整范围内得到保护。
应了解前述实施方式和随附实例仅仅是说明性的并且不认为是限制本发明的范围，本发明的范围仅由随附权利要求书以及其等效物限定。
本公开实施例的各种改变和修改将对所属领域的技术人员显而易见。这类改变和修改包括(但不限于)与本发明的化学结构、取代基、衍生物、中间产物、合成、组合物、调配物或使用方法有关的那些改变和修改，可以进行这类改变和修改而不脱离其精神和范围。
出于完整性的原因，本发明的多个方面在以下带编号的条款中陈述：
条款1.一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；(b)使分析物与第二结合成员接触，其中第二结合成员特异性结合到分析物且其中第二结合成员包含与其连接的可裂解标签；(c)去除未结合到分析物的第二结合成员，所述分析物结合到第一结合成员；(d)裂解附着于结合到分析物的第二结合成员的标签，所述分析物结合到第一结合成员；(e)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
条款2.根据条款1所述的方法，其中移位通过所述层的每一个标签为移位事件且测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中样品中存在的分析物量通过以下操作来确定：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准。
条款3.根据条款2所述的方法，其中小节i)中的标准曲线通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件的数量来确定；其中小节ii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现一定数量的移位事件所需要的时间来确定；且其中小节iii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。
条款4.根据条款1到3中任一项所述的方法，其中所述方法涉及单一分子计数。
条款5.根据条款1到4中任一项所述的方法，其中标签选自由以下组成的组：阴离子聚合物、阳离子聚合物、树枝状聚合物和纳米颗粒。
条款6.根据条款1或5中任一项所述的方法，其中标签实质上为球形或半球形。
条款7.根据条款1到6中任一项所述的方法，其中标签实质上为球形且包含纳米颗粒。
条款8.根据条款1到7中任一项所述的方法，其中标签实质上为球形或半球形且包含树枝状聚合物。
条款9.根据条款8所述的方法，其中树枝状聚合物带正电或带负电。
条款10.根据条款5或7所述的方法，其中纳米颗粒包含带正电的纳米颗粒。
条款11.根据条款10所述的方法，其中纳米颗粒包含带负电的纳米颗粒。
条款12.根据条款1到11中任一项所述的方法，其中第一和第二结合成员为抗体或受体。
条款13.根据条款1到12中任一项所述的方法，其中第一结合成员为受体且第二结合成员为抗体或其中第一结合成员为抗体且第二结合成员为受体。
条款14.根据条款1到12中任一项所述的方法，其中第一结合成员为第一抗体且第二结合成员为第二抗体。
条款15.根据条款1到14中任一项所述的方法，其中标签带负电且移位包含在层上施加正电势，进而使标签移位通过层。
条款16.根据条款1到14中任一项所述的方法，其中标签带正电且移位包含在层上施加负电势，进而使标签移位通过层。
条款17.根据条款1到16中任一项所述的方法，其中至少步骤(a)到(d)在微流体装置、基于液滴的微流体装置、数字微流体装置(DMF)、基于表面声波的微流体装置(SAW)、完全集成的DMF和纳米孔装置或完全集成的SAW和纳米孔装置中执行。
条款18.根据条款17所述的方法，其中DMF元件和纳米孔元件可操作地耦接在完全集成的DMF和纳米孔装置中或SAW元件和纳米孔元件可操作地耦接在完全集成的SAW和纳米孔装置中。
条款19.根据条款17所述的方法，其中DMF装置或SAW装置通过基于辊对辊的印刷电子方法来制造。
条款20.根据条款18所述的方法，其中DMF元件或SAW元件通过基于辊对辊的印刷电子方法来制造。
条款21.根据条款17所述的方法，其中完全集成的DMF和纳米孔装置或完全集成的SAW和纳米孔装置包含微流体管道。
条款22.根据条款21所述的方法，其中微流体管道将DMF元件耦接到纳米孔元件，且微流体管道包含由被动力或主动力诱导的流体流动。
条款23.根据条款1到22中任一项所述的方法，其中纳米孔为固态纳米孔或生物纳米孔。
条款24.根据条款1到23中任一项所述的方法，其中测量移位通过层的标签数量包含观测由标签与纳米孔的相互作用而诱导的电流变化。
条款25.根据条款24所述的方法，其中当电流变化具有高于阈值水平的量值时，分析物存在于样品中。
条款26.根据条款23所述的方法，其中所述方法进一步包含将步骤(d)中获得的含有标签的液滴传输到纳米孔装置且将所述液滴放置在纳米孔装置中存在的纳米孔层上以使得所述液滴被纳米孔层分裂且由纳米孔层中存在的纳米孔连接，其中标签存在于纳米孔层的两侧上的液滴中。
条款27.根据条款26所述的方法，其中所述方法包含使纳米孔层的第一侧上存在的标签移位跨过纳米孔到纳米孔层的第二侧，进而收集在纳米孔层的第二侧上的经分开液滴中的标签。
条款28.根据条款26所述的方法，其进一步包含使标签移位到纳米孔层的第一侧且确定液滴中存在的标签数。
条款29.根据条款1到28中任一项所述的方法，其中标签包含可裂解连接子。
条款30.一种用于测量或检测生物样品中存在的所关注分析物的方法，所述方法包含(a)使样品与固体载体、第一特异性结合成员和第二特异性结合成员接触，其中固体载体包含固定剂，第一特异性结合成员包含用于固定剂的配位体且第一特异性结合成员特异性结合所关注分析物，第二特异性结合成员包含可裂解标签并且第二特异性结合成员特异性结合所关注分析物，其中形成固体载体/第一特异性结合成员/所关注分析物/第二特异性结合成员复合物；(b)去除未结合到固体载体/第一特异性结合成员/分析物/第二特异性结合成员复合物的第二特异性结合成员；(c)裂解附着于经标记分析物的标签，所述经标记分析物结合到固体载体/第一特异性结合成员/所关注分析物/第二特异性结合成员复合物中的第二特异性结合成员；(d)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
条款31.一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含(a)使样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；(b)使分析物与第二结合成员接触，其中第二结合成员特异性结合到分析物且其中第二结合成员包含适体；(c)去除未结合到分析物的适体，所述分析物结合到固体衬底；(d)解离结合到分析物的适体；(e)使经解离适体移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的适体，其中测量移位通过所述层的适体数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中。
条款32.根据条款31所述的方法，其中移位通过所述层的每一个适体为移位事件且测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中样品中存在的分析物量通过以下操作来确定：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准。
条款33.根据条款32所述的方法，其中小节i)中的标准曲线通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件的数量来确定；其中小节ii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现一定数量的移位事件所需要的时间来确定；且其中小节iii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。
条款34.根据条款31到33中任一项所述的方法，其中所述方法包括单一分子计数。
条款35.根据条款31到34中任一项所述的方法，其中适体为DNA适体。
条款36.根据条款31到34中任一项所述的方法，其中适体为RNA适体。
条款37.根据条款31到36中任一项所述的方法，其中第一结合成员为抗体。
条款38.据条款31到36中任一项所述的方法，其中分析物为配位体且第一结合成员为受体。
条款39.根据条款31到38中任一项所述的方法，其中至少步骤(a)到(d)在微流体装置、基于液滴的微流体装置、数字微流体装置(DMF)、基于表面声波的微流体装置(SAW)、完全集成的DMF和纳米孔装置或完全集成的SAW和纳米孔装置中执行。
条款40.根据条款39所述的方法，其中DMF元件和纳米孔元件可操作地耦接在完全集成的DMF和纳米孔装置中或SAW元件和纳米孔元件可操作地耦接在完全集成的SAW和纳米孔装置中。
条款41.根据条款39所述的方法，其中DMF装置或SAW装置通过基于辊对辊的印刷电子方法来制造。
条款42.根据条款40所述的方法，其中DMF元件或SAW元件通过基于辊对辊的印刷电子方法来制造。
条款43.根据条款39所述的方法，其中完全集成的DMF和纳米孔装置或完全集成的SAW和纳米孔装置包含微流体管道。
条款44.根据条款43所述的方法，其中微流体管道将DMF元件耦接到纳米孔元件，且微流体管道包含由被动力或主动力诱导的流体流动。
条款45.根据条款31到44中任一项所述的方法，其中纳米孔为固态纳米孔或生物纳米孔。
条款46.一种集成数字微流体纳米孔装置，其包含：第一衬底，包含电极阵列；第二衬底，与第一衬底分隔开；和纳米孔层，安置在第一衬底与第二衬底之间，其中电极阵列配置成将液滴定位在纳米孔层两端以使得液滴被纳米孔层分裂成第一部分和第二部分，其中电极阵列中的至少两个电极定位在纳米孔层两端，其中两个电极形成阳极和阴极并且在液体液滴定位于纳米孔层两端时用以驱动电流通过纳米孔层中的纳米孔。
条款47.根据条款46所述的装置，其中纳米孔层附着于第一衬底和第二衬底。
条款48.根据条款46所述的装置，其中纳米孔层附着于第一衬底或第二衬底。
条款49.根据条款46到48中任一项所述的装置，其中电极为透明的。
条款50.根据条款46到49中任一项所述的装置，其中电极以门控模式设置。
条款51.根据条款46到50中任一项所述的装置，其中定位于纳米孔层两端的电极阵列中的至少两个电极侧接纳米孔层且不定位于纳米孔层两端。
条款52.根据条款46到51中任一项所述的装置，其中电极为交叉指形。
条款53.根据条款46到51中任一项所述的装置，其中电极阵列配置成通过电源来启用，其中电源以连续方式启用电极。
条款54.根据条款53所述的装置，其中连续方式包含接通或断开一个或多个电极。
条款55.根据条款52到54中任一项所述的装置，其中由电源启用电极阵列受到由控制电源的处理器执行的指令集控制。
条款56.一种集成数字微流体纳米孔装置，其包含：第一衬底，包含电极阵列；第二衬底，与第一衬底分隔开；和纳米孔层，安置在第一衬底与第二衬底之间，其中电极阵列配置成将液滴定位在纳米孔层两端以使得液滴被纳米孔层分离成第一部分和第二部分，其中电极阵列中的至少一个电极与定位于纳米孔层两端的液滴的第一部分接触且第二衬底中的电极定位成接触位于纳米孔层两端的液滴的第二部分，其中所述两个电极形成阳极和阴极并且在液滴定位于纳米孔层两端时用以驱动电流通过纳米孔层中的纳米孔。
条款57.根据条款56所述的装置，其中纳米孔层附着于第一衬底。
条款58.根据条款56或57中任一项所述的装置，其中纳米孔层附着于第二衬底。
条款59.根据条款56到58中任一项所述的装置，其中第一衬底和/或第二衬底为透明的。
条款60.根据条款56到59中任一项所述的装置，其中电极阵列为透明的。
条款61.一种试剂盒，其包含根据条款46到60中任一项的装置，或供用于根据条款1到45中任一项的方法中。
条款62.根据条款61所述的试剂盒，其进一步包含额外试剂，其中至少一种试剂包含可通过移位通过装置的纳米孔层来检测的标签。
条款63.一种使用根据条款46到60中任一项所述的装置的方法，或根据条款1到45中任一项所述的方法，其用于测量或检测生物样品中存在的分析物或用于诊断患者或筛检血液供给源。
条款64.根据条款1到45中任一项所述的方法，其中至少步骤(a)到(d)使用根据条款46到60中任一项所述的装置来执行。
条款65.一种根据条款46到60中任一项的装置的用途，或根据条款1到45中任一项的方法的用途，其用于诊断患者或筛检血液供给源或用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法中。
条款66.一种测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员固定于固体载体上且其中结合成员特异性结合到分析物；(b)使样品与经标记分析物接触，其中经标记分析物用可裂解标签标记；(c)去除未结合到结合成员的经标记分析物；(d)裂解附着于经标记分析物的标签，所述经标记分析物结合到结合成员；(e)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
条款67.一种测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员固定于固体载体上且其中结合成员特异性结合到分析物；(b)使样品与经标记分析物接触，其中经标记分析物包含适体；(c)去除未结合到结合成员的经标记分析物；(d)解离结合到经标记分析物的适体且使经解离适体移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的适体，其中测量移位通过所述层的适体数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中。
条款68.一种测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员特异性结合到分析物且结合成员用可裂解标签标记；(b)使样品与固定分析物接触，其中固定分析物固定于固体载体上；(c)去除未结合到固定分析物的结合成员；(d)裂解附着于结合成员的标签，所述结合成员结合到固定分析物；(e)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
条款69.一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员特异性结合到分析物且结合成员包含适体；(b)使样品与固定分析物接触，其中固定分析物固定于固体载体上；(c)去除未结合到固定分析物的结合成员；(d)解离结合到结合成员的适体，所述结合成员结合到固定分析物，且使经解离适体移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的适体，其中测量移位通过所述层的适体数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中。
条款70.根据条款66或68所述的方法，其中移位通过所述层的每一个标签为移位事件且测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中样品中存在的分析物量通过以下操作来确定：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准。
条款71.根据条款67或69所述的方法，其中移位通过所述层的每一个适体为移位事件且测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中样品中存在的分析物量通过以下操作来确定：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准。
条款72.根据条款70或71所述的方法，其中小节i)中的标准曲线通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件的数量来确定；其中小节ii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现一定数量的移位事件所需要的时间来确定；且其中小节iii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。
条款73.根据条款66到72中任一项所述的方法，其中所述方法包括单一分子计数。
条款74.根据条款66、68、70、72或73中任一项所述的方法，其中至少步骤(a)到(d)是使用根据条款46到60中任一项所述的装置来执行。
条款75.根据条款67、69、71、72或73中任一项所述的方法，其中至少步骤(a)到(d)是使用根据条款46到60中任一项所述的装置来执行。
条款76.根据条款66、68、70、72、73或74中任一项所述的方法，其中标签选自由以下组成的组：阴离子聚合物、阳离子聚合物、树枝状聚合物和纳米颗粒。
条款77.根据条款66、68、70、72、73或74中任一项所述的方法，其中标签实质上为球形或半球形。
条款78.根据条款66、68、70、72、73或74中任一项所述的方法，其中标签实质上为球形且包含纳米颗粒。
条款79.根据条款66、68、70、72、73或74中任一项所述的方法，其中标签实质上为球形或半球形且包含树枝状聚合物。
条款80.根据条款79所述的方法，其中树枝状聚合物带正电或带负电。
条款81.根据条款79所述的方法，其中纳米颗粒包含带正电的纳米颗粒。
条款82.根据条款76或78所述的方法，其中纳米颗粒包含带负电的纳米颗粒。
条款83.根据条款66、68、70、72、73、74或76到82中任一项所述的方法，其中结合成员为抗体或受体。
条款84.根据条款66、68、70、72、73、74或76到83中任一项所述的方法，其中标签带负电且移位包含在层两端施加正电势，进而使标签移位跨过层。
条款85.根据条款66、68、70、72、73、74或76到84中任一项所述的方法，其中标签带正电且移位包含在层两端施加负电势，进而使标签移位跨过层。
条款86.根据条款66、68、70、72、73、74或76到85中任一项所述的方法，其中测量移位通过层的标签数量包含观测标签对纳米孔的电流阻塞效应。
条款87.根据条款86所述的方法，其中当电流阻塞效应高于阈值水平时分析物存在于样品中。
条款88.根据条款67、69、71、72、73或75中任一项所述的方法，其中适体为DNA适体。
条款89.根据条款67、69、71、72、73或75中任一项所述的方法，其中适体为RNA适体。
条款90.根据条款67、69、71、72、73、75、88或89中任一项所述的方法，其中结合成员为抗体。
条款91.根据条款67、69、71、72、73、75、88或89中任一项所述的方法，其中分析物为配位体且结合成员为受体。
条款92.根据条款67、69、71、72、73、75或88到91中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含将含有标签的液滴传输到纳米孔装置且将所述液滴放置在纳米孔装置中存在的纳米孔层两端以使得所述液滴被纳米孔层分裂且通过纳米孔层中存在的一个或多个纳米孔连接，其中标签存在于纳米孔层的两侧上的液滴中。
条款93.根据条款92所述的方法，其中所述方法包含使纳米孔层的第一侧上存在的标签移位跨过纳米孔到纳米孔层的第二侧，进而收集在纳米孔层的第二侧上的经分裂液滴中的标签。
条款94.根据条款92所述的方法，其进一步包含使标签移位到纳米孔层的第一侧且确定液滴中存在的标签数。
条款95.根据条款67、69、71、72、73、75或88到94中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包含将含有适体的液滴传输到纳米孔装置且将所述液滴放置在纳米孔装置中存在的纳米孔层两端以使得所述液滴被纳米孔层分裂且通过纳米孔层中存在的一个或多个纳米孔连接，其中适体存在于纳米孔层的两侧上的液滴中。
条款96.根据条款95所述的方法，其中所述方法包含使纳米孔层的第一侧上存在的适体移位跨过纳米孔到纳米孔层的第二侧，进而收集在纳米孔层的第二侧上的经分裂液滴中的标签。
条款97.根据条款95所述的方法，其进一步包含使适体移位到纳米孔层的第一侧且确定液滴中存在的适体数。
条款98.根据条款66到97中任一项所述的方法，其中纳米孔为固态纳米孔或生物纳米孔。
条款99.根据条款1到45或63到98中任一项所述的方法，其中第二结合成员进一步包含间隔物。
条款100.根据条款99所述的方法，其中间隔物包含硝基苯甲基、二巯基乙基氨基、6碳间隔物、12碳间隔物，或3-(9-((3-羧丙基)(甲苯磺酰基)氨基甲酰基)吖啶-10-鎓-10-基)丙烷-1-磺酸酯。
条款101.根据条款100所述的方法，其中间隔物包含硝基苯甲基，且标签为DNA分子。
条款102.根据条款100所述的方法，其中间隔物为二巯基乙基氨基且标签为羧化纳米颗粒。
条款103.根据条款100所述的方法，其中间隔物为3-(9-((3-羧丙基)(甲苯磺酰基)氨基甲酰基)吖啶-10-鎓-10-基)丙烷-1-磺酸酯且标签为寡核苷酸。
条款104.根据条款103所述的方法，其中间隔物包含6碳间隔物或12碳间隔物且标签为生物素。
条款105.根据条款104所述的方法，其中第二结合成员包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:1-11中任一个中阐述的核苷酸序列。
条款106.一种集成数字微流体纳米孔装置，其包含微流体模块和纳米孔模块；所述微流体模块包含电极阵列，其中电极阵列将至少一滴流体传输到电极阵列中的第一转移位置，其中第一转移位置位于微流体模块与纳米孔模块之间的接口处；纳米孔模块包含：第一毛细管通道；和第二毛细管通道；其中至少第一毛细管通道延伸到接口且与第一转移位置邻接，并且定位成接收定位于第一转移位置处的流体液滴；其中第一毛细管通道与第二毛细管通道相交，其中纳米孔层定位于第一毛细管通道与第二毛细管通道之间的第一毛细管通道和第二毛细管通道相交的位置处。
条款107.根据条款106所述的装置，其中电极阵列将至少一滴流体传输到电极阵列中的第二转移位置，其中第二转移位置位于微流体模块与纳米孔模块之间的接口处；其中第二毛细管通道延伸到接口且与第二转移位置邻接，并且定位成接收定位于第二转移位置处的流体液滴。
条款108.根据条款106所述的装置，其中第二毛细管通道在第二毛细管通道的一端或两端上的排放口或储槽之间延伸。
条款109.根据条款108所述的装置，其中第二毛细管通道连接到一端处的第一储槽和另一端处的第二储槽。
条款110.根据条款109所述的装置，其中第一储槽和/或第二储槽包含定位在交叉点处的第二毛细管通道内的流体，所述流体促进纳米孔层的操作以驱动电流通过纳米孔层的纳米孔。
条款111.根据条款109所述的装置，其中第一毛细管通道和/或第二毛细管通道的横截面宽度在毛细管的长度上变化以使得在交叉点处的宽度与交叉点的任一侧上的宽度相比减小。
条款112.根据条款106所述的装置，其中第一毛细管包含第一对电极且第二毛细管包含第二对电极，其中第一对电极定位于第一毛细管通道中且侧接纳米孔层中的纳米孔，且其中第二对电极定位于第二毛细管通道中且侧接纳米孔层中的纳米孔。
条款113.根据条款107到112中任一项所述的装置，其中液滴为包含待通过传输通过纳米孔层中的纳米孔来计数的分子的液滴。
条款114.根据条款107所述的装置，其中流体液滴具有不同的组合物且为第一液滴和第二液滴，第一液滴包含待通过在纳米孔层两端传输通过纳米孔来计数的分子且第二液滴包含缺少所述分子的导电流体，其中导电流体促进所述分子在纳米孔层两端传输通过纳米孔。
条款115.根据条款106到114中任一项所述的装置，其中第一毛细管通道包含邻近于纳米孔层定位的第一电极且第二毛细管通道包含邻近于纳米孔层定位的第二电极，其中第一电极和第二电极中的每一个暴露在毛细管通道中以使得其与存在于毛细管通道中的流体接触，且其中在液体定位于第一毛细管通道和第二毛细管通道中的纳米孔层两端时，第一电极和第二电极用以驱动电流通过纳米孔层中的纳米孔。
条款116.根据条款106到115中任一项所述的装置，其中第一转移位置和第一毛细管通道大体上在相同的平面上，且其中流体液滴与第一毛细管通道的开口对准。
条款117.根据条款106到115中任一项所述的装置，其中第一转移位置处于比第一毛细管通道高的平面且其中装置配置有竖直端口以将流体液滴向下转移到第一毛细管通道的开口。
条款118.根据条款117所述的装置，其中第一衬底的第一表面包含其上设置有电极阵列的第一区域和其中形成有第一微通道的第二区域，其中电极阵列处于高于形成第一微通道的平面的平面上。
条款119.根据条款117所述的装置，其中第二衬底包含位于接口处的侧边缘处的凹槽，其中凹槽在第一毛细管通道上对齐且提供用于将位于转移电极处的液滴传输到第一毛细管通道的开口的竖直端口。
条款120.根据条款106到119中任一项所述的装置，其进一步包含与电极阵列分隔开的单电极，其中单电极延伸通过第一转移位置处的电极阵列的至少一部分且与第一转移位置处的电极阵列的至少一部分呈双平面配置。
条款121.根据条款107到119中任一项所述的装置，其进一步包含与电极阵列分隔开的单电极。
条款122.根据条款106到119中任一项所述的装置，其进一步包含与电极阵列分隔开的单电极，其中单电极不延伸通过第一转移位置且不与电极阵列呈双平面配置，其中流体液滴通过使用共平面电极移动到第一转移位置。
条款123.根据条款106到119中任一项所述的装置，其进一步包含与电极阵列分隔开的单电极，其中单电极不延伸通过第一转移位置且不与电极阵列呈双平面配置，其中流体液滴通过使用共平面电极移动到转移位置。
条款124.一种使用根据条款106到123中任一项所述的装置的方法，或根据条款66到105中任一项所述的方法，其用于测量或检测生物样品中存在的分析物或用于诊断患者或筛检血液供给源。
条款125.根据条款1到45或66到105中任一项所述的方法，其中至少步骤(a)到(d)是使用根据条款106到123中任一项所述的装置来执行。
条款126.一种根据条款106到123中任一项的装置的用途，或根据条款1到45中任一项的方法的用途，其用于诊断患者或筛检血液供给源或用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法中。
条款127.一种用于测量生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；(b)使分析物与第二结合成员接触，其中第二结合成员特异性结合到分析物且其中第二结合成员包含与其连接的可裂解标签；(c)去除未结合到分析物的第二结合成员，所述分析物结合到第一结合成员；(d)裂解附着于结合到分析物的第二结合成员的标签，所述分析物结合到第一结合成员；(e)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的标签，其中移位通过所述层的每一个标签为移位事件，其中测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中通过以下来确定样品中存在的分析物量：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准，其中小节i)中的标准曲线通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件的数量来确定；其中小节ii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现一定数量的移位事件所需要的时间来确定；且其中小节iii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。
条款128.一种用于测量生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；(b)使分析物与第二结合成员接触，其中第二结合成员特异性结合到分析物且其中第二结合成员包含适体；(c)去除未结合到分析物的适体，所述分析物结合到固体衬底；(d)解离结合到分析物的适体和(e)使经解离适体移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的适体，其中移位通过所述层的每一个适体为移位事件，其中测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中通过以下来确定样品中存在的分析物量：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准，其中小节i)中的标准曲线通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件的数量来确定；其中小节ii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现一定数量的移位事件所需要的时间来确定；且其中小节iii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。
条款129.一种用于测量生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员固定于固体载体上且其中结合成员特异性结合到分析物；(b)使样品与经标记分析物接触，其中经标记分析物用可裂解标签标记；(c)去除未结合到结合成员的经标记分析物；(d)裂解附着于经标记分析物的标签，所述经标记分析物结合到结合成员；(e)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的标签，其中移位通过所述层的每一个标签为移位事件，其中测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中通过以下来确定样品中存在的分析物量：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准，其中小节i)中的标准曲线通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件的数量来确定；其中小节ii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现一定数量的移位事件所需要的时间来确定；且其中小节iii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。
条款130.一种用于测量生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员固定于固体载体上且其中结合成员特异性结合到分析物；(b)使样品与经标记分析物接触，其中经标记分析物包含适体；(c)去除未结合到结合成员的经标记分析物；(d)解离结合到经标记分析物的适体且使经解离适体移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的适体，其中移位通过所述层的每一个适体为移位事件，其中测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中通过以下来确定样品中存在的分析物量：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准，其中小节i)中的标准曲线通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件的数量来确定；其中小节ii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现一定数量的移位事件所需要的时间来确定；且其中小节iii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。
条款131.一种用于测量生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员特异性结合到分析物，且结合成员用可裂解标签标记；(b)使样品与固定分析物接触，其中固定分析物固定于固体载体上；(c)去除未结合到固定分析物的结合成员；(d)裂解附着于结合成员的标签，所述结合成员结合到固定分析物；(e)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的标签，其中移位通过所述层的每一个标签为移位事件，其中测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中通过以下来确定样品中存在的分析物量：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准，其中小节i)中的标准曲线通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件的数量来确定；其中小节ii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现一定数量的移位事件所需要的时间来确定；且其中小节iii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。
条款132.一种用于测量生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：(a)使样品与结合成员接触，其中其中结合成员特异性结合到分析物，且结合成员包含适体；(b)使样品与固定分析物接触，其中固定分析物固定于固体载体上；(c)去除未结合到固定的结合成员分析物；(d)解离结合到结合成员的适体，所述结合成员结合到固定分析物，且使经解离适体移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的适体，其中移位通过所述层的每一个适体为移位事件，其中测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中通过以下来确定样品中存在的分析物量：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准，其中小节i)中的标准曲线通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件的数量来确定；其中小节ii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现一定数量的移位事件所需要的时间来确定；且其中小节iii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。
条款133.一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述包含：(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员固定于固体载体上，结合成员包含与其连接的可裂解标签且结合成员特异性结合到分析物；(b)去除为结合到分析物的结合成员；(c)裂解附着于结合成员的标签，所述结合成员结合到分析物；(d)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的标签，其中移位通过所述层的每一个标签为移位事件，其中测量移位事件的数量测量了样品中存在的分析物量，其中样品中存在的分析物量通过以下操作来确定：i)计数在设定时间段期间的移位事件数量并使移位事件数量与对照相关联；ii)测量出现一定数量移位事件的时间量并与对照相关联；或iii)测量出现移位事件之间的平均时间并与对照相关联，其中所述对照是包含校准曲线、标准叠加或数字聚合酶链反应的参考标准。
条款134.根据条款133所述的方法，其中小节i)中的标准曲线通过测量在设定时间段期间对于对照分析物浓度的移位事件的数量来确定；其中小节ii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现一定数量的移位事件所需要的时间来确定；且其中小节iii)中的标准曲线通过测量对于对照分析物浓度出现移位事件之间的平均时间来确定。
条款135.一种集成数字微流体纳米孔启用装置，其包含：微流体模块和纳米孔启用模块；所述微流体模块包含与单电极隔开的电极阵列，所述单电极大小设定成与电极阵列的至少一部分重叠，其中电极阵列和单电极将至少一滴流体传输到电极阵列中的转移电极，其中转移电极定位于微流体模块与纳米孔启用模块之间的接口处；纳米孔启用模块包含：第一微通道，其定位于第一衬底的第一表面上；第二微通道，其定位于第二衬底的第一表面上；其中第一衬底的第一表面与第二衬底的第一表面接触进而包封第一微通道和第二微通道以分别提供第一毛细管通道和第二毛细管通道，其中至少第一毛细管通道延伸到微流体模块与纳米孔启用模块之间的接口且与转移电极邻接，并且定位成接收定位于转移电极上的流体液滴；其中第一毛细管通道与第二毛细管通道相交，其中层定位于第一衬底与第二衬底之间的第一毛细管通道和第二毛细管通道相交的位置处，其中所述层不含纳米孔且将第一毛细管通道和第二毛细管通道中存在的离子液隔开，其中第一毛细管通道和第二毛细管通道与电极电连接以用于驱动第一毛细管通道到第二毛细管通道的电压或反之用于在第一毛细管通道和第二毛细管通道的交叉点处的层中产生纳米孔。
条款136.根据条款135所述的装置，其中离子液为水溶液。
条款137.根据条款136所述的装置，其中水溶液为盐溶液。
条款138.根据条款135到137中任一项所述的装置，其中离子液包含所关注分析物，其中装置配置成检测离子液中分析物的存在或不存在。
条款139.一种用于在集成数字微流体纳米孔启用装置中产生纳米孔的方法，所述方法包含：提供根据条款135到138中任一项的集成数字微流体纳米孔启用装置；在第一毛细管通道和第二毛细管通道中施加电压以驱动电流通过层；测量在层两端的电导；在检测到指示在层中产生纳米孔的电导时终止施加电压。
条款140.一种集成数字微流体纳米孔装置，其包含：第一衬底，包含电极阵列；第二衬底，与第一衬底隔开；开口，在与包含纳米孔的纳米孔层流体连通的第一衬底或第二衬底中；和一对电极，配置成通过纳米孔施加电场，其中电极阵列配置成将至少一滴流体传输到所述开口。
条款141.根据条款140所述的装置，其中开口为毛细管通道。
条款142.根据条款141所述的装置，其中毛细管通道在第一衬底或第二衬底的第一侧上具有比第一衬底或第二衬底的第二侧面上的开口更宽的开口。
条款143.根据条款142所述的装置，其中所述检测电极对包含为单电极的第一检测电极。
条款144.根据条款142或143所述的装置，其中所述检测电极对包含安置于第二侧上的第二检测电极。
条款145.一对集成数字微流体纳米孔装置，其包含：
根据条款142所述的第一集成数字微流体纳米孔装置，其中单电极为第一单电极，且毛细管通道为第一毛细管通道；和第二集成数字微流体纳米孔装置，其包含：第三衬底，包含第五侧面和与第五侧面相反的第六侧面，其中第五侧面包含电极阵列；第四衬底，与第三衬底隔开，其中第四衬底包含面对第三衬底的第五侧面的第七侧面和与第七侧面相反的第八侧面，其中第七侧面包含第二单电极且其中纳米孔层安置于第八侧面上，其中第四衬底包含从第七侧面延伸到第四衬底的第八侧面的第二毛细管通道，其中纳米孔层定位于毛细管通道的开口上方，其中纳米孔层插入于第二衬底与第四衬底之间以使得纳米孔在第一毛细管通道与第二毛细管通道之间提供电渗管道，其中所述检测电极对包含为第二单电极的第二检测电极。
条款146.一种集成数字微流体纳米孔启用装置，其包含：第一衬底，包含第一侧面和与第一侧面相反的第二侧面，其中第一侧面包含电极阵列；第二衬底，与第一衬底隔开，其中第二衬底包含面对第一衬底的第一侧面的第三侧面和与第三侧面相反的第四侧面；纳米孔启用层，不含纳米孔且安置于装置的外侧面，其中外侧面选自第二侧面或第四侧面，其中包含外侧面的第一衬底或第二衬底中的一个包含从第一衬底的第一侧面延伸到第二侧面，或从第二衬底的第三侧面延伸到第四侧面的毛细管通道，其中纳米孔启用层定位于毛细管通道的开口上方；和一对电极，配置成在纳米孔启用层两端施加电场，其中电极阵列配置成将至少一滴流体传输到毛细管通道。
条款147.一种用于在集成数字微流体纳米孔启用装置中产生纳米孔的方法，所述方法包含：提供根据条款143所述的集成数字微流体纳米孔启用装置；将纳米孔启用层的两侧浸没在离子液中以使得所述层的每一侧上的离子液与所述检测电极对中的任一个电接触；在所述检测电极对之间施加电压以驱动电流通过所述层；测量所述层两端的电导；在检测到指示在所述层中产生纳米孔的电导时终止施加电压。
条款148.根据条款147所述的方法，其中离子液为盐溶液。
条款149.根据条款147或148所述的方法，其中离子液包含所关注分析物，其中装置配置成检测离子液中分析物的存在或不存在。
条款150.根据条款139或147到149中任一项所述的方法，其进一步包含调节所产生的纳米孔。
条款151.根据条款150所述的方法，其中调节包含：替代地在纳米孔膜两端施加具有第一极性的第一电压和具有与第一极性相反的第二极性的第二电压，其中第一电压和第二电压各自施加至少一次；且测量与纳米孔大小相关的电渗属性。
条款152.根据条款150或151所述的方法，其进一步包含在调节之前测量与纳米孔大小相关的电渗属性。
条款153.一种组合物，其包含结合成员、标签和间隔物。
条款154.根据条款153所述的组合物，其中间隔物包含硝基苯甲基、二巯基乙基氨基、6碳间隔物、12碳间隔物，或3-(9-((3-羧丙基)(甲苯磺酰基)氨基甲酰基)吖啶-10-鎓-10-基)丙烷-1-磺酸酯。
条款155.根据条款154所述的组合物，其中间隔物包含硝基苯甲基，且标签为DNA分子。
条款156.根据条款154所述的组合物，其中间隔物为二巯基乙基氨基且标签为羧化纳米颗粒。
条款157.根据条款154所述的组合物，其中间隔物为3-(9-((3-羧丙基)(甲苯磺酰基)氨基甲酰基)吖啶-10-鎓-10-基)丙烷-1-磺酸酯且标签为寡核苷酸。
条款158.根据条款154所述的组合物，其中间隔物包含6碳间隔物或12碳间隔物且标签为生物素。
条款159.根据条款158所述的组合物，其中第二结合成员包含核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:1-11中任一个中阐述的核苷酸序列。
条款160.根据条款153到159中任一项所述的组合物，其中标签包含可裂解连接子。
条款161.根据条款160所述的组合物，其中可裂解连接子选自由以下组成的组：可光裂解连接子、可化学裂解连接子、可热裂解连接子、热敏感性可裂解连接子和可酶裂解连接子。
条款162.根据条款161所述的组合物，其中可裂解连接子为可光裂解连接子，其中可光裂解连接子包含衍生自以下的可光裂解部分
Figure BDA0002017627730002271
条款163.根据条款161所述的组合物，其中可裂解连接子为可热裂解连接子且使用局部温度升高来裂解。
条款164.根据条款163所述的组合物，其中局部温度升高是以光热方式或通过微波照射来产生。
条款165.根据条款164所述的组合物，其中将来自光的能量转移到吸收靶标。
条款166.根据条款165所述的组合物，其中吸收靶标包含染料、颜料或水。
条款167.根据条款163到166中任一项所述的组合物，其中可裂解连接子包含双链DNA。
条款168.根据条款161所述的组合物，其中可裂解连接子为可化学裂解连接子且裂解由硫醇介导。
条款169.根据条款29、66、68、70、72到86、92到94、98到105、127、129、131、133和134中任一项所述的方法，其中标签包含可裂解连接子。
条款170.根据条款169所述的方法，其中可裂解连接子选自由以下组成的组：可光裂解连接子、可化学裂解连接子、可热裂解连接子、热敏感性可裂解连接子和可酶裂解连接子。
条款171.根据条款170所述的方法，其中可裂解连接子为可光裂解连接子，其中可光裂解连接子包含衍生自以下的可光裂解部分
Figure BDA0002017627730002281
条款172.根据条款170所述的方法，其中可裂解连接子为可热裂解连接子且使用局部温度升高来裂解。
条款173.根据条款172所述的方法，其中局部温度升高是以光热方式或通过微波照射来产生。
条款174.根据条款173所述的方法，其中将来自光的能量转移到吸收靶标。
条款175.根据条款174所述的方法，其中吸收靶标包含染料、颜料或水。
条款176.根据条款172到175中任一项所述的方法，其中可裂解连接子包含双链DNA。
条款177.根据条款30和170所述的方法，其中可裂解连接子为可化学裂解连接子且通过硫醇裂解。
条款178.根据条款2到30、31到45、64、70到105、125、127到134和169到177中任一项所述的方法，其中一个或多个移位事件对应于结合成员与分析物的结合事件。
条款179.根据条款178所述的方法，其中一个移位事件对应于结合成员与分析物的结合事件。
条款180.根据条款178所述的方法，其中两个或更多个移位事件对应于结合成员与分析物的结合事件。
条款181.根据条款180所述的方法，其中每个结合成员并入两个或更多个标签且两个或更多个移位事件代表结合成员与分析物的结合。
条款182.根据条款1到45、63到105、124、125、127到134和169到181中任一项所述的方法，其中至少两个或更多个纳米孔在层中。
条款183.根据条款182所述的方法，其中至少两个或更多个纳米孔并排或串联呈现。
条款184.一种集成数字微流体纳米孔装置，其包含：第一衬底，包含电极阵列；第二衬底，与第一衬底分隔开；和具有第一表面和第二表面的纳米孔层，设置在第一衬底与第二衬底之间，其中电极阵列配置成将第一液滴定位在纳米孔层的第一表面处，其中电极阵列中的至少两个电极定位在纳米孔层两端，其中两个电极形成阳极和阴极并且在液体液滴定位于纳米孔层的第一表面处时用以驱动电流通过纳米孔层中的纳米孔。
条款185.根据条款173所述的电极阵列，其被进一步配置成将第二液滴定位在纳米孔层的第二表面处。
条款186.一种集成数字微流体纳米孔装置，其包含微流体模块和纳米孔模块；微流体模块包含电极阵列，其中电极阵列将至少一滴流体传输到电极阵列中的转移位置，其中转移位置在微流体模块与纳米孔模块之间的接口处；纳米孔模块包含从转移位置延伸到纳米孔层的第一毛细管通道。
条款187.一种集成数字微流体纳米孔装置，其包含：第一衬底，包含电极阵列；第二衬底，与第一衬底隔开；第一纳米孔层，其中具有一个或多个纳米孔；第二纳米孔层，其中具有一个或多个纳米孔；和至少两个电极，其用于产生电场以驱动标签通过第一纳米孔层和第二纳米孔层中的纳米孔。
条款188.根据条款30所述的方法，其中固定剂包含生物素或抗生蛋白链菌素。
条款189.根据条款188所述的方法，其中固定剂包含生物素且配位体包含抗生蛋白链菌素。
条款190.根据条款188所述的方法，其中固定剂包含抗生蛋白链菌素且配位体包含生物素。
条款191.根据条款30和188到190中任一项所述的方法，其中固体载体、第一结合成员和第二结合成员依序或同时地添加到样品中。
条款192.根据条款1到45、63到105、124、125、127到134、169到181、183和188到191中任一项所述的方法，其中孔大小比标签的比率为1.0或小于1.0。
条款193.一种测量或检测生物样品中存在的所关注分析物的方法，所述方法包含(a)使样品与固体载体、结合成员和用可裂解标签标记的经标记分析物接触，其中固体载体包含固定剂，结合成员包含用于固定剂的配位体，且结合成员特异性结合所关注分析物以形成固体载体/结合成员/所关注分析物复合物或固体载体/结合成员/经标记分析物复合物；(b)去除未结合到固体载体/结合成员/经标记分析物复合物中的结合成员的经标记分析物；(c)裂解附着于经标记分析物的标签，所述经标记分析物结合到固体载体/结合成员/经标记分析物复合物中的结合成员；(d)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
条款194.根据条款193所述的方法，其中固定剂包含生物素或抗生蛋白链菌素。
条款195.根据条款194所述的方法，其中固定剂包含生物素且配位体包含抗生蛋白链菌素。
条款196.根据条款194所述的方法，其中固定剂包含抗生蛋白链菌素且配位体包含生物素。
条款197.根据条款193到196中任一项所述的方法，其中固体载体、结合成员和经标记分析物依序或同时地添加到样品中。
条款198.一种用于测量或检测生物样品中存在的所关注分析物的方法，所述方法包含(a)使样品与固体载体、结合成员和外源性分析物接触，其中固体载体包含固定剂，外源性分析物包含用于固定剂的配位体并结合固体载体以便形成固体载体/经固定分析物复合物，且结合成员包含可裂解标签并特异性地结合所关注分析物以形成固体载体/所关注分析物/结合成员复合物或固体载体/经固定分析物/结合成员复合物；(b)去除固体载体/经固定分析物/结合成员复合物或固体载体/所关注分析物/结合成员复合物中未结合的结合成员；(c)裂解固体载体/经固定分析物/结合成员复合物中附着于结合成员的标签；(d)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
条款199.根据条款198所述的方法，其中固定剂包含生物素或抗生蛋白链菌素。
条款200.根据条款199所述的方法，其中固定剂包含生物素且配位体包含抗生蛋白链菌素。
条款201.根据条款199所述的方法，其中固定剂包含抗生蛋白链菌素且配位体包含生物素。
条款202.根据条款198到201中任一项所述的方法，其中固体载体、结合成员和外源性分析物依序或同时地添加到样品中。
条款203.根据条款198到201中任一项所述的方法，其中在裂解步骤(c)中的标签之前，将固体载体/经固定分析物/结合成员复合物隔离。
条款204.根据条款203所述的方法，其中隔离可以使用磁场来完成。
条款205.一种测量或检测生物样品中存在的所关注分析物的方法，所述方法包含(a)使样品与固体载体、结合成员和用适体的经标记分析物接触，其中固体载体包含固定剂，结合成员包含用于固定剂的配位体，且结合成员特异性结合所关注分析物以形成固体载体/结合成员/所关注分析物复合物或固体载体/经标记/经标记分析物复合物；(b)去除未结合到固体载体/结合成员/经标记分析物复合物中的结合成员的经标记分析物；(c)裂解附着于经标记分析物的适体，所述经标记分析物结合到固体载体/结合成员/经标记分析物复合物中的结合成员；(d)使经解离适体移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的适体数测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中。
条款206.根据条款205所述的方法，其中固定剂包含生物素或抗生蛋白链菌素。
条款207.根据条款206所述的方法，其中固定剂包含生物素且配位体包含抗生蛋白链菌素。
条款208.根据条款206所述的方法，其中固定剂包含抗生蛋白链菌素且配位体包含生物素。
条款209.根据条款205到208中任一项所述的方法，其中固体载体、结合成员和经标记分析物依序或同时地添加到样品中。
条款210.一种用于测量或检测生物样品中存在的所关注分析物的方法，所述方法包含(a)使样品与固体载体、结合成员和外源性分析物接触，其中固体载体包含固定剂，外源性分析物包含用于固定剂的配位体并结合固体载体以便形成固体载体/经固定分析物复合物，且结合成员包含适体并特异性地结合所关注分析物以形成固体载体/所关注分析物/结合成员复合物或固体载体/经固定分析物/结合成员复合物；(b)去除固体载体/经固定分析物/结合成员复合物或固体载体/所关注分析物/结合成员复合物中未结合的结合成员；(c)解离固体载体/经固定分析物/结合成员复合物中结合到结合成员的适体；(d)使标签移位通过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于样品中。
条款211.根据条款210所述的方法，其中固定剂包含生物素或抗生蛋白链菌素。
条款212.根据条款211所述的方法，其中固定剂包含生物素且配位体包含抗生蛋白链菌素。
条款213.根据条款211所述的方法，其中固定剂包含抗生蛋白链菌素且配位体包含生物素。
条款214.根据条款210到213中任一项所述的方法，其中固体载体、结合成员和外源性分析物依序或同时地添加到样品中。
条款215.根据条款210到213中任一项所述的方法，其中在解离步骤(c)中的适体之前，将固体载体/经固定分析物/结合成员复合物隔离。
条款216.根据条款215所述的方法，其中隔离可使用磁场来完成。
条款217.一种用于测量或检测生物样品中存在的分析物的方法，所述方法包含：
I.(a)使样品与第一结合成员接触，其中第一结合成员固定于固体载体上且其中第一结合成员特异性结合到分析物；(b)使分析物与第二结合成员接触，其中第二结合成员特异性结合到分析物且其中第二结合成员包含适体；(c)去除未结合到分析物的适体，所述分析物结合到固体衬底；(d)解离结合到分析物的适体并使经解离适体移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的适体，其中测量移位通过所述层的适体数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中；
II.(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员固定于固体载体上且其中结合成员特异性结合到分析物；(b)使样品与经标记分析物接触，其中经标记分析物用可裂解标签标记；(c)去除未结合到结合成员的经标记分析物；(d)裂解附着于经标记分析物的标签，所述经标记分析物结合到结合成员；(e)使经裂解标签移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或其中检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于标签样品中；
III.(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员固定于固体载体上且其中结合成员特异性结合到分析物；(b)使样品与经标记分析物接触，其中经标记分析物包含适体；(c)去除未结合到结合成员的经标记分析物；(d)解离结合到经标记分析物的适体，所述经标记分析物结合到结合成员，且使经解离适体移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的适体，其中测量移位通过所述层的适体数测量了样品中存在的分析物量，或检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中；
IV.(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员特异性结合到分析物，且结合成员用可裂解标签标记；(b)使样品与经固定分析物接触，其中经固定分析物固定于固体载体上；(c)去除未结合到固定分析物的结合成员；(d)裂解附着于结合成员的标签，所述结合成员结合到经固定分析物；(e)使经裂解标签移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；和(f)评定移位通过所述层的标签，其中测量移位通过所述层的标签数量测量了样品中存在的分析物量，或检测移位通过所述层的标签检测到分析物存在于标签样品中；以及
V.(a)使样品与结合成员接触，其中结合成员特异性结合到分析物，且结合成员包含适体；(b)使样品与经固定分析物接触，其中经固定分析物固定于固体载体上；(c)去除未结合到固定分析物的结合成员；(d)解离结合到结合成员的适体，所述结合成员结合到经固定分析物，且使经解离适体移位通过或跨过层中的一个或多个纳米孔；和(e)评定移位通过所述层的适体，其中测量移位通过所述层的适体数测量了样品中存在的分析物量，或检测移位通过所述层的适体检测到分析物存在于样品中。
条款218.根据条款193到217中任一项所述的方法，其中孔大小比标签的比率为1.0或小于1.0。

Claims (19)

1.一种多功能料筒，其包含：
微流体模块，其包含：
第一衬底；
第二衬底；
间隙，其将所述第一衬底与所述第二衬底分离；
多个电极，其在液体液滴上产生电致动力，所述液体液滴包含标签或分析物特异性结合成员；和
电化学物质感测区，其包含工作电极和参考电极；及
纳米孔模块，其包含：
电检测区，其包含含有纳米孔的纳米孔层；
电路，其配置成在所述标签或分析物特异性结合成员移位通过纳米孔时检测电信号；和
第一毛细管通道和第二毛细管通道，
其中所述微流体模块和所述纳米孔模块经包含第一转移位置和第二转移位置的接口流体地连接；
其中所述微流体模块中的所述多个电极：
将第一流体液滴传输到所述第一转移位置，并
将第二流体液滴传输到所述第二转移位置；
其中
所述第一毛细管通道延伸到所述接口且与所述第一转移位置邻接而接收所述第一流体液滴，且
所述第二毛细管通道延伸到所述接口且与所述第二转移位置邻接而接收所述第二流体液滴；
其中所述第一毛细管通道与所述第二毛细管通道相交，并且
其中所述纳米孔层定位于所述第一毛细管通道与所述第二毛细管通道之间的所述第一毛细管通道和所述第二毛细管通道相交的位置处。
2.根据权利要求1所述的多功能料筒，其中所述料筒还包含：光检测区，其为光学透明的且包含用于致动液滴的电极并配置成用于光探查所述液滴。
3.根据权利要求1所述的多功能料筒，其进一步包含覆盖所述多个电极的第一层。
4.根据权利要求3所述的多功能料筒，其中所述第一层包含介电层和/或疏水层。
5.根据权利要求1所述的多功能料筒，其中在所述液体液滴上产生电致动力的所述多个电极定位于所述第一衬底或所述第二衬底的表面上。
6.根据权利要求1所述的多功能料筒，其中所述工作电极和所述参考电极处于共平面配置。
7.根据权利要求1所述的多功能料筒，其中所述第一衬底和所述第二衬底之间的间隙发生变化，使得
所述料筒的第一区域包括具有高度h1的第一腔室，且
所述料筒的第二区域包括具有高度h2的第二腔室。
8.根据权利要求1所述的多功能料筒，其中所述工作电极覆盖有绝缘材料。
9.根据权利要求8所述的多功能料筒，还包括在覆盖所述工作电极的绝缘材料内的多个无绝缘开口。
10.根据权利要求9所述的多功能料筒，其中所述多个无绝缘开口提供用于所述液滴与所述工作电极之间的接触区。
11.根据权利要求9所述的多功能料筒，其中所述多个无绝缘开口包括多个插销孔开口。
12.根据权利要求8所述的多功能料筒，其中所述绝缘材料是在暴露于光时可去除的。
13.根据权利要求1所述的多功能料筒，其中所述标签或所述分析物特异性结合成员通过所述纳米孔层中的纳米孔的移位指示所述液滴中存在分析物。
14.根据权利要求1所述的多功能料筒，其中所述多个电极被配置成将所述液滴定位在所述纳米孔层两端，使得所述纳米孔层将所述液滴分成第一部分和第二部分。
15.根据权利要求14所述的多功能料筒，其中所述多个电极中的至少一个电极与定位于所述纳米孔层两端的液滴的所述第一部分接触。
16.根据权利要求14所述的多功能料筒，其中所述第一衬底包括至少一个电极，所述电极被定位成接触定位于所述纳米孔层两端的所述液滴的所述第二部分。
17.根据权利要求1所述的多功能料筒，其中所述纳米孔层的纳米孔定位于所述第一或第二衬底中的一个或多个开口中；或在多功能料筒的外侧面上。
18.根据权利要求17所述的多功能料筒，其中所述纳米孔层被密封到所述第一衬底或第二衬底的外表面。
19.根据权利要求1所述的多功能料筒，其中所述纳米孔模块未被配置成确定所述标签或分析物特异性结合成员的核酸序列。
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