WO2015178729A1 - 신규한 시료 내 검출대상물의 검출방법 및 그를 이용한 검출키트 - Google Patents

신규한 시료 내 검출대상물의 검출방법 및 그를 이용한 검출키트 Download PDF

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WO2015178729A1
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complex
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detection
bridge
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서준석
심규환
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주식회사 나노엔텍
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Definitions

  • the present invention relates to a novel detection method of a detection object in a sample and a detection kit using the same.
  • Testosterone is a male hormone with secondary sexual characteristics, belongs to the steroid hormones of the androgen group, and is mainly secreted from the gonads. Testosterone is associated with (1) decreased sexual desire and decreased erection and frequency of menopausal men, (2) intellectual activity, cognitive function, decreased spatial perception, mood changes in fatigue, mood and anxiety, (3) sleep disorders, (4) Decreased fat mass associated with a decrease in muscle mass and muscle strength, (5) increased visceral fat, (6) reduced body hair and skin disease, and (7) increased osteopenia and fracture risk due to decreased bone density.
  • the testosterone is diagnosed mainly by analyzing the amount of testosterone present in the blood.
  • the increased testosterone is associated with androgen resistance, ovarian cancer, testicular cancer, ngeni tal adrenal hyperplasia or precocious puberty. It is associated with chronic disease, pituitary abnormalities, delayed puberty, testicular abnormalities, or uncancerous tumors consisting of pituitary cells that are overproduced.
  • testosterone present in vivo is not present in a free state, but mostly in a state associated with a protein. In other words, the free state is only 2-3% of testosterone, 44-65% It is associated with Sex Hormone Binding Globulin (SHBG) and 33-54% is associated with albumin. For this reason it is difficult to detect testosterone present in the blood.
  • SHBG Sex Hormone Binding Globulin
  • the detection method to be used in the present invention is a competitive iterative (compet it ive assay), using a gold nanoparticles as a medium by amplifying the measurement signal by increasing the reaction sensitivity than the conventional method using a competitive reaction, such as testosterone
  • the purpose of this study is to establish a method for detecting micromolecules more accurately.
  • the present inventors made diligent research efforts to develop a novel method for detecting a target in a sample.
  • the detection object in the sample is combined with the 'bridge complex', whereby the 'bridge complex' and the 'competitor carrier complex' that generates a signal
  • the method does not bind to the same binder on the support, and as a result, a signal is not generated on the support, thereby developing a method for accurately detecting a target in a sample.
  • the present invention Unlike the conventional fluid flow detection method (l iquid f low assay), which is applied to an analysis immediately after separating a nontarget material bound to a detection object using an acidification or an analog of the detection object, By contacting the detection object in the sample isolated from the binding protein with particles in which a specific eye binder (eg, an antibody) was bound to the detection object, a complex of the detection object, the binder and the particle was also applied to the flow analysis. By performing the above process, the reaction of the detection object and the binder was induced to complete the loading sample in a state suitable for the detection method of the present invention, and thus it was confirmed that more accurate qualitative and quantitative analysis was possible.
  • a specific eye binder eg, an antibody
  • Another object of the present invention is to provide a detection kit of a detection object in a novel sample.
  • the present invention provides a method for detecting a target object in a sample, comprising the following steps:
  • a sample may contain (i) binding equivalents that have the same binding properties as the detection object and generate a signal.
  • Contact ing with a 3 ⁇ 4 " body (a compet i tor carr ier complex having an analyte and being capable of generat ing signal) and (ii) a binder complex with a binder that specifically binds to the target If a target is present in the sample, the target in the sample binds to the bridge complex; (b) contacting the resultant of step (a) with the same binder having the same binding properties as the detection object bound to the test zone on the support;
  • the detection object is present in the sample
  • the bridge complex to which the detection object in the sample is bound does not bind to the same binder on the support and no signal is generated on the support, and the detection object is not present in the sample
  • the bridge complex is bonded to the same bond on the support and the competitor carrier complex is bonded to the bridge complex to generate a signal on the support;
  • step (C) measuring the intensity of the signal generated from the competitor carrier complex in the result of step (b).
  • the present inventors have diligently researched to develop a novel method for detecting a target in a sample.
  • the target in the sample is competitive with the 'competitor carrier complex that generates a signal.''And thus, the bridge complex to which the detection target is bound does not bind to the same binding on the support, and as a result, no signal is generated on the support, thereby developing a method for accurately detecting the detection target in the sample.
  • the method of the present invention is a conventional fluid flow detection method (l iquid f low assay) which is applied to an analysis immediately after separating a nontarget material bound to a detection object using an acidification or an analog of the detection object.
  • a binding agent eg, an antibody
  • a complex of the detection object, the binding agent, and the particles was applied to the flow analysis.
  • the detection method of the present invention is a method for detecting an object present in an analyte by using a competing reaction (compet it ive react ion), the present inventors (i) fluid in a conventional competitive it method (compet it ive assay) In case of binding the detection object to the antibody immobilized on the support in the reaction in the flow (internal reaction), it is difficult to accurately quantitatively analyze because the reaction time between the detection object and the antibody in the sample is insufficient.
  • a competitor hormone for example, 2-methoxyestradiol
  • a protein for example, globulin or albumin
  • Various known methods for separating from the target material can be used.
  • the method of the present invention can improve reaction by 1 inducing a sufficient binding reaction between the antibody and the detection object by using a 'bridge complex' that binds the gold nanoparticles and the antibody specific to the detection object, and 2 excellent resolution or resolution (resolut ion) allows the detection object to be separated in a fine concentration range, thereby enabling accurate concentration measurement of the detection object in the sample.
  • the method of the present invention can effectively detect small molecules such as hormones and vitamins with small molecular weights.
  • sample includes, but is not limited to, an organic substance derived from all mammals and an artificially synthesized organic molecule (organi c molecules) as a substance including a detection object. It is not.
  • the sample may be a virus, bacteria, cell or tissue-derived extract, lysate or purified product, blood, plasma, serum, lymph, bone marrow, saliva, ocular fluid, semen, brain extract, spinal fluid, joint fluid, thymus Biological sample contaminants such as fluids, ascites or amniotic fluids, toxins, toxic chemicals, forensic substances Or similar materials.
  • organic molecules refers to a molecule having a covalent bond between carbon, nitrogen, oxygen and / or sulfur atoms.
  • Organic molecules can be selected from small sized molecules such as carbon monoxide to complex large site molecules such as polymers.
  • binding equivalents refers to all biochemical compounds that have the same binding properties as the detection target.
  • the detection target and the same conjugate may be a protein, peptide, carbohydrate, lipid, nucleic acid or compound.
  • the detection target and the same combination include various known compounds ' chemical hormones and analogues thereof, such as testosterone, thyroid hormone (TSH), human growth hormone, progesterone, chorionic gonadotropin (hCG) and analogue hormones thereof.
  • the same binder is testosterone-3-carboxymethyloxime-BSA.
  • the detection target and the same binder are compound hormones and compound hormones bound to proteins, and more specifically, testosterone (testosterone) and testosterone bound to sex hormone binding gluobul (SHBG) (testosterone) or testosterone bound to albumin (Albumin).
  • SHBG sex hormone binding gluobul
  • Albumin testosterone bound to albumin
  • the method of the present invention can be widely used to detect not only testosterone but also micromolecules such as vitamin D.
  • the term "competitor carrier complex” refers to a complex comprising the same binder and particles or beads, wherein the particles or beads have the same binding properties as the object to be detected. The binding equivalents are combined.
  • the particles or beads may generate a signal, for example the particles or beads include nanoparticles, microparticles, nanobeads or microbeads.
  • the particles or beads may have a diameter of 200 nm to 1000 nm, and according to the invention the diameter of the particles or beads is 200 nm to 500 nm.
  • the competitor carrier complex functions as a complex in which the same binder and the beads are bound, and more particularly, the same binder bound to the beads of the competitor carrier complex may be bound to the antibody bound to the bridge complex.
  • the term "binder" is a substance that specifically binds to a detection target, and includes, for example, proteins, peptides, carbohydrates, lipids, nucleic acids, and compounds specific to the detection target.
  • the binding agent is an antibody, modified antibody, antibody analogue, aptide, receptor, streptavidin, avidin, neutravidin, aptamer, lectin, substrate, DNA, RNA, lipid or viral protein.
  • the binder is an antibody.
  • bridge complex refers to a complex including a binder and particles or beads, wherein the particles or beads are bound to a binder that specifically binds to a detection object.
  • the binder bound to the bridge complex may bind to the detection target or the same binder in the sample.
  • the particles or beads include nanoparticles, microparticles or nanobeads or microbeads.
  • the particles or beads may have a diameter of 20 nm to 80 nm, and according to the invention the diameter of the particles or beads is 40 nm to 50 nm.
  • the bridge complex is a complex of 'antibody specific for gold nanoparticles and a detection object'.
  • the bridge composite may include a plurality of binders per particle.
  • Step (a): Contact of Sample, Competitor Carrier Complex and Bridge Complex (i) A sample of the competitor carrier complex (a compet i tor carr ier) bound to the binding equivalents having the same binding properties as the object to be detected. complex) and (ii) contact with a bridge complex to which a binder that binds specifically to the target is bound.
  • the detection object in the sample binds to the bridge complex.
  • the detection target and the competitor carrier complex in the sample which bind to the bridge complex may react competitively at the same time or may react selectively or sequentially, respectively.
  • (i) sample, competitor carrier composite and bridge When contacting the complexes simultaneously, the bridge complex binds to the sample in the sample competitively with respect to the competitor carrier complex.
  • the bridging complex binds to the detection object (sample) or the same conjugate (competitor carrier complex) and little competition reaction occurs unlike simultaneous contact.
  • a competitor carrier complex may be first bound to a residual binder of a bridge complex after a complex of a target complex and a bridge complex bond in a sample is formed. For example, when the sample and the bridge complex are reacted to form a complex of the object-bridge complex, and then applied to the detection kit of the present invention, the complex is bound to the same conjugate in the test zone, and then the competitor carrier complex is a non-binding antibody of the bridge complex.
  • the competitor carrier composite includes colored particles as particles, and a signal is generated directly from the colored particles.
  • the chromogenic particles are particles of fluorescent molecules, chromogenic.
  • the particles or beads of the competitor carrier complex further comprise a detectable signal generating label and the signal can be generated from the signal generating label.
  • signal means a detectable parameter and includes the flow of optical, electrical or magnetic parameters, fluorescence emission, infrared radiation, ultraviolet radiation, chemiluminescence, light reflection and also the degree of absorption of the signal.
  • Labels that generate detectable signals include chemicals (e.g. biotin), enzymes (alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, horse radish peroxidase and cytochrome ⁇ 450 ), radioactive substances (e.g.
  • the label may comprise a variety of known fluorescent materials, for example, fluorosane and its derivatives, rhodamine and its derivatives, phycoerythrin, lucifer yellow, B-phytoerythrin, 9-acridine isothiocyanate , Lucifer yellow VS, 4-acetamido-4'-isothio-cyanatostilben-2,2'-disulfonic acid, 7-diethylamino-3- (4'-isothiocyatophenyl) 4-methylcoumarin, succinimidyl-pyrenebutyrate, 4-acetamido-4'-isothiocyanatostilben-2, 2'-disulfonic acid derivative, LC TM -Red 640, LC TM -Red 705 , PC5, Cy5, Cy5.5, lysamine isothiocyanate, erythrosine isothiocyanate, diethylenetriamine pentaacetate, 1-dimethylamin
  • the step (a) may include the following sub-steps:
  • step (a-1) contacting the sample with the bridge complex treated with a displacement agent to dissociate the compound hormone from the compound hormone bound to the protein; And (a-2) the substep of contacting the resultant of step (a-1) with the competitor carrier complex.
  • the displacement agent may be an acid, an alkali, a heavy metal or an organic solvent, a competitor hormone, or the like, as a reagent for separating a compound hormone and a protein.
  • the dissociating agent is a competitor hormone (e.g. 2-methoxyestradiol), and the competitor hormone acts competitively against the compound hormone (e.g. testosterone) to bind to the compound hormone (sex Hormone binding globulin or albumin).
  • the competitor carrier composite may be located upstream of the test zone on the support prior to performing step (a).
  • the sample passes through the test zone where the same compound is bound together with the competitor carrier complex.
  • the sample containing the detection object is (i) 'sample zone' into which the sample is put on the support, (ii) 'competitor carrier complex zone' and () bridge complex contacting the competitor carrier composite with the sample And / or a 'test zone' to which the competitor carrier complexes can bind, the three zones may be located on the support in fluid flow order.
  • the step (a) may be performed by treating the sample treated with a di spl acement agent that dissociates the compound hormone from the compound hormone bound to the protein. Contacting the bridge complex to obtain a sample / bridge complex reactant, and then applying the sample / bridge complex reactant to the sample zone, wherein step (b) is performed through the fluid flow of the sample cartridge composite reactant and the competitor
  • the carrier complex may be moved to the test zone and brought into contact with binding equivalents bound to the test zone.
  • Step (b) contact of the same combination of test zones and the result of step (a) followed by the same binding properties having the same binding properties as the detection object bound to the test zone on the support Contact with the bond.
  • the bridge complex to which the detection object in the sample is bound does not bind to the same binder on the support and no signal is generated on the support, and the detection object is not present in the sample
  • the bridge complex is bonded to the same bond on the support and the competitor carrier complex is bonded to the bridge complex to generate a signal on the support.
  • a support is bonded to the same binder, and the same bond exists on the surface of the substrate of one reaction vessel in which a continuous flow of the reaction product is carried out, and the semi-reactor has a microchannel. It's a microcheap.
  • the term "support” may be used in the same sense as "sol id substrate, sol id support or sol id phase", and means a non-liquid material. .
  • the support is Microchannels can be formed therein and can exist, for example, as membranes, portions of capillaries or as small l ammeter beads flowed / adhered within the microchannels.
  • Known materials of this type include hydrocarbon polymers such as polystyrene and polypropylene, glass, metals, and gels.
  • the support may be in the form of dipsticks, microtiter plates, particles (such as beads), affinity columns and immunoblot membranes (such as polyvinylidene fluoride membranes) (see, eg, US Pat. No. 5,143). 825, 5,374, 530, 4,908, 305 and 5, 498, 551).
  • a signal measuring device is used to measure the intensity of the signal generated from the competitor carrier complex in the result of step (b).
  • the signal emitted from the label contained in the competitor carrier complex is measured as a fluorescence signal
  • the presence of the detection object can be confirmed by measuring the fluorescence signal of the test zone
  • the sample passed through the test zone Quantitative analysis is possible through a series of processes.
  • the quantitative analysis of the detection object is carried out by the method described in Republic of Korea Registration No. 10-1353930.
  • the microchannel on the support includes a test zone and a reference zone, the same binder is bound to the surface of the test zone, and an animal-derived peptide in the standard zone.
  • a detection antibody selected as a substance capable of binding thereto may bind.
  • a detection antibody specific for the same binding entity or a detection target may be bound.
  • test zone is a compartment included in the microchannel of the support for fluid flow analysis, and the same binder having the same binding properties as the detection object is bound to the surface of the test zone.
  • reference zone refers to a compartment included in the microchannel of the support, to which a detection antibody selected as an animal-derived peptide or a substance bindable thereto may bind.
  • the surface of the standard zone is bound to an antibody that is specific for the same binder or to the target, so that the same binder or target through the test zone can bind.
  • the same conjugate or antibody may be attached to a solid substrate by physical adsorption or chemical adhesion.
  • Physical adsorption is carried out by reaction between the solid phase material and the antibody or antigen in the appropriate supernatant.
  • the buffer include a phosphate complete solution, a tris-hydrochloride complete solution, and a carbonate buffer solution.
  • the reaction is carried out by mixing and maintaining the complete layer at 4-37 ° C., especially at room temperature for a certain time.
  • Chemical attachment is feasible by using the carbodiimide method in the peptide attachment method.
  • Other chemistries include glutaraldehyde or cyanuric chloride ("peptide synthesis", Maruzen, 1975 or “enzyme immunoassay", Gyorizuphan, "protein nucleic acid enzymes", Special Issue 31, 1987), and the like. The same two is done with a crosslinking reagent.
  • the sample is applied to the microchip and the sample is in contact with the test area and the standard area through a flow formed in the microchannel.
  • the present invention provides a detection kit of a detection object in a sample comprising:
  • a support provided with a microchannel (Mi croChanne l) to receive a sample and to react;
  • the detection apparatus of the present invention uses the above-described detection method of the object to be detected in the sample of the present invention, and the contents common between the two are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the apparatus of the present invention will be described in detail for each configuration as follows: Configuration (a): A support provided with a microchannel (micro crochannel)
  • the detection device of the present invention includes a support for receiving a sample and forming a reaction. Included.
  • the support is provided with a microchannel for receiving an analytical sample, the microchannel may have a variety of depth (depth).
  • the microchip capable of accommodating an analyte sample may include one or more microchannels, and the microchannels may be combined with the same compound and a detection antibody that detect different targets.
  • the microchannel may include a sample zone, a reaction zone, a competitor carrier complex zone, a test zone, a standard zone, and a reaction termination zone.
  • each of the zones may include a sample zone, a reaction zone, a competitor carrier complex zone, a test zone, a standard zone. It can be located in the order of the zone and the end zone.
  • the microchannel may include a sample inlet for injecting a sample, and when the sample is introduced into the microchannel through the inlet, the microchannel is bound or non-binding to binding equivalents located in the test zone while passing through the microchannel. Combined.
  • a specific reaction of the analyte such as a labeling reaction using a fluorescent material or an antigen-antibody reaction, is performed in a microchannel.
  • a specific reaction of the analyte such as a labeling reaction using a fluorescent material or an antigen-antibody reaction
  • a microchannel for detection of the detection target, a specific reaction of the analyte, such as a labeling reaction using a fluorescent material or an antigen-antibody reaction, is performed in a microchannel.
  • a specific reaction of the analyte such as a labeling reaction using a fluorescent material or an antigen-antibody reaction.
  • the competitor carrier complex region is formed in one region of the microchannel, and the same carrier having the same binding properties as the detection target is bound and a competitor carrier complex capable of generating a signal is bound. It is designed to be.
  • the competitor carrier composite zone is located upstream of the test zone on the support.
  • the test region is formed in one region of the microchannel, and has a binding property that is the same as that of the detection target and binds a binder that binds specifically to the detection target.
  • the binding equivalents that can be combined with are designed to be combined.
  • the detection object in the sample binds to the bridge complex, and the bridge complex in which the detection object in the sample is bound does not bind to the same binder on the support and a signal is not generated on the support. And when the detection object is not present in the sample, the bridge complex is bound to the same binder on the support and the competitor carrier complex is bound to the bridge complex to generate a signal on the support.
  • a support included in the detection apparatus of the present invention includes (i) a sample zone, (ii) a competitor carrier complex zone and (iii) a test zone, wherein the three zones are in fluid flow order Located on the support
  • the detection device of the present invention may further include a reference zone formed at one portion of the microchannel and having a reference substance bound to the surface to which a detection target or the same binding substance specifically binds. have.
  • the device may include, as a reference material, a detection antibody that binds a label that generates a detectable signal and specifically binds the detection target or the same binding material.
  • the apparatus may further include measuring means for measuring a signal generated from the label, or the apparatus may include analyzing means for calculating a ratio of the intensity of the signal measured in the test area and the standard area. It may further include.
  • the method and apparatus of the present invention can be used in a variety of ways, for example, when detecting hormones that are micromolecules, by effectively dissociating non-target proteins and binding hormones into a free hormone state in the sample, excellent resolution or resolution ( By providing a resolut ion, the object to be detected in the sample can be separated into a fine concentration range.
  • the present invention relates to a novel detection method of a detection target in a sample and a detection apparatus using the same.
  • the detection method of the present invention can improve the reactivity by inducing the binding reaction between the antibody and the detection object by using the 'bridge complex' in which the gold nanoparticles and the antibody specific to the detection object are bound.
  • the method of the present invention can effectively detect small molecules of small molecular weight such as hormones and vitamins. [Brief Description of Drawings]
  • FIG. 1 schematically shows a detection method of the present invention.
  • Figure 2 measures the degree of dissociation (displacement) according to the concentration of testosterone.
  • 2A shows a calibration curve according to the conventional detection methods 1 and 2 without using gold nanoparticles
  • FIG. 2B shows a calibration curve according to the method of the present invention using gold nanoparticles.
  • the horizontal axis represents the ratio of the test intensity signal to the reference intensity signal
  • the vertical axis represents the concentration of testosterone.
  • FIG. 3 shows the correlation according to the detection method.
  • Figure 3a shows the correlation according to the conventional detection method 1 and 2 (Figs. 6a and 6b)
  • Figure 3b shows the correlation according to the conventional detection method 3 (Fig. 6c)
  • Figure 3c shows the method of the present invention Correlation according to In the case of FIG. 3A, the correlation was low as 0.7414.
  • FIG. 3B the correlation was high, but it requires a separate washing process. In the case of the present invention, it does not go through the washing process and the correlation was also found to be high.
  • 5A shows a calibration curve according to the conventional detection methods 1 and 2 without using gold nanoparticles
  • FIG. 5B shows a calibration curve according to the method of the present invention using gold nanoparticles.
  • FIG. 6a to 6c show a testosterone detection method using the detection apparatus of the present invention using the conventional testosterone detection method (respective reactions 1, 2 and 3, respectively).
  • Samples represent blood (a: sample inlet, b: competitor carrier complex zone, c: test zone, d: standard zone). * Abbreviation
  • Ant i-Testosterone F.B. Ant i -Testosterone Fluorescence bead Tes t O-3CM0 : BSA-® : Testosterone ⁇ 3 ⁇ carboxymethyloxime ⁇ bovine serum albumin-Biot in
  • Ant i -Testosterone-® Ant i-Testosterone-Biot in
  • Gold nanoparticles (Go Id nanopart icle) of about 40 nm in diameter and antibodies (anti-testosterone or anti-Vi tamin D) were mixed in a constant ratio in a test tube and reacted at room temperature for 1 hour. The antibody was added so that the final concentration was 5 y g / mL.
  • BSA bovine serum albumin
  • phosphate buffer PB buf fer
  • the activated fluorescent microparticles and antigen [Testosterone-3-carboxymethyloxime-bovine serum albumin, Testosterone—3-CM0-BSA) or vitamin D] were then added at a constant rate in the test tube. After mixing (100 uL of 2% fluorescent microparticles and 250 ug of antigen), the mixture was reacted at room temperature for 2 hours.
  • Example 3 Biotinylation of Testosterone 3CM0 BSA
  • Testosterone 3CM0 BSA was mixed with biotin (biot in) at a rate and reacted at room temperature for 1 hour (20 mol biotin / 1 mol antibody).
  • Biotinylated-Testosterone or Biotinylated-Vi tamin D is dotted onto the lower substrate of the chip with avidin and then at room temperature It was time to react.
  • the detection method of the present invention was found to be wider range and dissociation degree (Di s.%) Of the average value of the measured signal. Table 3

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Abstract

본 발명은 신규한 시료 내 검출대상물의 검출방법 및 그를 이용한 검출장치에 관한 것이다. 본 발명의 검출방법은 금 나노입자와 검출대상물에 특이적인 항체를 결합시킨 '브리지 복합체'를 사용하여 항체와 검출대상물 간의 충분한 결합반응을 유도함으로써 반응성을 향상시킬 수 있다. 이로써 우수한 분해능 또는 분리능(resolution)을 제공하여 시료 내 검출대상물의 정확한 농도측정이 가능케 하며, 측정 시그널을 증폭시킬 수 있다는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 방법은 호르몬, 비타민 등 분자량이 작은 미소 분자(small molecule)를 효과적으로 검출할 수 있다.

Description

【명세서】
【발명의 명칭】
신규한 시료 내 검출대상물의 검출방법 및 그를 이용한 검출키트
【기술분야】
본 특허출원은 2014년 5월 23일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제 10-2014-0062143호에 대하여 우선권을 주장하며， 상기 특허출원의 개시 사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 신규한 시료 내 검출대상물의 검출방법 및 그를 이용한 검출키트에 관한 것이다. 【배경기술】
테스토스테론 (Testosterone)은 2차 성징을 나타내는 남성 호르몬으로서， 안드로겐 그룹의 스테로이드 호르몬에 속하며， 주로 생식선에서 분비된다. 테스토스테론은 남성 갱년기의 (1) 성욕 감소 및 발기능력 및 빈도 감소, (2) 지적 활성， 인지 기능, 공간 지각력의 감소， 피로, 기분 저하 및 불안의 기분 변화, (3) 수면 장애， (4) 근육량 및 근육 강도의 감소와 관련된 제지방량의 감소， (5) 내장 지방의 증가, (6) 체모의 감소 및 피부 질환， 및 (7) 골밀도 감소로 인한 골감소증 및 골절위험 증가와 관련된다.
주로 혈액 내에 존재하는 테스토스테론의 양을 분석하여 진단하며， 증가된 테스토스테론은 안드로겐 저항성， 난소암， 고환암, 선천성부신과형성 (ngeni tal adrenal hyperplasia) 또는 성조숙증 (Precocious puberty)과 관련되며， 감소된 테스토스테론은 만성질환， 뇌하수체 이상， 사춘기지연 (Delayed puberty) , 고환이상 또는 프를락틴올 과생산하는 뇌하수체 세포로 이루어진 암화되지 않은 종양과 관련된다. - 한편, 생체 내에 존재하는 테스토스테론은 유리된 상태로 존재하는 것이 아니라, 대부분이 단백질과 결합된 상태로 존재한다. 즉， 유리된 ( free) 상태는 테스토스테론은 약 2-3%에 불과하며， 44-65%가 성호르몬 결합 글로불린 (Sex Hormone Binding Globul in, SHBG)과 결합된 상태로 존재하며， 33-54%가 알부민과 결합된 상태로 존재한다. 이러한 이유 때문에 혈액 내 존재하는 테스토스테론을 검출하기 어렵다.
일반적으로 테스토스테론에 결합한 단백질을 제거하기 위하여 단백잘 변성을 일으키는 산 용액을 이용하거나, 테스토스테론과 유사한 구조를 가진 호르몬인 2-메록시에스트라디올 (2-ME)을 사용하는 것이 필요하다. 경우에 따라, 충분한 시그널을 얻기 위한 유리 ( free) 상태의 테스토스테론을 얻기 위해 반웅 조건 및 반웅 시약을 조절할 수도 있다. 한편， 테스토스테론 (분자량 288.42) 등의 호르몬을 기존 검출방법에 적용할 경우， 작은 분자량으로 인해 샌드위치 측정법 (Sandwich Assay)의 사용이 불가능하였다.
본 발명에서 이용하고자 하는 검출방법은 경쟁반응 (compet i t ive assay)을 이용한 한 것으로서， 금 나노입자를 매개체로 사용하여 종래 경쟁반웅을 이용한 분석법보다 반웅감도를 높여 측정 시그널을 증폭시킴으로써， 테스토스테론과 같은 미소분자를 보다 정확하게 검출할 수 있는 방법을 확립하고자 한다.
- 본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
【발명의 내용】
【해결하려는 과제】
본 발명자들은 신규한 시료 내 검출대상물의 검출방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과， 본 발명자들은 시료 내에 검출대상물이 존재하는 경우， 시료 내 검출대상물이 '브리지 복합체' 와 결합하게 되고， 이로써 검출대상물이 결합된 '브리지 복합체' 및 시그널을 발생시키는 '경쟁자 캐리어 복합체 ' 는 지지체 상의 동일결합물과 결합하지 않으며， 결과적으로 상기 지지체 상에서 시그널이 발생되지 않아 시료 내 검출대상물을 정확히 검출할 수 있는 방법을 개발하였다. 본 발명의 방법은 산성화 또는 검출대상물의 유사체 (analog) 등을 이용하여 검출대상물에 결합된 비타겟 (nontarget ) 물질을 분리한 후 곧바로 분석에 적용하였던 종래 유체유동 검출방법 ( l iquid f low assay)과 달리， 상기 결합 단백질로부터 분리된 시료 내 검출대상물을 검출대상물에 특이적안 결합제 (예컨대， 항체)를 결합시킨 입자와 접촉시킴으로써， 검출대상물， 결합제 및 입자의 복합체가 유동 분석에 적용되도특 하였다. 상기 과정을 수행함으로써 검출대상물과 결합제의 층분한 반응을 유도하여 본 발명의 검출방법에 적합한 상태의 로딩 ( loading)시료를 완성하였고， 이로써 보다 정밀한 정성 및 정량분석이 가능함을 확인하였다. 또한， 별도의 세척과정을 필요로 하지 않으므로 외부 요인에 의한 영향을 최소화하여 데이터의 안전성을 향상시키고, 기존의 방법과 비교하여 정밀한 분해능 (resolut ion)을 제공하여 시료 내 검출대상물의 정확한 농도측정이 가능케 하며， 측정 시그널을 증폭시킬 수 있다는 장점이 있다.
따라서 본 발명의 목적은 신규한 시료 내 검출대상물의 검출방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 신규한 시료 내 검출대상물의 검출키트를 제공하는 데 있다. 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명， 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
【과제의 해결 수단】
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 시료 내 검출대상물의 검출방법을 제공한다:
(a) 시료를 ( i ) 검출대상물과 동일한 결합특성을 갖는 동일결합물 (binding equivalents )이 결합되어 있고 시그널을 발생시킬 수
Figure imgf000005_0001
¾ "체 (a compet i tor carr i er complex having an analyte and being capable of generat ing signal ) 및 ( i i ) 검줄대상물에 특이적으로 결합하는 결합제 (binder )가 결합되어 있는 브리지 복합체와 접촉 (contact ing)시키는 단계; 상기 시료 내에 검출대상물이 존재하는 경우， 상기 시료 내 검출대상물은 상기 브리지 복합체와 결합하며; (b) 상기 단계 (a)의 결과물을 지지체 상의 시험구역 (test zone)에 결합된 검출대상물과 동일한 결합특성을 갖는 동일결합물과 접촉시키는 단계; 상기 시료 내에 검출대상물이 존재하는 경우 상기 시료 내 검출대상물이 결합된 상기 브리지 복합체는 상기 지지체 상의 동일결합물과 결합하지 않고 상기 지지체 상에서 시그널이 발생되지 않으며， 상기 시료 내에 검출대상물이 비존재하는 경우 상기 브리지 복합체는 상기 지지체 상의 동일결합물과 결합하고 상기 경쟁자 캐리어 복합체는 상기 브리지 복합체에 결합되어 상기 지지체 상에서 시그널이 발생되며; 그리고，
(C) 상기 단계 (b)의 결과물에서 상기 경쟁자 캐리어 복합체로부터 발생되는 시그널의 세기를 측정하는 단계. 본 발명자들은 신규한 시료 내 검출대상물의 검출방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 시료 내에 검출대상물이 존재하는 경우, 시료 내 검출대상물이 '시그널을 발생시키는 경쟁자 캐리어 복합체' 에 대하여 경쟁적으로 '브리지 복합체' 와 결합하게 되고， 이로써 검출대상물이 결합된 브리지 복합체는 지지체 상의 동일결합물과 결합하지 않으며, 결과적으로 상기 지지체 상에서 시그널이 발생되지 않아 시료 내 검출대상물을 정확히 검출할 수 있는 방법을 개발하였다. 본 발명의 방법은 산성화 또는 검출대상물의 유사체 (analog) 등을 이용하여 검출대상물에 결합된 비타겟 (nontarget ) 물질을 분리한 후 곧바로 분석에 적용하였던 종래 유체유동 검출방법 ( l iquid f low assay)과 달리, 상기 결합 단백질로부터 분리된 시료 내 검출대상물을 검출대상물에 특이적인 결합제 (예컨대， 항체)를 결합시킨 입자와 접촉시킴으로써， 검출대상물， 결합제 및 입자의 복합체가 유동 분석에 적용되도록 하였다. 상기 과정을 수행함으로써 검출대상물과 결합제의 층분한 반웅을 유도 _하여 본 발명의 검출방법에 적합한 상태의 로딩 ( loading)시료를 완성하였고， 이로써 보다 정밀한 정성 및 정량분석이 가능함을 확인하였다. 또한 별도의 세척과정을 필요로 하지 않으므로 외부 요인에 의한 영향을 최소화하여 데이터의 안전성을 향상시키고， 기존의 방법과 비교하여 정밀한 분해능 (resolut ion)을 제공하여 시료 내 검출대상물의 정확한 농도측정이 가능케 하며， 측정 시그널을 증폭시킬 수 있다. 본 발명의 검출방법은 경쟁 반웅 (compet i t ive react ion)을 이용하여 분석시료 내 존재하는 검출대상물을 검출하는 방법으로서， 본 발명자들은 종래의 경쟁 분석방법 (compet i t ive assay)에서 ( i ) 유체 유동 중의 반응 (내부반응)에서 지지체 (support )에 고정된 항체에 검출대상물을 결합시킬 경우 시료 내 검출대상물과 항체와의 반웅시간이 층분하지 않아 정확한 정량분석이 어려우며， ( Π ) 유체 유동 적용 전 시험관 내 반웅 (외부반웅)에서 검출대상물과 항체를 반응시킬 경우 검출 시그널이 나오지 않거나 또는 항체를 비드 (bead)에 결합시켜 외부반응을 진행할 경우 시그널 측정 시 비드에 결합된 항체를 제거하는 세척과정 (washing)을 별도로 요구한다는 점에 착안하여， 이를 개선하기 위한 시료 내 검출대상물의 검출방법을■ 개발하고자 노력하였고, 그 결과 본 발명의 방법이 설계되었다.
본 발명의 실시예에 따르면， 검출대상물인 테스토스테론에 결합되어 있는 단백질 (예컨대， 글로불린 또는 알부민)을 분리하기 위하여 경쟁자 호르몬 (예컨대， 2-메록시에스트라디올)을 사용하였으나， 이 외에도 검출대상물을 비타겟 물질로부터 분리하기 위한 다양한 공지된 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 방법은 ① 금 나노입자와 검출대상물에 특이적인 항체를 결합시킨 '브리지 복합체' 를 사용하여 항체와 검출대상물 간의 충분한 결합반응을 유도함으로써 반웅성을 향상시킬 수 있고， ② 우수한 분해능 또는 분리능 (resolut ion)으로 인하여 검출대상물을 세밀한 농도 범위로 분리할 수 있으며， 이로써 시료 내 검출대상물의 정확한 농도측정이 가능하다. ③ 또한, 본 발명의 방법은 호르몬， 비타민 등 분자량이 작은 미소 분자 (smai r molecule)를 효과적으로 검출할 수 있다.
본 명세서에서， 용어 "시료 " 는 검출대상물을 포함하는 물질로서 모든 포유동물로부터 유래한 유기물질 (organi c mater i al s) 및 인위적으로 합성된 유기분자 (organi c molecules)를 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다. 예컨대， 상기 시료는 바이러스， 박테리아， 세포 또는 조직 -유래 추출물, 파쇄물 ( lysate) 또는 정제물, 혈액, 혈장, 혈청, 림프， 골수액， 타액， 안구액， 정액， 뇌 추출물, 척수액， 관절액, 흉선액， 복수 또는 양막액 등의 생물학적 시료 오염물질， 독소， 유독화학물질， 법의학적 물질 또는 이와 유사한 물질을 포함한다. 상기 유기분자 (organi c molecules)는 탄소, 질소， 산소 및 /또는 황 원자 사이에 공유결합을 가지는 분자를 의미한다. 유기분자는 일산화탄소와 같은 작은 사이즈의 분자부터 폴리머 (polymer)와 같은 복잡한 큰 사이트의 분자로부터 선택할 수 있다. 본 명세서에서， 용어 "동일결합물 (binding equivalents)" 은 검출대상물과 동일한 결합특성을 갖는 모든 생화학적 화합물을 의미한다. 본 발명에서 검출대상물 및 동일결합물은 단백질, 펩타이드， 탄수화물, 지질， 핵산 또는 화합물일 수 있다. 상기 검출대상물 및 동일결합물은 공지된 다양한 화합물' 호르몬 (chemical hormone) 및 이들의 유사체 (analog)를 포함하며， 예컨대 테스토스테론, 갑상선자극호르몬 (TSH)， 인간성장호르몬， 프로게스테론， 융모성성선자극호르몬 (hCG) 및 이들의 유사체 호르몬을 포함한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 동일결합물은 테스토스테론 -3-카르복시메틸옥심 -BSA이다.
본 발명에 따르면， 상기 검출대상물 및 동일결합물은 화합물 호르몬 및 단백질에 결합된 화합물 호르몬이며， 보다 상세하게는 테스토스테론 (testosterone) , 성호르몬 결합 글로불린 (Sex hormone binding gluobul in, SHBG)에 결합된 테스토스테론 (testosterone) 또는 알부민 (Albumin)에 결합된 테스토스테론 (testosterone)이다. 한편, 본 발명의 방법은 테스토스테론 뿐만 아니라 비타민 D와 같은 미소 분자를 검출하는데 폭 넓게 이용될 수 있다.
본 명세서에서， 용어 "경쟁자 캐리어 복합체 (a compet i tor carr ier complex)" 는 동일결합물 및 입자 또는 비드 (bead)를 포함하는 복합체로서， 상기 입자 또는 비드 (bead)에는 검출대상물과 동일한 결합특성을 갖는 동일결합물 (binding equivalents)이 결합되어 있다. 상기 입자 또는 비드는 시그널을 발생시킬 수 있으며， 예컨대 상기 입자 또는 비드는 나노입자, 마이크로입자, 나노비드 또는 마이크로 비드를 포함한다. 상기 입자 또는 비드는 200 nm 내지 1000 nm의 직경을 가질 수 있으며， 본 발명에 따르면 상기 입자 또는 비드의 직경은 200 nm 내지 500 nm이다. 본 발명에 따르면， 상기 경쟁자 캐리어 복합체는 동일 결합물과 비드가 결합된 복합체로서 기능하며， 보다 상세하게는 상기 경쟁자 캐리어 복합체의 비드에 결합된 동일결합물이 브리지 복합체에 결합된 항체와 결합될 수 있다. 본 명세서에서， 용어 "결합제 (binder )" 는 검출대상물에 특이적으로 결합하는 물질로서， 예컨대 검출대상물에 특이적인 단백질， 펩타이드, 탄수화물， 지질， 핵산 및 화합물을 포함한다. 예컨대， 상기 결합제는 항체, 변형 항체， 항체 유사체， 앱타이드, 수용체， 스트렙타비딘， 아비딘, 뉴트라비딘， 앱타머, 렉틴, 기질 (substrate) , DNA, RNA, 지질 또는 바이러스 단백질이다. 본 발명에 따르면， 상기 결합제는 항체이다.
본 명세서에서， 용어 "브리지 복합체" 는 결합제 (binder) 및 입자 또는 비드 (bead)를 포함하는 복합체 (complex)로서， 상기 입자 또는 비드에는 검출대상물에 특이적으로 결합하는 결합제 (binder )가 결합되어 있으며, 상기 브리지 복합체에 결합된 결합제는 시료 내 검출대상물 또는 동일결합물과 결합할 수 있다. 상기 입자 또는 비드는 나노입자， 마이크로입자ᅳ 나노비드 또는 마이크로 비드를 포함한다. 상기 입자 또는 비드는 20 nm 내지 80 nm의 직경을 가질 수 있으며, 본 발명에 따르면 상기 입자 또는 비드의 직경은 40 nm 내자 50 nm이다.
본 발명에 따르면， 상기 브리지 복합체는 '금 나노입자 및 검출대상물에 특이적인 항체' 의 복합체이다. 한편， 상기 브리지 복합체는 하나의 입자 당 복수개의 결합제를 포함할 수 있다. 아래에서 이와 같은 본 발명의 방법에 따른 시료 내 검출대상물의 검출방법에 대하여 구체적으로 설명한다 :
단계 (a) : 시료, 경쟁자 캐리어 복합체 및 브리지 복합체의 접촉 우선 시료를 ( i ) 검출대상물과 동일한 결합특성을 갖는 동일결합물 (binding equivalents)이 결합되어 있는 경쟁자 캐리어 복합체 (a compet i tor carr ier complex) 및 ( i i ) 검출대상물에 특이적으로 결합하는 결합제 (binder )가 결합되어 있는 브리지 복합체와 접촉 (contact ing)시킨다.
상기 시료 내에 검출대상물이 존재하는 경우, 상기 시료 내 검출대상물은 상기 브리지 복합체와 결합한다.
브리지 복합체와 결합하는 시료 내 검출대상물과 경쟁자 캐리어 복합체는 동시에 경쟁적으로 반응할 수 있고 또는 각각 선택적， 순차적으로 반응할 수 있다. 예컨대, ( i ) 시료， 경쟁자 캐리어 복합체 및 브리지 복합체를 동시에 접촉시키는 경우 상기 브리지 복합체는 상기 경쟁자 캐리어 복합체에 대하여 경쟁적으로 상기 시료 내 검출대상물과 결합하몌
(ii) 선택적， 순차적으로 접촉시키는 경우 브리지 복합체는 검출대상물 (시료) 또는 동일결합물 (경쟁자 캐리어 복합체)와 결합하며 동시 접촉할 때와 달리 경쟁 반웅은 거의 일어나지 않는다.
본 발명에 따르면， 우선 시료 내 검출대상물과 브리지 복합체 결합의 복합체가 형성된 후 브리지 복합체의 잔여 결합제 (binder)에 경쟁자 캐리어 복합체가 결합할 수 있다. 예컨대， 시료와 브리지 복합체를 반웅시켜 검출대상물-브리지 복합체의 복합체를 형성한 후 본 발명의 검출키트에 적용한 경우, 상기 복합체가 시험구역의 동일결합체에 결합한 뒤 경쟁자 캐리어 복합체가 브리지 복합체의 비결합 항체와 결합한다.
본 발명에 따르면， 상기 경쟁자 캐리어 복합체는 입자로서 발색성 입자 (colored particle)를 포함하고， 상기 발색성 입자로부터 시그널이 직접 발생된다. 예컨대， 상기 발색성 입자는 형광분자의 입자， 발색성. 금속 입자， 발색성 리포좀， 블랙 카본 입자， 발색성 폴리머 입자, 인광분자의 입자 또는 다이분자의 입자이다.
본 발명에 따르면, 상기 경쟁자 캐리어 복합체의 입자 또는 비드는 검출가능한 시그널 발생 표지를 추가적으로 포함하며 상기 시그널은 상기 시그널 발생 표지로부터 발생될 수 있다. 용어 "시그널" 은 검출 가능한 파라미터 (parameter)를 의미하며， 광학적， 전기적 또는 자기적 파라미터의 흐름, 형광방사， 적외선 방사 자외선 방사， 화학발광, 광반사 또한 상기 시그널의 흡수정도를 포함한다. 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지는 화학물질 (예컨대， 바이오틴)， 효소 (알칼린 포스파타아제, β- 갈락토시다아제， 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 ρ450), 방사능물질 ((예컨대， C14, I125, Ρ32및 S35), 형광물질 (예컨대ᅳ 플루오레신), 발광물질， 화학발광물질 ( chemi luminescent) 및 FRET( fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Ant i bodies : A Laboratory Manual , Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다. 상기 표지는 발산하는 파장에 따라 각기 다른 형광 시그널이 관찰될 수 있다. 상기 표지는 공지된 다양한 형광물질을 포함할 수 있으며 예컨대 , 플루오로세인과 그 유도체， 로다민과 그 유도체 , 피코에리드린， 루시퍼 엘로우， B-파이토에리쓰린, 9-아크리딘이소티오시아네이트， 루시퍼 엘로우 VS , 4-아세트아미도 -4 ' -이소티오-시아나토스틸벤 -2，2 ' -다이설폰산, 7-다이에틸아미노 -3-(4 ' -이소티오시아토페닐) -4-메틸쿠마린， 석시니미딜- 파이렌부티레이트 , 4-아세트아미도 -4 ' -이소티오시아나토스틸벤 -2 , 2 ' - 다이설폰산 유도체, LC™-Red 640， LC™-Red 705， PC5 , Cy5 , Cy5.5 , 리사민 이소티오시아네이트, 에리쓰로신 이소티오시아네이트， 다이에틸렌트리아민 펜타아세테이트， 1-다이메틸아미노나프틸 -5-설포네이트， 1-아닐리노 -8- 나프탈렌 설포네이트， 2-P-토우이디닐 -6-나프탈렌설포네이트, 3-페닐 -7- 이소시아나토쿠마린, 9-이소티오시아나토아크리딘， 아크리딘 오렌지， N-(p- (2-벤족사조일릴)페닐)멜레이미드， 벤족사디아졸, 스틸벤 및 파이렌을 포함하지만， 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에서 상기 검출대상물이 단백질에 결합된 화합물 호르몬인 경우， 상기 단계 (a)는 다음의 소단계 (sub-step)를 포함할수 있다:
(a-1) 상기 단백질에 결합된 화합물 호르몬으로부터 상기 화합물 호르몬을 해리시키는 해리제 (di splacement agent )로 처리된 상기 시료를 상기 브리지 복합체에 접촉시키는 소단계; 및 (a-2) 상기 단계 (a-1) 결과물을 상기 경쟁자 캐리어 복합체와 접촉시키는 소단계.
상기 해리제 (di splacement agent )는 화합물 호르몬과 단백질을 분리시키기 위한 시약으로서 산， 알칼리， 중금속 또는 유기용제 및 경쟁자 호르몬 등을 사용할 수 있다. 본 발명에 따르면, 상기 해리제는 경쟁자 호르몬 (예컨대， 2-메톡시에스트라디을)이며， 상기 경쟁자 호르몬은 상기 화합물 호르몬 (예컨대， 테스토스테론)에 대하여 경쟁적으로 작용하여 상기 화합물 호르몬에 결합된 단백질 (성호르몬 결합 글로불린 또는 알부민)을 분리시킨다.
한편， 상기 경쟁자 캐리어 복합체는 상기 단계 (a)를 실시하기 이전에 상기 지지체 상 시험구역의 업스트림쪽에 위치할 수 있다. 이 경우， 시료는 경쟁자 캐리어 복합체와 함께 동일화합물이 결합된 시험구역을 통과하게 된다. 본 발명에 따르면， 검출대상물을 포함하는 시료는 상기 지지체 상의 ( i ) 시료가 투입되는 '시료구역' ， ( ii ) 상기 시료와 경쟁자 캐리어 복합체를 접촉시키는 '경쟁자 캐리어 복합체 구역' 및 ( ) 브리지 복합체 및 /또는 경쟁자 캐리어 복합체가 결합 가능한 '시험구역' 을 포함하며 상기 3개의 구역은 유체 흐름적으로 순서적으로 상기 지지체 상에 위치할 수 있다. 예컨대， 상기 검출대상물이 단백질에 결합된 화합물 호르몬인 경우， 상기 단계 (a)는 상기 단백질에 결합된 화합물 호르몬으로부터 상기 화합물 호르몬을 해리시키는 해리제 (di spl acement agent )로 처리된 상기 시료를 상기 브리지 복합체에 접촉시켜 시료 /브리지 복합체 반웅물을 얻은 다음 상기 시료구역에 상기 시료 /브리지 복합체 반응물을 적용하여 실시하며， 상기 단계 (b)는 유체 흐름을 통하여 상기 시료 i리지 복합체 반웅물과 상기 경쟁자 캐리어 복합체를 상기 시험구역으로 이동시켜 상기 시험구역에 결합된 동일결합물 (binding equivalents)과 접촉시켜 실시할 수 있다. 단계 (b) : 시험구역의 동일결합물 및 상기 단계 (a)의 결과물의 접촉 이어 상기 단계 (a)의 결과물을 지지체 상의 시험구역 (test zone)에 결합된 검출대상물과 동일한 결합특성을 갖는 동일결합물과 접촉시킨다.
상기 시료 내에 검출대상물이 존재하는 경우 상기 시료 내 검출대상물이 결합된 상기 브리지 복합체는 상기 지지체 상의 동일결합물과 결합하지 않고 상기 지지체 상에서 시그널이 발생되지 않으며， 상기 시료 내에 검출대상물이 비존재하는 경우 상기 브리지 복합체는 상기 지지체 상의 동일결합물과 결합하고 상기 경쟁자 캐리어 복합체는 상기 브리지 복합체에 결합되어 상기 지지체 상에서 시그널이 발생된다.
본 발명에 따르면， 지지체 (support )에는 동일결합물이 결합되어 있고， 상기 동일결합물은 반웅물의 연속적인 흐름이 이루어지는 하나의 반응용기의 기질 표면 상에 존재하며， 상기 반웅용기는 마이크로채널을 갖는 마이크로첩이다.
본 명세서에서, 용어 "지지체 (support ) " 는 "고상 기질 (sol id substrate) , 고상지지체 (sol id support ) 또는 고체상 (sol id phase) " 과 동일한 의미로 사용될 수 있으며， 비액상물질을 의미한다. 상기 지지체는 내부에 마이크로채널이 형성될 수 있으며 예컨대, 막 (membrane) , 모세관의 일부 또는 마이크로채널 내를 유동 /접착된 소경비드 (smal l di ameter beads )로서 존재할 수 있다. 이러한 형태의 공지의 물질은 폴리스티렌 및 폴리프로필렌， 유리， 금속, 및 젤과 같은 탄화수소 중합체를 포함한다. 상기 지지체는 딥스틱, 마이크로티터 플레이트， 입자 (예컨대， 비드) , 친화성 컬럼 및 이뮤노블롯 멤브레인 (예컨대， 폴리비닐리덴플로라이드 멤브레인) 형태로 있을 수 있다 (참조: 미국 특허 제 5 , 143 , 825호， 제 5，374， 530호 , 제 4，908，305호 및 제 5 , 498 , 551호) . 단계 (c) : 시그널 측정
이어， 시그널 측정장치를 사용하여 상기 단계 (b)의 결과물에서 상기 경쟁자 캐리어 복합체로부터 발생되는 시그널의 세기를 측정한다.
본 발명의 방법에 따르면， 경쟁자 캐리어 복합체에 포함된 표지가 방출하는 시그널은 형광 시그널로서 측정되는바， 시험구역의 형광 시그널올 측정하여 검출대상물의 존재여부를 확인할 수 있으며， 시험구역을 통과한 시료는 일련의 과정을 통해 정량 분석이 가능하다. 본 발명에 따르면， 검출대상물의 정량분석은 대한민국 등록번호 제 10-1353930호에 기재된 방법으로 실시된다.
본 발명에 따르면， 상기 지지체 상의 마이크로채널은 시험구역 (test zone) 및 표준구역 (reference zone)올 포함하며, 상기 시험구역의 표면에 동일결합물이 결합되어 있고， 상기 표준영역에 동물 유래의 펩타이드 또는 이와 결합가능한 물질로 선정되는 검출항체가 결합할 수 있다. 경우에 따라, 동일결합물 또는 검출대상물에 특이적인 검출항체가 결합될 수 있다.
본 명세서에서， 용어 "시험구역 (test zone)" 은 유체 유동 분석을 위해 상기 지지체의 마이크로채널 내에 포함된 구획으로서 , 시험영역의 표면에는 검출대상물과 동일한 결합특성을 갖는 동일결합물이 결합되어 있다. 본 명세서에서， 용어 "표준구역 (reference zone)" 은 상기 지지체의 마이크로채널 내에 포함된 구획으로서， 동물 유래의 펩타이드 또는 이와 결합가능한 물질로 선정되는 검출항체가 결합할 수 있다. 경우에 따라, 표준구역의 표면에는 동일결합물 또는 검출대상물에 특이적인 항체가 결합되어 있어 시험구역을통과한동일결합물또는 검출대상물이 결합할수 있다. 상기 동일결합물 또는 항체는 물리적인 흡착 또는 화학적인 접착에 의하여 고상 기질에 부착가능하다. 물리적 흡착은 적절한 완층액에 있는 항체 또는 항원과 고체상의 재료 사이에서 반응에 의하여 수행된다. 완충액으로서는 인산염 완층액， 트리스 -히드로클로라이드 완층액， 탄산염 완충액 등이다. 반웅은 4-37°C , 특히 실온에서 특정시간 동안 상기 완층액을 흔합하고 유지함에 의하여 수행된다. 화학적 부착은 펩티드 부착 방법중 카르보디미드법을 사용함으로서 실행 가능하다. 또 다른 화학법은 글루타르알데히드 또는 시아누트릭 클로라이드 ( "펩티드 합성법"， 마루젠 (Maruzen) , 1975 또는 "효소 면역측정법 "， 교리쪼 슈판， "프로테인 핵산 효소"， 특별호 31， 1987) 등과 같은 2가 횡연결 시약으로 실행되는 방법이다.
본 발명에 따르면， 상기 시료는 상기 마이크로칩에 적용되며 상기 시료는 상기 마이크로채널에 형성된 흐름을 통해 상기 시험영역 및 표준영역과 접촉한다.
상기 시그널 측정 방법에 대한 상세한 설명은 대한민국 등록번호 제 10- 1353930호에 기재되어 있다. 본 발명의 다른 양태에 따르면， 본 발명은 다음을 포함하는 시료 내 검출대상물의 검출키트를 제공한다:
(a) 시료를 수용하고 반응이 이루어지는 마이크로채널 (Mi croChanne l )이 구비된 지지체 (support )；
(b) ( i ) 상기 마이크로채널의 한 부위에 형성되어 있고， ( ii ) 검출대상물과 동일한 결합특성을 갖는 동일결합물이 결합되어 있고 시그널을 발생시킬 수 있는 경쟁자 캐리어 복합체 (a compet i tor carr ier comp 1 ex having an analyte and being capable of generat ing s ignal )가 결합되어 있는 경쟁자 캐리어 복합체 구역 (compet i tor carrier zone) ; 및
(c) ( i ) 상기 마이크로채널의 한 부위에 형성되어 있고, ( ii ) 검출대상물과 동일한 결합특성을 갖고， 검출대상물에 특이적으로 결합하는 결합제 (binder)가 결합되어 있는 브리지 복합체와 결합 가능한 동일결합물 (binding equivalents)이 결합되어 있는 시험구역 (test zone)； 상기 시료 내에 검출대상물이 존재하는 경우 상기 시료 내 검출대상물은 상기 브리지 복합체와 결합하고 상기 시료 내 검출대상물이 결합된 상기 브리지 복합체는 상기 지지체 상의 동일결합물과 결합하자 않고 상기 지지체 상에서 시그널이 발생되지 않으며， 상기 시료 내에 검출대상물이 비존재하는 경우 상기 브리지 복합체는 상기 지지체 상의 동일결합물과 결합하고 상기 경쟁자 캐리어 복합체는 상기 브리지 복합체에 결합되어 상기 지지체 상에서 시그널이 발생하는 것을 특징으로 하는 검출키트.
본 발명의 검출장치는 상술한 본 발명의 시료 내 검출대상물의 검출방법을 이용한 것으로서， 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여， 그 기재를 생략한다. 본 발명의 장치를 각각의 구성 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다: 구성 (a) : 마이크로채널 (mi crochannel )이 구비된 지지체 (support ) 본 발명의 검출장치에는 시료를 수용하고 반웅이 이루어지는 지지체가 포함된다. 상기 지지체 내에는 분석 시료를 수용하기 위한 마이크로채널이 구비되어 있으며， 상기 마이크로채널은 다양한 깊이 (depth)를 가질 수 있다.
분석 시료를 수용할 수 있는 상기 마이크로칩은 1 이상의 마이크로채널을 포함할 수 있으며， 상기 마이크로채널에는 각각 다른 검출대상물을 검출하는 동일화합물 및 검출항체가 결합될 수 있다. 상기 마이크로채널에는 시료구역， 반웅시작구역 경쟁자 캐리어 복합체 구역， 시험구역, 표준구역 및 반응종료구역이 포함될 수 있으며， 예컨대 상기 각 영역은 시료구역, 반웅시작구역, 경쟁자 캐리어 복합체 구역， 시험구역， 표준구역 및 반웅종료구역의 순서로 위치할 수 있다.
상기 마이크로채널은 시료를 주입할 수 있는 시료 주입구를 포함할 수 있으며， 시료가 상기 주입구를 통하여 마이크로채널 내부로 유입되면 마이크로채널을 지나면서 시험구역에 위치한 동일결합물 (binding equivalents)에 결합 또는 비결합된다.
한편， 검출대상물의 탐지를 위하여 형광 물질 등을 이용한 분석 시료의 라벨링 ( l abel l ing) 반응 또는 항원 -항체 반응 등을 이용한 분석 시료의 특이 반웅 (spec i f i c react ion) 등이 마이크로채널 내에서 이루어질 수 있다. 즉， 단백질의 항원 -항체 특이 반웅 (specification) 등을 이용하여, 추후 센서 등 다양한 탐지 수단을 통하여 원하는 대상만을 선별적으로 확인할 수 있다. 표지된 분석 시료는 마이크로 채널 내부를 통과하게 되는데 이때 마이크로 채널의 일 단면이 광학 센서에 노출되며, 이를 이용하여 형광 시그널을 탐지할 수도 있다. 구성 (b): 경쟁자 캐리어 복합체 구역 (competitor carrier complex zone)
본 발명의 검출장치에 있어서, 상기 경쟁자 캐리어 복합체 구역은 상기 마이크로채널의 한 부위에 형성되어 있고 검출대상물과 동일한 결합특성을 갖는 동일결합물이 결합되어 있으며 시그널을 발생시킬 수 있는 경쟁자 캐리어 복합체가 결합되도록 설계된다.
본 발명에 따르면， 상기 경쟁자 캐리어 복합체 구역은 상기 지지체 상 시험구역의 업스트림쪽에 위치한다. 구성 (c): 시험영역 (test zone)
본 발명의 항원 검출장치에 있어서, 상기 시험영역은 상기 마이크로채널의 한 부위에 형성되어 있고, 검출대상물과 동일한 결합특성을 갖고 검출대상물에 특이적으로 결합하는 결합제 (binder)가 결합되어 있는 브리지 복합체와 결합 가능한 동일결합물 (binding equivalents)이 결합되도록 설계된다.
상기 시료 내에 검출대상물이 존재하는 경우 상기 시료 내 검출대상물은 상기 브리지 복합체와 결합하고 상기 시료 내 검출대상물이 결합된 상기 브리지 복합체는 상기 지지체 상의 동일결합물과 결합하지 않고 상기 지지체 상에서 시그널이 발생되지 않으며, 상기 시료 내에 검출대상물이 비존재하는 경우 상기 브리지 복합체는 상기 지지체 상의 동일결합물과 결합하고 상기 경쟁자 캐리어 복합체는 상기 브리지 복합체에 결합되어 상기 지지체 상에서 시그널이 발생된다.
본 발명에 따르면， 본 발명의 검출장치에 포함되는 지지체는 (i) 시료구역， (ii) 경쟁자 캐리어 복합체 구역 및 (iii) 시험구역을 포함하며 상기 3개의 구역은 유체 흐름적으로 순서적으로 상기 지지체 상에 위치한다. 본 발명의 검출장치는 상기 마이크로채널의 한 부위에 형성되어 있고 검출대상물 또는 동일결합물이 특이적으로 결합하는 표준물질 (reference substance)이 표면에 결합된 표준구역 (reference zone)을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 상기 장치는 검출가능한 시그널을 발생시키는 표지가 결합되어 있고 상기 검출대상물 또는 동일결합물에 특이적으로 결합하는 검출항체를 표준물질로서 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면， 상기 장치는 상기 표지로부터 발생되는 시그널을 측정하는 측정수단을 추가적으로 포함할 수 있으며, 또는 상기 장치는 상기 시험영역 및 표준영역에서 측정된 시그널의 세기의 비율을 계산하는 분석수단을 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 방법 및 장치는 다양한 방식으로 이용될 수 있으며， 예컨대 미소분자인 호르몬을 검출하는 경우， 시료 내 비타겟 단백질과 결합 호르몬을 자유 ( free) 호르몬 상태로 효과적으로 해리시켜， 우수한 분해능 또는 분리능 (resolut ion)을 제공함으로써 시료 내의 검출대상물을 세밀한 농도 범위로 분리할 수 있다.
【발명의 효과】
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 신규한 시료 내 검출대상물의 검출방법 및 그를 이용한 검출장치에 관한 것이다.
(b) 본 발명의 검출방법은 금 나노입자와 검출대상물에 특이적인 항체를 결합시킨 '브리지 복합체' 를 사용하여 항체와 검출대상물 간의 층분한 결합반웅을 유도함으로써 반응성을 향상시킬 수 있다.
(c) 이로써 우수한 분해능 또는 분리능 (resolut ion)을 제공하여 시료 내 검출대상물의 정확한 농도측정이 가능케 하며， 측정 시그널을 증폭시킬 수 있다.
(d) 또한， 본 발명의 방법은 호르몬， 비타민 등 분자량이 작은 미소 분자 (smal l molecule)를 효과적으로 검출할 수 있다. 【도면의 간단한 설명】
도 1은 본 발명의 검출방법을 모식적으로 나타낸 것이다.
도 2는 테스토스테론의 농도에 따른 해리 (displacement) 정도를 측정한 것이다. 도 2a는 금 나노입자를 사용하지 않은 종래 검출방법 1 및 2에 따른 검량선 (Calibration curve)을 나타내고， 도 2b는 금 나노입자를 사용한 본 발명의 방법에 따른 검량선 (Calibration curve)을 나타낸다. 가로축은 표준구역 시그널 (reference intensity)에 대한 시험구역 시그널 (test intensity)의 비을 (ratio)을 나타내고， 세로축은 테스토스테론의 농도를 의미한다. 본 발명의 방법을 이용한 경우， 측정된 시그널의 평균값의 범위 및 해리정도 (Dis. %)가 더 넓은 것을 확인할 수 있었으며， 이로써 본 발명의 방법이 높은 분리능을 제공할 수 있음을 확인하였다.
도 3은 검출방법에 따른 상관관계를 나타낸 것이다. 도 3a는 종래 검출방법 1 및 2(도 6a 및 도 6b)에 따른 상관도를 나타낸 것이고， 도 3b는 종래 검출방법 3(도 6c)에 따른 상관도를 나타낸 것이며， 도 3c는 본 발명의 방법에 따른 상관도를 나타낸 것이다. 도 3a의 경우， 상관성이 0.7414로서 낮았으며, 도 3b의 경우 상관성은 높았으나， 별도의 세척과정을 요한다는 단점이 있다. 본 발명의 경우, 세척과정을 거치지 않으며 상관성 또한 높은 것으로 나타났다.
도 4는 금 나노입자를 포함하는 매개체를 사용한 경우 및 사용하지 않은 경우의 분해능 (resolution)을 비교하기 위한 ELISA 결과이다. 금 나노입자를 사용한 경우 O.D. 값의 범위가 넓게 측정되는 것을 확인하였다. 도 5a 및 도 5b는 비타민 D의 농도에 따른 해리 (displacement) 정도를 측정한 것이다. 도 5a는 금 나노입자를 사용하지 않은 종래 검출방법 1 및 2에 따른 검량선 (Calibration curve)을 나타내고， 도 5b는 금 나노입자를 사용한 본 발명의 방법에 따른 검량선 (Calibration curve)을 나타낸다.
도 6a 내지 도 6c는 본 발명의 검출장치를 이용하되 기존의 테스토스테론 검출방법을 사용하여 테스토스테론을 검출하는 방법을 나타낸 것이다 (각각 기존 반웅 1， 2 및 3). 시료 (sample)는 혈액을 나타낸다 (a: 시료주입구， b: 경쟁자 캐리어 복합체 구역， c: 시험구역， d: 표준구역). * 약어
Ant i-Testosterone F.B. : Ant i -Testosterone Fluorescence bead Tes t O-3CM0： BSA-®： Testosteroneᅳ 3一 carboxymethyloximeᅳ bovine serum albumin-Biot in
Ant i -Testosterone-® : Ant i-Testosterone-Biot in
2一 ME : 2-methoxyestradiol
【발명을 실시하기 위한 구체적인 내용】
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로， 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다. 실시예
.
실시예 1: 금 나노입자와 항체의 커플링 (Ant ibody coupl ing with Gold nanopart icle)
직경 약 40 nm의 금 나노입자 (Go Id nanopart icle)와 항체 (항 - 테스토스테론 또는 항— Vi tamin D)를 테스트 튜브 내에서 일정한 비율로 섞은 뒤 상온에서 1시간 반웅시켰다. 상기 항체는 최종 농도가 5 y g/mL가 되도록 첨가하였다.
이후， 상기 반응 흔합물에 인산 버퍼 (PB buf fer) 내 10% BSA (bovine serum albumin)를 1.1%가 되도록 첨가한 후 상온에서 1시간 반응시켰다. 상기 반웅물을 10 , 000 rpm에서 15분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하였다.
상층액을 제거한 류브에 저장 버퍼 (Storage buf fer , 2 mM 붕산염 내 0.1% 카제인)를 넣어 현탁시켰다. 상기 원심분리 및 재현탁 과정을 2번 더 반복한 후 4°C에서 보관하였다. 실시예 2: 형광 마이크로비드와 항원의 커플링 (Ant igen coupl ing with Fluorescent micropart icle) l-(3-디메틸아미노프로필 )-3-에틸카르보디이미드 /N- 하이드록시숙신이미드 (EDC/NHS)를 이용하여 직경 약 500 nm의 형광 마이크로입자 (또는 마이크로비드)를 활성화시켰다. 이어， 활성화된 형광 마이크로입자와 항원 [테스토스테론 -3-카르복시메틸옥심 -BSA (Testosterone-3-carboxymethyloxime-bovine serum albumin, Testosterone— 3-CM0-BSA) 또는 비타민 D]을 테스트 튜브 내에서 일정한 비율로 섞은 뒤 (2% 형광 마이크로입자 100 u L 및 항원 250 u g) , 상온에서 2시간 반웅시켰다.
이후， 상기 반웅 흔합물에 증류수 내 10% BSA를 최종 농도 1¾가 되도록 첨가한 후 상온에서 1시간 반응시켰다.
상기 반웅물에 1M 글리신을 최종 농도 50 mM이 되도록 첨가한 후 상온에서 30분 반웅시켰다. 이어, 상기 실시예 1의 원심분리와 재현탁 과정을 반복실시한 후 4°C에서 보관하였다. 실시예 3: 테스토스테론 3CM0 BSA의 바이오티닐화 (biot inylat ion) 반웅
테스토스테론 3CM0 BSA와 바이오틴 (biot in)을 일정 비율로 섞은 뒤 상온에서 1시간 반웅시켰다 (20 mol 바이오틴 /1 mol 항체) .
이후， 남아있는 비반웅 바이오틴을 제거하기 위해 PBS 내에서 투석 (dialysi s)을 진행하였다. 상기 투석과정 중 비반응 비오틴이 층분히 제거될 수 있도록 3번 내지 4번 정도 새로운 PBS로 교체하였다. 바이오틴이 제거된 항체는 UV-분광기를 이용하여 농도를 확인한 후 4°C에서 보관하였다. 실시예 4: 칩 (Chip) 준비
바이오티닐화된 테스토스테론 (Biot inylated-Testosterone) 또는 바이오티닐화된 비타민 D (Biot inylated-Vi tamin D)를 아비딘 (avidin)이 결합되어 있는 칩의 하부 기판에 점적 (dott ing)한 뒤 상온에서 1시간 반웅시켰다.
이어, 세척용액 (Washing buf fer)으로 칩을 세척하고 37°C에서 층분히 건조시킨 후， 샘플 버퍼 (2-메톡시에스트라디올, 2— ME)와 테스토스테론 -형광 마이크로입자를 하부 기판에 점적한 뒤 37°C에서 층분히 건조시켰다. 준비된 하부 기판과 상부 기판을 결합시킨 뒤 사용 전까지 건조기에서 보관하였다. 실시예 5 : 테스토스테론 측정
2-ME , 실시예 1의 금 나노입자 용액 및 혈액을 흔합한 뒤 상온에서 5분 동안 반웅시켰다. 상기 흔합 반웅물 35 y L를 실시예 4의 칩 위에 떨어뜨린 후, 반웅물이 칩의 반웅 경로를 모두 통과하면 FREND (나노엔텍， 대한민국)를 이용하여 형광 시그널을 측정하였다.
본 발명의 방법 및 기존의 검출방법을 이용하여 테스토스테론의 해리 (di spl acement )정도를 비교하였을 때， 본 발명의 검출방법의 경우 측정된 시그널의 평균값의 범위 및 해리정도 (Di s . ¾)가 더 넓은 것을 확인할 수 있었으며， 이로써 본 발명의 방법이 높은 분리능을 제공할 수 있음을 확인하였다.
【표 1】
기존 반웅 1 및 2에 의한 수치
Figure imgf000021_0001
【표 2】
본 발명의 방법에 의한 수치
Figure imgf000021_0002
실시예 6 : 비타민 D측정
방출 시약 (Releas ing reagent )이 포함된 들어간 금 나노입자 용액과 혈액을 흔합한 뒤 49°C에서 10분 동안 반웅시켰다. 상기 흔합 반웅물 35 U L를 실시예 4의 칩 위에 떨어뜨린 후， 반응물이 칩의 반웅 경로를 모두 통과하면 FREND를 이용하여 형광 시그널을 측정하였다.
상기 실시예 5와 마찬가지로， 본 발명의 검출방법의 경우 측정된 시그널의 평균값의 범위 및 해리정도 (Di s . %) 7} 더 넓은 것을 확인할 수 있었다. 【표 3】
기존 반웅 1 및 2에 의한 수치
Figure imgf000022_0001
【표 4】
본 발명의 방법에 의한 수치
Figure imgf000022_0002
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며， 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

【특허청구범위】
【청구항 1】
다음의 단계를 포함하는 시료 내 검출대상물의 검출방법:
(a) 시료를 ( i ) 검출대상물과 동일한 결합특성을 갖는 동일결합물 (binding equivalents)이 결합되어 있고 시그널을 발생시킬 수 있는 경쟁자 캐리어 복합체 (a compet i tor carr i er com l ex having an analyte and being capable of generat ing s ignal ) 및 ( i i ) 검출대상물에 특이적으로 결합하는 결합제 (binder)가 결합되어 있는 브리지 복합체와 접촉 (contact ing)시키는 단계; 상기 시료 내에 검출대상물이 존재하는 경우， 상기 시료 내 검출대상물은 상기 브리지 복합체와 결합하며;
(b) 상기 단계 (a)의 결과물을 지지체 상의 시험구역 (test zone)에 결합된 검출대상물과 동일한 결합특성을 갖는 동일결합물과 접촉시키는 단계; 상기 시료 내에 검출대상물이 존재하는 경우 상기 시료 내 검출대상물이 결합된 상기 브리지 복합체는 상기 지지체 상의 동일결합물과 결합하지 않고 상기 지지체 상에서 시그널이 발생되지 않으며, 상기 시료 내에 검출대상물이 비존재하는 경우 상기 브리지 복합체는 상기 지지체 상의 동일결합물과 결합하고 상기 경쟁자 캐리어 복합체는 상기 브리지 복합체에 결합되어 상기 지지체 상에서 시그널이 발생되며; 그리고，
(c) 상기 단계 (b)의 결과물에서 상기 경쟁자 캐리어 복합체로부터 발생되는 시그널의 세기를 측정하는 단계.
【청구항 2]
제 1 항에 있어서， 상기 검출대상물 및 동일결합물은 단백질, 펩타이드, 탄수화물， 지질, 핵산 또는 화합물인 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 3】
제 2 항에 있어서， 상기 검출대상물 및 동일결합물은 화합물 호르몬 (chemi cal hormone)인 것을 특징으로 하는 방법,
【청구항 4】
제 3 항에 있어서, 상기 검출대상물 및 동일결합물은 단백질에 결합된 화합물 호르몬인 것을 특징으로 하는 방법
[청구항 5】
제 4 항에 있어서， 상기 검출대상물은 단백질에 결합된 화합물 5. 호르몬이고 상기 단계 (a)는 다음의 소단계 (sub-step)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법: (a-1) 상기 단백질에 결합된 화합물 호르몬으로부터 상기 화합물 호르몬을 해리시키는 해리제 (displacement agent)로 처리된 상기 시료를 상기 브리지 복합체에 접촉시키는 소단계; 및 (a-2) 상기 단계 (a-1) 결과물을 상기 경쟁자 캐리어 복합체와 접촉시키는 소단계.
0
【청구항 6】
제 1 항에 있어서， 상기 경쟁자 캐리어 복합체는 입자 또는 비드 (bead)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법. 5
【청구항 7】
제 6 항에 있어서 ， 상기 입자는 발색성 입자 (colored particle)이고 상기 발색성 입자로부터 직접 시그널이 발생되는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 8】
0 제 6 항에 있어서 , 상기 입자는 시그널 발생 표지를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 9】
제 1 항에 있어서, 상기 브리지 복합체에 있는 상기 결합제는 항체，5 변형 항체， 항체 유사체， 앱타이드, 수용체， 스트렙타비딘， 아비딘， 뉴트라비딘， 앱타머, 렉틴, 기질 (substrate), DNA, RNA, 지질 또는 바이러스 단백질인 것올 특징으로 하는 방법.
【청구항 10】
0 제 1 항에 있어서, 상기 브리지 복합체는 입자 또는 비드 (bead)를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 11】
제 1 항에 있어서, 상기 브리지 복합체는 하나의 입자 당 복수개의 결합제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 12】 '
제 1 항에 있어서， 상기 단계 (a)는 상기 시료를 상기 브리지 복합체와 우선적으로 접촉시킨 다음 이어서 상기 경쟁자 캐리어 복합체와 접촉시키는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 13】
제 1 항에 있어서， 상기 경쟁자 캐리어 복합체는 상기 단계 (a)를 실시하기 이전에 상기 지지체 상 시험구역의 업스트림쪽에 위치해 있는 것을 특징으로 하는 방법.
【청구항 14】
제 1 항에 있어서, 상기 지지체는 ( i ) 시료구역， ( Π ) 경쟁자 캐리어 복합체 구역 및 ( i i i ) 시험구역을 포함하며 상기 3개의 구역은 유체 흐름적으로 순서적으로 상기 지지체 상에 위치해 있는 것을 특징으로 하는 방법 .
【청구항 15】
제 14 항에 있어세 상기 검출대상물은 단백질에 결합된 화합물 호르몬이고, 상기 단계 (a)는 상기 단백질에 결합된 화합물 호르몬으로부터 상기 화합물 호르몬을 해리시키는 해리제 (di splacement agent )로 처리된 상기 시료를 상기 브리지 복합체에 접촉시켜 시료 /브리지 복합체 반응물을 얻은 다음 상기 시료구역에 상기 시료 /브리지 복합체 반웅물을 적용하여 실시하며， 상기 단계 (b)는 유체 흐름을 통하여 상기 시료 /브리지 복합체 반웅물과 상기 경쟁자 캐리어 복합체를 상기 시험구역으로 이동시켜 상기 시험구역에 결합된 동일결합물 (binding equivalents)과 접촉시켜 실시하는 것을 특징으로 하는 방법 .
[청구항 16】
다음을 포함하는 시료 내 검출대상물의 검출키트:
(a) 시료를 수용하고 반웅이 이루어지는 마이크로채널 (microchannel)이 구비된 지지체 (support )；
(b) ( i ) 상기 마이크로채널의 한 부위에 형성되어 있고， (ii) 검출대상물과 동일한 결합특성을 갖는 동일결합물이 결합되어 있고 시그널을 발생시킬 수 있는 경쟁자 캐리어 복합체 (a competitor carrier com lex having an analyte and being capable of generating signal)가 결합되어 있는 경쟁자 캐리어 복합체 구역 (competitor carrier complex zone); 및
(c) ( i ) 상기 마이크로채널의 한 부위에 형성되어 있고， (ii) 검출대상물과 동일한 결합특성을 갖고, 검출대상물에 특이적으로 결합하는 결합제 (binder)가 결합되어 있는 브리지 복합체와 결합 가능한 동일결합물 (binding equivalents)이 결합되어 있는 시험구역 (test zone)； 상기 시료 내에 검출대상물이 존재하는 경우 상기 시료 내, 검출대상물은 상기 브리지 복합체와 결합하고 상기 시료 내 검출대상물이 결합된 상기 브리지 복합체는 상기 지지체 상의 동일결합물과 결합하지 않고 상기 지지체 상에서 '시그널이 발생되지 않으며， 상기 시료 내에 검출대상물이 비존재하는 경우 상기 브리지 복합체는 상기 지지체 상의 동일결합물과. 결합하고 상기 경쟁자 캐리어 복합체는 상기 브리지 복합체에 결합되어 상기 지지체 상에서 시그널이 발생하는 것을 특징으로 하는 검출키트.
【청구항 17】
제 16 항에 있어서， 상기 경잼자 캐리어 복합체 구역은 상기 지지체 상 시험구역의 업스트림쪽에 위치해 있는 것을 특징으로 하는 검출키트.
【청구항 18】 _
제 16 항에 있어서, 상기 지지체는 (i) 시료구역， (Π) 경쟁자 캐리어 복합체 구역 및 (iii) 시험구역을 포함하며 상기 3개의 구역은 유체 흐름적으로 순서적으로 상기 지지체 상에 위치해 있는 것을 특징으로 하는 검출키트.
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