CN113533012B - 用于伏立康唑血药浓度检测的样本前处理液 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于伏立康唑血药浓度检测的样本前处理液。具体地，所述前处理液包括：(a)液相；(b)蛋白酶K；和(c)添加剂：所述添加剂选自下组：pH调节剂、防腐剂，或其组合。本发明的前处理液能够显著提高血液样本中伏立康唑的回收率且提高检测结果准确性。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于伏立康唑血药浓度检测的样本前处理液。
背景技术
伏立康唑(voriconazole)，结构如式I，伏立康唑是第二代三唑类抗真菌药物，具有抗菌谱广、抗菌效力强的特点，是侵袭性曲霉菌病的首选药物，也可以用于治疗侵袭性念珠菌病以及不能耐受其他药物治疗的炎症真菌感染。
伏立康唑药代动力学呈非线性特性，患者年龄、体重、肝功能、基因多态性、合并用药等因素均会影响其体内过程，使其血药浓度个体间和个体内差异较大。伏立康唑的血药浓度不仅能够影响药物疗效，还与药物的神经毒性、肝脏毒性等安全性有关，故在临床应用时应进行治疗药物监测。
在测定伏立康唑浓度之前，需对样本进行前处理后再进行检测。现有的前处理液易挥发，毒性大，且伏立康唑提取不完全，且存在基质效应的干扰，影响检测结果可信度。
所以本领域急需一种能够提高血液样本中伏立康唑的回收率、提高检测结果准确性且安全的前处理液。
发明内容
本发明的目的是提供一种能够提高血液样本中伏立康唑的回收率、提高检测结果准确性且安全的前处理液。
本发明的另一目的是提供用于血液样品中伏立康唑检测的检测试剂盒和检测方法。
本发明第一方面，提供了一种血液样本前处理液，所述前处理液包括：
(a)液相；
(b)蛋白酶K；和
(c)添加剂：所述添加剂选自下组：pH调节剂、防腐剂，或其组合。
在另一优例中，所述血液样本选自下组：血浆、血清，或其组合。
在另一优选例中，所述pH调节剂为三羟甲基氨基甲烷缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸缓冲溶液，或其组合。
在另一优选例中，所述防腐剂选自：叠氮钠、Proclin300，硫柳汞、硫酸庆大霉素，或其组合。
在另一优选例中，所述防腐剂含量为0.01-0.2wt％，较佳地，0.02-0.1wt％，以所述前处理液总重量计。
在另一优选例中，所述pH调节剂为三羟甲基氨基甲烷缓冲液，其中，所述三羟甲基氨基甲烷在所述前处理液中的浓度为40-60mM，较佳地，45-55mM，更佳地，48-55mM。
在另一优例中，所述样本为伏立康唑的血液样本。
在另一优选例中，所述前处理液还包括雌二醇。
在另一优选例中，所述前处理液的最终pH为7.1-8.5，较佳的7.2-8.0，更佳地7.3-7.8。
在另一优选例中，所述液相为水或水性溶剂。
在另一优选例中，所述液相中，水的含量≥80wt％，较佳地，≥85wt％、≥90wt％、≥95wt％、≥98wt％，更佳地，99％或100％。
在另一优例中，所述前处理液中，所述蛋白酶K的浓度为50-100ug/mL，较佳的60-90ug/mL，更佳地65-85ug/mL。
在另一优例中，所述前处理液中，所述蛋白酶K的含量为1-3U/mL，较佳地，1.5-2.5U/mL，更佳地，1.8-2.2U/mL。
在另一优例中，所述前处理液中，所述雌二醇的浓度为0.1-3.0mg/mL，较佳的0.2-2.5mg/mL，更佳地0.4-2.0mg/mL。
在另一优选例中，所述前处理液中，所述蛋白酶K与雌二醇的质量比为1:60-1，较佳的1:40-2、1:30-5或1:20-10。
本发明第二方面，提供了一种伏立康唑血液样本前处理方法，包括步骤：
(a)提供本发明第一方面所述的前处理液；
(b)使所述前处理液与所述样本混合，得混合液；和
(c)将所述混合液放置一段时间T以发生反应，反应完成后使蛋白酶K活性降低或失活。
在另一优选例中，步骤(c)中，所述反应具有一个或多个下述特征：
(1)所述反应的温度为4-37℃，较佳地，25±5℃；
(2)所述反应的时间T为1-10min，较佳地，1.5-5min。
在另一优选例中，所述反应为蛋白质水解反应。
在另一优选例中，所述“使所述蛋白酶K活性降低或失活”包括步骤：
将步骤(c)中反应完成后所得的反应液在65-100℃加热，较佳地，70-95℃，更佳地，70-80℃。
在另一优选例中，所述加热时长为5-30min，较佳地，10-20min。
在另一优选例中，所述加热为水浴加热。
在另一优选例中，所述前处理方法还包括步骤：
(d)将步骤(c)中所得反应液离心，取上清液用于检测。
本发明第三方面，提供了一种检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于所述第一容器内的如本发明第一方面所述的前处理液。
本发明第四方面，提供了一种伏立康唑胶乳免疫抑制比浊检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于所述第一容器内的如本发明第一方面所述的前处理液；
(b)第二容器，以及位于第二容器内试剂R1：所述试剂R1包括伏立康唑-载体蛋白复合物；和
(c)第三容器，以及位于第三容器内的试剂R2：所述试剂R2包括偶联有抗伏立康唑抗体的胶乳微球试剂。
在另一优选例中，所述试剂盒还包括：
伏立康唑校准品或任选的说明书。
本发明第五方面，提供了一种血液样本中伏立康唑的检测方法，所述方法包括步骤：
如本发明第二方面所述的样本前处理方法。
在另一优选例中，所述检测方法选自下组：HPLC法(内标法、外标法)、质谱法或免疫抑制比浊法。
本发明第六方面，提供了一种血液样本中伏立康唑的胶乳免疫抑制比浊检测法包括步骤：
(a)提供如本发明第四方面所述的试剂盒；
(b)将所述样本用如本发明第二方面的方法进行前处理，将处理后的上清液作为待检测液：
(c)将试剂R1与所述待检测液或校准品混合，孵育混合物；和
(d)将所述步骤(c)所得混合液与试剂R2混合，测试混匀后初始吸光度A1，孵育一定时间后测试吸光度A2，计算得△A＝A2-A1。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
以校准品浓度～△A校准制作校准曲线，根据△A样本计算得样本中待测物浓度。
在另一优选例中，步骤(c)中，所述孵育时间为3-8min，较佳地，4-6min。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1-3为使用不同前处理液的免疫比浊检测法与HPLC内标法检测临床样本的相关性。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了一种用于伏立康唑样本(尤其是血液样本)的样本前处理液。本发明的前处理液中含有蛋白酶K，可以将样本中的伏立康唑-蛋白质结合物中的伏立康唑释放出来，从而大大提高了伏立康唑的回收率和样本检测的准确度，与HPLC内标法相比，检测结果一致性高(R2>0.975)，令人惊讶地，当使用蛋白酶K与雌二醇共同处理样本时，检测结果准确性可进一步显著提高(R2>0.995)。在此基础上完成了本发明。
术语
除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。
前处理液
本发明提供了一种血液样本前处理液，所述前处理液包括：
(a)液相；
(b)蛋白酶K；和
(c)添加剂：所述添加剂选自下组：pH调节剂、防腐剂，或其组合。
通常，本发明的前处理液可用于各种待检测的血液样本的前处理，尤其是，样本中的待测物能够与蛋白质结合的样本；优选地，含伏立康唑的血液样本。
本发明的前处理液中，所述蛋白酶K的浓度可以根据需求使用常用的方法配制成合适浓度。例如，所述前处理液中，所述蛋白酶K的含量为1-3U/mL，较佳地，1.5-2.5U/mL，更佳地，1.8-2.2U/mL。
本发明中，对所述pH调节剂、防腐剂等没有特别要求，可使用本领域常用的物质。优选地，所述pH调节剂将所述前处理液的pH稳定在7.1-8.5范围内。
典型地，所述血液样本包括原血或原血经过初步处理(如离心、过滤和/或提取)后的样本，例如，血浆或血清。
优选地，所述前处理液的所述液相为水或基本为水。例如，所述液相中，水的含量≥80wt％，较佳地，≥85wt％、≥90wt％、≥95wt％、≥98wt％，更佳地，99％或100％。
优选地，所述前处理液还包括雌二醇。雌二醇可以为α-雌二醇和/或β-雌二醇。通常，所述雌二醇的浓度可根据需要确定，如根据伏立康唑在血液中的浓度确定。例如，所述前处理液中，所述雌二醇的浓度为0.1-3.0mg/mL，较佳的0.2-2.5mg/mL，更佳地0.4-2.0mg/mL。
在另一优选例中，所述前处理液中，所述蛋白酶K与雌二醇的质量比为1:60-1，较佳的1:40-2、1:30-5或1:20-10。
前处理方法及检测方法
本发明还一种伏立康唑血液样本前处理方法，包括使用含有蛋白酶K的前处理液处理所述血液样本的步骤。
具体地，包括步骤：
(a)提供上述的前处理液；
(b)使所述前处理液与所述样本混合，得混合液；和
(c)将所述混合液放置一段时间T以发生反应，反应完成后使蛋白酶K活性降低或失活。
在步骤(c)中，所述反应为蛋白质水解反应。
本发明的前处理液中的蛋白酶K与样本混合后，蛋白酶K可水解蛋白质以释放伏立康唑，从而提高血液样本中伏立康唑的回收率和/或降低基质对检测的干扰。值得注意的是，蛋白酶K同样会水解免疫抑制比浊分析中的抗体、载体蛋白等物质，所以蛋白酶K对蛋白质的水解反应结束后，需要进行使蛋白酶K活性降低或失活的步骤。
本发明中，对所述使蛋白酶K活性降低或失活的方法没有特别限制，可使用本领域常用的方法，且不会对待测样品造成分解即可。例如，将水解后的反应液在水浴(65-100℃)加热5-30min。
优选地，可使用蛋白酶K和雌二醇同时对所述样本进行前处理。所述蛋白酶K与雌二醇可在同一溶液中，或不同溶液中加入并与样本混合。本发明人发现，雌二醇的存在，可进一步提高前处理和检测效果。一种可能的机理是(但不用于限制本发明)，雌二醇可置换与蛋白质结合的伏立康唑，从而进一步的释放伏立康唑，从而得到更好的效果。
在另一优选例中，所述前处理方法还包括步骤：
(d)将步骤(c)中所得反应液离心，取上清液用于检测。
本发明还提供了一种血液样本中伏立康唑的检测方法，所述方法包括上述的样本前处理方法。
检测试剂盒
本发明还提供了一种检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的前处理液。
特别地，本发明提供了一种一种伏立康唑胶乳免疫抑制比浊检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于所述第一容器内的如上所述的前处理液；
(b)第二容器，以及位于第二容器内试剂R1：所述试剂R1包括伏立康唑-载体蛋白复合物；和
(c)第三容器，以及位于第三容器内的试剂R2：所述试剂R2包括偶联有抗伏立康唑抗体的胶乳微球试剂。
所述试剂R1和试剂R2可采用本领域常用的胶乳免疫抑制比浊试剂。
优选地，试剂R1包括：0.4-0.6wt％2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)一水合物，0.08-0.12wt％BSA，0.8-1.2wt％NaCl，0.08-0.12wt％D-海藻糖，0.008-0.012wt％Tween-20，0.08-0.12wt％叠氮钠，0.2-0.6ug/ml伏立康唑与载体蛋白偶联物，pH,5.4-5.8，其中，所述百分比以所述试剂R1总重量计。
优选地，所述试剂R2包括：48-52mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，0.08-0.12％封闭剂(V/V)，0.8-1.2％wt NaCl，0.08-0.12wt％D-海藻糖，0.08-0.12wt％叠氮钠，0.08-0.12wt％BSA，和偶联有抗伏立康唑抗体的胶乳微球，pH为7.4-7.8，其中，所述试剂R2中抗伏立康唑抗体浓度为0.2-0.6mg/mL，胶乳微球的终浓度为0.09-0.13wt％，如无特别说明，所述百分比以所述试剂R1总重量计。
乳胶免疫抑制比浊检测法
本发明还提供了一种血液样本中伏立康唑的胶乳免疫抑制比浊检测法。基于乳胶增强免疫抑制比浊检测法测定血浆样本伏立康唑的浓度原理大致如下：样本来源的伏立康唑与试剂中的伏立康唑衍生物竞争结合胶乳颗粒表面的抗伏立康唑抗体，样本中的伏立康唑浓度越高，胶乳表面抗体被其结合的程度越大，伏立康唑衍生物-可引发的胶乳聚集程度越低，反应体系的浊度大小与样本中的伏立康唑浓度呈负相关，通过测定特定波长(如600nm)处的吸光度，建立校准曲线，计算血浆样本伏立康唑的浓度。
具体地，本发明提供了一种血液样本中伏立康唑的胶乳免疫抑制比浊检测法，包括步骤：
(a)提供如上所述的试剂盒；
(b)将所述样本进行前处理，将处理后的上清液作为待检测液：
(c)将试剂R1与所述待检测液或校准品混合，孵育混合物；和
(d)将所述步骤(c)所得混合液与试剂2混合，测试混匀后初始吸光度A1，孵育一定时间后测试吸光度A2，计算得△A＝A2-A1。
在另一优选例中，所述方法还包括步骤：
以校准品浓度～△A校准制作校准曲线，根据△A样本计算得样本中待测物浓度。
本发明的主要优点包括：
(a)本发明提供了一种血液样本的前处理液，所述前处理液可显著提高待测物质(如伏立康唑)的回收率，并降低基质效应，从而提高后续检测的准确度。
(b)本发明的前处理液溶剂为水或水性溶液，与现有技术中的采用有机溶剂的前处理液相比，不易挥发，安全环保。
(c)本发明好提供了基于所述前处理液的伏立康唑的免疫抑制比浊检测试剂盒和检测方法，使用所述前处理液处理后的样品可非常好的免疫抑制比浊试剂配合，检测结果准确，检测速度快。
下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
试剂
蛋白酶K：Diamond；活性：27.8U/mg
实施例1
1.1前处理液配方
分别配置或提供以下用于免疫比浊抑制法检测样品中伏立康唑的前处理液：
前处理液a(现有技术中常用的前处理液)：甲醇82％，乙二醇18％，七水合硫酸锌4g/100mL)；
前处理液b：50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液，70ug/mL蛋白酶K，0.1wt％叠氮钠，pH7.4。
前处理液c：50mM三羟甲基氨基甲烷缓冲液，70ug/mL蛋白酶K，0.9mg/mL雌二醇，0.1wt％叠氮钠，pH 7.4。
1.2前处理及检测方法
1.21HPLC内标法
操作流程：取血浆样品150μL于1.5mL EP管中，加入含内标的前处理液(地西泮的乙腈溶液，0.5mg/L)450μL，加盖后于涡旋混合器上混匀1min，13000r/min离心10min，取上清用0.22um(尼龙材质过滤器)的过滤器过滤至进样瓶中，进样分析，进样量20μL。
检测仪器:Ultimate 3000高效液相色谱仪。
1.3免疫比浊抑制法
1.31免疫比浊抑制法前处理
仪器:日立7180自动生化分析仪
操作流程：取200ul血浆样本加入200ul前处理液a，加盖后于涡旋混合器上混匀30s，13000r/min离心5min，取上清后进样分析，进样量25ul。
1.32免疫比浊抑制法前处理
仪器:日立7180自动生化分析仪
操作流程：取血浆100ul样本加入300ul前处理液b或c)，加盖后于涡旋混合器上混匀2min，然后将其放入75℃的水浴中15min，13000r/min离心5min，取上清后进样分析，进样量25ul。
免疫比浊抑制法
R1试剂：0.533wt％2-(N-吗啉)乙磺酸(MES)一水合物，0.1wt％BSA，1.0wt％NaCl，0.1wt％D-海藻糖，0.01wt％Tween-20 0.1wt％叠氮钠，0.4ug/ml伏立康唑-载体蛋白偶联物，pH为5.65；
R2试剂：50mM HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸)，0.1％CE510(V/V)，1％wt NaCl，0.1wt％D-海藻糖，0.1wt％叠氮钠，0.1wt％BSA，0.11wt％偶联有抗伏立康唑抗体的胶乳微球，pH为7.6；其中，抗伏立康唑抗体的浓度为0.4mg/ml，胶乳微球终浓度为0.11wt％)
使用时，各试剂和样本的加样量：R1:100ul；R2:60ul；样本：25ul。
各组检测结果如表1(单位：mg/L)：
表1
如图1-3所示，将前处理液a-c的检测结果与HPLC法的结果进行线性拟合，前处理液a组线性方程为：y＝0.8564x+0.0847，R2＝0.9583；前处理液b组线性方程为：y＝0.9268x+0.0124，R2＝0.9759；前处理液c组线性方程为：y＝1.0223x+0.1249，R2＝0.9954。可以看出，与本领域常用的前处理液a相比，含有蛋白酶K的前处理液b和c组伏立康唑的检测值与HPLC内标法的检测结果一致性大幅度提高，令人惊讶地，前处理液c组检测值与HPLC内标法的检测值相关系数R2＞0.995，这提示使用前处理液中同时含有蛋白酶K和雌二醇可进一步显著提高伏立康唑的回收率，并提高后续检测的准确性。
综上，本发明提供了一种含伏立康唑的血液样本的前处理液和检测方法，所述前处理液使用蛋白酶K将伏立康唑从其蛋白结合物解离出来，使得伏立康唑的回收率大幅提高。伏立康唑在血液样本中与蛋白质结合在一起，这对使用免疫抑制比浊等方法检测伏立康唑造成了严重的干扰，而本发明的蛋白酶K或蛋白酶K与雌二醇的组合，极大限度的将伏立康唑与蛋白质分离，从而使后续检测可更顺利的进行，因此，本发明还提供了相应的伏立康唑检测试剂盒与伏立康唑胶乳免疫抑制比浊检测方法，实验证明，本发明的检测方法可与HPLC内标法结果保持高度一致性(R2>0.995)，准确性高，且与HPLC法相比，免疫抑制比浊检测具有操作简单，分析速度快，溶剂消耗少等优点。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种伏立康唑血液样本前处理液，其特征在于，所述前处理液包括：
(a)液相；
(b)蛋白酶K；和
(c)添加剂：所述添加剂选自下组：pH调节剂、防腐剂，或其组合；且
所述前处理液还包括雌二醇。
2.如权利要求1所述的前处理液，其特征在于，防腐剂选自：叠氮钠、Proclin300，硫柳汞、硫酸庆大霉素，或其组合。
3.如权利要求1所述的前处理液，其特征在于，所述前处理液的最终pH为7.1-8.5。
4.如权利要求1所述的前处理液，其特征在于，所述液相为水或水性溶剂。
5.一种伏立康唑血液样本前处理方法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供如权利要求1-4任一所述的前处理液；
(b)使所述前处理液与所述样本混合，得混合液；和
(c)将所述混合液放置一段时间以发生反应，反应完成后使蛋白酶K活性降低或失活。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(c)中，所述反应具有一个或多个下述特征：
(1)所述反应的温度为4-37℃；
(2)所述反应的时间为1-10min。
7.一种伏立康唑血液样本检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于所述第一容器内的如权利要求1-4任一所述的前处理液。
8.一种伏立康唑胶乳免疫抑制比浊检测试剂盒，所述试剂盒包括：
(a)第一容器，以及位于所述第一容器内的如权利要求1-4任一所述的前处理液；
(b)第二容器，以及位于第二容器内试剂R1：所述试剂R1包括伏立康唑-载体蛋白复合物；和
(c)第三容器，以及位于第三容器内的试剂R2：所述试剂R2包括偶联有抗伏立康唑抗体的胶乳微球试剂。
9.一种血液样本中伏立康唑的检测方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
如权利要求5或6所述的样本前处理方法。
10.一种血液样本中伏立康唑的胶乳免疫抑制比浊检测法，其特征在于，包括步骤：
(a)提供如权利要求8所述的试剂盒；
(b)将所述样本如权利要求5所述的方法进行前处理，将处理后的上清液作为待检测液：
(c)将试剂R1与所述待检测液或校准品混合，孵育混合物；和
(d)将所述步骤(c)所得混合液与试剂R2混合，测试混匀后初始吸光度A1，孵育一定时间后测试吸光度A2，计算得△A＝A2-A1。
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