JP2548240B2 - 固定化リグニン複合体およびその利用 - Google Patents
固定化リグニン複合体およびその利用Info
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- JP2548240B2 JP2548240B2 JP62279309A JP27930987A JP2548240B2 JP 2548240 B2 JP2548240 B2 JP 2548240B2 JP 62279309 A JP62279309 A JP 62279309A JP 27930987 A JP27930987 A JP 27930987A JP 2548240 B2 JP2548240 B2 JP 2548240B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、蛋白質を固定することのできる化学的固定
化リグニン組成物に関するものであり、更に詳しく述べ
るならば、酵素固定材料および蛋白質除去材料などとし
て有用な化学的固定化リグニン複合体に関するものであ
る。
化リグニン組成物に関するものであり、更に詳しく述べ
るならば、酵素固定材料および蛋白質除去材料などとし
て有用な化学的固定化リグニン複合体に関するものであ
る。
酵素は蛋白質よりなるものであって、穏和な条件下で
特異的な反応を極めて高い効率で促進する触媒効果を有
している。従って酵素による物質の生産、あるいは分解
は、エネルギーの節約、さらにはバイオマスの活用など
の産業上の面からの極めて有益なものと考えられる。と
ころで、酵素を不溶性の担体に化学的に固定化すること
ができるならば、高価でかつ比較的不安定な蛋白質であ
る酵素の物理的化学的安定性を増し、さらに繰り返し使
用性を付与することができるなどの多くの利点を創出す
ることができる。
特異的な反応を極めて高い効率で促進する触媒効果を有
している。従って酵素による物質の生産、あるいは分解
は、エネルギーの節約、さらにはバイオマスの活用など
の産業上の面からの極めて有益なものと考えられる。と
ころで、酵素を不溶性の担体に化学的に固定化すること
ができるならば、高価でかつ比較的不安定な蛋白質であ
る酵素の物理的化学的安定性を増し、さらに繰り返し使
用性を付与することができるなどの多くの利点を創出す
ることができる。
このため、これまでにも酵素をセルロース、プラスチ
ック、金属、シリカ等数多くの担体への固定化が試みら
れた。これらの固定化法も物理的吸着法、包括法、ある
いは化学的結合法など多岐にわたっている。このなか
で、化学的結合法は強固ではあるが、この方法には固定
化の際に酵素が変性したり、或は失活、活性低下すると
いう問題がある。包括法においては、物質のマトリック
スへの透過が比較的遅い事や、反応物質が分子量の低い
ものに限られるなどの問題がある。また物理的吸着法に
おいては、簡便であるという大きな利点は有するもの
の、一般に環境の変化により酵素の脱着が避けられない
ことや、反応基質、生成物の吸着があるなどの問題点が
ある。
ック、金属、シリカ等数多くの担体への固定化が試みら
れた。これらの固定化法も物理的吸着法、包括法、ある
いは化学的結合法など多岐にわたっている。このなか
で、化学的結合法は強固ではあるが、この方法には固定
化の際に酵素が変性したり、或は失活、活性低下すると
いう問題がある。包括法においては、物質のマトリック
スへの透過が比較的遅い事や、反応物質が分子量の低い
ものに限られるなどの問題がある。また物理的吸着法に
おいては、簡便であるという大きな利点は有するもの
の、一般に環境の変化により酵素の脱着が避けられない
ことや、反応基質、生成物の吸着があるなどの問題点が
ある。
これを解決するには、蛋白質を特異的に結合する基を
有する高分子を担体として用いることが有効と考えられ
る。このように、蛋白質と特異的に結合する基として
は、ホルミル基、イソチオシアネート基等が考えられ
る。しかしこれらはいずれも、比較的安定性が低いこと
や、イソチオシアネート基の場合には、導入に要する手
順が比較的煩雑である等の問題がある。また特異的結合
基を有する高分子を固定化用担体として用いる場合に
は、これら高分子と酵素が結合する際に活性基を破壊或
は変性しないものでなければならないという制約があ
る。
有する高分子を担体として用いることが有効と考えられ
る。このように、蛋白質と特異的に結合する基として
は、ホルミル基、イソチオシアネート基等が考えられ
る。しかしこれらはいずれも、比較的安定性が低いこと
や、イソチオシアネート基の場合には、導入に要する手
順が比較的煩雑である等の問題がある。また特異的結合
基を有する高分子を固定化用担体として用いる場合に
は、これら高分子と酵素が結合する際に活性基を破壊或
は変性しないものでなければならないという制約があ
る。
上記の理由により、酵素固定材料として満足できる材
料は、未だ見出されていない。
料は、未だ見出されていない。
また、種々な蛋白質を選択的に除去するのに有用な固
定材料も求められている。
定材料も求められている。
例えば、血液や尿、髄液中の成分の分析は各種疾病の
診断の際の、いわゆる臨床分析の中でも最も重要なもの
のひとつである。わけても、血液、あるいはそれを除血
球処理した血漿や血清の分析が最も頻繁に行なわれてお
り、被検対象としては低分子成分であるブドウ糖、尿
素、尿酸などがポピュラーである。
診断の際の、いわゆる臨床分析の中でも最も重要なもの
のひとつである。わけても、血液、あるいはそれを除血
球処理した血漿や血清の分析が最も頻繁に行なわれてお
り、被検対象としては低分子成分であるブドウ糖、尿
素、尿酸などがポピュラーである。
このような低分子成分の臨床検査の際には、血清中に
含まれている高分子成分、わけてもアルブミン、グロブ
リンや各種プロテアーゼなどの蛋白質成分が検出を妨害
することがしばしばある。たとえば、固定化酵素法に限
ってみても蛋白質成分が酵素カラムにつまったり、ある
いは固定化されている酵素の分解・失活をもたらすこと
があり、サンプル中の蛋白質をあらかじめ除いておくこ
とが酵素カラムの寿命を延ばし、検査の精度を上げるこ
とにつながる。
含まれている高分子成分、わけてもアルブミン、グロブ
リンや各種プロテアーゼなどの蛋白質成分が検出を妨害
することがしばしばある。たとえば、固定化酵素法に限
ってみても蛋白質成分が酵素カラムにつまったり、ある
いは固定化されている酵素の分解・失活をもたらすこと
があり、サンプル中の蛋白質をあらかじめ除いておくこ
とが酵素カラムの寿命を延ばし、検査の精度を上げるこ
とにつながる。
従来の除蛋白法として代表的なものはアセトンやアセ
トニトリルのような水溶性の有機溶媒による沈澱法、酢
酸エチル、塩化メチレン、エーテルのような非水溶性有
機溶媒による被検物質の抽出法、また、硫酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどによる塩析
法、さらにはタングステン酸、リンタングステン酸、ト
リクロロ酢酸などの酸による沈澱法がある。これらの手
法は現在もしばしば実用されており、たとえばFolin−W
u法では、血液と10％タングステン酸ナトリウム、2/3 N
硫酸を1:1:1に混ぜたものに、水７容を加え、10〜20分
放置後に2500〜3000rpmで５〜10分間遠沈することによ
り、蛋白を除去することができる。
トニトリルのような水溶性の有機溶媒による沈澱法、酢
酸エチル、塩化メチレン、エーテルのような非水溶性有
機溶媒による被検物質の抽出法、また、硫酸アンモニウ
ム、硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなどによる塩析
法、さらにはタングステン酸、リンタングステン酸、ト
リクロロ酢酸などの酸による沈澱法がある。これらの手
法は現在もしばしば実用されており、たとえばFolin−W
u法では、血液と10％タングステン酸ナトリウム、2/3 N
硫酸を1:1:1に混ぜたものに、水７容を加え、10〜20分
放置後に2500〜3000rpmで５〜10分間遠沈することによ
り、蛋白を除去することができる。
しかし上に示した手法は、いずれも、おもに大量の血
清などの処理に用いられるものであり、遠沈、分液、濾
過などの手順が必要なことも併せて、現在の臨床科学の
目指している微量検体の迅速な除蛋白処理と、それに続
く分析にはいささか不向きである。一方、現在使用され
ている固定化酵素カラムを有する臨床診断用機器では、
透析器を用いて除蛋白を行なっているものが多いが、サ
ンプル中の目的物質のほとんどが透析膜を通らずに無駄
になり、結果として多量のサンプルが要求されること
や、試料が希釈されること、テーリングが大きいことな
ど多くの問題が指摘されている。
清などの処理に用いられるものであり、遠沈、分液、濾
過などの手順が必要なことも併せて、現在の臨床科学の
目指している微量検体の迅速な除蛋白処理と、それに続
く分析にはいささか不向きである。一方、現在使用され
ている固定化酵素カラムを有する臨床診断用機器では、
透析器を用いて除蛋白を行なっているものが多いが、サ
ンプル中の目的物質のほとんどが透析膜を通らずに無駄
になり、結果として多量のサンプルが要求されること
や、試料が希釈されること、テーリングが大きいことな
ど多くの問題が指摘されている。
そこで、これら従来の蛋白質除去方法に代わるものと
して、蛋白質とに対して特異的相互作用を示す高分子樹
脂を充填した前処理用プレカラムを用いる簡便な蛋白除
去法が注目されはじめている。
して、蛋白質とに対して特異的相互作用を示す高分子樹
脂を充填した前処理用プレカラムを用いる簡便な蛋白除
去法が注目されはじめている。
しかしながら、簡便な操作で困難なく蛋白質を固定除
去することのできる材料の開発は、未だ十分にはなされ
ていない。
去することのできる材料の開発は、未だ十分にはなされ
ていない。
一方、リグニンは自然界に多量に存在する物質ではあ
るが、従来その高度利用法が無いために、燃料として日
々焼却されているのが現状である。
るが、従来その高度利用法が無いために、燃料として日
々焼却されているのが現状である。
リグニン物質が、蛋白質に対し、、結合性を有するこ
とが知られていたが、これを蛋白質固定材料として利用
することは、行なわれていない。それは、リグニン物質
には水溶性を有するものが多く、このため除蛋白処理し
た液体からリグニン物質の完全な除去が困難であるとい
う問題があるためである。
とが知られていたが、これを蛋白質固定材料として利用
することは、行なわれていない。それは、リグニン物質
には水溶性を有するものが多く、このため除蛋白処理し
た液体からリグニン物質の完全な除去が困難であるとい
う問題があるためである。
リグニンには、人体、動植物に無害であり、しかも抗
菌作用を有することが知られている。
菌作用を有することが知られている。
本発明者らは、上記のような特性を有するリグニンの
有効利用について種々の研究を重ね、これを高分子固形
粒子上に化学的に固定して蛋白質固定用材料として利用
することを試み、上述の問題点を解決して本発明を完成
させたものである。
有効利用について種々の研究を重ね、これを高分子固形
粒子上に化学的に固定して蛋白質固定用材料として利用
することを試み、上述の問題点を解決して本発明を完成
させたものである。
本発明の化学的固定化リグニン複合体は、10〜1000μ
ｍの粒径を有する多孔質高分子固形粒子からなる担体
と、この担体に化学的に固定されたリグニン物質層とを
含んでなり、前記リグニン物質の含有量が、前記担体の
重量に対し、２〜20重量％の範囲内にあることを特徴と
するものである。
ｍの粒径を有する多孔質高分子固形粒子からなる担体
と、この担体に化学的に固定されたリグニン物質層とを
含んでなり、前記リグニン物質の含有量が、前記担体の
重量に対し、２〜20重量％の範囲内にあることを特徴と
するものである。
本発明の複合体において、担体として用いられる高分
子固形粒子は、例えばセルロース、例えばパルプ、植物
繊維などセルロース誘導体、特に水不溶性セルロース誘
導体、例えば、アセチル化度の低いアセチルセルロー
ス、硝化度の低いニトロセルロースなど、キトサン、キ
トサン誘導体、デンプン、デンプン誘導体、特に水不溶
性デンプンおよびその誘導体、アミノ酸類、蛋白質物
質、アミノ酸誘導体、ポリアミド、ポリスチレン、ポリ
（メタ）アクリル重合体、およびそれらのエステル、フ
ェノール−ホルムアルデヒド重合体、メラミン−ホルム
アルデヒド重合体、尿素−ホルムアルデヒド重合体など
から選ぶことができる。また、水不溶性高分子材料は、
ガラスなどのような無機高分子材料であってもよい。
子固形粒子は、例えばセルロース、例えばパルプ、植物
繊維などセルロース誘導体、特に水不溶性セルロース誘
導体、例えば、アセチル化度の低いアセチルセルロー
ス、硝化度の低いニトロセルロースなど、キトサン、キ
トサン誘導体、デンプン、デンプン誘導体、特に水不溶
性デンプンおよびその誘導体、アミノ酸類、蛋白質物
質、アミノ酸誘導体、ポリアミド、ポリスチレン、ポリ
（メタ）アクリル重合体、およびそれらのエステル、フ
ェノール−ホルムアルデヒド重合体、メラミン−ホルム
アルデヒド重合体、尿素−ホルムアルデヒド重合体など
から選ぶことができる。また、水不溶性高分子材料は、
ガラスなどのような無機高分子材料であってもよい。
本発明に用いられるリグニン物質には、それが蛋白質
に対し結合性を有している限り、格別の制限はなく、例
えばクラフトリグニン、ソーダリグニンなどのようなア
ルカリリグニン類、並びに、ソルボリシスリグニン、サ
ルファイトリグニン、および爆砕リグニンなどを利用す
ることができる。
に対し結合性を有している限り、格別の制限はなく、例
えばクラフトリグニン、ソーダリグニンなどのようなア
ルカリリグニン類、並びに、ソルボリシスリグニン、サ
ルファイトリグニン、および爆砕リグニンなどを利用す
ることができる。
本発明の複合体において、担体に対して、リグニン物
質層が化学的結合によって固定されている。
質層が化学的結合によって固定されている。
化学的結合による固定方法において、リグニン物質、
および担体物質の少なくとも一方に、化学的に活性な官
能基を導入してもよい。このような化学的活性な官能基
としては、例えばエポキシ基の開環による結合、或は、
アミノ基、水酸基、カルボキシル基、およびカルギニル
基などの縮合反応による結合を利用することができる。
および担体物質の少なくとも一方に、化学的に活性な官
能基を導入してもよい。このような化学的活性な官能基
としては、例えばエポキシ基の開環による結合、或は、
アミノ基、水酸基、カルボキシル基、およびカルギニル
基などの縮合反応による結合を利用することができる。
エポキシ基を担体物質、又はリグニン物質に導入する
には、エピクロルヒドリン、グリシジルメタクリレート
のようなエポキシ化試薬を、通常のエポキシ化反応条
件、例えばアルカリ条件下での加熱により反応させれば
よい。
には、エピクロルヒドリン、グリシジルメタクリレート
のようなエポキシ化試薬を、通常のエポキシ化反応条
件、例えばアルカリ条件下での加熱により反応させれば
よい。
縮合反応基を利用するには、リグニン物質中の官能
基、例えばカルボキシル基を利用し、担体に、この官能
基と縮合反応する官能基、例えばアミノ基を導入すれば
よい。或は、担体物質の有する官能基に応じてリグニン
にアミノ基、水酸基、カルボキシル基、又はカルボニル
基などを常法に従って導入してもよい。
基、例えばカルボキシル基を利用し、担体に、この官能
基と縮合反応する官能基、例えばアミノ基を導入すれば
よい。或は、担体物質の有する官能基に応じてリグニン
にアミノ基、水酸基、カルボキシル基、又はカルボニル
基などを常法に従って導入してもよい。
本発明の複合体において、リグニン物質の含有量は、
担体重量に対して２〜20重量％の範囲内にある。
担体重量に対して２〜20重量％の範囲内にある。
また、本発明に用いられる高分子材料固形粒子は、10
〜1000μｍの粒径を有するもので、かつ多孔質であっ
て、その気孔の孔径は、0.02〜0.2μｍであることが好
ましい。
〜1000μｍの粒径を有するもので、かつ多孔質であっ
て、その気孔の孔径は、0.02〜0.2μｍであることが好
ましい。
本発明の固定化リグニン複合体は、酵素固定材料の有
効成分として有用なものである。
効成分として有用なものである。
この酵素固定材料は、ウレアーゼ．ウリカーゼ、グル
コースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、コレステロー
ルエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ、キモトリプシン、カルボキシペプチダー
ゼ、およびサーモライシンなどの酵素を固定するのに有
用である。酵素の固定は、従来慣用の方法で行うことが
できる。例えば、所定の酵素の溶液中に、本発明の固定
化リグニン組成物を懸濁し、所定の温度、例えば５〜37
℃に、所定時間、例えば１〜３時間静置し、その後、酵
素固定物を分離捕集すればよい。
コースオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、コレステロー
ルエステラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラク
トシダーゼ、キモトリプシン、カルボキシペプチダー
ゼ、およびサーモライシンなどの酵素を固定するのに有
用である。酵素の固定は、従来慣用の方法で行うことが
できる。例えば、所定の酵素の溶液中に、本発明の固定
化リグニン組成物を懸濁し、所定の温度、例えば５〜37
℃に、所定時間、例えば１〜３時間静置し、その後、酵
素固定物を分離捕集すればよい。
また、本発明の固定化リグニン複合体は、蛋白質除去
材料の有効成分として有用なものである。
材料の有効成分として有用なものである。
前述のように、従来の除蛋白法として代表的な沈澱法
や限外濾過法は、多量のサンプルを必要とする。この問
題を解決するために、プレカラム法について検討し、そ
の結果、本発明の組成物を使用してすぐれた成果を得る
ことができた。
や限外濾過法は、多量のサンプルを必要とする。この問
題を解決するために、プレカラム法について検討し、そ
の結果、本発明の組成物を使用してすぐれた成果を得る
ことができた。
従来のプレカラム法の中のスイッチ法は、途中にサン
プルバルブを設ける必要を生じていたし、また、ベンテ
ィング法では、バルブを３ケ所も設けることを必要とす
るものであった。本発明の材料を用いると、一旦吸着し
たものを送り出すのではなく、検出物自身がカラムを素
通りし、蛋白質のみを選択的にカラムにより吸着除去す
るという全く簡便な方法が可能になった。また従来のプ
レカラム法では、疎水性担体を用いているために、蛋白
質に対して非特異的吸着を利用せざるを得なかったが、
本発明の組成物を用いると、この点をも解消することが
できる。
プルバルブを設ける必要を生じていたし、また、ベンテ
ィング法では、バルブを３ケ所も設けることを必要とす
るものであった。本発明の材料を用いると、一旦吸着し
たものを送り出すのではなく、検出物自身がカラムを素
通りし、蛋白質のみを選択的にカラムにより吸着除去す
るという全く簡便な方法が可能になった。また従来のプ
レカラム法では、疎水性担体を用いているために、蛋白
質に対して非特異的吸着を利用せざるを得なかったが、
本発明の組成物を用いると、この点をも解消することが
できる。
蛋白質の除去効果の評価法としては、バッチ法とカラ
ム法があり、導入された蛋白質量の除去率により除去材
料の性能を判定することができる。
ム法があり、導入された蛋白質量の除去率により除去材
料の性能を判定することができる。
本発明を実施例により更に説明する。
実施例１および２ セルロース粒子への固定 実施例１においてメルク社製のセルロース微結晶（Ar
t.2331）5gを20mlの水に懸濁し、５℃に冷却した。これ
に、あらかじめ調製して５℃に冷却した6N−水酸化ナト
リウム75mlを加え、撹拌して均一にした。この懸濁液を
５℃にて１時間静置した後水150mlを加え60℃にて１時
間撹拌した。つぎにエピクロルヒドリン50mlを加え60℃
で３時間撹拌し、得られたエポキシ活性化セルロースを
濾取して500mlの水で洗浄した。得られたエポキシ活性
化セルロースを、水酸化ナトリウムによりpH12に調整し
た1.2％ヘキサメチレンジアミン二塩酸塩水溶液150mlに
懸濁し、60℃にて３時間撹拌した。得られたアミノヘキ
シルセルロースを濾取し500mlの水で洗浄してつぎの反
応に用いた。
t.2331）5gを20mlの水に懸濁し、５℃に冷却した。これ
に、あらかじめ調製して５℃に冷却した6N−水酸化ナト
リウム75mlを加え、撹拌して均一にした。この懸濁液を
５℃にて１時間静置した後水150mlを加え60℃にて１時
間撹拌した。つぎにエピクロルヒドリン50mlを加え60℃
で３時間撹拌し、得られたエポキシ活性化セルロースを
濾取して500mlの水で洗浄した。得られたエポキシ活性
化セルロースを、水酸化ナトリウムによりpH12に調整し
た1.2％ヘキサメチレンジアミン二塩酸塩水溶液150mlに
懸濁し、60℃にて３時間撹拌した。得られたアミノヘキ
シルセルロースを濾取し500mlの水で洗浄してつぎの反
応に用いた。
0.5N−水酸化ナトリウム200ml中に前記アミノヘキシ
ルセルロースを懸濁し、60℃にて１時間撹拌した後エピ
クロルヒドリン40mlを加えさらに２時間撹拌した。得ら
れたエポキシ活性化アミノヘキシルセルロースを濾取し
500mlの水により洗浄してこれを、水酸化ナトリウムに
よりpH11に調整した６％アルカリリグニン（東京化成L0
82）水溶液100ml中に懸濁し45℃にて４時間撹拌した。
リグニン固定化セルロースを濾取し水・1/10N−水酸化
ナトリウムおよびメタノールで洗浄し未反応のリグニン
を除去した後得られたリグニン固定化セルロースを真空
乾燥した。
ルセルロースを懸濁し、60℃にて１時間撹拌した後エピ
クロルヒドリン40mlを加えさらに２時間撹拌した。得ら
れたエポキシ活性化アミノヘキシルセルロースを濾取し
500mlの水により洗浄してこれを、水酸化ナトリウムに
よりpH11に調整した６％アルカリリグニン（東京化成L0
82）水溶液100ml中に懸濁し45℃にて４時間撹拌した。
リグニン固定化セルロースを濾取し水・1/10N−水酸化
ナトリウムおよびメタノールで洗浄し未反応のリグニン
を除去した後得られたリグニン固定化セルロースを真空
乾燥した。
また実施例２において東洋濾紙製のセルロース粉末
（濾紙粉末A,100〜200メッシュ）を用いて実施例１と同
様の方法でリグニンを固定した。得られたリグニン固定
化セルロースは標準ふるいにより分級し、200〜350メッ
シュのものを捕集した。
（濾紙粉末A,100〜200メッシュ）を用いて実施例１と同
様の方法でリグニンを固定した。得られたリグニン固定
化セルロースは標準ふるいにより分級し、200〜350メッ
シュのものを捕集した。
なお、リグニン固定化セルロースのリグニン含量の測
定法を以下に示す。得られたリグニン固定化セルロース
のリグニン含量は以下に述べるようにアセチルブロマイ
ド法を用いて測定した。
定法を以下に示す。得られたリグニン固定化セルロース
のリグニン含量は以下に述べるようにアセチルブロマイ
ド法を用いて測定した。
得られたリグニン固定化セルロース2mgにアセチルブ
ロミドの25％酢酸溶液を1ml加えて30分間70℃に加熱
し、リグニン固定化セルロースを溶解させた。これを水
浴中で冷やした後2N−水酸化ナトリウム0.9mlと氷酢酸5
mlを加え混和した。これに7.5M塩酸ヒドロキシルアミン
溶液0.1mlを加え冷却しながら振り混ぜた。氷酢酸を加
え全量を20mlとした後280nmの吸光度を測定することに
よりリグニン含量を求めた。
ロミドの25％酢酸溶液を1ml加えて30分間70℃に加熱
し、リグニン固定化セルロースを溶解させた。これを水
浴中で冷やした後2N−水酸化ナトリウム0.9mlと氷酢酸5
mlを加え混和した。これに7.5M塩酸ヒドロキシルアミン
溶液0.1mlを加え冷却しながら振り混ぜた。氷酢酸を加
え全量を20mlとした後280nmの吸光度を測定することに
よりリグニン含量を求めた。
また、得られたリグニン固定試料の触媒活性の比較用
試料として未修飾のセルロースを用いた。
試料として未修飾のセルロースを用いた。
得られた本実施例１および２のリグニン固定化試料の
リグニン含有量は、セルロース担体の重量に対し、それ
ぞれ11％および5.7％であった。
リグニン含有量は、セルロース担体の重量に対し、それ
ぞれ11％および5.7％であった。
酵素の固定 仔牛小腸由来のアルカリホスファターゼ（シグマ社Ｐ
−3877,1.4U/mg）15mgを、3mlのpH8.0,0.5M,2−（シク
ロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（CHES）緩衝液に
溶解させたこの溶液に、あらかじめ同じ緩衝液中で脱気
しておいた約0.3gのリグニン固定試料を懸濁させ、25℃
で１時間静置することにより固定した。
−3877,1.4U/mg）15mgを、3mlのpH8.0,0.5M,2−（シク
ロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（CHES）緩衝液に
溶解させたこの溶液に、あらかじめ同じ緩衝液中で脱気
しておいた約0.3gのリグニン固定試料を懸濁させ、25℃
で１時間静置することにより固定した。
評価試験 酵素を固定する操作を行った後、固定に用いたものと
同じ緩衝液で酵素固定試料を十分洗浄し内径10mmの恒温
ジャケット付きガラスカラムに充填した。これに、pH9.
0CHES緩衝液（MgCl2 80m mol/）に溶解した11m mol/
リン酸ｐ−ニトロフェニルエステル二ナトリウム塩を
25℃で0.05ml/minの速度で潅流させた。流出溶液中の生
成物ｐ−ニトロフェノールアニオンに由来する430nmに
おける吸光度変化を測定することによりカラムの触媒活
性を検討した。
同じ緩衝液で酵素固定試料を十分洗浄し内径10mmの恒温
ジャケット付きガラスカラムに充填した。これに、pH9.
0CHES緩衝液（MgCl2 80m mol/）に溶解した11m mol/
リン酸ｐ−ニトロフェニルエステル二ナトリウム塩を
25℃で0.05ml/minの速度で潅流させた。流出溶液中の生
成物ｐ−ニトロフェノールアニオンに由来する430nmに
おける吸光度変化を測定することによりカラムの触媒活
性を検討した。
リグニン固定試料と酵素を１時間インキュベーション
した際の酵素固定量はリグニン固定化セルロース（実施
例1,2）および未修飾のセルロースのみのどちらの場合
にも5.4mg/g−gelであったが、それらの触媒活性は、リ
グニン固定化セルロース（実施例1,2）の場合には未修
飾のセルロースのみの場合の５〜７倍あった。これはリ
グニンを介して酵素が担体に固定されているため、直接
セルロースの表面に吸着している場合よりも酵素の触媒
反応に有利なコンフォメーションで担体上に固定されて
いるためであると考えられる。またリグニン固定化セル
ロース（実施例1,2）にアルカリホスファターゼを固定
した場合の酵素活性の半減期は約７日と良好であり、リ
グニン固定化セルロースから酵素が脱離しにくいことが
明らかであった。
した際の酵素固定量はリグニン固定化セルロース（実施
例1,2）および未修飾のセルロースのみのどちらの場合
にも5.4mg/g−gelであったが、それらの触媒活性は、リ
グニン固定化セルロース（実施例1,2）の場合には未修
飾のセルロースのみの場合の５〜７倍あった。これはリ
グニンを介して酵素が担体に固定されているため、直接
セルロースの表面に吸着している場合よりも酵素の触媒
反応に有利なコンフォメーションで担体上に固定されて
いるためであると考えられる。またリグニン固定化セル
ロース（実施例1,2）にアルカリホスファターゼを固定
した場合の酵素活性の半減期は約７日と良好であり、リ
グニン固定化セルロースから酵素が脱離しにくいことが
明らかであった。
実施例３および４ 実施例１および２の各々記載のリグニン固定試料を下
記のように蛋白質除去材料として用いた。
記のように蛋白質除去材料として用いた。
蛋白質の除去 １）バッチ法 ウシ血清アルブミンあるいはウシ血清γ−グロブリン
を1/30Mリン酸緩衝液に溶解させたものにリグニン固定
試料を懸濁させた。25℃にて撹拌した後メンブランフィ
ルター（東洋濾紙DISMIC−25cs,孔径0.45μｍ）を用い
て濾過し、濾液中のタンパク濃度をローリー法により測
定して樹脂へのタンパク質結合量を測定した。
を1/30Mリン酸緩衝液に溶解させたものにリグニン固定
試料を懸濁させた。25℃にて撹拌した後メンブランフィ
ルター（東洋濾紙DISMIC−25cs,孔径0.45μｍ）を用い
て濾過し、濾液中のタンパク濃度をローリー法により測
定して樹脂へのタンパク質結合量を測定した。
２）カラム法 内径4.7mm、長さ55mmのガラスカラムに充填した約0.2
gのリグニン固定試料を通常の低圧クロマトグラフ用装
置に組み込んだ。移動相にpH5.5,1/30Mリン酸緩衝液を
用い、流量は1ml/minとした。移動相と同じ緩衝液を用
いて調製した2.5mg/mlの濃度のウシ血清アルブミン溶液
をオートインジェクターを用いて、10μずつ10分ごと
に繰り返しこの分析装置に注入した。蛋白結合量を、カ
ラムからの流出溶液中のタンパク質をUVモニターを用い
て追跡し、積分計を用いてピーク面積を求めることによ
り定量した。
gのリグニン固定試料を通常の低圧クロマトグラフ用装
置に組み込んだ。移動相にpH5.5,1/30Mリン酸緩衝液を
用い、流量は1ml/minとした。移動相と同じ緩衝液を用
いて調製した2.5mg/mlの濃度のウシ血清アルブミン溶液
をオートインジェクターを用いて、10μずつ10分ごと
に繰り返しこの分析装置に注入した。蛋白結合量を、カ
ラムからの流出溶液中のタンパク質をUVモニターを用い
て追跡し、積分計を用いてピーク面積を求めることによ
り定量した。
結 果 次にリグニン固定化セルロースへのタンパク質の結合
の結果を記す。
の結果を記す。
リグニンをセルロース微結晶に固定したもの（実施例
3,リグニン含量11％）をバッチ法により評価したとこ
ろ、ウシ血清アルブミンの結合量は、担体であるセルロ
ースのみの場合に比べて大きく増加した。特にpH5.0〜
5.5の弱酸性条件においてその傾向は顕著で６〜30倍に
結合量が増加していた（表１）。このようにタンパクの
等電点（ウシ血清アルブミンの等電点4.7〜4.9）付近で
リグニン固定試料へのタンパク質結合量が増加する傾向
は他のタンパク質吸着剤においてもみられる。タンパク
質等電点付近のpH5.0〜5.5といった条件下では、タンパ
ク質の疎水性が増大しており、タンパク質とリグニン固
定試料との疎水性相互作用が大きくなっていると考えら
れる。このためタンパク質がリグニン固定試料粒子の表
面に引き寄せられ易く、タンパク質の樹脂へ結合に有利
な条件になり、このような領域においてタンパク質結合
量が増加したと考えられる。ウシ血清γ−グロブリンの
場合にもリグニンを固定化することによりタンパク質結
合量は大きく増加した（表２）。ウシ血清γ−グロブリ
ンの等電点は5.7〜6.8であるが今回pH5.5付近で結合量
が最大になった。γ−グロブリンが会合しやすいタンパ
ク質であることからpH6〜７の領域では大きな会合粒子
となっていると考えられる。このためセルロース結晶表
面に存在すると考えられる微小孔へのタンパク粒子の拡
散が妨げられ、このようなpH領域におけるγ−グロブリ
ンの結合量が減少したと考えられる。
3,リグニン含量11％）をバッチ法により評価したとこ
ろ、ウシ血清アルブミンの結合量は、担体であるセルロ
ースのみの場合に比べて大きく増加した。特にpH5.0〜
5.5の弱酸性条件においてその傾向は顕著で６〜30倍に
結合量が増加していた（表１）。このようにタンパクの
等電点（ウシ血清アルブミンの等電点4.7〜4.9）付近で
リグニン固定試料へのタンパク質結合量が増加する傾向
は他のタンパク質吸着剤においてもみられる。タンパク
質等電点付近のpH5.0〜5.5といった条件下では、タンパ
ク質の疎水性が増大しており、タンパク質とリグニン固
定試料との疎水性相互作用が大きくなっていると考えら
れる。このためタンパク質がリグニン固定試料粒子の表
面に引き寄せられ易く、タンパク質の樹脂へ結合に有利
な条件になり、このような領域においてタンパク質結合
量が増加したと考えられる。ウシ血清γ−グロブリンの
場合にもリグニンを固定化することによりタンパク質結
合量は大きく増加した（表２）。ウシ血清γ−グロブリ
ンの等電点は5.7〜6.8であるが今回pH5.5付近で結合量
が最大になった。γ−グロブリンが会合しやすいタンパ
ク質であることからpH6〜７の領域では大きな会合粒子
となっていると考えられる。このためセルロース結晶表
面に存在すると考えられる微小孔へのタンパク粒子の拡
散が妨げられ、このようなpH領域におけるγ−グロブリ
ンの結合量が減少したと考えられる。
濾紙由来のセルロース粉末にリグニンを固定したもの
（実施例4,リグニン含量5.7％）の場合にもウシ血清ア
ルブミン結合量が大きく増加した（表３）。このセルロ
ース粉末にリグニンを固定したものを用いカラム法によ
り評価を行ったところ、セルロース粉末のみの場合には
１回目のタンパク質溶液注入からタンパク質の溶出がみ
られたのに対し、９回目の注入までタンパク質の溶出は
全くみられず、また流出曲線が飽和に達するまでのタン
パク質溶液注入回数も増加し、タンパク質結合量が大き
く増加した（第１図）。またこのカラム法では、タンパ
ク質溶液を反復注入する間に移動相溶媒によってカラム
が常に洗浄されている形になるため、可逆的結合ではな
く不可逆的なタンパク結合のみを測定している。したが
ってタンパク溶出が始まるまでのタンパク質溶液注入回
数および流出曲線が飽和に達するまでの注入回数が大き
く増加することは、セルロースにリグニンを固定した充
填剤がタンパクと強固に結合することを示している。
（実施例4,リグニン含量5.7％）の場合にもウシ血清ア
ルブミン結合量が大きく増加した（表３）。このセルロ
ース粉末にリグニンを固定したものを用いカラム法によ
り評価を行ったところ、セルロース粉末のみの場合には
１回目のタンパク質溶液注入からタンパク質の溶出がみ
られたのに対し、９回目の注入までタンパク質の溶出は
全くみられず、また流出曲線が飽和に達するまでのタン
パク質溶液注入回数も増加し、タンパク質結合量が大き
く増加した（第１図）。またこのカラム法では、タンパ
ク質溶液を反復注入する間に移動相溶媒によってカラム
が常に洗浄されている形になるため、可逆的結合ではな
く不可逆的なタンパク結合のみを測定している。したが
ってタンパク溶出が始まるまでのタンパク質溶液注入回
数および流出曲線が飽和に達するまでの注入回数が大き
く増加することは、セルロースにリグニンを固定した充
填剤がタンパクと強固に結合することを示している。
〔発明の効果〕 本発明の化学的固定化リグニン複合体はそのリグニン
物質が担体に安定して固定されていて、しかも蛋白質に
対し、すぐれた結合性を有し、酵素固定材料、蛋白質除
去材料として有用であり、更に産業廃水の処理、放射性
同位元素廃水の前処理（これは同位体吸着用活性炭は蛋
白質により著しく妨害を受けるために前処理を行うもの
である）、清酒・ビールなどの食品のにごり防止等の分
野へも有効に利用することができる。
物質が担体に安定して固定されていて、しかも蛋白質に
対し、すぐれた結合性を有し、酵素固定材料、蛋白質除
去材料として有用であり、更に産業廃水の処理、放射性
同位元素廃水の前処理（これは同位体吸着用活性炭は蛋
白質により著しく妨害を受けるために前処理を行うもの
である）、清酒・ビールなどの食品のにごり防止等の分
野へも有効に利用することができる。
第１図は、実施例４において調製された本発明に係る化
学的固定化リグニン複合体の蛋白質除去効果を示すグラ
フである。
学的固定化リグニン複合体の蛋白質除去効果を示すグラ
フである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 11/04 Ｃ１２Ｎ 11/04 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ｇ０１Ｎ 33/48 Ａ
Claims (6)
- 【請求項１】10〜1000μｍの粒径を有する多孔質高分子
固形粒子からなる担体と、この担体に化学的に固定され
たリグニン物質層とを含んでなり、前記リグニン物質の
含有量が、前記担体の重量に対し２〜20重量％の範囲内
にある化学的固定化リグニン複合体。 - 【請求項２】前記固形高分子粒子がセルロース、セルロ
ース誘導体、キトサン、キトサン誘導体、デンプン、デ
ンプン誘導体、アミノ酸類、アミノ酸誘導体、ポリアミ
ド、ポリスチレン、ポリアクリル重合体、フェノール−
ホルムアルデヒド重合体、メラミン−ホルムアルデヒド
重合体、尿素−ホルムアルデヒド重合体の粒子から選ば
れる、特許請求の範囲第１項記載の複合体。 - 【請求項３】前記リグニン物質がクラフトリグニン、ソ
ーダリグニン、ソルボリシスリグニン、サルファイトリ
グニン、爆砕リグニンから選ばれる、特許請求の範囲第
１項記載の複合体。 - 【請求項４】前記担体の固形高分子物質および前記リグ
ニン物質の少なくとも一方が、エポキシ基、アミノ基、
水酸基、カルボキシル基およびカルボニル基から選ばれ
た少なくとも１種の官能基を有し、前記担体固形高分子
物質に、前記リグニン物質が、前記官能基による化学的
反応により固定されている、特許請求の範囲第１〜３項
のいずれか１項に記載の複合体。 - 【請求項５】10〜1000μｍの粒径を有する多孔質高分子
固形粒子からなる担体と、この担体に化学的に固定され
たリグニン物質層とを含んでなり、前記リグニン物質の
含有量が、前記担体の重量に対し２〜20重量％の範囲内
にある化学的固定化リグニン複合体を有効成分とする酵
素固定材料。 - 【請求項６】10〜1000μｍの粒径を有する多孔質高分子
固形粒子からなる担体と、この担体に化学的に固定され
たリグニン物質層とを含んでなり、前記リグニン物質の
含有量が、前記担体の重量に対し２〜20重量％の範囲内
にある化学的固定化リグニン複合体を有効成分とする蛋
白質除去材料。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62279309A JP2548240B2 (ja) | 1987-11-06 | 1987-11-06 | 固定化リグニン複合体およびその利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62279309A JP2548240B2 (ja) | 1987-11-06 | 1987-11-06 | 固定化リグニン複合体およびその利用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01121342A JPH01121342A (ja) | 1989-05-15 |
| JP2548240B2 true JP2548240B2 (ja) | 1996-10-30 |
Family
ID=17609368
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62279309A Expired - Lifetime JP2548240B2 (ja) | 1987-11-06 | 1987-11-06 | 固定化リグニン複合体およびその利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2548240B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013152492A1 (zh) * | 2012-04-12 | 2013-10-17 | 淮北中润生物能源技术开发有限公司 | 吸附水相中酚类有机物的方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10218999A (ja) * | 1996-12-06 | 1998-08-18 | Showa Denko Kk | 多孔質物品内部処理用組成物及びその用途 |
| DE19810094A1 (de) | 1998-03-10 | 1999-09-16 | Nukem Nuklear Gmbh | Adsorptionsmittel für Radionuklide |
| WO2006123686A1 (ja) * | 2005-05-20 | 2006-11-23 | Jsr Corporation | 担体ポリマー粒子およびその製造方法ならびに特異捕捉用磁性粒子およびその製造方法 |
| JP2006321932A (ja) * | 2005-05-20 | 2006-11-30 | Jsr Corp | 担体ポリマー粒子およびその製造方法 |
| JP4873123B2 (ja) * | 2005-11-28 | 2012-02-08 | Ｊｓｒ株式会社 | 担体ポリマー粒子の製造方法 |
| WO2010080531A1 (en) * | 2008-12-17 | 2010-07-15 | Novozymes North America, Inc. | Methods for enzymatic modification |
| GB201002824D0 (en) * | 2010-02-19 | 2010-04-07 | Temasek Polytechnic | A method of preparing a substrate for immobilization of functional substances thereon and the substrate obtained therefrom |
| JP2013035885A (ja) * | 2011-08-03 | 2013-02-21 | Asahi Organic Chemicals Industry Co Ltd | リグニン、このリグニンを含有する組成物及びこのリグニンの製造方法 |
| JP2013035886A (ja) * | 2011-08-03 | 2013-02-21 | Asahi Organic Chemicals Industry Co Ltd | リグニン、このリグニンを含む組成物及びこのリグニンの製造方法 |
| CN111036052A (zh) * | 2019-12-27 | 2020-04-21 | 武汉宝绿环保科技有限公司 | 一种治理室内甲醛污染的工艺方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54475A (en) * | 1977-06-01 | 1979-01-05 | Takuma Co Ltd | Apparatus for gasifying and combustion waste material |
| JPS5810076A (ja) * | 1981-07-13 | 1983-01-20 | 株式会社ソフイア | パチンコ遊技方法 |
-
1987
- 1987-11-06 JP JP62279309A patent/JP2548240B2/ja not_active Expired - Lifetime
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2013152492A1 (zh) * | 2012-04-12 | 2013-10-17 | 淮北中润生物能源技术开发有限公司 | 吸附水相中酚类有机物的方法 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01121342A (ja) | 1989-05-15 |
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