CN1923864A - 一种氨基化高分子微球制备技术及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一种氨基化高分子微球的制备技术及其在免疫比浊定量检测中的应用的方法。实施方式是先合成聚苯乙烯(PS)种子微粒，种子微粒再与氨基化单体进行化学反应，在PS种子微粒的表面接上氨基基团形成氨基化高分子微球。本方法合成的氨基化高分子微球在戊二醛等交联剂的作用下能与抗体等蛋白质交联，形成稳定的交联产物，可作为免疫比浊检测试剂应用于抗原、抗体和其他蛋白的定量检测，也可作为亲和纯化介质应用于蛋白质、核酸等生物分子的分离纯化和定位标记。

Description

一种氨基化高分子微球制备技术及其应用

技术领域：高分子材料生物诊断技术

技术背景：

高分子微球已广泛应用于生物医学的各个领域，既可作为分离材料用于蛋白质、核酸和细胞等生物物质的分离，也可作为抗原、抗体和酶等物质的固化支持材料应用于采用颗粒增强免疫比浊法对各种物质，特别是蛋白质、多肽和抗体的定量检测。高分子微球的性能取决于它的粒径大小、均匀度，以及表面化学基团的性质和数量。粒径的大小与免疫定量检测的灵敏度有关。粒径越小，灵敏度越高。免疫定量检测的粒径一般要求在0.1-0.2μm。微球的均匀度与免疫定量检测的稳定性和精密度(CV值)有关。均匀度越好，稳定性和精密度就越高。当粒径小到一定程度以后，就只有通过改变微球表面的化学基团的性质和数量来进一步提高免疫定量检测的灵敏度和稳定性。高分子微球的表面一般接入羧基、醛基和氨基等几种化学基团。氨基化微球因其便于与抗体等蛋白质交联，并且交联的稳定性较好而被广泛采用。

发明内容：

本发明专利涉及一种氨基化高分子微球的制备技术及其在免疫比浊定量检测中的应用。氨基化高分子微球的制备方案是：先在合成聚苯乙烯(polystyrene，PS)种子微粒，种子微粒再与氨基化单体进行化学反应，在PS种子微粒的表面接上氨基基团。合成的氨基化高分子微球在双功能分子——戊二醛的作用下与抗体等带有氨基的分子交联，形成稳定的交联产物，可用于抗原、抗体和其他蛋白的免疫定量检测。与其他微球的合成方法相比，本发明技术合成氨基化高分子微球简化了微球的制备步骤，省却了合成聚苯乙烯微球的中间过程，直接在种子微粒的表面连接氨基基团，合成的粒径更小，单位质量的微球表面积增大，氨基基团更丰富，而且原材料的消耗也大为减少。因此，进一步提高了免疫比浊定量检测灵敏度，降低了生产成本。

具体实施方式：

本发明的目的可以通过以下措施来达到：

(1)材料与试剂：单体：苯乙烯(Styrene，St)、氨基官能团单体(Aminoethylmethacrylatehydrochloride，AEMH)、乳化剂(Hexadecyltrimethylammonium bromide，HDTAB)、引发剂(2，2’-azobisisobutyramidine dihydrochloride，AIBA或2，2’-azobisdimethylenisobutyramidine dihydrochloride，ADIBA)、终止剂(对苯二酚Hydroquinone)。

(2)氨基化聚苯乙烯微球的制备配方见下表：

       表1聚苯乙烯种子微粒(PS Seed)的合成

组分	Water	St	HDTAB	AIBA
					用量/g	400	80	0.18	0.40

               表2氨基化聚苯乙烯微球的合成

组分	Water	PS Seed	St	HDTAB	AEMH	ADIBA
							用量/g	500	400	20	0.337	0.2	0.1

(3)操作步骤：

A按表1配方在氮气保护下制备聚苯乙烯种子微粒乳液。反应温度为70℃，搅拌速率为250rpm，反应时间为12h；

B取出75g种子微粒乳液加入150g水，氮气保护下，以0.98g/min的速率加入苯乙烯单体，在室温下以200rpm的速率搅拌1h；

C升温至70℃。待温度恒定后，以2.08g/min的速率加入引发剂ADIBA(溶液形式2.0g溶于800g二次蒸馏去离子水中)，反应时间为4h；

D取出400g聚苯乙烯种子微粒，加入500g水、乳化剂HDTAB 0.337g、苯乙烯20g和氨基化单体AEMH 0.2g，转速200rpm下搅拌1h。温度恒定70℃后，加入引发剂0.1g。反应时间为4h；

E最后加入20ml对苯二酚结束反应。

F合成的氨基化高分子微球可用超速离心方法或超滤方法浓缩和纯化。采用离心方法浓缩和纯化的操作步骤是：将微球悬液移入离心管中，50000-100000×g 4℃离心10-20分钟，倾去上清液。加0.1mM甘氨酸缓冲液(PH值7.4)洗涤两次，离心去上清，最后加0.1mM甘氨酸缓冲液重悬，调整至浓度为10％，于4-8℃保存。采用超滤方法进行浓缩和纯化的操作步骤是：选用滤膜孔径为100KD的滤膜包或带有滤膜的离心管，蠕动泵加压过滤或1000-15000×g 4℃离心10-20分钟，0.1mM甘氨酸缓冲液(PH值7.4)洗涤两次，去上清，最后加0.1mM甘氨酸缓冲液重悬，调整至浓度为10％，于4-8℃保存。

G制备的氨基化高分子微球可在戊二醛(一般作用浓度为0.125％)作用下，与抗体或抗原等各种蛋白质进行交联，即可获得交联有蛋白的微球，可作为检测试剂采用免疫比浊法对目的蛋白进行定量检测。

H氨基化高分子微球免疫比浊检测试剂可应用于临床上对各种体液蛋白和生物医学研究中对各种目的蛋白进行定量检测。检测的操作步骤如下：将交联有抗体等蛋白的微球加入到180μl反应液(PH7.4磷酸缓冲液，含6％聚乙二醇(PEG6000))至终浓度为0.05-0.1％，加入待测标本液20μl，37℃孵育10分钟，于全自动生化分析仪(或半自动生化分析仪、紫外分光光度计)340nm波长出测定缓冲液的吸光度值(OD值)。以梯度稀释的标准蛋白所测得的OD值绘制标准曲线，可推算出待测标本目的蛋白的含量。

本技术直接在聚苯乙烯种子微粒的表面连接氨基基团来制备氨基化微球。与以往的微球合成技术相比，省去了合成聚苯乙烯微球的中间环节，因而制备的氨基化微球一般较小，粒径在0.1-0.2μm之间，微球的均质性较好，非常适合采用免疫透射比浊法对各种体液蛋白和体外蛋白进行定量检测。

采用本技术制备的氨基化聚苯乙烯微球也可作为亲和纯化的介质应用于抗原、抗体和其他蛋白的分离和纯化，以及体外对各种生物活性分子进行定位标记。

Claims (4)

1.一种氨基化高分子微球的制备技术及其在蛋白质定量检测中的应用，其特征是以苯乙烯作为种子微粒合成的材料，以氨基官能团单体(Aminoethylmethacrylate hydrochloride，AEMH)作为氨基基团的供体，采用聚苯乙烯种子微粒表面直接连接氨基基团的方法合成氨基化高分子微球。

2.氨基化高分子微球与抗原、抗体等蛋白质交联后，作为免疫比浊法检测试剂应用于临床上对各种体液蛋白和生物医学研究中对各种标本中的蛋白进行定量检测。

3.合成的氨基化高分子微球在双功能交联剂(如戊二醛等化学物质)作用下与抗原、抗体等各种蛋白多肽分子交联。

4.交联有抗体等蛋白分子的氨基化高分子微球也可作为纯化介质应用于蛋白质的分离纯化，作为标记试剂应用于生物分子的定位标记。