CN102888394A - 核酸提取方法和核酸提取筒 - Google Patents

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Abstract

本公开内容提供了用于在同一区室中执行下列步骤的核酸提取方法，所述步骤包括：在含有核酸的样品上实施超声波处理；通过使用吸附载体吸附样品中包含的物质；通过拦截在电泳现象中移动的核酸来浓缩核酸。根据该核酸提取方法，可以在同一区室中进行超声波处理、吸附处理和电泳处理。因此，可以除去为了每种处理而将样品从一个区室转移到另一个区室的操作。

Description

核酸提取方法和核酸提取筒
背景
一般而言，本公开内容涉及核酸提取方法和核酸提取筒(cartridge)。更具体而言，本公开内容涉及用于从样品中提取核酸的方法，所述方法是通过对样品实施超声处理、从样品中吸附外源物质等的处理，在同一通道中对核酸进行电泳处理；还涉及适用于所述方法的核酸提取筒。
核酸扩增反应方法例如PCR(聚合酶链式反应)方法和LAMP(环介导等温扩增)方法适用于生物技术的多个领域。例如，在医学领域进行的基于DNA和/或RNA碱基序列的诊断，而DNA评估(如鉴别遗传改造的植物)则在农业领域得以实际应用。
在核酸扩增反应中，为了能够检测核酸，以高效率扩增样品中极小量的核酸。如果包含在样品中的核酸的量非常小，则在一些情况下，所述量可能小于检测下限。此外，如果包含在样品中的核酸浓度非常低，则在一些情况下不能检测到核酸，因为具有可导入到反应区域中的量的样品中未含有足以扩增的核酸。可以通过使用下文描述的有效方法，解决在此情况下产生的问题。核酸在导入反应区域前，是经过精制、浓缩和提取的。
如普遍已知的，过去由于提取核酸的方法包括使用酚、氯仿或乙醇的方法，使用柱或过滤器的方法，以及使用磁性二氧化硅珠的方法。柱子和过滤器是用于吸附核酸的。
例如，日本专利公开号2005-080555公开了用于浓缩核酸的方法，通过使用能够吸附核酸的多孔载体。此外，用于在毛细管电泳现象中浓缩核酸的方法公开在“On-line sample preconcentration in capillary electrophoresis:Fundamentals and applications.”Journal of Chromatography A.第1184期(2008)第504-541页中。
概述
在过去的方法中使用酚、氯仿或乙醇，但是必须利用有害的有机溶剂，花费大量精力进行离心分离处理等。此外，在使用用于吸附核酸的柱或过滤器的方法中，柱或过滤器对阻塞状态是敏感的，导致了操作不便，该操作不便会产生问题。
理想的是提供这样的核酸提取方法，所述方法允许进行简单的操作，并且能够在短时间内从样品中高效提取核酸。
为了解决上述问题，本公开内容提供了用于在同一区室(cell)中执行下列步骤的核酸提取方法，所述步骤包括：
对含有核酸的样品实施超声波处理；
通过使用吸附载体吸附所述样品中包含的物质；和
通过拦截(damming)在电泳现象中移动的所述核酸来浓缩所述核酸。
如上所述，核酸提取方法能够在同一区室中执行超声波处理、吸附处理和电泳处理。超声波核酸提取方法允许消除针对每一步处理的将样品从区室内转移(translocate)到另一个区室的操作。
此外，理想的是使用阳离子交换树脂或沸石作为吸附载体。此外，理想的是使用强酸性阳离子交换树脂作为阳离子交换树脂。
此外，理想的是在样品掺混珠状颗粒之后进行超声波处理。此外，理想的是所述物质均为除核酸以外的各种外源物质(foreign substance)。
此外，理想的是对样品实施超声波处理的步骤是在使用缓冲溶液稀释样品后，对样品实施超声波处理的步骤，和所述缓冲溶液的pH具有在4.0至8.0范围内的值。此外，理想的是缓冲溶液含有增稠剂。此外，理想的是增稠剂含有聚乙二醇和/或羟乙基纤维素。应注意的是，上述区室主要表示后文描述的用于提取核酸的筒。此外，上述外源物质主要表示在分析样品所含的核酸时检测到的具体物质。具体物质包括各种非必需蛋白质、肽、糖、盐和金属离子等。
此外，为了解决上述问题，本公开内容还提供了核酸提取筒，包括：
通道，所述通道允许含有核酸的样品导入到所述通道中；
分别位于所述通道每一端的电极；
拦截部分，其构造将所述通道分为负极侧区域和正极侧区域，并拦截所述核酸；
设置在所述负极侧区域中的吸附载体，其吸附包含在所述样品中的物质；和
超声波产生部分，其构造为用于对所述样品进行超声波处理。
此外，上述超声波产生部分是作为与所述电极之一相同的构件(member)而构成的。此外，理想的是拦截部分是透析膜或聚合物凝胶(polymer gel)。此外，理想的是超声波产生部分是超声波探针(ultrasonic probe)或超声波喇叭(ultrasonic horn)。
如上所述，本公开内容提供了这样的核酸提取方法，所述方法允许简单地进行操作，并且能够在短时间内从样品中高效地提取核酸。
附图简介
图1是解释性的模式图，显示了根据本公开内容的第一个实施方案的核酸提取筒的构造。
图2A至2D是解释性的模式图，涉及对根据本公开内容的第一个实施方案的核酸提取方法步骤的描述。
图3是解释性的模式图，显示了根据本公开内容的第一个实施方案的修改方式的核酸提取筒的构造。
图4显示的图分别表示沸石对样品的吸附率。
图5显示的图分别表示强酸性阳离子交换树脂对样品的吸附率。和
图6显示的图表示样品的LAMP反应的结果。
具体实施方案的详述
本公开内容的优选实施方案解释如下。应注意，下述待描述的作为本公开内容的实施方案的实施方案只是本公开内容的典型实施方式，不视为缩小本公开内容范围的限制。实施方案按下列顺序描述。
1、根据本公开内容的第一个实施方案的核酸提取筒，针对所述筒的核酸提取方法，和用于生产所述核酸提取筒的方法。
(1)核酸提取筒
(2)核酸提取方法
(3)生产核酸提取筒的方法
2、根据本公开内容的第一个实施方案的修改方式的核酸提取筒，针对所述筒的核酸提取方法，和用于生产所述核酸提取筒的方法
1、根据本公开内容的第一个实施方案的核酸提取筒，针对所述筒的核酸提取方法，和用于生产所述核酸提取筒的方法
(1)核酸提取筒
图1是解释性的模式图，显示了根据本公开内容的第一个实施方案的核酸提取筒1的构造。
由图1的参考编号1所表示的核酸提取筒具有形成于基体材料中的通道11、正极12和负极13。正极12和负极13分别位于通道11两端的一侧。可以将样品导入到通道11的内部。在通道11的正极12和通道11的负极13之间提供了透析膜14。透析膜14位于正极12和负极13之间，将通道11的内部分为正极侧区域112和负极侧区域113。此外。正极12和负极13连接在构造中的电源V上，允许向导入通道11内部的样品上施加电压或去除电压。在上部，吸附载体容纳在通道11的负极侧区域113内。此外，超声波喇叭(horn)15也位于负极侧区域113内。
基体材料的特征可以与玻璃或各种类型的塑料相同，如聚丙烯、聚碳酸酯、环烯聚合物和聚二甲基硅氧烷。
如上所述，透析膜14将通道11内部分为正极侧区域112和负极侧区域113。根据本公开内容的核酸提取方法作为利用核酸提取筒1的方法，在电泳移动中，核酸从负极侧13向正极侧12迁移，并被透析膜14拦截。出于该原因，将样品导入到通道11的负极侧区域113中。
没有具体描述通道11的形状。但是负极侧区域113的形状一般可类似于图1所示的形状。如图所示，负极侧区域113的形状按从负极13至透析膜14的方向逐渐压低。
在负极侧区域113中容纳了吸附载体。对吸附载体没有特殊描述。换言之，吸附载体可以是任何载体，只要所述载体能够吸附样品中除核酸以外的物质。吸附载体的典型的恰当例子是阳离子交换树脂或沸石。根据本公开内容提供的核酸提取方法，通过在吸附处理中，将此类吸附载体容纳在上述负极侧区域113中，可以在样品的电泳处理前，排除包含在负极侧区域113中的样品中的预定物质。预定物质主要是样品中含有的除核酸以外的物质。
此外，理想的是在负极侧区域113中容纳珠状颗粒(bead particle)。根据本公开内容提供的核酸提取方法，通过在负极侧区域113中容纳珠状颗粒，可以如后文所述，以更高的精确度进行样品的超声波处理。
正极12和负极13分别由恰当的含金(Au)或铂的材料制成，所述金或铂是在电镀工艺、溅射工艺或蒸发工艺中添加至其中的。作为备选，正极12和负极13分别由防腐蚀的材料制成，例如石墨、钛或不锈钢。
透析膜14是典型的根据本公开内容的拦截部分。对拦截部分没有特殊的描述。换言之，拦截部分可以是任何构件，只要所述构件能够在电泳处理中拦截包含在样品中的核酸。此外，拦截部分不必须是透析膜14。相反，拦截部分还可以是多孔膜，例如反渗透膜、半透膜、离子交换膜等。作为备选，拦截部分还可以是由纤维素、聚丙烯腈、陶瓷、沸石、聚砜、聚亚酰胺、钯等。此外，还可以使用聚合物凝胶替代透析膜14。
聚合物凝胶由聚丙烯酰胺恰当的制成。理想的是聚合物凝胶由含有阴离子官能团的聚丙烯酰胺制成。甚至更理想的是聚合物凝胶由含有酸性解离常数(pKa)在1至5的范围内的阴离子官能团的聚丙烯酰胺制成。应注意的是，在该实施方案中，聚丙烯酰胺表示丙烯酰胺或甲基丙烯酰胺(meta acrylicamide)。
对阴离子官能团未作特殊描述。阴离子官能团的典型例子是羧酸例如乙酸、丙酸或丁酸；多元酸例如草酸或邻苯二甲酸；羟酸例如柠檬酸、二醇酸(glycol acid)或乳酸；不饱和多元酸或不饱和酸例如丙烯酸或甲基丙烯酸；氨基酸例如甘氨酸；磷酸的偏酯；硫酸的偏酯；膦酸酯和磺酸。
具体而言，典型的羧酸的例子是脂肪族单羧酸、脂肪族或芳香族二元羧酸、不饱和羧酸、取代的苯甲酸类和多元羧酸(poly-carboxylic acid)，及其衍生物。典型的脂肪族单羧酸的例子是pKa为3.55的甲酸、pKa为4.56的乙酸、pKa为4.67的丙酸、pKa为4.63的丁酸、pKa为4.68的戊酸、pKa为4.63的己酸、pKa为4.66的庚酸、pKa为4.64的棕榈酸和pKa为4.69的硬脂酸。典型的脂肪族或芳香族二元羧酸的例子是具有pKa1为4.00和pKa2为5.24的琥珀酸、具有pKa1为4.13和pKa2为5.03的戊二酸、具有pKa1为4.26和pKa2为5.03的己二酸、具有pKa1为4.31和pKa2为5.08的庚二酸、具有pKa1为4.35和pKa2为5.10的辛二酸、具有pKa1为4.39和pKa2为5.12的壬二酸、具有pKa1为3.24和pKa2为4.71的苹果酸，和具有pKa1为3.54和pKa2为4.46的对苯二甲酸。典型的不饱和羧酸的例子是具有pKa为4.69的巴豆酸、具有pKa为4.26的丙烯酸和具有pKa为4.66的甲基丙烯酸。包括在取代的苯甲酸类中的酸是具有pKa为4.09的茴香酸、具有pKa1为3.12和pKa2为4.74的间氨基苯甲酸、具有pKa1为3.82和pKa2为3.99的间氯和对氯苯甲酸、和具有pKa1为4.08和pKa2为9.96的羟基苯甲酸。多元羧酸的典型例子是具有pKa1为2.87、pKa2为4.35和pKa3为5.69的柠檬酸。
作为含有阴离子官能团的丙烯酰胺单体，丙烯酰胺烷磺酸(acrylic amidealkane sulfone acid)是特别理想的。磺酸是具有聚合的不饱和自由基的磺酸。具有聚合的不饱和自由基的磺酸的典型例子是具有pKa为-2.8的苯乙烯磺酸、具有pKa为3.74的间苯胺磺酸、具有pKa为3.23的对苯胺磺酸、2-(甲基)丙烯酰胺-2-烷基(碳数为1至4)丙烷磺酸，或更具体而言，具有pKa为-1.7的2-丙烯酰胺-2-甲基丙烷磺酸。
聚丙烯酰胺凝胶中的阴离子官能团的浓度理想的是具有0至30%的范围内的值。在此情况下，浓度定义为以%表示的相对质量(relative mass)。
超声波喇叭15是本公开内容提供的对样品进行超声波处理的部分发挥作用的超声波产生部分的典型例子。对作为超声波产生部分发挥作用的超声波喇叭15的形状(和其他属性)没有进行特殊的描述。换言之，超声波产生部分可具有任何属性(包括形状)，只要所述超声波产生部分能够根据本公开内容提供的核酸提取方法对样品进行超声波处理。例如，作为超声波产生部分，还可以使用超声波探头等取代超声波喇叭15。在大部分下文给出的描述中，在本公开内容的第一个实施方案和第一个实施方案的修改方式的情况下，都是假设以超声波喇叭15作为根据本公开内容的超声波产生部分发挥作用。
(2)核酸提取方法
之后，参考图2A至2D解释根据本公开内容的核酸提取方法的步骤如下。
在解释根据本公开内容的核酸提取方法之前，首先下列说明解释了基于下述技术的核酸提取方法，所述技术与本公开内容提供的技术相关。
基于相关技术的核酸提取方法的典型例子是AGPC(酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿提取)方法。根据AGPC方法，首先，对作为掺入碱化剂所获得的经碱化样品进行热处理。然后，使用酶(例如蛋白酶)溶解蛋白质材料。之后，通过应用苯酚-氯仿提取方法，去除蛋白质材料、糖和亲脂性物质。但是，该方法在安全性和快速性能的方面需要改进。例如，使用的样品类型和用于多分析物的处理的适应性仍需要改善。
此外，还提供了这样的方法，所述方法在二氧化硅等的颗粒表面，将DNA、RNA等核酸物理地或化学地连接在一起(或吸附在表面上)，从而将DNA、RNA等从样品中物理地或化学地分离(参考文件例如日本专利公开号Hei7-51065)。但是，根据该方法，如果将悬浮在溶液中的磁性二氧化硅颗粒从样品容器分散到小管中，则理想的是在为了分散颗粒而搅拌颗粒液体溶液的时期结束时完成分散。此外，上述分散溶液的浓度难以均匀，而颗粒的浓度倾向于根据分散的时间而变化。因此，为了定量分析，需要改进该方法。
在上述基础上，对于用于分离核酸的颗粒，还提供了根据使用磁力回收核酸的方法。例如，还提供了这样的方法，根据所述方法，在由超顺磁性氧化铁制成的中心核微粒的表面使用形成有目标膜的磁性二氧化硅颗粒，所述目标膜由核酸等能够共价键合的聚合性硅氧烷构成(参考文件例如日本专利公开号Hei9-19292)。
此外，在基因测试工业中，还提供了这样的方法，根据所述方法，二氧化硅形成了过滤膜的形状，并整合到离心柱(spin column)中，然后进行吸滤处理或离心过滤处理。此外，还有使用聚合物多孔膜替代二氧化硅膜过滤器的方法(参考文件例如日本专利公开号2003-128691)。但是，这些方法需要大量处理过程、大量清洁液和诸如泵或离心机一类的装置。因此，增加了整个装置的大小。
为了解决上述问题，本公开内容详细提供了下述核酸提取方法，作为本公开内容的发明人认真努力的结果。所述核酸提取方法允许简单地进行操作，并且能够在短时间内高效的从样品中提取核酸。
根据本公开内容提供的核酸提取方法，首先，如图2A所示，将含有核酸的样品导入到位于放置在通道11的透析膜14和负极13之间的负极侧区域113中。此时，通道11充满了用于稀释将进行电泳处理的样品的缓冲溶液。导入到负极侧区域113中的样品是由生物学材料制成的液体。由生物学材料制成的液体的典型例子是拭子(swab)、口腔拭子、唾液、全血、血清、血浆、外周血单核细胞、脑脊髓液、粪便、尿液、汗、精液、细菌发酵液、培养的细胞和活体切片组织(biopsy tissue)。此外，由生物学材料制成的液体的另一个典型例子是液体，例如包含在食物、水、土壤基质、海水、湖水和河水中的液体。因此，在一些情况下，样品液体还包含干扰核酸扩增反应的物质。在下列描述中，此类物质被称为核酸分析中不需要的外源物质。外源物质的典型例子是各种蛋白质、糖和金属离子。
之后，如图2B所示，超声波喇叭15对样品进行超声波处理。如上所述，使用各种类型的由生物学材料制成的液体作为样品。因此，对样品进行超声波处理可以破碎样品中结实的膜。结实的膜的典型例子是细胞膜，这是糖、脂质膜和肽聚糖层。可以根据包括样品的类型在内的因素恰当的设置超声波处理的属性。属性包括频率和持续时间。为了高度精确的破碎真菌、病毒等，例如理想的是设置超声波处理的频率为在10kHz至3MHz范围内的值，设置超声波处理的持续时间为在5秒至10分钟的范围内的值。甚至更理想的是设置超声波处理的频率为30kHz或更高的值。
此外，为了提高进行超声波处理破碎上述膜的操作，理想的是预先在负极侧区域113中设置珠状颗粒。对珠状颗粒的属性没有特殊描述。在此情况下，所述属性包括珠状颗粒的大小和颗粒的类型。换言之，可以根据使用的样品恰当的选择珠状颗粒的属性。但是，可以使用无机颗粒或有机颗粒。无机颗粒可以是氧化锆颗粒、二氧化硅颗粒、沸石颗粒等，而有机颗粒可以是离子交换树脂颗粒等。相比其他颗粒，使用直径约0.1mm的氧化锆珠子是理想的。此外，珠状颗粒可以与将样品导入到通道11中同时放入负极侧区域113中。作为备选，还可以在将样品导入到负极侧区域113中之前，将珠状颗粒放入到负极侧区域113中。
此外，为了进一步提高进行超声波处理破碎上述膜的操作，理想的是预先在样品中含有中性或阴离子表面活性剂。可以根据样品类型恰当的选择表面活性剂。表面活性剂的典型例子是SDS(十二烷基硫酸钠)、Triton-X100、Tween20和Brij35。
此外，理想的是使用在4.0至8.0范围内的pH值的区域内具有缓冲能力的缓冲溶液作为稀释样品的缓冲溶液。具体而言，理想的是使用甘氨酸盐酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液、醋酸缓冲溶液、柠檬酸/磷酸缓冲溶液、磷酸缓冲溶液、tris-盐酸缓冲溶液、具有pKa为6.2的MES、具有pKa为6.5的Bis-Tris、具有pKa为6.6的ADA、具有pKa为6.8的PIPES、具有pKa为6.9的ACES、具有pKa为6.95的MOPSO、具有pKa为7.15的BES或具有pKa为7.2的MOPS。但是，用于稀释样品的缓冲溶液不限于此。
此外，在负极侧区域113中进行超声波处理。但是，也不是必须在负极侧区域113中进行超声波处理。例如，还可以在与负极侧区域113相邻的区域中进行超声波处理。在此情况下，将完成超声波处理的样品通过管子等注射到负极侧区域113中。
然后，如图2C所示，吸附载体吸附样品中包含的物质。包含在样品中的物质主要是除上述核酸之外的外源物质。因此，外源物质被从样品中去除并吸附于吸附载体上。结果，包含在样品中的核酸可以选择性地进行后述的高度精确的电泳移动。在此情况下，理想的是通过应用疏水性结合技术或静电力技术，吸附外源物质。出于该原因，使用特别具有疏水表面或负电荷表面的吸附载体是较好的。例如，理想的是使用沸石、阳离子交换树脂等。更理想的是，沸石是高二氧化硅质子型沸石，而阳离子交换树脂是强酸性阳离子交换树脂。此外，甚至更理想的是，阳离子交换树脂是质子型强酸性阳离子交换树脂。通过使用此类吸附载体，可以降低样品的pH，并将样品脱矿物化。理想的是强酸性阳离子交换树脂是具有磺酸自由基质子型(-SO3H)或磺酸自由基钠离子型(-SO3Na)作为交换基团的树脂。
对吸附外源物质的方法没有特殊描述。但是，根据典型的外源物质吸附方法，是通过将充满吸附载体的过滤器插入到负极侧区域113中，并将处于液体状态的、完成超声波处理破碎操作的样品通过滤器，来吸附外源物质。此外，根据备选的方法，在对上述样品进行超声波处理之前，预先将吸附载体放入负极侧区域113中，在超声波处理的同时吸附外源物质。
然后，样品进行如图2D所示的电泳移动。带负电荷的核酸按朝向正极12的方向，通过通道11进行电泳移动。同时，透析膜14阻断了核酸的电泳移动并拦截核酸，使得核酸在透析膜14的界面上和界面附近浓缩。根据通道11的大小，将电泳移动的持续时间设置为恰当的值。例如，将电泳移动的持续时间恰当的设置为在10秒至10分钟范围内的典型值是较好的。应注意，透析膜14的界面是在透析膜14和充满负极侧区域113侧空间的缓冲溶液之间的接触表面。
此外，上述缓冲溶液还可以掺杂用于增加缓冲溶液粘度的增稠剂。对增稠剂没有特殊的描述。但理想的是，缓冲溶液是能够通过调节缓冲溶液的粘度来控制电泳移动速度的溶液。理想的缓冲溶液的典型例子包括聚乙二醇和羟乙基纤维素。作为备选，还可以通过掺混上述典型的例子来制备缓冲溶液。此外，通过调节缓冲溶液的粘度，还可以降低核酸的再分散。由于在电泳移动过程中产生焦耳热(Joule’s heat)所引发的热对流，核酸的这一再分散发生在浓缩部分。
此外，在缓冲溶液吸入到负极侧区域113的透析膜14附近的过程中，在正极12和负极13之间短时间使用反向电压也是增加核酸回收量的有效技术。通过在回收核酸的过程中，在正极12和负极13之间短时间使用反向电压，可以将存在于透析膜14的界面上的核酸转移到负极侧区域113的透析膜14附近，使得可以通过使用微量移液器吸取和回收核酸。根据通道11的大小，将在正极12和负极13之间施用向电压的持续时间设置为恰当的值。例如，将在正极12和负极13之间施用反向电压的持续时间恰当的设置为1至10秒是较好的。
最后，为了回收浓缩的核酸，使用微量移液器吸取在负极侧区域113的透析膜14附近的缓冲溶液。
如上所述，根据本公开内容提供的核酸提取方法，在将样品导入到负极侧区域113中之后，进行超声波处理和实施使用吸附载体从样品中吸附外源物质的处理。然后，进行电泳处理浓缩核酸。以该方式，可以进行核酸扩增反应浓缩和提取核酸。应注意，可以彼此独立的，或者通过组合任何处理(包括超声波处理、吸附处理和电泳处理)进行对样品的处理。例如，在超声波处理和吸附处理同时进行之后，实施电泳处理。作为备选，在进行了超声波处理后，同时实施吸附处理和电泳处理。作为另一种备选，同时进行超声波处理、吸附处理和电泳处理。
此外，用于本公开内容提供的核酸提取方法中的吸附载体的功能可以是在执行核酸的电泳处理之前，通过沉淀(settling)或过滤来去除外源物质。可以选择多种典型方法之一作为沉淀方法。多种典型方法包括天然沉淀方法和使用离心力的沉淀方法。此外，作为过滤方法，可以应用这样的方法，所述方法是根据吸附载体的类型等，一般使用预先确定具有恰当形状的多孔膜的方法。
理想的是用于由本公开内容提供的核酸提取方法中的样品能够提高在超声波处理中破碎上述膜的操作，并具有在4.0至8.0的范围内的pH，使得可以更顺利的进行电泳处理。
根据上述由本公开内容提供的核酸提取方法，可以在同一区室中，执行对样品进行的超声波处理，实施使用吸附载体从样品中吸附外源物质的处理，和通过按一系列步骤进行电泳处理来浓缩核酸。换言之，可以在同一区室中，执行超声波处理、吸附处理和电泳处理。即，可以消除为了每步处理而将样品从一个区室转移到另一个区室所进行的操作。因此，可以非常简单地进行提取核酸的处理。此外，可以在短时间内高效地进行从样品提取核酸的处理。
此外，根据上述由本公开内容提供的核酸提取方法，在同一区室中执行所有的处理，因此，不必将样品从区室转移到另一个装置中。其结果是，当将检验的感染目标作为样品处理时，可以降低操作员的被检验目标感染的风险。此外，当使用血液标本作为样品时，可以直接进行从将样品导入到核酸提取筒1的同一区域至提取核酸的处理。
此外，根据上述由本公开内容提供的核酸提取方法，通过进行超声波处理，可以用超声波破碎结实的膜，例如细胞膜、糖、脂质膜和肽聚糖层。因此，可以在不使用胍盐、强碱等的条件下，进行根据上述由本公开内容提供的核酸提取方法的处理。胍盐是干扰核酸扩增反应的离液离子(chaotropicion)。
此外，在上述由本公开内容提供的核酸提取方法，在不使用强碱、酶等的条件下，可以在超声波处理中破碎革兰氏阳性细菌的细胞膜、囊膜(enveloping membrane)和肽聚糖层。因此，在通常检验咳出的痰中结核病细菌时，可以排除基于还原剂的分析物处理等。其结果是，可以简单高精确度地从样品中提取核酸。
此外，在不实施使用特定有机溶剂的化学处理等的条件下进行超声波处理。因此，可以以高度的安全性破碎上述膜，并且同时防止样品变质(deteriorating)。在此基础上，由于可以在不使用强碱的条件下提取核酸，所以可以提取RNA，同时避免由碱导致的RNA降解。
此外，根据上述由本公开内容提供的核酸提取方法，不需要加热处理。因此，可以提取RNA，同时避免由加热处理导致的RNA降解。在此基础上，将缓冲溶液的pH设置为在4.0至8.0的范围内的值，并在酸性条件下对样品进行超声波处理。因此，可以抑制RNA酶的作用。
此外，根据上述由本公开内容提供的核酸提取方法，可以使用吸附载体去除外源物质。因此，在电泳处理中，只高效地浓缩核酸。其结果是，当具有低浓度的核酸时，可以精确的检测包含在分析物中的靶核酸。
此外，根据上述由本公开内容提供的核酸提取方法，可以在不实施样品清洁处理的条件下，进行核酸提取处理。因此，可以设计核酸提取筒1用于在不提供液体切割泵、离心机、复杂的溶液发送机构等的核酸提取方法。其结果是，可以简化核酸提取筒1的装置构造，并可以减小核酸提取筒1的大小，如图1所示。在此基础上，根据上述由本公开内容提供的核酸提取方法，可以在不实施样品清洁处理的条件下，进行核酸提取处理。因此，可以从小量的样品中提取核酸。
(3)生产核酸提取筒的方法
如下生产根据本公开内容的第一个实施方案的核酸提取筒1。将透析膜14插入到在形成基体材料中的通道11中，透析膜14将通道11分为正极侧区域112和负极侧区域113。吸附载体容纳在负极侧区域113中，并且还在负极侧区域113中提供超声波喇叭15。
通道11是在基体材料(是玻璃基体材料)的内部形成的，一般通过对基体材料进行湿蚀刻处理或干蚀刻处理来进行。作为备选，还可以通过对塑料基体材料进行切割处理等在基体材料内部形成通道11。应注意，可以在核酸提取筒1内形成一条、两条或多条通道。
理想的是通过进行溅射处理或蒸发处理制造金(Au)或铂(Pt)的每个正极12和负极13。在这一方面，在根据相关技术的核酸提取筒内，在某些构型中以铂丝作为电极。在此情况下，每次进行实验时，必须将铂丝放入核酸提取筒中。此外，铂丝的价格昂贵。考虑到这些因素，核酸提取筒不能做成一次性的。另一方面，如上所述，在根据本实施方案的核酸提取筒1的情况下，通过进行溅射处理或蒸发处理用金(Au)制造每个正极12和负极13，从而预先在核酸提取筒1内形成正极12和负极13。因此，可以简单地操作根据本实施方案的核酸提取筒1。此外，相比根据相关技术的核酸提取筒，根据本实施方案的核酸提取筒1还可以制成一次性的。因此，在根据本实施方案的核酸提取筒1的情况下，可以防止样品污染。
超声波喇叭15可以恰当的设计成任何构造，只要所述构造允许对样品进行超声波处理。例如，超声波喇叭15可以嵌入到基体材料中。
2、根据本公开内容的第一个实施方案修改方式的核酸提取筒，针对所述筒的核酸提取方法，和用于生产所述核酸提取筒的方法
之后，参考图3，下列说明解释了根据本公开内容的第一个实施方案的修改方式的核酸提取筒101。图3是解释性的模式图，显示了根据本公开内容的第一个实施方案的修改方式的核酸提取筒101的构造。应注意，在上述实施方案的修改方式中，每个具有与上述实施方案中使用的对应物具有基本相同的功能构造的元件都用与对应物用相同的参考编号标示，为了避免重复说明，省略了对此类相同元件的解释。
用于根据上述实施方案的修改方式的核酸提取筒101中的通道11、正极12、负极13和透析膜14分别具有与用于根据上述实施方案的核酸提取筒1中的通道11、正极12、负极13和透析膜14相同的功能构造。除了在根据上述实施方案的修改方式的核酸提取筒101中由相同构件——电极/超声波喇叭25作为负极13和超声波喇叭15以外，核酸提取筒101与根据实施方案的核酸提取筒1基本相同。出于该原因，下列说明只解释了执行负极13和超声波喇叭15的相同构件电极/超声波喇叭25。
由上述实施方案的修改方式提供的核酸提取方法和用于生产根据修改方式的核酸提取筒101的方法相对于由上述实施方案提供的核酸提取方法和用于生产根据上述实施方案的核酸提取筒1的方法而言是相同的，除了在根据修改方式的核酸提取筒101中，负极13和超声波喇叭15由相同的构件，即电极/超声波喇叭25构成。出于该原因，为了避免重复说明，省略了对此类方法的解释。
由于电极/超声波喇叭25具有与之前解释的负极13相同的功能构造，因此，电极/超声波喇叭25可以通过溅射处理或蒸发处理，由金(Au)或铂(Pt)恰当的制成。此外，由于电极/超声波喇叭25具有与前述的超声波喇叭15相同的功能构造，所以对电极/超声波喇叭25的属性不作特殊描述。在此情况下，属性包括电极/超声波喇叭25的形状。换言之，电极/超声波喇叭25可以是任何构件，只要该构件能够根据核酸提取方法对样品进行超声波处理。甚至通常可以使用通常的超声波探头替代超声波喇叭15。
应注意，本公开内容可以按下列执行方式实现：
(1)用于在同一区室中进行下列步骤的核酸提取方法，步骤包括：
对含有核酸的样品实施超声波处理；
通过使用吸附载体吸附所述样品中包含的物质；和
通过拦截在电泳现象中移动的所述核酸来浓缩所述核酸。
(2)根据执行方式(1)的核酸提取方法，其中使用阳离子交换树脂或沸石作为所述吸附载体。
(3)根据执行方式(2)的核酸提取方法，其中使用强酸性阳离子交换树脂作为所述阳离子交换树脂。
(4)根据执行方式(1)-(3)中的任一项的核酸提取方法，其中所述超声波处理是在将珠状颗粒掺入所述样品中之后进行的。
(5)根据执行方式(1)-(4)中的任一项的核酸提取方法，其中所述物质均为除所述核酸以外的外源物质。
(6)根据执行方式(1)-(5)中的任一项的核酸提取方法，
其中所述对样品实施超声波处理的步骤是在使用缓冲溶液稀释样品后，对样品实施超声波处理的步骤，和
所述缓冲溶液的pH具有在4.0至8.0范围内的值。
(7)根据执行方式(1)-(6)中的任一项的核酸提取方法，其中所述缓冲溶液含有增稠剂。
(8)根据执行方式(1)-(7)中的任一项的核酸提取方法，其中所述增稠剂含有聚乙二醇和/或羟乙基纤维素。
(9)核酸提取筒，包括：
通道，所述通道允许含有核酸的样品导入到所述通道中；
分别位于通道每一端的电极；
拦截部分，其构造将通道分为负极侧区域和正极侧区域，并拦截核酸；
设置在负极侧区域中的吸附载体，其吸附包含在样品中的物质；和
超声波产生部分，其构造为用于对样品进行超声波处理。
(10)根据执行方式(9)的核酸提取筒，其中所述超声波产生部分是作为与所述电极之一相同的构件而构成的。
(11)根据执行方式(9)或(10)的核酸提取筒，其中拦截部分是透析膜或聚合物凝胶。
(12)根据执行方式(9)-(11)中的任一项的核酸提取筒，其中超声波产生部分是超声波探针或超声波喇叭。
实施例
1、验证样品的吸附载体的吸附量
(1-1、沸石的核酸精制能力)
将100mg的质子型沸石放入离心过滤柱(Ultrafree-M，0.45μm)中。然后，调节含有0.5%SDS并具有pH5的50mM MES缓冲液，并向其中加入BSA至0.5%。此外，向其中添加Cy3修饰的20mer寡聚DNA至5μM。在常温下充分搅拌由掺合该蛋白质与核酸获得的混合液体后，将200μl量的液体滴至沸石装填的离心柱上，并充分搅拌。然后，在12,000G进行2分钟的离心处理，使混合液体离心沉降。之后，在Nanodrop水平对沉降的液体进行吸光值测量。根据沸石处理前的吸光度和沸石处理后的吸光度之间的差异，评估核酸精制能力。在蛋白质A280模式下评估BSA吸光度，而在微阵列模式下按Cy3吸光度评估核酸的吸光度。评估结果显示在图4中。
如图4所示，根据从沸石处理前的吸光度至沸石处理后的吸光度的BSA浓度的降低，发现沸石的吸附量约为70%。另一方面，发现对核酸的非特异性吸附量约为45%。基于上述现象，可以证实通过进行沸石处理，即使在混合蛋白质与核酸而获得的混合体系中，也可以提高DNA存在比例(参考图4)。
(1-2、通过强酸性阳离子交换树脂的核酸精制能力)
将100mg的强酸性阳离子交换树脂(Nuvia S，由Bio Rad公司生产)放入离心过滤柱(Ultrafree-M，0.45μm)中。然后，调节具有pH5的50mM MES缓冲液，并向其中加入BSA至0.5%。此外，向其中添加Cy3修饰的20mer寡聚DNA至5μM。在常温下充分搅拌由掺合该蛋白质与核酸获得的混合液体后，将200μl量的液体滴至强酸性阳离子交换树脂装填的离心柱上，并充分搅拌。然后，在12,000G进行2分钟的离心处理，使混合液体离心沉降。之后，在Nanodrop水平对沉降的液体进行吸光值测量。根据强酸性阳离子交换树脂处理前的吸光度和强酸性阳离子交换树脂处理后的吸光度之间的差异，评估核酸精制能力。在蛋白质A280模式下评估BSA吸光度，而在微阵列模式下按Cy3吸光度评估核酸的吸光度。评估结果显示在图5中。
如图5所示，根据从强酸性阳离子交换树脂处理前的吸光度至强酸性阳离子交换树脂处理后的吸光度的BSA浓度的降低，发现强酸性阳离子交换树脂的吸附量约为85%。另一方面，发现对核酸的非特异性吸附量约为28%。基于上述现象，可以证实通过进行强酸性阳离子交换树脂处理，即使在混合蛋白质与核酸而获得的混合体系中，也可以提高DNA存在比例(参考图5)。
2、LAMP反应和RT-LAMP反应
(第一个实施例)
<超声波处理>
向EDTA抽血的牛全血中添加双歧杆菌，使得达到1,000细菌/μL的浓度。然后，将总量1mL的双歧杆菌与血液注射到容量为2mL的聚丙烯管中。之后，浸入超声波喇叭，在40kHz的振动频率进行破碎处理2分钟。
<吸附处理>
然后，将100mg的质子型沸石放入离心过滤柱(Ultrafree-M，0.45μm)中。然后，在常温下充分搅拌由掺合蛋白质与核酸获得的混合液体后，将200μl量的液体滴至沸石装填的离心柱上，并充分搅拌。
<电泳>
然后，在核酸提取筒1的电极12和13之间施加20分钟的100V DC电压，从而对样品进行电泳。
<LAMP反应>
之后，将样品、酶、荧光异硫氰酸盐、核酸单体、缓冲液、用于靶核酸链式扩增的引物对和用于实时测量的探针彼此组合，制备LAMP-反应液。使用由美国公司Bio Rad制造的热循环仪Chromo4作为能够进行实时测量的循环仪，测量LAMP反应。使用的探针是QP探针，QP探针是淬灭探针，使得可以观察到核酸的扩增和荧光强度的减少。关于称为J-bio21的QP探针的更多信息，参考标注日期为2011年7月19日的日本网站http://www.j-bio21.co.jp/tech/qpmethod.htm，具有标题“QP方法”。
(结果)
图6是显示从预处理过程中提取的结果的示意图，作为LAMP反应的评估结果。图中标注为“超声波”的结果是在样品完成了只使用超声波破碎处理的情况下，靶核酸链式扩增量的实时测量结果。此外，图中标注为“超声波+沸石”的结果是样品完成了使用超声波破碎处理和使用吸附处理的情况下，靶核酸链式扩增量的实时测量结果。在此基础上，图中标注为“超声波+沸石+电泳浓缩”的结果是样品完成了使用超声波破碎处理、使用吸附处理和电泳浓缩处理的情况下，靶核酸链式扩增量的实时测量结果。
如图6所示，只完成了超声波破碎处理的样品没有检测到核酸的扩增反应。另一方面，在完成了沸石处理的样品的情况下，可以验证荧光淬灭。此外，在样品完成了超声波破碎处理、沸石处理和电泳浓缩处理的情况下，可以验证淬灭开始的时间提前这一事实。换言之，很明显沸石处理消除了反应干扰物质和外源性物质，电泳处理允许浓缩靶核酸。
本公开内容提供的核酸提取方法允许简单地操作，并且能够在短时间内高效的从样品中提取核酸。因此，所述核酸提取方法可用于核酸扩增反应的核酸提取处理，其中所述核酸扩增反应可以是根据PCR(聚合酶链式反应)方法或LAMP(环介导等温扩增)方法。此外，所述核酸提取方法还可以适用于从只含有少量或非常低浓度的核酸的样品中检测核酸。
本公开内容包括涉及在2011年7月20日提交的日本优先权专利申请JP 2011-158991中公开的主题，其通过引用整合到本文中。
本领域技术人员应该理解，只要设计要求和其他因素落入所附权利要求或其等价形式的范围内，就可以根据其产生各种修饰、组合、亚组合和改变。

Claims (12)

1.用于在同一区室中执行下列步骤的核酸提取方法，所述步骤包括：
对含有核酸的样品实施超声波处理；
通过使用吸附载体吸附所述样品中包含的物质；以及
通过拦截在电泳现象中移动的所述核酸来浓缩所述核酸。
2.根据权利要求1的核酸提取方法，其中使用阳离子交换树脂或沸石作为所述吸附载体。
3.根据权利要求2的核酸提取方法，其中使用强酸性阳离子交换树脂作为所述阳离子交换树脂。
4.根据权利要求3的核酸提取方法，其中所述超声波处理是在将珠状颗粒掺入所述样品中之后进行的。
5.根据权利要求4的核酸提取方法，其中所述物质均为除所述核酸以外的外源物质。
6.根据权利要求5的核酸提取方法，其中所述对所述样品实施所述超声波处理的步骤是在使用缓冲溶液稀释所述样品后，对所述样品实施所述超声波处理的步骤，和
所述缓冲溶液的pH具有在4.0至8.0范围内的值。
7.根据权利要求6的核酸提取方法，其中所述缓冲溶液含有增稠剂。
8.根据权利要求7的核酸提取方法，其中所述增稠剂含有聚乙二醇和/或羟乙基纤维素。
9.核酸提取筒，包括：
通道，所述通道允许含有核酸的样品导入到所述通道中；
分别位于所述通道每一端的电极；
拦截部分，其构造将所述通道分为负极侧区域和正极侧区域，并拦截所述核酸；
设置在所述负极侧区域中的吸附载体，其吸附包含在所述样品中的物质；和
超声波产生部分，其构造为用于对所述样品进行超声波处理。
10.根据权利要求9的核酸提取筒，其中所述超声波产生部分是作为与所述电极之一相同的构件而构成的。
11.根据权利要求10的核酸提取筒，其中所述拦截部分是透析膜或聚合物凝胶。
12.根据权利要求11的核酸提取筒，其中所述超声波产生部分是超声波探针或超声波喇叭。
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