JP3023469B2 - 糖タンパク質３９遺伝子 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なムチン糖タンパク
質３９遺伝子に関し、更に詳細には腫瘍マーカー、免疫
異常マーカーあるいは各種炎症性疾患マーカーとして有
用なヒト由来のムチン糖タンパク質３９のコアタンパク
質をコードする塩基配列を含有する遺伝子に関する。

【０００２】

【従来の技術】一般に癌化した細胞の細胞膜には正常な
細胞とは異なる糖タンパク質や糖脂質などの複合糖質が
存在することが知られている。またガンを診断するに際
し、癌患者において特異的に産生されるタンパク抗原や
糖鎖抗原を測定する方法が行なわれている。その例とし
ては、癌胎児抗原(CEA) 、α−フェトプロテイン、CA19
−９などの測定による消化器系癌の診断等が知られてい
る〔村松喬，日本臨床，44, p.337-344(1986) ；神奈木
玲児，臨床病理，35, p.1247-1264(1986) ；医学のあゆ
み，106巻，５号，第５土曜特集，235〜250頁（1978
年）〕。

【０００３】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
各種癌抗原測定を利用するガンの診断法は適用できる癌
の種類が比較的限られていたり、健常人や肝炎等の他疾
患との交差反応がおこるなどの問題点があり、より広範
な種類の癌に適用できる診断法又は特異性の高い診断法
が望まれている。また、種々の免疫異常応答に基づく疾
病や各種炎症性疾患においても適確な診断法が望まれて
いる。そして、かかる疾患の診断に利用出来る腫瘍マー
カー、免疫異常マーカーあるいは各種炎症性疾患マーカ
ーとなり得る新たな糖タンパク質及びそのコアタンパク
質をコードする遺伝子の開発が切望されている。

【０００４】一方、近年、各種癌組織等において発現し
ているムチンの糖鎖およびコアタンパク質の構造解析が
進展し、癌をはじめとする各種疾患との関連性が注目さ
れてきている〔Bhavanandan, V. P., Glycobiology, 1,
493-503(1991)〕。

【０００５】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、上
記課題を解決する目的でヒト胃癌細胞表面に発現する糖
タンパク質に着目して研究をしてきたところ、腫瘍、免
疫異常あるいは各種炎症性疾患の診断への応用が期待さ
れる新規ムチン糖タンパク質３９のコアタンパク質をコ
ードする遺伝子を見出し、これが乳癌や膵癌において見
出されたポリモルフィック エピセリアル ムチン（Ｐ
ＥＭ）と高いホモロジーを示すが、明らかに異なる新し
いムチンであることを明らかにし、本発明を完成した。

【０００６】すなわち、本発明は配列番号：１で示され
るアミノ酸配列をコードする塩基配列と配列番号：２で
示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列とを含有す
る糖タンパク質３９遺伝子を提供するものである。ま
た、本発明は当該糖タンパク質３９遺伝子を発現するベ
クター、当該発現ベクターで形質転換された宿主細胞、
当該糖タンパク質３９遺伝子によってコードされる組換
えタンパク質、当該組換えタンパク質の製造方法、当該
組換えタンパク質に対するモノクローナル抗体又はポリ
クローナル抗体、及び当該糖タンパク質３９遺伝子検出
用プローブを提供するものである。

【０００７】本発明遺伝子は、例えば配列番号：１で示
されるアミノ酸配列をコードする塩基配列と配列番号：
２で示されるアミノ酸配列をコードする塩基配列、これ
らの塩基配列に相補的な塩基配列、又はそれらの両者を
含有するものである。なお、配列表において、塩基配列
の下段は上段の塩基配列より推定されるアミノ酸配列で
ある。

【０００８】本発明の糖タンパク質３９遺伝子は、例え
ば以下のようにして調製される。すなわち、まず糖タン
パク質３９を発現している細胞より全RNA を分離し、こ
れよりmRNAを精製し、常法によりcDNAを合成したのちこ
れを発現ベクターに組込んだライブラリーを構築する。
次いで抗糖タンパク質３９抗体を用いてこのcDNAライブ
ラリーより糖タンパク質３９遺伝子を有するクローンを
選択し、本発明の糖タンパク質３９遺伝子を得る。次に
上記本発明遺伝子の製法につき、詳細に説明する。

【０００９】〔１〕cDNAライブラリーの構築 全RNA の抽出に用いられる組織細胞としてはヒト胃癌組
織又は既にセルラインとして確立された細胞株、例えば
胃癌細胞株KATO-III〔Sekiguchi M., Sakakibara K. an
d Fujii G. (1978). Jpn. J. Exp. Med., 48, p.61-6
8〕が挙げられる。

【００１０】RNA の抽出は、グアニジン−イソチオシア
ネート混合液又は適当な界面活性剤、例えばSDS, NP-4
0、トリトンX-100 、デオキシコール酸等を用いて、或
いはホモジナイザーを用いる方法や凍結融解等の物理的
方法によって、細胞を部分的又は完全に破壊、可溶化し
た後、染色体DNA を、ポリトロン等のミキサーもしくは
注射筒を用い、ある程度せん断し、その後、蛋白質と核
酸分画とを分別する操作により行なわれる。この操作に
は、特にフェノール・クロロホルム抽出もしくは超遠心
を用いるCsCl重層法〔Chirgwin, J. M., et al.，Bioch
emistry, 18, p.5294(1979)〕等が一般に用いられる。

【００１１】また上記各方法においては、RNase による
RNA の分解を防ぐために、RNase インヒビター、例えば
ヘパリン、ポリビニル硫酸、ジエチルピロカーボネー
ト、パナジウム複合体、ベントナイト、マカロイド等を
添加しておくのがよい。

【００１２】上記抽出操作に従って得られるRNA からの
mRNAの分離、精製は、抽出物を例えばオリゴdT−セルロ
ース（Colaborative Research Inc.）、ポリＵ−セファ
ロース（ファルマシア社）等の吸着カラムを用いる方法
により又はバッチ法により実施できる。

【００１３】上記により得られる精製mRNAは、通常不安
定であり、安定な相補DNA(cDNA) の型に代えられ、目的
遺伝子の増幅を可能とするために微生物由来のベクター
に接続される。インビトロでの、上記mRNAのcDNAへの変
換、即ちcDNAの合成は、一般に次のようにして行なうこ
とができる。

【００１４】即ち、まずオリゴdTをプライマーとし（こ
のプライマーは遊離のオリゴdTもしくは既にベクタープ
ライマーに付加されたオリゴdTのいずれでもよい）、mR
NAを鋳型としてdNTP（dATP, dGTP, dCTP又はdTTP）の存
在下で、逆転写酵素を用いてmRNAに相補的な一本鎖cDNA
を合成する。次のステップは、上記において遊離のオリ
ゴdTを用いたか、ベクタープライマーに付加されたオリ
ゴdTを用いたかにより、各々以下の如く異なる。

【００１５】前者の場合、鋳型としたmRNAをアルカリ処
理等により分解して除去し、その後一本鎖DNA を鋳型と
して逆転写酵素又はDNA ポリメラーゼを用いて二本鎖DN
A を作成する。次に得られる二本鎖DNA の両端をエキソ
ヌクレアーゼで処理し、そのそれぞれに適当なリンカー
DNA 又はアニーリング可能な組合せの塩基を複数付加
し、これを適当なベクターへ組込む。これは使用するベ
クターに応じ公知の方法、例えばヤングらの方法〔Youn
g, R. A. et al., in " DNA Cloning, Vol. 1" ,p.49(1
985) 〕、あるいはグブラーとホフマンの方法〔Gubler,
U. and Hoffman, B. J. Gene, 25, p.263(1983) 〕 な
どを使用して行われる。また、上記cDNAの合成には市販
のcDNA合成キットを用いれば容易に行うことができる。

【００１６】ベクターは、特に制限はされないが、λgt
系のファージベクターやプラスミドベクター等を宿主に
応じて適当に選択し、あるいは組合せて使用できる。こ
こで用いられるベクターとしてはλgt１０、λgt１１等
を例示でき、λgt１０、λgt１１をベクターとして用い
る方法は前記ヤングらの方法に準じて行うことができる
。

【００１７】λgt系のファージベクターに組込んだcDNA
組換え体はインビトロパッケージング液と反応させるこ
とによりcDNA組換え体ファージとなり、λgt１０又はλ
gt１１のcDNAライブラリーが構築される。上記のλgt系
ファージライブラリーの作成は市販のλgt１０又はλgt
１１cDNAクローニングキットを用いれば容易に行うこと
ができる。

【００１８】また、後者の場合、鋳型としてmRNAを残存
させたまま、上記と同様のリンカーを付加した開環状プ
ラスミドと、リンカーDNA(しばしば動物細胞で自立複製
できる領域とmRNAの転写プロモーター領域を含むDNA 断
片が用い得る) とを、アニーリングさせて閉環状とした
後、dTNP存在下で、RNase とDNA ポリメラーゼを共存さ
せてmRNAをDNA 鎖に置換し、完全なプラスミドDNA を作
成できる。

【００１９】上記の如くして得られるcDNA組換え体プラ
スミドを宿主微生物に導入し、該微生物を形質転換す
る。宿主微生物としては、大腸菌（Escherichia coli）
が代表的であるが、特にこれに限定されず、その他に枯
草菌（Bacillus subtilis）、酵母（Saccharomyces cer
visiae）等も使用することができる。

【００２０】DNA の宿主微生物への導入及びこれによる
形質転換の方法としては、一般に用いられている方法、
例えば主として対数増殖期にある細胞を集め、CaCl₂ 処
理して自然にDNA を取り込みやすい状態にして、プラス
ミドを取り込ませる方法等を採用できる。上記方法にお
いては、通常知られているように形質転換の効率を一層
向上させるためにMgCl₂ やRbClを更に共存させることも
できる。また、微生物細胞をスフェロプラスト又はプロ
トプラスト化してから形質転換させる方法も採用するこ
とができる。

【００２１】〔２〕糖タンパク質３９遺伝子クローンの
選択 上記により得られる形質転換株から、本発明糖タンパク
質３９のコアタンパク質をコードするcDNAを含有する株
を選出する方法としては、例えば以下に示す各種方法を
採用できる。

【００２２】(1) 本発明糖タンパク質３９を含むレクチ
ン結合糖タンパク質のコアタンパク質に対する抗体を用
いて選出する方法 予め、cDNAを形質転換株内でタンパク質を発現し得るベ
クターに組込み、形質転換株内でタンパク質を産生さ
せ、本発明糖タンパク質３９を含むレクチン結合糖タン
パク質のコアタンパク質に対する抗体及び該抗体に対す
る第２抗体を用いて、本発明糖タンパク質３９を含むレ
クチン結合糖タンパク質のポリペプチド産生株を検出
し、目的株を得る。

【００２３】(2) 動物細胞で本発明糖タンパク質３９の
ポリペプチドを産生させてスクリーニングする方法 形質転換株を培養し、遺伝子を増殖させ、その遺伝子を
動物細胞にトランスフェクトし（この場合、自己複製可
能でmRNA転写プロモーター領域を含むプラスミド若しく
は動物細胞染色体にインテグレートするようなプラスミ
ドのいずれでもよい）、遺伝子にコードされたタンパク
質を産生させ、本発明糖タンパク質３９を含むレクチン
結合糖タンパク質のコアタンパク質に対する抗体を用い
て本発明糖タンパク質３９を含むレクチン結合糖タンパ
ク質のポリペプチドを検出することにより、元の形質転
換株より目的の本発明糖タンパク質３９のポリペプチド
部分をコードするcDNAを有する株を選出する。

【００２４】(3) セレクティブ・ハイブリダイゼーショ
ン・トランスレーションの系を用いる方法 形質転換株から得られるcDNAを、ニトロセルロースフィ
ルター等にブロットし、本発明糖タンパク質３９を含む
レクチン結合糖タンパク質のポリペプチド産生細胞から
のmRNAをハイブリダイゼーションさせた後、cDNAに対応
するmRNAを回収する。回収されたmRNAを蛋白翻訳系、例
えばアフリカツメガエルの卵母細胞への注入や、ウサギ
網状赤血球ライゼートや小麦胚芽等の無細胞系で蛋白質
に翻訳させ、本発明糖タンパク質３９を含むレクチン結
合糖タンパク質のコアタンパク質に対する抗体を用いて
検出して、目的の株を得る。

【００２５】なお、上記方法において用いられる本発明
糖タンパク質３９を含むレクチン結合糖タンパク質のコ
アタンパク質に対する抗体は、公知の方法により作成す
ることができる。

【００２６】即ち、まず本発明糖タンパク質３９を発現
している組織細胞の細胞膜を界面活性剤を用いて可溶化
し、これを糖タンパク質３９が結合しうるレクチン結合
アガロースカラムに吸着させて、レクチン結合糖タンパ
ク質を調製する。

【００２７】各種組織細胞の細胞膜可溶化画分分離手段
としては、例えばヒト癌組織、ヒト細胞を適当な緩衝液
中で破砕後、100,000×gの高速遠心分離に付し、その残
渣をトリトン系界面活性剤に溶解し、これを再度100,00
0×gの高速遠心分離に付し、その上清を採取する方法が
挙げられる。

【００２８】得られた細胞膜可溶化画分より本発明糖タ
ンパク質３９を含むレクチン結合糖タンパク質を分離す
るために用いられるレクチンとしては、例えばピーナッ
ツ豆レクチン（Peanut agglutinin, PNA）が挙げられ、
かかるレクチンは市販されているものを用いてもよい
し、例えばピーナッツ豆より自体公知の手段により抽出
分離したものを用いてもよい。レクチン結合アガロース
は市販されているものを用いてもよいし、通常の手段に
よりアガロースゲルにカップリングさせて得ることもで
きる。

【００２９】レクチン結合糖タンパク質の溶出には、ハ
プテン糖、例えばラクトース溶液等が用いられる。ここ
で用いる溶出液の濃度は0.05〜0.2Mが好ましい。

【００３０】次に、本発明糖タンパク質３９を含むレク
チン結合糖タンパク質をトリフルオロメタンスルホン酸
（TFMS）またはフッ化水素で処理して糖鎖を除去した
後、これを完全アジュバントと共にウサギ等の小動物に
免疫し、さらに適当な間隔をおいて数回不完全アジュバ
ントと共に免疫した後抗血清を採取する。次に大腸菌を
熱処理し遠心分離して得られる菌体成分と前述で得られ
た抗血清とを４℃にて混和した後、遠心分離すれば求め
るポリクローナル抗体を得ることができる。

【００３１】上記において得られた本発明遺伝子クロー
ンは、常法に従って各種プラスミドにサブクローニング
することができる。例えばEcoRI にて切断して精製した
本発明遺伝子を含むcDNA断片を、同様にEcoRI にて切断
した pUC１８〔Yanisch-Perron, C., et al., Gene, 8
3, p.103-119(1985)〕などのクローニングベクターの切
断部位へ挿入すればよい。これにより所望の組換え体プ
ラスミドを得ることができる。また得られる組換え体プ
ラスミドの宿主への導入及びこれによる組換え体プラス
ミドの増幅と個別化は、一般に用いられている各種の方
法、例えば主として対数増殖期にある細胞を集め、CaCl
₂ 処理により自然にDNA を取り込みやすい状態とし、こ
れをにベクターを取り込ませる方法等により行い得る。

【００３２】なお、上記において採用される各種の操
作、例えば一部DNA の化学合成、DNA鎖の切断、削除、
付加ないし結合を目的とする酵素処理、DNA の単離、精
製、複製、選択等はいずれも常法に従うことができる。
より具体的には、上記DNA の単離精製は、アガロースゲ
ル電気泳動等により行うことができる。

【００３３】また、上記で得られる本発明遺伝子の塩基
配列の決定は、適当な制限酵素でDNA を消化した後、ジ
デオキシ法〔Sanger, et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 74, p.5463(1977)〕 やマキサム−ギルバート法
〔A. M. Maxam and W. Gilbert, Methods in Enzymolog
y, 65, p.499(1980)〕等により行い得る。更に上記塩基
配列の決定は、市販のシークエンスキット等を用いるこ
とによっても容易に行い得る。

【００３４】かくして得られた本発明糖タンパク質３９
遺伝子の塩基配列の一部及び対応するアミノ酸配列を配
列番号１及び配列番号２に示す。塩基の番号は５′末端
を１とし、５′末端から３′末端方向につけられてい
る。アミノ酸残基の番号はＮ末端からＣ末端方向へつけ
られており、最初にコードされるアミノ酸を１としてい
る。配列番号１は配列を決定できた糖タンパク質３９遺
伝子の翻訳領域のうち、最も５′末端に位置する180塩
基の長さの翻訳領域で、60個のアミノ酸のタンパク質部
分に相当する。この配列はPEM遺伝子と類似の60塩基（2
0アミノ酸残基）を１単位とするくり返し配列（tandem
repeats）領域と考えられ、くり返し数には個体差があ
ると思われる。また、配列番号２に示される糖タンパク
質３９遺伝子の翻訳領域は981塩基の長さで、327個のア
ミノ酸のタンパク質部分に相当する。配列番号１の配列
は塩基配列で３′側（アミノ酸配列でＣ末端側）にさら
にくり返し配列がつながり、これに配列番号２が接続す
る。

【００３５】得られた本発明遺伝子の利用によれば、従
来公知の一般的な遺伝子組換え技術により〔Science, 2
24, p.1431(1984); Biochem. Biophys. Res. Comm., 13
0, p.692(1985); Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80,
p.5990(1983); EP特許公開第187991号公報等参照〕 、
糖タンパク質３９のコアタンパク質を容易に且つ大量に
製造、取得することができる。また、このようにして得
られる糖タンパク質３９のコアタンパク質を用い、糖タ
ンパク質３９のコアタンパク質に特異的な抗体を作成す
ることができる。抗体は通常のポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体の製造法に従い製造されるが、糖タン
パク質３９のコアタンパク質複合体に対するポリクロー
ナル抗体からワインバーガー(Weinberger)らの方法〔Si
ence, 228,p.740-742(1985)〕に従いエピトープ特異的
抗体を得ることも可能である。抗体は糖タンパク質３９
及びそのコアタンパク質の精製、測定、識別等に用いら
れる。

【００３６】また、上記の如くして得られる糖タンパク
質３９のコアタンパク質には、配列表に示すアミノ酸配
列のＮ末端にメチオニンが結合したポリペプチド、及び
上記アミノ酸配列のＮ末端に糖タンパク質３９のための
シグナルペプチドの部分もしくは全部が結合、又は欠損
した中間体も包含される。かかる変異は天然に、例えば
翻訳後の修飾により得られ、あるいは遺伝子工学的手法
においては、天然から得た遺伝子を例えばサイトスペシ
フィック・ミュータゲネシス等の方法により改変した
り、ホスファイトトリエステル法等の化学合成法により
変異したDNA を合成したり、或いは両者を組合せて、遺
伝子を合成できる。これらの遺伝子を利用し、これを微
生物のベクターに組込み、形質転換された微生物から産
生させることにより、変異を有するコンポーネントを得
ることができる。又、これらのタンパク質は、その機能
を保ったまま、天然或いは人口の変異により、その一部
のアミノ酸の置換や配列の改変を行うことができる。従
って、本発明の糖タンパク質３９遺伝子は、上記の各種
変異を有する蛋白質をコードする遺伝子も包含する。遺
伝暗号の末端にはTAG 、TAA 等の終止コドンを付加する
ことができる。遺伝暗号は上記配列番号１及び２に例示
されたコドンに限られず、アミノ酸配列を変えることな
く各アミノ酸に対し任意のコドンを選択でき、例えば遺
伝子組換えに利用する宿主のコドン使用頻度等を考慮し
た常法に従えばよい〔Nucl. Acids. Res., ９, p.43-74
(1981)〕。

【００３７】

【発明の効果】本発明糖タンパク質３９遺伝子を用いれ
ば糖タンパク質３９のコアタンパク質を容易に且つ大量
に製造することができる。本発明の糖タンパク質３９
は、ヒト癌組織、特に胃癌、大腸癌、膵癌、肝癌、食道
癌、肺癌などに発現が認められる一方、胃、結腸、肺な
ど分泌性正常組織に発現していることより、腫瘍マーカ
ー、免疫異常マーカーあるいは各種炎症性疾患マーカー
としての応用が期待される。

【００３８】

【実施例】次に実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明
する。

【００３９】実施例１ 本発明糖タンパク質３９の調製：胃癌細胞KATO-III ２
ｇを氷冷下CaCl₂およびMgCl₂添加PBS [PBS（＋）] 中で
細断し、これをPotter-Elvehjem 型のホモジナイザーに
てホモジナイズした。

【００４０】この破砕液を４℃にて１時間高速遠心(10
5,000×g)し、その上清を除去したペレットに２％トリ
トンX−100 、0.15M NaCl、0.01Mトリス−HCl (pH7.6)
及び50μg／mlのプロテアーゼ阻害剤であるPMSF（フェ
ニルメチルスルホニルフルオライド）（シグマ社）を含
む溶液60mlを加え、さらにこれをホモジナイズしたのち
４℃にて30分放置し、細胞膜を可溶化した。これを４℃
にて１時間高速遠心(105,000×g)し、該上清を得た。

【００４１】該上清を市販のPNA 結合アガロースカラム
（E.Y ラボラトリーズ社製）に添加し、PNA 結合糖タン
パク質を吸着させた。

【００４２】該カラムを0.1 ％トリトンX-100、0.15M N
aCl及び0.01Mトリス-HClを含む洗浄液(pH7.6)200mlにて
洗浄した。その後PNA 結合糖タンパク質を0.05M ラクト
ース溶液50mlにて溶出させた。

【００４３】溶出液中のPNA 結合糖タンパク質のタンパ
ク濃度はローリー法にて測定し、総量で３mg（タンパク
含量）のPNA 結合糖タンパク質を得た。

【００４４】実施例２ (1) PNA 結合糖タンパク質の糖鎖除去：PNA 結合糖タン
パク質２mgを凍結乾燥後、トリフルオロメタンスルホン
酸（TFMS）−アニソール（２：１）溶液１mlを加えて溶
解した。反応液中に窒素ガスを通気して置換したのち25
℃で５時間撹拌し、糖鎖を分解した。反応終了後、２倍
量のジエチルエーテルを加えて混和したのち、−80℃に
１時間放置した。次に氷冷した50％ピリジン溶液を等量
加えてボルテックスミキサーで撹拌し、次いでエーテル
層を除去した。さらにエーテルを加えて同様にエーテル
抽出を２回行ったのち、２mMピリジン−酢酸バッファー
（pH 5.5）４lに対して、透析した。

【００４５】(2) PNA 結合糖タンパク質のコアタンパク
質に対するポリクローナル抗体の作成：(1)で調製した
糖鎖除去PNA 結合糖タンパク質のPBS（−）溶液（タン
パク質濃度 800μg/ml）0.5ml とフロインドの完全アジ
ュバント0.5ml を混和して調製した懸濁液をニュージー
ランドホワイト種の雄ウサギの足跂に皮下接種した。そ
の後２週間おきに３回、上記フロインドの不完全アジュ
バントとPNA 結合糖タンパク質の懸濁液を足跂又は背に
皮下接種して免疫した。最終免疫後10日目にウサギの耳
静脈より採血し、完全に凝血させた後４℃で20分間高速
遠心（150,000rpm）を２回くり返して上清を回収し、抗
血清を得た。

【００４６】(3) 抗体の吸収処理：後記実施例３(2)で
示す、本発明糖タンパク質３９のコアタンパク質をコー
ドする組換え体ファージクローン分離のためのスクリー
ニングに用いる抗体は、大腸菌菌体成分と交差反応しな
いことが望まれる。そこで、予めスクリーニングに用い
る抗体を大腸菌(E. coli Y1090) 菌体成分と反応させ、
これと交差する抗体を除去した。

【００４７】E. coli Y1090 株をLB培地 〔Molecular C
loning (A Laboratory Manual); T.Maniatis, E. F. Fr
itsch, J. Sambrook; Cold Spring Harbor Laboratory
(1982), p.68〕 500ml 中で37℃にて一夜培養し、5000r
pm 、10分間の遠心で菌体を集めた。これを20mlの蒸留
水に懸濁して100 ℃で５〜10分間加熱処理した。更に、
10,000rpm で10分間遠心したのち上清を分離した。次
に、実施例２(2) で作成した抗血清をPBS（−）で50倍
希釈した溶液100mlに、この上清１mlを加えて混和し、
４℃で２時間放置したのち、10,000rpm で15分間遠心
し、その上清を分離して本発明糖タンパク質３９のコア
タンパク質に対する抗体を得た。

【００４８】実施例３ (1) 胃癌細胞株KATO-IIIのcDNAライブラリー作成：胃癌
細胞株KATO-IIIを、RPMI-1640 培地に10％の割合で牛胎
仔血清を加えた培地で５％のCO₂ ガス通気下37℃にて継
代培養した。得られた胃癌細胞株KATO-III１gからグア
ニジウムイソチオシアネート法 〔Molecular Cloning
(A Laboratory Manual); T. Maniatis, E. F. Fritsch,
J. Sambrook; Cold Spring Harbor Laboratory (198
2), p.196〕に従って全RNA ３mgを抽出し、これをオリ
ゴ（dT）セルロースカラム（Colaborative Research In
c., カラム容量１ml）を用いてポリ(A)⁺RNA200μg を得
た。以下アマシャム社のcDNA合成システムのプロトコー
ルに従い、２本鎖のcDNAを合成した。即ち、該当ポリ
(A)⁺RNA ５μgに逆転写酵素（アマシャム社）を作用さ
せて第一DNA 鎖を合成した。次に大腸菌リボヌクレアー
ゼH(RNase H)及び大腸菌DNA ポリメラーゼＩ（共にアマ
シャム社）を作用させ、RNA を消化しながら第一DNA 鎖
を鋳型として第二DNA 鎖を合成し、T4DNA ポリメラーゼ
のエキソヌクレアーゼ活性を利用して平滑末端を有する
二本鎖cDNA（ds-cDNA）を合成した。

【００４９】上記により得られたds-cDNA をさらにアマ
シャム社のcDNA・クローニングシステムλgt11を使って
発現ベクターλgt11にクローニングした。即ちds-cDNA
にEcoRI メチラーゼ（アマシャム社）を作用させ、ds-c
DNA の内部にある制限酵素EcoRI の認識部位をメチル基
により保護し、次にT4DNA リガーゼ（アマシャム社）に
より合成EcoRIリンカー（アマシャム社）を両末端に接
続し、最後にこれに制限酵素EcoRI（アマシャム社）を
作用させて両端を付着末端とした。

【００５０】このds-cDNA とλgt11アーム（アマシャム
社）をT4DNA リガーゼ（アマシャム社）により結合さ
せ、組換えDNA を作成した。これにインビトロパッケー
ジング液（アマシャム社）を作用させてcDNAライブラリ
ーを作成した。

【００５１】(2) 本発明糖タンパク質３９をコードする
組換え体ファージクローンの分離：(1)で得られたλgt1
1cDNAライブラリーとE. coli Y1090を37℃にて20分間イ
ンキュベートし、組換え体ファージを宿主菌であるY109
0 に吸着させた後、溶解した上層軟寒天と混合して寒天
平板上にまきひろげた。上層寒天固化後寒天平板を42℃
で４〜８時間培養し、プラークを形成させた。次いで10
mMイソプロピル-1-チオ-β-D- ガラクトシド (IPTG) で
飽和させ、乾燥させたニトロセルロースフィルターを寒
天平板表面に置き37℃にて２時間インキュベートして、
β−ガラクトシダーゼ融合タンパク質を発現させた。

【００５２】その後これを４℃にて１時間以上冷却した
後フィルターをはがした。このフィルターを室温で１時
間ブロッキング溶液（２％馬ヘモグロビン、0.1 ％ Twe
en20、PBS（−））に浸した後、該ブロッキング溶液中
で実施例２(3)で吸収処理した本発明糖タンパク質３９
のコアタンパク質に対する抗体50μg/mlと反応させ、室
温にて２時間インキュベートさせた。該フィルターを0.
1％ Tween20を含むPBS（−）で５回洗浄後、このフィル
ターをホースラディッシュパーオキシダーゼ（HRP）標
識抗ウサギIgG抗体（Cappel社製）ブロッキング溶液（2
00倍希釈液）中で室温にて２時間反応させ、該反応終了
後、上記の洗浄液で５回洗浄した。次いで過酸化水素含
有４−クロロ−１−ナフトール溶液で発色させて本発明
糖タンパク質３９のコアタンパク質に対応する融合タン
パク質を発現しているクローンを選択した。得られたク
ローンの単一プラークを分離した後、Y1090 を宿主とし
て増殖させSM緩衝液中に懸濁させて４℃で保存した。該
クローンをλKP39と命名した。

【００５３】(3) 本発明糖タンパク質３９をコードする
組換え体ファージの溶原菌作成：Huynh, T. V., Young,
R. A., Davis, R. W. :DNA Coloning Vol.1 A Practic
al Approach, (ed.) Glover, D. M., IRL Press(1985)
p.49-78記載の方法に従ってλKP39をE. coli BNN103に
溶原化させた溶原菌を作成した。

【００５４】(4) 本発明糖タンパク質３９をコードする
組換え体ファージDNAの分離：(2)で得られた本発明糖タ
ンパク質３９をコードする組換え体ファージクローン
（λKP39）をE. coli Y1090 を宿主として増殖させたの
ち、〔Molecular Cloning (A Laboratory Manual); T.
Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook; ColdSpring H
arbor Laboratory (1982) p.371-372〕記載の方法に従
って、本発明組換え体ファージDNA（λKP39 DNA）を調
製した。

【００５５】(5) プラスミドpKP39形質転換株の作成：
λKP39 DNAを制限酵素EcoRI（日本ジーン社製）で消化
し、約1900塩基対のDNA断片を得た。

【００５６】一方、プラスミドベクターpBluescript II
KS（ストラタージーン社製）を同じくEcoRIで消化した
のち、両断片をT4DNAリガーゼ（宝酒造社製）で結合さ
せ、本発明糖タンパク質３９のポリペプチド鎖をコード
する組換え体プラスミドpKP39を得た。

【００５７】得られた組換え体プラスミドpKP39 をE. c
oli JM83のコンピテント細胞に形質導入した。

【００５８】(6) 制限酵素地図の作成：(5)で得られたp
KP39 を 〔Molecular Cloning (A Laboratory Manual);
T. Maniatis, E. F. Fritsch, J. Sambrook; Cold Spr
ing Harbor Laboratory (1982)p.104-106〕 に記載の方
法に従って処理し、さら上記文献p.374-p.381の方法に
従って、本発明糖タンパク質３９をコードするpKP39 ク
ローンの制限酵素地図を作成した（図１）。

【００５９】(7) pKP39 クローンの塩基配列決定：pKP3
9 クローンの塩基配列の決定はサンガー（Sanger）らの
方法 〔Sanger F.,Nicklen S. & Coulson A. R., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 74, p.5463-5467(1977)〕に従
って行なった。

【００６０】以上の結果より得られた糖タンパク質３９
遺伝子の配列は、翻訳領域及び３′側の非翻訳領域を含
めて全体で約1900個の塩基からなる。このうち、５′末
端より約600塩基は60塩基を１単位とするくり返し配列
領域である。この領域を含めて翻訳領域は約1560塩基の
長さで、約553個のアミノ酸のタンパク質部分をコード
することが判明した。しかし、くり返し配列領域の配列
は、180塩基（60アミノ酸残基をコードし得る）を決定
できた（配列番号１）が、その他のくり返し配列は未決
定である。くり返し配列より下線の1320塩基の配列は決
定し、配列番号２に示した。

【００６１】実施例４ (1) 全RNA及びポリ(A)⁺RNAの調製 実施例３−(1)に示したグアニジウムイソチオシアネー
ト法に従って胃癌細胞株KATO-IIIより全RNA を抽出し、
また市販のオリゴ（dT）セルロースカラム（Colaborati
ve Research Inc.）を用いてポリ(A)⁺RNA を調製した
（前記MolecularCloning p.196-198 参照）。

【００６２】(2) ノーザンブロッティング (1)で調製した全RNA20μg又はポリ(A)⁺RNA10μgを前記M
olecular Cloning (p.200〜201)の方法に従って、グリ
オキサール存在下、50℃にて１時間加温して変性させた
後、10mMリン酸ナトリウム溶液を含む１％アガロースゲ
ルにて90V で３〜４時間電気泳動を行なった。次に分離
したRNAを20×SSC中でニトロセルロースフィルター（シ
ュライアーアンドシェル社）へ15時間かけて転写させ
た。RNA 転写後のニトロセルロースフィルターを室温で
乾燥後80℃で２時間ベーキングして固定し、その後20mM
トリス塩酸バッファー（pH 8.0）中、100 ℃にて５分間
加熱してグリオキサールを除去した。このフィルターを
実施例３−(7) に記したプレハイブリダイゼーション溶
液中で42℃にて３時間振とうした後、α−³²P-dCTP標識
プローブを含むハイブリダイゼーション溶液（組成はプ
ローブ以外プレハイブリダイゼーション溶液と同じ）中
に移して42℃にて20時間振とうした。プローブはpKP39
クローン中cDNAを制限酵素EcoRIで切断した断片をマル
チプライムDNAラベリングシステム（アマシャム社）を
用いてα−³²P-dCTPにて標識したものを0.5〜１×10⁷cp
m/mlの濃度で使用した。ハイブリーダイゼーション終了
後、フィルターを２×SSC-0.1％SDS 溶液に移して室温
で１０分間ずつ３回洗浄し、更に0.1×SSC-0.1％SDS 溶
液中で60℃にて30分間ずつ３回洗浄した後室温で乾燥し
た。フィルターをろ紙にはりつけてＸ線フィルムカセッ
トに入れ、Ｘ線フィルム（コニカ社XAR-5 ）を重ねて−
70℃で１〜３日間感光させた。

【００６３】得られたノーザンブロッティングの結果を
図２に示す。

【００６４】なお、RNA の分子量マーカーとして28S 及
び18S リボゾームRNA を用いた。その結果、4400塩基長
及び6800塩基長の二本のmRNAが検出された。これは既知
のPEM mRNAと同様にオルターナティブ スプライシング
により生じたものと考えられる。

【００６５】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：180 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ホモサピエンス 細胞の種類：胃印環細胞癌 セルライン：KATO-III 直接の起源 ライブラリー名：λgt11 KATO-III cDNA library クローン名：λKP39 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..180 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：repeat region 存在位置：1..180 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：repeat unit 存在位置：1..60 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGC TCC ACC GCC CCC CCA GCC CAC GGT GTC ACC TCG GCC CCG GAG AGC 48 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Glu Ser 1 5 10 15 AGG CCG GCC CCG GGC TCC ACC GCG CCC GCA GCC CAC GGT GTC ACC TCG 96 Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Ala Ala His Gly Val Thr Ser 20 25 30 GCC CCG GAG AGC AGG CCG GCC CCG GGC TCC ACC GCG CCC GCA GCC CAC 144 Ala Pro Glu Ser Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Ala Ala His 35 40 45 GGT GTC ACC TCG GCC CCG GAC ACC AGG CCG GCC CCG 180 Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro 50 55 60

【００６６】配列番号：2 配列の長さ：1320 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ホモサピエンス 細胞の種類：胃印環細胞癌 セルライン：KATO-III 直接の起源 ライブラリー名：λgt11 KATO-III cDNA library クローン名：λKP39 配列の特徴 特徴を表す記号：mat peptide 存在位置：1..981 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：polyA signal 存在位置：1267..1272 特徴を決定した方法：Ｓ 特徴を表す記号：polyA site 存在位置：1293..1320 特徴を決定した方法：Ｓ 配列 GGC TCC ACC GCC CCC CCA GCC CAC GGT GTC ACC TCG GCC CCG GAC ACC 48 Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr 5 10 15 AGG CCC GCC TTG GGC TCC ACC GCG CCT CCA GTC CAC AAT GTC ACC TCG 96 Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser 20 25 30 GCC TCA GGC TCT GCA TCA GGC TCA GCT TCT ACT CTG GTG CAC AAC GGC 144 Ala Ser Gly Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly 35 40 45 ACC TCT GCC AGG GCT ACC ACA ACC CCA GCC AGC AAG AGC ACT CCA TTC 192 Thr Ser Ala Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe 50 55 60 TCA ATT CCC AGC CAC CAC TCT GAT ACT CCT ACC ACC CTT GCC AGC CAT 240 Ser Ile Pro Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His 65 70 75 80 AGC ACC AAG ACT GAT GCC AGT AGC ACT CAC CAT AGC ACG GTA CCT CCT 288 Ser Thr Lys Thr Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser Thr Val Pro Pro 85 90 95 CTC ACC TCC TCC AAT CAC AGC ACT TCT CCC CAG TTG TCT ACT GGG GTC 336 Leu Thr Ser Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gln Leu Ser Thr Gly Val 100 105 110 TCT TTC TTT TTC CTG TCT TTT CAC ATT TCA AAC CTC CAG TTT AAT TCC 384 Ser Phe Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gln Phe Asn Ser 115 120 125 TCT CTG GAA GAT CCC AGC ACC GAC TAC TAC CAA GAG CTG CAG AGA GAC 432 Ser Leu Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp 130 135 140 ATT TCT GAA ATG TTT TTG CAG ATT TAT AAA CAA GGG GGT TTT CTG GGC 480 Ile Ser Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly 145 150 155 160 CTC TCC AAT ATT AAG TTC AGG CCA GGA TCT GTG GTG GTA CAA TTG ACT 528 Leu Ser Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr 165 170 175 CTG GCC TTC CGA GAA GGT ACC ATC AAT GTC CAC GAC GTG GAG ACA CAG 576 Leu Ala Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln 180 185 190 TTC AAT CAG TAT AAA ACG GAA GCA GCC TCT CGA TAT AAC CTG ACG ATC 624 Phe Asn Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile 195 200 205 TCA GAC GTC AGC GTG AGT GAT GTG CCA TTT CCT TTC TCT GCC CAG TCT 672 Ser Asp Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser 210 215 220 GGG GCT GGG GTG CCA GGC TGG GGC ATC GCG CTG CTG GTG CTG GTC TGT 720 Gly Ala Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys 225 230 235 240 GTT CTG GTT GCG CTG GCC ATT GTC TAT CTC ATT GCC TTG GCT GTC TGT 768 Val Leu Val Ala Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys 245 250 255 CAG TGC CGC CGA AAG AAC TAC GGG CAG CTG GAC ATC TTT CCA GCC CGG 816 Gln Cys Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg 260 265 270 GAT ACC TAC CAT CCT ATG AGC GAG TAC CCC ACC TAC CAC ACC CAT GGG 864 Asp Thr Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly 275 280 285 CGC TAT GTG CCC CCT AGC AGT ACC GAT CGT AGC CCC TAT GAG AAG GTT 912 Arg Tyr Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val 290 295 300 TCT GCA GGT AAT GGT GGC AGC AGC CTC TCT TAC ACA AAC CCA GCA GTG 960 Ser Ala Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val 305 310 315 320 GCA GCC ACT TCT GCC AAC TTG TAGGGGCACG TCGCCCGCTG AGCTGAGTGG 1011 Ala Ala Thr Ser Ala Asn Leu 325 327 CCAGCCAGTG CCATTCCACT CCACTCAGGT TCTTCAGGGC CAGAGCCCCT GCACCCTGTT 1071 TGGGCTGGTG AGCTGGGAGT TCAGGTGGGC TGCTCACACC GTCCTTCAGA GGCCCCACCA 1131 ATTTCTCGGA CACTTCTCAG TGTGTGGAAG CTCATGTGGG CCCCTGAGGC TCATGCCTGG 1191 GAAGTGTTGT GGTGGGGGCT CCCAGGAGGA CTGGCCCAGA GAGCCCTGAG ATAGCGGGGA 1251 TCCTGAACTG GACTGAATAA AACGTGGTCT CCCACTGCGC CAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 1311 AAAAAAAAA 1320

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明糖タンパク質３９のコアタンパク質をコ
ードするcDNAの制限酵素地図及び塩基配列決定方法を示
す。図１中、最上段に示したスケールは、cDNAの１番目
の塩基を基準にしたヌクレオチドの長さ（キロベース）
である。その下段は本発明糖タンパク質３９をコードす
るcDNAクローンpKP39 を示している。該線上左側の破線
部分は20アミノ酸残基を１単位とするくり返し配列をコ
ードする領域を、中央の太い黒線部分はそれにひき続く
コーディング領域を示す。矢印は各DNA断片について決
定した塩基配列の方向と長さを示す。

【図２】実施例４における本発明タンパク質をコードす
るmRNAのノーザンブロッティングを示す図面である。44
00塩基長及び6800塩基長の２本のmRNAが存在する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C07K 14/00 - 16/46 C12N 1/00 - 1/38 C12P 21/00 - 21/08 C12Q 1/00 - 1/70 G01N 33/50 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号：１で示されるアミノ酸配列を
   コードする塩基配列と配列番号：２で示されるアミノ酸
   配列をコードする塩基配列とを含有する糖タンパク質３
   ９遺伝子。
2. 【請求項２】 （ａ）配列番号：１で示される５′末端
   側部分の塩基配列と配列番号：２で示される３′末端側
   部分の塩基配列とを含有するポリヌクレオチド配列、又
   は（ｂ）当該ポリヌクレオチド配列に相補的な塩基配列
   を有する請求項１記載の遺伝子。
3. 【請求項３】 図１の制限酵素地図を有するものである
   請求項１又は２記載の遺伝子。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項記載の遺伝
   子とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、か
   つ腫瘍、免疫異常又は炎症性疾患のマーカーとしての機
   能を有する糖タンパク質をコードする糖タンパク質３９
   遺伝子。
5. 【請求項５】 ヒト遺伝子である請求項１〜４のいずれ
   か１項記載の遺伝子。
6. 【請求項６】 請求項１〜４のいずれか１項記載の遺伝
   子を発現する発現ベクター。
7. 【請求項７】 請求項６記載の発現ベクターで形質転換
   された宿主細胞。
8. 【請求項８】 請求項１〜４のいずれか１項記載の遺伝
   子によってコードされる組換えタンパク質。
9. 【請求項９】 請求項１〜４のいずれか１項記載の遺伝
   子を微生物のベクターに組み込み、形質転換された微生
   物から産生させることを特徴とする請求項８記載の組換
   えタンパク質の製造方法。
10. 【請求項１０】 請求項９記載の組換えタンパク質に対
    するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体。
11. 【請求項１１】 請求項１〜４のいずれか１項記載の遺
    伝子又はこれと結合する塩基配列からなる糖タンパク質
    ３９遺伝子検出用プローブ。