WO2006080192A1 - 癌に特異的な遺伝子及びそれを用いた診断キット - Google Patents

癌に特異的な遺伝子及びそれを用いた診断キット Download PDF

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seq
polynucleotide
primer
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Hideaki Shimada
Takeshi Tomonaga
Kazuyuki Matsushita
Takenori Ochiai
Fumio Nomura
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National University Corporation Chiba University
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
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    • G01N33/57496—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites involving intracellular compounds
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    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
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    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a gene specific for cancer and a diagnostic kit using the same, and further relates to a method using the same.
  • Early detection of carcinoma is the most important issue as a countermeasure against cancer.
  • early detection is more important because cancer that has developed in the upper part of the large intestine has few subjective symptoms and has a high risk of progression.
  • screening for colorectal cancer has been mainly performed by screening of fecal occult blood, diagnosis using serum markers such as CEA or CA19-9-9, and diagnosis of the course of treatment.
  • serum markers such as CEA or CA19-9-9
  • a molecular biological diagnostic method using a cancer tissue-specific protein marker has been proposed as a method that enables simple and reliable early diagnosis of malignant tumors. Since this method does not require large-scale equipment and places little burden on the subject, it can be widely applied to many subjects who have no subjective symptoms.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-5 10 65 discloses the use of glycoprotein 39 as a tumor marker.
  • International Publication No. 2 0 4Z0 1 8 6 7 9 pamphlet describes a technique relating to a cancer diagnostic kit using C EN P.-A.
  • Patent Document 1 alone still has a problem about completely confirming the onset of cancer, and it is necessary to make a more reliable determination by using a plurality of means.
  • an object of the present invention is to provide further identification of a gene related to the expression of a new cancer and a diagnostic kit using the gene. Disclosure of the invention
  • the present invention employs the following specific means.
  • the polynucleotide described in any one of the following (a) to (c) is used.
  • C a polynucleotide comprising a nucleotide sequence having at least 70% homology with a complementary nucleotide sequence to 5; (c) one or several amino acids in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 or its amino acid sequence A polynucleotide encoding a protein comprising an amino acid sequence in which is deleted, substituted or added.
  • D is also preferred. Since it was confirmed that the polynucleotide in this means was highly expressed in the tissue of the cancerous part, it can greatly contribute to cancer diagnosis by using it as a marker.
  • the homology with the nucleotide sequence set forth in SEQ ID NO: 1 Therefore, it is preferably 0% or more, more preferably 80%, and even more preferably 90% or more.
  • the second means is a nucleic acid molecule containing the polynucleotide in the first means.
  • the third means is a cancer diagnostic kit using the polynucleotide and the specific factor in the first means.
  • the term “specific gene” means that the affinity for a polynucleotide is more significant than the affinity for other unrelated (especially those with less than 30% identity) polynucleotides. It is expensive.
  • the affinity can be measured by, for example, hybridization assay or binding assay.
  • the specific factor is at least one of the group consisting of nucleic acid molecules, polypeptides, lipids, sugar chains, small organic molecules, and complex molecules thereof, and the cancer diagnostic kit diagnoses
  • the cancer to be detected is preferably rectal cancer or colon cancer.
  • a primer having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 3 is used.
  • a primer having the base sequence set forth in SEQ ID NO: 4 is used.
  • a primer set comprising the primer set forth in SEQ ID NO: 3 and the primer set forth in SEQ ID NO: 4 is used.
  • a seventh means a step of determining the expression level of the protein comprising the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 2 for each of the two collected cells, Calculating the ratio of the expression levels.
  • the ratio of the expression level differs between the two It can be determined that the person is a high-risk person suspected of having cancer.
  • the step of determining the protein expression level is to use a western plot, that one of the two collected cells is a cell in a non-cancerous tissue, and that the two collected cells are It is also desirable that one of them is a cell in a cancerous tissue and a step of determining whether or not the ratio of the calculated expression levels is 1.7 or more.
  • a gene associated with cancer expression can be further specified, and a diagnostic kit using the gene can be provided.
  • FIG. 1 shows the results of Western plotting for C EN P-H.
  • FIG. 2 is a diagram showing the results of Western blotting for hM i s 12.
  • FIG. 3 is a diagram showing the results of staining a cross section of a rectal cancer tissue and a non-rectal cancer tissue adjacent thereto with an anti-human CENP—H polyclonal antibody.
  • Figure 4 shows the results of investigating the amount of C EN P-H mRNA on each surface of rectal cancer tissue and normal tissue using RT-PCR and real-time quantitative PCR.
  • Fig. 5 shows the results of investigating the amount of C EN P—H mRNA on each surface of rectal cancer tissue and normal tissue using RT-PCR and real-time quantitative PCR.
  • Tissues from 5 bodies were collected by surgical methods. Tissues were collected from cancerous tissues (hereinafter referred to as “cancerous tissues”) and tissues located 5 to 10 cm away from the cancerous tissues (hereinafter referred to as “non-cancerous tissues”). The collected tissue was immediately immersed in liquid nitrogen and stored frozen at 180 ° C.
  • cryopreserved tissue was added to lysis buffer (7 M urea, 2 M thiourea, 2% 3— [(3—Cho 1 amidopropy 1) D imethy 1 a mm onio] — 1— P ropanesu 1 fonate, 0. 1 MD TT, 2% IPG buffer (Amersha mP harmacia Biotech), 40 mM Tris) A, po 1 ytronhomogenizer (Kinematica) was used to dissolve, Centrifuge 4. After 1 hour, the supernatant was collected and the protein was extracted.
  • Protein is stored in a tank transfer device (Bio-Rad) It was transferred to olyvinylidenefluoride membranes (M i 1 1 ipore), and the membrane was first blocked with Phosphate Bufferedsaline (PBS) containing 5% skimmilk.
  • PBS Phosphate Bufferedsaline
  • a rabbit anti-CENP-H antibody diluted 1: 500 a rabbit anti-hM isl 2 antibody diluted 1: 100
  • Anti- ⁇ -actin antibodies in B-locking buffer were used, and the secondary antibodies were: 1: 300 000 diluted rabbit anti-rabbit I g GHRP, 1: 5 000 diluted rabbit anti-rabbit
  • the caps I g G HR P, each in b 1 ockingbuffer were used.
  • the antibody on the antigen membrane was detected with an enhanced chemiluminescence detection reagent (Am er sham P ham a c aia Biotech). The intensity of each band was measured by NIH images.
  • RNA was extracted from cancer tissue and non-cancer tissue using RN easy Mini Kit (manufactured by Qiagen). CDNA was synthesized from each of the extracted total RNAs using 1 st trandc DNA synthesis kit for RT-PCR (Roche).
  • each cDNA obtained by this synthesis was used as a template, and the cDNA of CEMP-H was amplified by PCR.
  • a primer having the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 is used as a forward primer having a base sequence shown in SEQ ID NO: 4 as a reverse, and GAP DH is used as a control.
  • CDNA or actin was amplified.
  • C EN P—H cDNA real-time quantitative PCR was performed in the Light Cyc 1er library.
  • the PCR reaction mixture used was Light Cycler DNA Master SYBRG reen I (Fast Start Taq DNA Polymerase, dNTP, Buffer 1, SYBRG reen I), and 3 MgCl 2 was added to it.
  • O mM, the primer set forth in SEQ ID NO: 3 and the primer set forth in SEQ ID NO: 4 were added in an amount of 0.5 ⁇ 0 each, and the reaction was performed in a total of 2. ⁇ 2 ..
  • Frozen tissue sections were dried in slide glass and fixed in 4 ° C acetone. After washing 3 times with P B S, the cells were blocked with b 1 o c ki ng buf er (10% bovine fetal serum, P B S) for 1 hour.
  • Samples were prepared using either one or both of rabbit anti-C EN P—H antibody diluted 1: 200, and anti-human CENP—A monoclonal antibody diluted 1: 100, 3% bovine Serum in albumin / PBS for 1 hour. After washing with PBS, the sample was diluted 1: 100 A 1 e X a Fluor TM 4 8 8 or 5 9 4 conjugated goat anti-rabbit anti-mouse Ig G secondary anti- ⁇ : (M o 1 ocu 1 ar Probes) and / or A 1 exa Fluor TM 5 94 4-conjugated goat anti-mouse Ig G secondary antibody and incubated for 1 hour. .
  • DNA is DA PIIIIC ounterstain (Vysis) Was counterstained. The sample was observed with a fluorescence microscope (Leica QFISH). For HE staining, tissue sections were stained with hematoxy 1 in for 30 minutes, dried with 100% ethanol and xylene, and sealed with P ermount.
  • FIG. 1 shows the results of the Western plot.
  • C EN P 1 H was very much expressed in cancer tissues in all 15 cases.
  • the ratio of C EN P—H expression between non-cancerous tissue and cancerous tissue was 1.7 to 9.6, and there was a large difference between cancerous tissue and non-cancerous tissue.
  • hM isl 2, which is another centromere protein
  • no particular difference was found in cancerous tissue and non-cancerous tissue (see Fig. 2, Case in the figure).
  • the number indicates the same organization as the Case number in Figure 1).
  • FIG. 3 shows the HE-stained image of the cancerous part
  • Figures 3 (b), (c) and (d) show the immunostained images of the cancerous part with CENP-H antibody
  • Figure 3 (e) shows the non-cancerous part
  • Fig. 3 (f) shows the CENP-H stained image of the non-cancerous part.
  • CENP-H like other centromeric proteins like C EN P-A and C EN P-C, appears in small spots in the cell nucleus, consistent with the centromere. It was confirmed to exist as a point. Its C EN P—H increases in number and size in cancerous areas compared to non-cancerous tissues (Fig. 3 (f)). (See Fig. 3 (c) and (d)). Stained C EN P—H was confirmed not in the stromal cells but in the cancerous epithelium. This experiment was performed on various tissue sections, and all showed similar results.
  • C EN P—H was expressed in cancer cell lines.
  • C EN P—H mRNA levels in colorectal cancer tissues and C EN P in non-cancerous tissues —H The amount of mRNA was analyzed using RT-PCR and real-time quantitative PCR. The results are shown in FIGS.
  • Fig. 5 compares the mRNA expression levels shown in Fig. 4 between non-cancerous and cancerous tissues, and was determined by the statistical analysis of the start view. According to Fig. 5, cancer tissue (Canc cer) was expressed about 5 times higher than non-cancerous tissue (Norm a 1). This also showed that the presence of cancer can be confirmed by examining the expression of C EN P—H. Industrial applicability

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Abstract

本発明は新たな癌の発現に関連する遺伝子の更なる特定及びそれを用いた診断キットを提供する。

Description

明細書 癌に特異的な遺伝子及びそれを用いた診断キッ ト 技術分野
本発明は、 癌に特異的な遺伝子及びそれを用いた診断キッ トに関し、 更には それを用いる方法に'関する。 背景技術
癌に対する対策としては癌腫の早期発見が最も重要な課題である。特に大腸 上部に発生した癌は自覚症状に乏しく、発見時には病状が進行している危険性 が高いためより早期発見がより重要である。
従来、 大腸癌に対しては、 主に便潜血反応によるスク リーニングと、 C E A あるいは C A 1 9 - 9等の血清マーカーによる診断、並びに治療経過の診断が 行われている。 しかしこれらの方法はいずれも進行癌では陽性率が高いものの、 早期癌では陽性率が極めて低く、 正確な診断が困難であった。
一方、 悪性腫瘍の簡便かつ確実な早期診断を可能とする方法として、 癌組織 特異的タンパク質マーカーを用いた分子生物学的診断方法が提案されている。 この方法は大がかりな設備を必要とせず、被験体への負担も少ないため、 自覚 症状のない多くの被験体に対しても広範囲に実施することが可能である。例え ば、特開平 7— 5 1 0 6 5号公報には糖タンパク質 3 9の腫瘍マーカーとして の利用が開示されている。 また、 国際公開第 2 0 0 4Z0 1 8 6 7 9号パンフレッ トには、 C EN P.— Aを用いた癌診断キッ トに関する技術が記載されている。
しかしながら、上記特許文献 1に記載の技術だけでは癌の発現を完全に確認 することについて未だ課題を残し、複数の手段を用いることでよりより確実に 5 判定する必要がある。
以上、 本発明は、 新たな癌の発現に関連する遺伝子の更なる特定及びそれを 用いた診断キッ トを提供することを目的とする。 発明の開示
0 以上を鑑み、 本発明は以下の具体的な手段を採用する。
まず第一の手段として下記 （a ) 乃至 （ c ) のいずれかに記載のポリヌク レ ォチドとする。
( a )配列番号 1に記載の塩基配列又はその塩基配列と相補的な塩基配列から なるポリヌクレオチド、 （b ) 配列番号 1に記載の塩基配列又はその塩基配列
5 と相補的な塩基配列と相同性が少なく とも 7 0 %以上である塩基配列からな るポリヌクレオチド、 （ c ) 配列番号 2に記載のアミノ酸配列又はそのアミノ 酸配列において 1若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァ ミノ酸配列からなるタンパク質をコ一ドするポリヌクレオチド。
なおこの手段において、癌を検出するためのマーカーと して用いられること
D も好ましい。 この手段におけるポリヌクレオチドは癌部組織において高発現し ていることが確認されたため、マーカーと して利用することにより癌診断に大 きく寄与することができる。 なお、 配列番号 1に記載の塩基配列との相同性と しては Ί 0 %以上が好ましく、 より好ましくは 8 0 %、 更には 9 0 %以上が好 ましい。
また第二の手段と して、第一の手段におけるポリヌクレオチドを含む核酸分 子とする。
また第三の手段と して、第一の手段におけるポリヌクレオチドと特異的な因 子を用いる癌診断キッ トとする。なお本明細書でいう「特異的な遺伝子」とは、 ポリヌク レオチ ドに対する親和性が、 他の無関連の （特に、 同一性が 3 0 %未 満のもの） ポリヌクレオチドに対する親和性よりも有意に高いものをいう。 親 和性は、 例えばハ ブリダイゼーションアツセィ、 結合ァッセィなどによって 測定することができる。
なおこの手段において、 特異的な因子は核酸分子、 ポリペプチド、 脂質、 糖 鎖、有機低分子及びそれらの複合分子から ¾る群のうち少なく どもいずれかで あること、 前記癌診断キッ トが診断する癌は、 直腸癌又は結腸癌であること、 が望ましい。
また第四の手段として、配列番号 3に記載の塩基配列からなるプライマーと する。
また第五の手段と して、配列番号 4に記載の塩基配列からなるプライマーと する。
また第六の手段と して、配列番号 3に記載のプライマーと配列番号 4に記載 のプライマーからなるプライマーセッ トとする。
また第七の手段として、採取した二つの細胞それぞれに対し配列番号 2に記 載のァミノ酸配列からなるたんぱく質の発現量を求めるステップ、その求めた 発現量の比を算出するステップ、を有する方法とする。なおこの場合において、 試料の一方は非癌組織から採取した試料とし、 もう一方を例えば癌部組織であ るとの疑いのある組織から採取した試料とし、 この両者において発現量の比が 異なる場合、癌について疑いのあるハイ リスク者であると判定することができ る。
またこの手段において、 たんぱく質の発現量を求めるステップは、 ゥエスタ ンプロッ トを用いてなること、採取した二つの細胞のうち一つは非癌部組織に おける細胞であること、採取した二つの細胞のうち一つは癌部組織における細 胞であること、 算出した発現量の比が 1. 7以上であるか否かを判定するステ ップ、 を有することも望ましい。
以上により、 新たに癌の発現に関連する遺伝子を更に特定でき、 またそれを 用いた診断キッ トを提供することができる。
図面の簡単な説明
図 1は、 C EN P— Hに対するウェスタンプロッ トの結果を示す図である。 図 2は、 hM i s 1 2に対するウェスタンブロッ トの結果を示す図である。 図 3は、直腸癌の組織とそれに隣接する非直腸癌の組織の断面を抗ヒ ト C E N P— Hポリクロナール抗体で染色した結果を示す図。
図 4は、直腸癌組織と通常組織の各表面における C EN P— Hの mRNAの 量を R T— P C Rと リアルタイム定量 P C Rを用いて調査した結果を示す図 である 図 5は、直腸癌組織と通常組織の各表面における C EN P— Hの mRNAの 量を R T— P C Rと リ アルタイム定量 P C Rを用いて調査した結果を示す図 である。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明の実施の一例について詳細に説明する。
(組織の採取）
初期の結腸直腸癌患者 1 5名の体の組織を外科的方法により採取した。組織 は、 癌の組織 （以下 「癌組織」 という。） 及びこの癌の組織から 5〜 1 0 c m 離れた部分における組織 （以下 「非癌組織」 という。） をそれぞれ採取した。 なお採取した組織はすぐに液体窒素に浸し、 一 8 0°Cに冷凍保存した。
(タンパク質抽出）
次に、 冷凍保存した組織を、 l y s i s b u f f e r ( 7 M u r e a , 2 M t h i o u r e a、 2 % 3— [( 3— C h o 1 a m i d o p r o p y 1 ) D i m e t h y 1 a mm o n i o ] — 1— P r o p a n e s u 1 f o n a t e、 0. 1 M D TT、 2 % I P G b u f f e r (Am e r s h a mP h a r m a c i a B i o t e c h社製）、 4 0 mM T r i s) A 、 p o 1 y t r o n h o m o g e n i z e r ( K i n e m a t i c a社製) を用 いて溶解し、 1 0 0 0 0 X gの遠心分離を 4。じで 1時間行った後、 上清を採取 し、 タンパク質を抽出した。
(ィムノブロ ッ ト）
タンパク質は、 タンク トランスファー装置 （B i o— R a d社製） の中で p o l y v i n y l i d e n e f l u o r i d e m e m b r a n e s (M i 1 1 i p o r e社製） に転写し、 そのメンブレンをまず 5 % s k i m m i l kを含有する P h o s p h a t e B u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) でプロックした。 次に、 一次抗体と して、 1 : 5 0 0 0に希釈したゥサギ 抗 C E N P— H抗体、 1 : 1 0 0に希釈したゥサギ抗 hM i s l 2抗体、 1 : 5 0 0に希釈したャギ抗 βァクチン抗体をそれぞれ B l o c k i n g b u f f e rに入れたものを用い、 二次抗体と しては、 1 ： 3 0 0 0に希釈したャ ギ抗ゥサギ I g G H R P、 1 ： 5 0 0に希釈したゥサギ抗ャギ I g G HR P、 をそれぞれ b 1 o c k i n g b u f f e rに入れたものを用いた。
なお抗原メンブレン上の抗体は強化化学発光検出試薬 （Am e r s h a m P h a r a m a c i a B i o t e c h社製） により検出した。 また各バンド の強度は N I H画像により測定した。
(P C R及びリ アルタイム定量 P CR)
t o t a 1 R N Aは、癌組織及び非癌組織からそれぞれ R N e a s y M i n i K i t (Q i a g e n社製） を用いて抽出した。 また c DN Aは、 抽出 した各 t o t a l RNA力 ら 1 s t S t r a n d c DNA s y n t h e s i s k i t f o r R T- P C R (R o c h e社製） を用いてそれぞれ 合成した。
そしてこの合成により得られたそれぞれの c DNAをテンプレートと し、 C EMP— Hの c DNAを P C Rにより増幅した。 なお P C Rは、 配列番号 3に 記載の塩基配列を有するプライマーをフォワード、配列番号 4に記載の塩基配 列を有するプライマーをリ バースとして用い、 コン ト ロールとして GA P DH の c DNA又は ァクチンを増幅した。
そして次に、 C EN P—Hの c DNAリアルタイム定量 P C Rを、 L i g h t C y c 1 e rキヤビラリ一中で実施した。 なおその P C R反応混合液は、 L i g h t C y c l e r DNA M a s t e r S Y B R G r e e n I (F a s t S t a r t T a q DNAポリ メラーゼ、 d NT P、バッファ一、 S Y B R G r e e n I ) を用い、 それに Mg C l 2を 3. O mM、 配列番 号 3に記載のプライマー及び配列番号 4に記載のプライマーそれぞれを 0. 5 μ Μずつ加え、 合計 2. Ο μ ΐ 中で行った。
そして L i g h t C y c l e r ソフ トウェア バージョン 3. 3 ( R o c h e社製） を用いて分析した。
(免疫組織染色法）
凍結組織切片は、スライ ドガラス上で乾燥後、 4°Cのァセ トン中で固定した。 そして P B Sで 3回洗浄した後、 b 1 o c k i n g b u f f e r ( 1 0 %の 牛の胎児の血清 ,P B S ) で 1時間ブロック した。
試料は 1 : 2 0 0 0に希釈したゥサギ抗 C EN P— H抗体、 1 ： 1 0 0 0に 希釈した抗ヒ ト C E N P— Aモノ ク ロナル抗体の一方若しくは双方を用い、 3 %の牛の血清のアルブミン/ P B S中で 1時間ィンキュベート した。 P B S で洗浄した後、試料は 1 ： 1 0 00に希釈した A 1 e X a F l u o r™ 4 8 8 若しくは 5 9 4結合ャギ抗ゥサギ抗マウス I g G二次抗^: (M o 1 o c u 1 a r P r o b e s社製） 及び 又は A 1 e x a F l u o r™ 5 9 4結合ャギ抗マウス I g G二次抗体と ともに 1時間ィンキュベー 卜 した。.
DNAは、 DA P I I I I C o u n t e r s t a i n (V y s i s社製） を用いて対比染色した。 試料は蛍光顕微鏡 （ L e i c a Q F I S H社製） に より観察した。 なお HE染色のため、 組織切片を h e m a t o x y 1 i nで 3 0分染色し、 1 0 0 %のエタノール及び x y l e n eで乾燥し、 P e r m o u n tを用いて封入した。
(結果）
ウェスタンプロッ トによる結果を図 1に示す。 図 1に示すとおり、 C E N P 一 Hは 1 5症例いずれにおいても癌組織で非常に多く発現していた。 特に、 非 癌組織と癌組織の C EN P— H発現の比は 1. 7〜 9. 6であり、 癌組織と非 癌組織において大きな差異が見られた。 一方これに対し、 他の動原体たんぱく 質である hM i s l 2の場合は、 癌組織、 非癌組織において特段の差異を見出 すことはできなかった （図 2参照、 図中の C a s e番号は図 1における C a s e番号と同一の組織であることを示す）。
次に、 C E N P—Hが間質細胞ではなく癌細胞で発現していることを確かめ るために、大腸直腸癌の組織とそれに隣接する非癌部の組織の断面を抗ヒ ト C EN P— Hポリクロナール抗体で染色した。 その結果を図 3に示す。 なお図 3 ( a ) は癌部の HE染色像を、 図 3 ( b ) ( c ) ( d ) は癌部の C E N P— H抗 体による免疫染色像を、 図 3 ( e ) は 非癌部の HE染色像を、 図 3 ( f ) は 非癌部の C E N P一 Hの染色像をそれぞれ示している。
この結果、 C E N P— Hは、 C EN P— Aや C EN P— Cのような他のセン トロメァたんぱく質と同様に、 セン トロメァと一致して、 細胞の核の中で小さ な斑点状に現れる点として存在していることが確認された。その C EN P— H は、 非癌部組織に比較して （図 3 ( f ))、 癌部では数及びサイズにおいて増加 していることが確認された （図 3 ( c ) 及び （d ) 参照）。 なお、 染色された C EN P— Hは、 間質細胞ではなく、 癌部上皮において確認された。 また、 本 実験を様々な組織切片において行ったが、 どれも同様の結果を示した。
以上、 C EN P— Hは、 癌細胞內において発現していることが確認できた。 次に、 C EN P— Hの過剰発現が転写により增加した結果であることを確認 するために、 大腸直腸癌組織における C EN P— Hの mRNAの量と、 非癌部 組織における C EN P— Hの： mR NAの量とを R T— P C Rとリアルタイム 定量 P C Rを用いて解析した。 この結果を図 4及び図 5に示す。
図 4で示すとおり、 癌組織における C E N P— Hの m R N Aの発現レベルは 非痺部組織に比べ非常に増大していることがわかる。 そして更に、 C EN P— Hの m R N Aの発現レベルは、図 1にて示した非癌組織と癌組織の C EN P— H発現の比に強い相関を示していることがわかった。 なおコン トロールとして の G A P DHについて確認したが、癌組織及び非癌部組織において差異は見ら れなかった。
図 5は図 4で示した mR N Aの発現レベルを非癌組織と癌組織との間で比 較したものであって、 スタツ トビュー統計解析ソフ トによって求めた。 図 5に よると、 癌組織 （C a n c e r ) は非癌組織 （N o r m a 1 ) に比べ、 約 5倍 も高く発現していた。 これによつても C EN P— Hの発現を調べることにより 癌の存在を確かめることができることがわかった。 産業上の利用可能性
以上、 本発明によれば、 新たに癌の発現に関連する遺伝子を特定することが でき、 更にはそれを用いた診断キッ トを提供することができる。

Claims

請求の範囲
1 . 下記 （a ) 乃至 （c ) のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
( a )配列番号 1に記載の塩基配列又はその塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌ クレオチド
( b )配列番号 1に記載の塩基配列又はその塩基配列と相補的な塩基配列と相同性が少な くとも 7 0 %以上である塩基配列からなるポリヌクレオチド
( c )配列番号 2に記載のァミノ酸配列又はそのァミノ酸配列において 1若しくは数個の ァミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたァミノ酸配列からなるタンパク質をコードする ポリヌクレオチド。
2 . 癌を検出するためのマーカーである請求の範囲第 1項記載のポリヌクレオチド。
3 . 請求の範囲第 1項記載のポリヌクレオチドを含む核酸分子。
4 . 請求の範囲第 1項記載のポリヌクレオチドと特異的な因子を用いる癌診断キット。
5 . 前記特異的な因子は、 核酸分子、 ポリペプチド、 脂質、 糖鎖、 有機低分子及びそれら の複合分子からなる群の少なくともいずれかである請求の範囲第 5項記載の癌診断キッ
6 . 前記癌診断キットが診断する癌は、 直腸癌又は結腸癌である請求の範囲第 5項記載の 癌診断キット。
7 . 配列番号 3に記載の塩基配列からなるプライマー。
8 . 配列番号 4に記載の塩基配列からなるプライマー。
9 .請求の範囲第 7項に記載のプライマーと請求の範囲第 8項に記載のプラィマーからな るプライマーセット。
1 0 .採取した二つの細胞それぞれに対し配列番号 2に記載のアミノ酸配列からなるたん ばく質の発現量を求めるステップ、その求めた発現量の比を算出するステップ、 を有する 方法。
1 1 . 前記たんぱく質の発現量を求めるステップは、 ウェスタンプロットを用いてなるこ とを特徴とする請求の範囲第 1 0項記載の方法。
1 2 .前記採取した二つの細胞のうち一つは非癌部組織における細胞である請求の範囲第 1 0項記載の方法。
1 3 .前記採取した二つの細胞のうち一つは癌部組織における細胞である請求の範囲第 1 0項記載の方法。
1 4 . 前記算出した発現量の比が 1 . 7以上であるか否かを判定するステップ、 を有する 請求の範囲第 1 0項記載の方法。
第 1図
N Τ N Ν Τ Ν Τ Ν Τ Ν Τ Ν Τ Ν Τ Ν Τ Ν Τ Ν Τ Ν Τ Ν
CENP-M ^ ^¾^¾¾
Figure imgf000014_0001
第 2図
CM* 6 Π 12
Figure imgf000014_0002
Figure imgf000015_0001
N JL N 丄 M N N N
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2
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