CN101410532B - 用于检测癌症的尿基因表达比值 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基于分析低表达肿瘤标志物(TM)和至少一种其他TM的表达水平来检测受试者是否存在癌症的方法。具体地，本发明涉及通过对至少一种低表达TM特别是低表达膀胱TM(BTM)和至少一种高表达TM特别是高表达BTM的表达水平进行比值、回归或分类分析来检测癌症特别是膀胱癌。本发明多方面涉及实施这些方法的试剂盒和装置。

Description

用于检测癌症的尿基因表达比值
技术领域
本发明涉及癌症的检测。具体地，本发明涉及标志物检测膀胱癌的用途。更具体地，本发明涉及低表达标志物与至少一种其他标志物组合检测膀胱癌的用途。
技术背景
当癌症在早期得到治疗时，癌症患者的存活率极大地提高。对于膀胱癌而言，诊断为疾病早期的患者5年存活率>90％，相比之下，诊断为疾病晚期的患者仅为大约15-30％。因此，早期诊断膀胱癌的改良方法能够改善患者的预后。已确立的利用尿样检测膀胱癌的方法为细胞学方法。然而，细胞学方法检测浸润性膀胱癌的灵敏性仅为大约75％，而检测浅表性膀胱癌的灵敏性仅为大约25％(Lotan和Roehrborn，Urology61，109-118(2003))。
鉴定尿中的特异性癌标志物能够提供有价值的早期诊断癌症的手段，进而实现早期治疗并改善预后。特异性癌标志物还提供了监测疾病进程的手段，能够监测手术治疗、放射疗法和化疗的疗效。
目前，检测膀胱癌的最可靠的方法是膀胱镜检，附以活检病变的组织学方法。然而，这是一项耗时、侵入性的技术，且灵敏性仅为大约90％，这意味着大约10％的癌症利用这些方法是检测不到的。在非侵入性的方法中，尿细胞学方法是当前首选的方法，该方法通过显微镜检检测脱落的恶性细胞。虽然细胞学方法的特异性约为95％，但是对于低级病变的灵敏性差(9-25％)，极度依赖于样品质量，并且苦于不同观测人员给出的结果高度可变。
已知多种尿蛋白标志物。检验这些标志物提供比细胞学方法更佳的灵敏性，但是往往呈亚适特异性，因为在非恶性疾病包括炎症、尿石病以及良性前列腺增生患者中也常观察到这些标志物水平的升高。例如，检测特异性核基质蛋白质的MP22灵敏性为47-87％，而特异性为58-91％。
与尿检有关的一个缺点是，随着(i)不同的尿样采集方法(导尿管、排尿、尿沉淀物)；(ii)每日尿样采集时间选择的不同；(iii)排尿期取样点的不同(如中段尿与末段尿)；以及(iv)与影响血浆容量的不同流食摄取、肾功能或疾病相关的尿液浓度的差异，个体标志物的水平会大幅变动。这些变化有可能导致假阳性及假阴性检验。尽管利用严格的标准操作方法能够减小一些这样的变化，但患者对这些方法的依从性将是不可靠的。在有些情况下，通过评估标志物相对于尿肌酐的水平，能够解决尿液浓度变化的效应，然而，这增大了检验的成本和复杂度，在样品制备和贮存方法有别于标志物检测和肌酐测定的情况下尤为如此。
急需早期检测和诊断癌症的简单工具。本发明提供了另外的基于标志物、特别是膀胱癌标志物的比值、回归或分类分析的方法、装置和试剂盒，以辅助检测和诊断膀胱癌。
发明概述
本发明提供了确定受试者存在癌症的方法，包括：
(a)提供来自受试者的样品；
(b)检测所述样品中至少两种肿瘤标志物(TM)家族成员的表达水平，其中至少一种TM为低表达的TM；
(c)依照预定的阈值确立患者是否患有癌症。
步骤(c)可以通过确定所述TM表达的比值，或通过对所述TM的表达水平进行回归或分类分析来进行。
TM可以是BTM。待检测的癌症可以是膀胱癌，并且在某些实施方案中，至少一种TM是过表达的BTM。过表达的BTM可以选自图11或图12所列的那些。
在某些实施方案中，至少一种低表达的TM是选自图3或图4所列的BTM。
在本发明的其他实施方案中，检测步骤通过检测BTMmRNA、BTM蛋白或BTM肽的过表达来进行。
样品可以是活检、血液、血清、腹腔冲洗液、脑脊髓液、尿和大便样品中任一。
本发明还提供了检测TM的装置，包括：
其上具有TM捕获试剂的基质；和
与所述基质相连的检测仪，所述检测仪能够检测与所述捕获试剂相连的TM，其中TM是低表达的TM。
TM可以是BTM。
TM捕获试剂可以是寡核苷酸或抗体。
在某些实施方案中，TM可以是选自图3或图4所列的BTM。
本发明还提供了确定受试者存在癌症的试剂盒，包括：
基质；
至少两种TM捕获试剂，其中至少一种TM是低表达的TM；和
使用说明。
TM可以是BTM。
TM捕获试剂可以是TM特异性的寡核苷酸或TM特异性的抗体。
由所述试剂盒检测的TM可以是选自图3或图4所列的BTM。
由所述试剂盒检测的至少一种TM可以是过表达的TM或过表达的BTM。过表达的BTM可以选自图11或图12所列的那些。
附图的简短说明
本发明参照其具体实施方案并参照附图予以说明，其中：
图1的表格显示了qPCR分析中所用尿样特征。
图2的表格为进行本发明膀胱癌qPCR分析的标志物的引物和寡核苷酸探针。
图3的表格为通过微阵列法在膀胱癌样品上鉴定到的低表达膀胱肿瘤标志物。
图4的表格为通过微阵列法在膀胱癌样品上鉴定到的低表达膀胱肿瘤标志物，所述标志物在全血中不显著表达，但在正常膀胱组织中高表达。
图5的盒须图显示了非恶性泌尿科疾病或膀胱移行细胞癌(TCC)患者尿样中三种TCC标志物(HoxA13、IGFBP5和MDK)与低表达标志物LTB4DH的比值。盒定义25、50和75个百分点，水平条标出相邻值。离群值以圆圈表示。空心盒代表来自非恶性疾病对照的样品，而阴影盒代表来自TCC患者的样品。
图6显示了TCC检测在包括LTB4DH的检验中的灵敏性和特异性。(a).单独检验；(b).组合检验，使用LTB4DH以及三种标志物HoxA13、IGFBP5和MDK中的两种。
图7a-c显示了利用包括LTB4DH在内的比值分析在尿样中检测TCC的灵敏性和特异性的ROC曲线。7a.IGFBP5/LTB4DH；7b.MDK/LT4BDH；7c.HoxA13/LTB4DH。
图8a-f显示了组合检验的散点图，a-c使用LTB4DH以及三种标志物HoxA13、IGFBP5和MDK中的两种，而d-f使用BAG1代替LTB4DH进行重复。8a.MDK/LTB4DH和IGFBP5/LTB4DH；8b.MDK/LTB4DH和HoxA13/LTB4DH；8c.IGFBP5/LTB4DH和HoxA13/LTB4DH；8d.MDK/BAG1和IGFBP5/BAG1；8e.MDK/BAG1和HoxA13/BAG1；8f.IGFBP5/BAG1和HoxA13/BAG1。
图9a-b为散点图，显示了IGFBP5的ΔCt以及IGFBP5/LTB4DH的ΔCt比值与尿肌酐浓度之间的相关性。9a.来自TCC患者的尿样；9b.来自非恶性疾病患者的尿样。
图10a-f为自身散点图，显示了来自TCC患者的排尿和导尿管尿样的分布，单独使用膀胱肿瘤标志物MDK、IGFBP5和HoxA13，或其与LTB4DH的比值进行分析。
图11显示了已知的过表达的浸润性膀胱肿瘤标志物。
图12显示了已知的过表达的浅表性膀胱肿瘤标志物。
图13显示了ROC曲线分析中所用的低级TCC样品和对照的临床特征。
图14显示了ROC曲线分析的结果。图解说明了当使用HoxA13和IGFBP5与LTB4DH的比值时，获得的检验准确性提高。
图15显示了在有或无LTB4DH的情况下，用于检测TCC的BTM的线性判别分析。
发明详述
定义
术语“标志物”是指与生物学现象定量或定性关联的分子。“标志物”的实例包括多核苷酸，如基因、基因片段、RNA或RNA片段；或基因产物，包括多肽，如肽、寡肽、蛋白质或蛋白质片段；或产物或其他鉴定分子的相关代谢物，如与现象后面的机制直接或者间接相关的抗体或抗体片段。本发明的标志物包括本文公开的核苷酸序列(如GenBank序列)，特别是上文定义的全长序列、任何编码序列、非编码序列和片段，或其任何互补物，及其任何可测定的标志物。
术语“灵敏性”是指(通过模型)检验阳性的患病个体比例。因此，灵敏性提高意味着假阴性检验结果更少。
术语“特异性”是指(通过模型)检验阴性的无病个体比例。因此，特异性提高意味着假阳性检验结果更少。
术语“表达”包括多核苷酸和多肽的产生，特别是，由基因或基因的一部分产生RNA(如mRNA)，包括RNA或基因或基因的一部分所编码多肽的产生，还包括与表达相关的可检测物质的出现。例如，由于例如多肽-多肽相互作用、多肽-多核苷酸相互作用等引起的复合物形成包括在术语“表达”的范围内。另一实例，结合配体的结合，如杂交探针或抗体与基因或其他多核苷酸、多肽或蛋白质片段的结合，以及结合配体的可视化[如微阵列、杂交印迹如Northern印迹、或免疫印迹如Western蛋白质印迹或珠阵列上的斑点密度，或通过PCR分析]，包括在术语潜在生物分子的“表达”的范围内。
术语“过表达”用于指标志物在一种细胞或细胞类型中的表达高于在另一种等同细胞或细胞类型中的表达的情况。
术语“低表达”用于指标志物在一种细胞或细胞类型中的表达低于在另一种等同细胞或细胞类型中的表达的情况。
术语“TM”或“肿瘤标志物”或“TM家族成员”是指与特定癌症相关的标志物。术语TM也包括个体标志物的组合，所述组合提高癌症检测的灵敏性和特异性。应当理解，术语TM并不要求所述标志物仅特异于特定的肿瘤。相反，TM在其他类型的细胞、患病细胞、肿瘤、包括恶性肿瘤中的表达可以改变。
通过从疑患膀胱癌患者的组织样品中提取RNA，将所述RNA或cDNA拷贝施加到其上具有大量寡核苷酸的微阵列上，使样品RNA与阵列上的寡核苷酸杂交，然后定量结合在各个阵列斑点上的所测RNA的水平，可以鉴定TM。如果利用微阵列法发现标志物的存在低于正常非恶性组织至少大约1.2倍的阈值，则认为其为低表达TM。可选地，阈值比正常情况低大约2倍、低大约3倍、低4倍或者甚至大约5倍。“正常”表示低于正常群体90个百分点。在其他情况下，正常可以表示存在水平为95个百分点(即，偏离中值大约2个标准偏差(SD))，而在其他情况下，低于大约97.5个百分点(即，大约3SD)或99个百分点。
术语“低表达的TM”表示标志物在膀胱肿瘤中显示出比非恶性膀胱组织更低的表达。
术语“过表达的TM”表示标志物在膀胱肿瘤中显示出比非恶性组织更高的表达。
术语“BTM”或“膀胱肿瘤标志物”或“BTM家族成员”是指与膀胱癌相关的TM。术语BTM也包括个体标志物的组合，所述组合提高膀胱癌检测的灵敏性和特异性。应当理解，术语BTM并不要求所述标志物仅特异于膀胱肿瘤。相反，BTM在其他类型的细胞、患病细胞、肿瘤、包括恶性肿瘤中的表达可以改变。
术语“低表达的BTM”表示标志物在膀胱肿瘤中显示出比非恶性膀胱组织更低的表达。
术语“过表达的BTM”表示标志物在膀胱肿瘤中显示出比非恶性组织更高的表达。
术语“qPCR”表示定量聚合酶链式反应。术语“qPCR”或“QPCR”是指例如PCRTechnique：QuantitativePCR，J.W.Larrick编辑，EatonPublishing，1997和A-ZofQuantitativePCR，S.Bustin编辑，IULPress，2004中所述的定量聚合酶链式反应。
术语“TCC”表示膀胱移行细胞癌。TCC构成所有膀胱癌的～95％。
如本文所用，“抗体”或类似术语是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的免疫活性部分，即含有与抗原特异性结合(与之发生免疫反应)的抗原结合位点的分子。这些分子包括但不限于：多克隆、单克隆、嵌合、单链抗体、Fc、Fab、Fab’和Fab2片段，以及Fab表达文库。抗体分子涉及IgG、IgM、IgA、IgE和IgD类的任何分子，所述分子中存在的重链的性质彼此不同。这些分子也包括亚类，如IgG1、IgG2等等。轻链可以是K链或λ链。本文述及的抗体包括对所有类、亚类和型的述及。同样包括在内的有嵌合抗体，例如特异于不止一种来源如小鼠或人序列的单克隆抗体或其片段。还包括骆驼(camelid)抗体、鲨鱼抗体或纳米抗体。
术语“癌症”和“癌”是指或者描述哺乳动物中通常以异常或失控的细胞生长为特征的生理状态。癌症和癌症病理可以伴随着例如转移、干扰邻近细胞的正常机能、以异常水平释放细胞因子或其他分泌产物、抑制或加重炎性或免疫应答、瘤形成、癌前病变(premalignancy)、恶性肿瘤、周围或远处组织或器官如淋巴结的浸润等。
术语“肿瘤”是指所有恶性或良性的瘤形成性细胞生长和增生，以及所有癌前及癌细胞和组织。
术语“微阵列”是指捕获剂、优选多核苷酸(如探针)或多肽在基质上的有序或无序排置。参见例如MicroarrayAnalysis，M.Schena，JohnWiley&Sons，2002；MicroarrayBiochipTechnology，M.Schena编辑，EatonPublishing，2000；GuidetoAnalysisofDNAMicroarrayData，S.Knudsen，JohnWiley&Sons，2004；以及ProteinMicroarrayTechnology，D.Kambhampati编辑，JohnWiley&Sons，2004。
术语“寡核苷酸”是指多核苷酸，通常为探针或引物，包括但不限于：单链脱氧核糖核苷酸、单链或双链核糖核苷酸、RNA：DNA杂合体和双链DNA。寡核苷酸如单链DNA探针寡核苷酸通过通过化学法合成，例如，利用可商购的自动化寡核苷酸合成仪，或通过多种其他方法，包括体外表达系统、重组技术以及细胞和生物体中的表达。
单数或复数形式使用的术语“多核苷酸”通常是指任何多聚核糖核苷酸或多聚脱氧核糖核苷酸，其可以是未修饰的RNA或DNA或者修饰的RNA或DNA。这包括但不限于：单链和双链DNA，包括单链和双链区的DNA，单链和双链RNA，以及包括单链和双链区的RNA，包含可能为单链或更通常为双链形式的、或者包括单链和双链区的DNA和RNA的杂合分子。同样包括在内的有包含RNA或DNA或者RNA和DNA两者兼而有之的三链区。特别包括的有：mRNA、cDNA和基因组DNA及其任何片段。该术语包括含有一个或多个修饰碱基如氚化碱基或者稀有碱基如肌苷的DNA和RNA。本发明的多核苷酸能够涵盖编码或非编码序列或有义或反义序列。应当理解，本文各处述及的“多核苷酸”或类似术语将包括全长序列及其任何片段、衍生物或变体。
如本文所用，“多肽”是指寡肽、肽或蛋白质序列，或其片段，并且是天然存在的、重组的、合成的或半合成的分子。在本文引述的“多肽”是指天然存在的蛋白质分子的氨基酸序列的情况下，“多肽”或类似术语并不意在将氨基酸序列局限为全长分子的全部天然氨基酸序列。应当理解，本文各处述及的“多肽”或类似术语将包括全长序列及其任何片段、衍生物或变体。
杂交反应的“严谨性”可由本领域普通技术人员容易地确定，并且通常是取决于探针长度、洗涤温度和盐浓度的经验式计算。一般而言，较长的探针需要较高的温度进行正确退火，而较短的探针需要较低的温度。杂交通常取决于在互补链存在于低于其解链温度的环境时变性DNA重新退火的能力。期望的探针和可杂交序列之间的同源性程度越高，可以使用的相对温度就越高。因此，结论就是较高的相对温度将倾向于使反应条件更加严谨，而较低的温度则不太严谨。杂交反应严谨性的其他细节和说明见于例如Ausubel等，CurrentProtocolsinMolecularBiology，WileyIntersciencePublishers，(1995)。
如本文所定义，“严谨条件”或“高严谨条件”通常：(1)采用低离子强度和高温进行洗涤，例如0.015M氯化钠/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基硫酸钠，50℃；(2)杂交期间采用变性剂如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺，和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸钠缓冲液pH6.5，和750mM氯化钠，75mM柠檬酸钠，42℃；或(3)采用50％甲酰胺，5×SSC(0.75MNaCl，0.075M柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH6.8)，0.1％焦磷酸钠，5×Denhardt溶液，超声化鲑鱼精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸葡聚糖，42℃，在0.2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)中于42℃和50％甲酰胺中于55℃洗涤，接着是包括于55℃在含EDTA的0.1×SSC中的高严谨洗涤。
“中等严谨条件”可如Sambrook等，《分子克隆实验指南》(MolecularCloning：ALaboratoryManual)，纽约：冷泉港出版社(ColdSpringHarborPress)，1989所述予以确认，并且包括使用不如上文所述的那些严谨的洗涤溶液和杂交条件(如温度、离子强度和SDS％)。中等严谨条件的实例为于37℃在包含20％甲酰胺，5×SSC(150mMNaCl，15mM柠檬酸钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5×Denhardt溶液，10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性剪切的鲑鱼精DNA的溶液中过夜孵育，接着在1×SSC中于大约37-50℃洗涤滤膜。熟练技术人员将会明了如何对温度、离子强度等进行必要的调整，以适应诸如探针长度等因素。
除非另有说明，本发明的实施将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学和生物化学的常规技术，这落入本领域技术范围内。这样的技术在文献中有充分的说明，例如：《分子克隆实验指南》，第2版，Sambrook等，1989；OligonucleotideSynthesis，MJGait编辑，1984；AnimalCellCulture，R.I.Freshney编辑，1987；MethodsinEnzymology，AcademicPress，Inc.；HandbookofExperimentalImmunology，第4版，D.M.Weir&CC.Blackwell编辑，BlackwellScienceInc.，1987；GeneTransferVectorsforMammalianCells，J.M.Miller&M.P.Calos编辑，1987；CurrentProtocolsinMolecularBiology，F.M.Ausubel等编辑，1987；以及PCR：ThePolymeraseChainReaction，Mullis等编辑，1994。
发明实施方案的说明
利用微阵列分析和定量聚合酶链式反应(qPCR)的组合，鉴定到在肿瘤中低表达的膀胱移行细胞癌(TCC)标志物。令人惊讶地发现，这些标志物与其他膀胱肿瘤标志物(BTM)特别是在肿瘤中过表达的标志物之间的比值可用于诊断膀胱癌。
所述比值(而不是测定标志物的绝对水平)能单纯鉴定膀胱癌细胞典型的基因表达‘标签’，并且令人惊讶地具有更高的采样技术和尿液浓度变化的鲁棒性。而且，低表达标志物与过表达标志物的组合最大化了患者样品与非恶性对照之间的差异，增大了检验的可靠性。此处所述的低表达标志物基于如下标准选择：(i)在TCC中强烈一致地下调，(ii)在正常组织中高表达，和(iii)在全血中不显著表达，以最小化血尿症患者的假阳性风险。
作为确定两种BTM比值的替代方案，发现可以在回归分析或分类技术包括线性判别分析中对低表达和高表达BTM进行分析，且这些分析的结果也能够指示膀胱癌的存在。
检验包括测定疑患癌症或处于罹患癌症风险的患者样品中的至少两种TM标志物如BTM，其中至少一种TM是低表达的TM。低表达TM与另一TM的比值指示癌症的存在。第二种TM可以本领域公知的任何TM，但是优选为过表达的BTM。图3显示了适用于本发明的许多低表达标志物。
最好使用低表达TM与过表达TM组合进行检验。例如，可以使用任何过表达的TM。已知的由浸润性膀胱肿瘤(此处定义为≥1期的肿瘤)鉴定的过表达BTM示于图11，而由浅表性膀胱肿瘤(此处定义为Ta和Tis期的肿瘤)鉴定的过表达BTM示于图12。
已令人惊讶地确立，用于本发明的优选的低表达BTM在全血中不显著升高，而且在肿瘤细胞和非恶性膀胱细胞中均以足够高的拷贝数存在。优选的低表达BTM示于图4。
可以利用任何适宜的技术检测样品中的癌标志物，并且可以包括但不限于：寡核苷酸探针、qPCR或针对癌标志物产生的抗体。
应当理解，待检样品不局限于疑为肿瘤组织的样品。标志物可以分泌到血清中、自细胞膜上脱落、自裂解细胞中释放或与消失在尿液中的细胞结合。因此，样品可以包括任何机体样品，并且包括活检、血液、血清、腹腔冲洗液、脑脊髓液、尿和大便样品。
也应当理解，本发明不局限于人类癌症的检测，而是适合于任何动物癌症的检测，包括但不限于：狗、猫、马、牛、羊、鹿、猪以及任何已知会得癌症的其他动物。
癌症检测的一般途径
如下途径为可用于测定TM的非限制性方法。在个体TM测定之后，确定高和低表达BTM家族成员之间的比值。这些比值用来预测癌症存在与否。
可选地，在回归或分类分析中使用高和低表达TM。这些分析的结果也用来预测癌症存在与否。
用于确定表达水平的一般方法学概述于下文，不过应当理解，用于确定表达水平的任何方法都将是适宜的。
定量PCR(qPCR)
可以利用BTM特异性引物和探针对肿瘤样品、血清、血浆和尿样进行定量PCR(qPCR)。在控制反应中，PCR反应中形成的产物量(Sambrook，J.，EFritsch，E.和TManiatis，《分子克隆实验指南》，第3版，冷泉港实验室出版社：冷泉港(2001))与起始模板的量相关。通过在对数期在试剂成为限制因素之前终止PCR反应，可以进行PRC产物的定量。然后PCR产物在琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶上电泳，以溴化乙锭或相当的DNA染料染色，并通过密度计量法测定染色强度。可选地，可以利用PCR仪器例如实时测定产物累积的应用生物系统公司(AppliedBiosystems)的Prism7000或罗氏(Roche)的LightCycler测定PCR反应的进程。实时PCR测定进入合成PCR产物的DNA嵌入染料如SybrGreen的荧光，或报告分子自淬灭分子上裂解时释放的荧光；报告分子和淬灭分子掺入寡核苷酸探针中，所述探针与引物寡核苷酸的DNA链延伸之后的靶DNA分子杂交。在下一个PCR循环中，寡核苷酸探针由于Taq聚合酶的酶促作用被置换和降解，从淬灭分子上释放报告分子。在一种称为Scorpion的变化形式中，探针共价连接于引物。
反转录PCR(RT-PCR)
RT-PCR可用于比较正常及肿瘤组织中经或未经药物处理的不同样品群中的RNA水平，以表征表达模式，区分密切相关的RNA，和分析RNA结构。
关于RT-PCR，第一步是从靶样品中分离RNA。起始材料通常是分别从人肿瘤或肿瘤细胞系以及对应的正常组织或细胞系中分离的总RNA。RNA可以分离自多种样品，如来自乳腺、肺、结肠(如大肠或小肠)、结肠直肠、胃、食道、肛门、直肠、前列腺、脑、肝、肾、胰腺、脾、胸腺、睾丸、卵巢、子宫、膀胱等组织、来自原发性肿瘤或肿瘤细胞系以及来自健康供体混合样品的肿瘤样品。如果RNA的来源是肿瘤，则可以例如从冷冻或贮存的石蜡包埋和固定的(如福尔马林固定的)组织样品中提取RNA。
RT-PCR基因表达谱研究的第一步是将RNA模板反转录为cDNA，接着在PCR反应中进行指数扩增。两种最常用的反转录酶是禽成髓细胞瘤病毒反转录酶(AMV-RT)和莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(MMLV-RT)。反转录步骤通常利用特异性引物、随机六聚体或oligo-dT引物引发，视情况和表达谱研究的目的而定。例如，可遵循生产商的说明，利用GeneAmpRNAPCR试剂盒(珀金埃尔默公司，PerkinElmer，CA，USA)对提取的RNA进行反转录。得到的cDNA然后可在后续的PCR反应中用作模板。
虽然PCR步骤能够利用多种热稳定的DNA依赖性DNA聚合酶，但通常采用TaqDNA聚合酶，其具有5’-3’核酸酶活性但缺乏3’-5’校正核酸内切酶活性。因此，TaqMan(q)PCR通常利用Taq或Tth聚合酶的5’核酸酶活性水解结合在靶扩增子上的杂交探针，但任何具有等同5’核酸酶活性的酶均可使用。
利用两个寡核苷酸引物产生PCR反应典型的扩增子。设计第三寡核苷酸或探针检测位于所述两个PCR引物之间的核苷酸序列。探针不可以由TaqDNA聚合酶延伸，并用报告荧光染料和淬灭荧光染料标记。当报告染料和淬灭染料在探针上的定位靠近在一起时，任何激光诱导的报告染料的发射均被淬灭染料淬灭。在扩增反应期间，TaqDNA聚合酶以模板依赖性的方式切割探针。所产生的探针片段在溶液中解离，且来自所释放的报告染料的信号解除了另一荧光团的淬灭效应。每合成一个新分子，就释放一分子报告染料，从而未淬灭报告染料的检测为数据的定量阐释提供了基础。
TaqManRT-PCR可以利用可商购的设备进行，例如ABIPRISM7700序列检测系统(珀金埃尔默应用生物系统公司，Perkin-Elmer-AppliedBiosystems，福斯特城，加利福尼亚州，美国)或Lightcycler(罗氏分子生物药剂公司，RocheMolecularBiochemicals，曼海姆，德国)。在优选的实施方案中，在实时定量PCR装置如ABIPRISM7700tam序列检测系统中运行5’核酸酶方法。该系统包括热循环仪、激光、电荷耦合器件(CCD)、照相机和计算机。该系统在热循环仪上以96孔的形式扩增样品。在扩增期间，通过光纤光缆实时采集所有96个孔的激光诱导的荧光信号，并在CCD处进行检测。该系统包括用于运行仪器以及分析数据的软件。
5’核酸酶测定数据最初表达为Ct或循环阈值。如上文所讨论的那样，在每一循环过程中记录荧光值，其代表扩增反应中该时间点所扩增的产物量。第一次记录到具有统计学显著性的荧光信号的时间点为循环阈值。
实时定量PCR(qPCR)
RT-PCR技术更为新近的变化形式是实时定量PCR，其通过双重标记的荧光探针(即TaqMan探针)测定PCR产物的累积。实时PCR与定量竞争PCR和定量比较PCR均兼容。前者利用每个靶序列的内部竞争剂以进行标准化，而后者利用样品内包含的标准化基因或者持家基因进行RT-PCR。更多的细节由例如Held等，GenomeResearch6：986-994(1996)提供。
可以利用固定的、石蜡包埋的组织作为RNA来源以确定表达水平。根据本发明的一个方面，基于待扩增基因中存在的内含子序列设计PCR引物和探针。在这种实施方案中，引物/探针设计的第一步是描述基因内的内含子序列。这可以通过公共可用的软件进行，如Kent，W.J.，GenomeRes.12(4)：656-64(2002)研发的DNABLAT软件，或者通过BLAST软件包括其变化形式。后续步骤遵循充分确立的PCR引物和探针设计方法。
为了避免非特异性信号，实用的做法是在设计引物和探针的时候遮蔽内含子内的重复序列。这可以利用可通过贝勒医学院(BaylorCollegeofMedicine)在线获得的重复序列遮蔽程序(RepeatMaskerprogram)容易地实现，其针对重复元件文库筛选DNA序列，并返回遮蔽了重复元件的查询序列。然后可以利用遮蔽的序列设计引物和探针序列，使用任何可商购的或以其他方式公共可用的引物/探针设计包如PrimerExpress(应用生物系统公司，AppliedBiosystems)；MGBassay-by-design(应用生物系统公司，AppliedBiosystems)；Primer3(SteveRozen和HelenJ.Skaletsky(2000)Primer3ontheWWWforgeneralusersandforbiologistprogrammersin：KrawetzS，MisenerS(编辑)BioinformaticsMethodsandProtocols：MethodsinMolecularBiology.HumanaPress，Totowa，NJ，pp365-386)。
PCR引物设计中考虑的最重要的因素包括引物长度、解链温度(Tm)和G/C含量、特异性、互补引物序列和3’端序列。一般而言，最佳PCR引物长度通常为17-30个碱基，并含有大约20-80％，例如大约50-60％G+C碱基。通常优选解链温度50至80℃，例如大约50至70℃。有关PCR引物和探针设计的更多指南，参阅例如Dieffenbach，C.W.等，GeneralConceptsforPCRPrimerDesignin：PCRPrimer，ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，NewYork，1995，第133-155页；Innis和Gelfand，OptimizationofPCRsin：PCRProtocols，AGuidetoMethodsandApplications，CRCPress，London，1994，第5-11页；和Plasterer，T.N.Primerselect：Primerandprobedesign.MethodsMol.Biol.70：520-527(1997)，特此将其全部公开内容明确并入作为参考。
微阵列分析
差异表达也可以利用微阵列技术鉴定或证实。因此，可以利用微阵列技术在新鲜或者石蜡包埋的肿瘤组织中测定CCPM的表达谱。在这种方法中，在微芯片基质上镀上或排置目的多核苷酸序列(包括cDNA和寡核苷酸)。阵列序列(即捕获探针)随之与来自目的(即靶)细胞或组织的特异性多核苷酸杂交。通过RT-PCR方法一样，RNA的来源通常为从人肿瘤或肿瘤细胞系以及对应的正常组织或细胞系中分离的总RNA。因此，RNA可以分离自多种原发性肿瘤或肿瘤细胞系。如果RNA的来源是原发性肿瘤，则可以例如从冷冻或贮存的福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)组织样品以及固定(如福尔马林固定)组织样品中提取RNA，这些样品在日常的临床实践中都是常规制备和保存的。
在微阵列技术的具体实施方案中，向基质上施加PCR扩增的cDNA克隆插入物。基质可以包括多达1、2、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50或75种核苷酸序列。在其他方面，基质可以包括至少10,000种核苷酸序列。固定在微芯片上的微阵列序列适合于在严谨条件下杂交。在其他实施方案中，微阵列靶标的长度可以为至少50、100、200、400、500、1000或2000个碱基；或者50-100、100-200、100-500、100-1000、100-2000或500-5000个碱基。在另外的实施方案中，微阵列捕获探针的长度可以为至少10、15、20、25、50、75、80或100个碱基；或者10-15、10-20、10-25、10-50、10-75、10-80或20-80个碱基。
通过反转录提取自目的组织的RNA，掺入荧光核苷酸，可以生成荧光标记的cDNA探针。施加到芯片上的标记cDNA探针与阵列上的每个DNA斑点特异性地杂交。严谨洗涤以除去非特异性结合的探针之后，通过激光共聚焦显微镜或通过其他检测方法如CCD照相机扫描芯片。各阵列元件的杂交定量能够评估对应mRNA的丰度。利用双色荧光，由两种RNA来源生成的独立标记的cDNA探针成对地与阵列杂交。从而对应于各指定基因的两种来源转录物的相对丰度得以同时确定。与此相关的示例性方案在实施例4中详细描述。
所述小型规模的杂交提供了便利快速评价大量基因表达模式的手段。这类方法已经证明具有检测稀有转录物以及可再现地检测至少大约两倍的表达水平差异所需的灵敏性，其中所述稀有转录物在每个细胞中仅以少数几个拷贝表达(Schena等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA93(2)：106-149(1996))。微阵列分析可以通过可商购的设备遵循生产商的方案进行，例如利用AffymetrixGenChip技术、Illumina微阵列技术或Incyte微阵列技术。研发大规模分析基因表达的微阵列法使得我们有可能在多种肿瘤类型中系统寻找有关癌症分类和结果预测的分子标志物。
RNA分离、纯化和扩增
用于mRNA提取的一般方法在本领域众所周知，并公开在分子生物学的标准教科书中，包括Ausubel等，CurrentProtocolsofMolecularBiology，JohnWileyandSons(1997)。例如，用于石蜡包埋组织RNA提取的方法包括在Rupp和Locker，LabInvest.56：A67(1987)，以及DeSandres等，BioTechniques18：42044(1995)中。特别是，可以利用来自商业生产商如Qiagen的纯化试剂盒、成套缓冲液和蛋白酶按照生产商的说明进行RNA分离。例如，可以利用QiagenRneasy微型柱自培养细胞分离总RNA。其他可商购的RNA分离试剂盒包括MasterPure全DNA和RNA纯化试剂盒(EPICENTRE公司(D，Madison，WI)和ParaffinBlockRNA分离试剂盒(Ambion有限公司)。可以利用RNAStat-60(Tel-Test公司)分离来自组织样品的总RNA。例如，可以通过氯化铯密度梯度离心分离由肿瘤制备的RNA。
利用固定石蜡包埋组织作为RNA来源进行基因表达谱研究的代表性方案的步骤包括mRNA分离、纯化、引物延伸和扩增，这在多种发表的期刊文章中提供(例如：T.E.Godfrey等J.Molec.Diagnostics2：84-91(2000)；K.Specht等，Am.J.Pathol.158：419-29(2001))。简言之，代表性方法始于切割大约10μm厚的石蜡包埋肿瘤组织样品切片。然后提取RNA，除去蛋白质和DNA。分析RNA浓度之后，如果必要的话，可以包括RNA修复和/或扩增步骤，并利用基因特异性启动子反转录RNA，接着进行RT-PCR。最后，分析数据，以基于在所研究的肿瘤样品中鉴定到的特征性基因表达模式来鉴定患者可用的最佳治疗选择。
免疫组织化学和蛋白质组学
免疫组织化学法也适合于检测本发明增生标志物的表达水平。因此利用特异于各标志物的抗体或抗血清、优选多克隆抗血清、最优选单克隆抗体检测表达。可以通过，例如用放射性标记、荧光标记、半抗原标记如生物素、或酶如马辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶直接标记抗体本身，来检测抗体。可选地，未标记的一抗与标记的二抗联合使用，包括特异于一抗的抗血清、多克隆抗血清或单克隆抗体。免疫组织化学方案和试剂盒在本领域众所周知并且可以商购。
蛋白质组学可用于分析某个时间点样品(如组织、器官或细胞培培养物)中存在的多肽。特别是，蛋白质组学技术可用于评估样品中多肽表达的全局变化(也称为表达蛋白质组学)。蛋白质组学分析通常包括：(1)通过二维凝胶电泳(2-DPAGE)分离样品中的个体多肽；(2)鉴定从凝胶中回收的个体多肽，例如通过质谱法或N-末端测序法，和(3)利用生物信息学分析数据。蛋白质组学方法对于其他基因表达谱研究方法是有价值的补充，并且可以单独或与其他方法组合使用，以检测本发明增生标志物的产物。
使用选择标志物的核酸探针的杂交方法
这些方法包括使核酸探针结合到支持物上，并在适宜的条件下与来源于测试样品的RNA或cDNA杂交(Sambrook，J.，EFritsch，E.和TManiatis，《分子克隆实验指南》，第3版，冷泉港实验室出版社：冷泉港(2001))。这些方法可应用于来源于肿瘤组织或体液样品的BTM。RNA或cDNA制品通常用荧光或放射性分子标记，以便能够检测和定量。在一些应用中，杂交DNA可以用荧光标记的支链结构进行标记，以增强信号强度(Nolte，F.S.，BranchedDNAsignalamplificationfordirectquantitationofnucleicacidsequencesinclinicalspecimens.Adv.Clin.Chem.33，201-35(1998))。通过在低盐溶液如0.1×SSC，0.5％SDS中彻底洗涤除去未杂交的标记，之后通过荧光检测或凝胶图像的密度计量法对杂交量进行定量。支持物可以是固相的，如尼龙或硝酸纤维素膜，或包括在液体悬浮液中杂交的微球或珠子。为进行洗涤和纯化，珠子可以是磁性的(Haukanes，B-I和Kvam，C.，Applicationofmagneticbeadsinbioassays.Bio/Technology11，60-63(1993))或荧光标记的，以能够进行流式细胞仪计数(参见例如：Spiro，A.，Lowe，M.和Brown，D.，ABead-BasedMethodforMultiplexedIdentificationandQuantitationofDNASequencesUsingFlowCytometry.Appl.Env.Micro.66，4258-4265(2000))。
杂交技术的一种变化形式是QuantiGenePlex测定法(Genospectra公司，弗里蒙特市(Fremont))，其将荧光珠支持物和支链DNA信号扩增结合在一起。杂交技术的又一种变化形式是QuantikinemRNA测定法(安迪系统公司(R&DSystems)，明尼阿波利斯市(Minneapolis))。方法如生产商的说明所述。简言之，该测定法使用与地高辛缀合的寡核苷酸杂交探针。利用与碱性磷酸酶偶联的抗地高辛抗体通过比色法检测杂交。
其他方法在本领域众所周知，故此处无需赘述。
酶联免疫试验(ELISA)
简言之，在夹心ELISA试验中，将抗BTM的多克隆或单克隆抗体结合在固相支持物(Crowther，J.R.TheELISAguidebook.HumanaPress：NewJersey(2000)；Harlow，E.和Lane，D.，Usingantibodies：alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress：ColdSpringHarbor(1999))或悬浮珠上。其他方法在本领域公知，故此处无需赘述。单克隆抗体可以是杂交瘤来源的或选自噬菌体抗体文库(HustM.和DubelS.，Phagedisplayvectorsfortheinvitrogenerationofhumanantibodyfragments.MethodsMolBiol.295：71-96(2005))。非特异性结合位点用非靶蛋白质制品和洗涤剂封闭。然后使捕获抗体与含BTM抗原的尿或组织制品一起孵育。洗涤混合物，之后使抗体/抗原复合物与检测靶BTM的二抗一起孵育。二抗通常与荧光分子或其他报告分子缀合，所述分子能够在酶促反应中或用缀合于报告分子的第三抗体检测(Crowther，同前)。可选地，在直接ELISA中，可以使含BTM的制品结合到支持物或珠子上，并用抗体-报告分子缀合物直接检测靶抗原(Crowther，同前)。
生产单克隆抗体和多克隆抗血清的方法在本领域众所周知，故此处无需赘述。
免疫检测
该方法也可用于免疫检测切除肿瘤手术前后采集的膀胱癌患者血清或血浆中的标志物家族成员；免疫检测其他癌症患者的标志物家族成员，所述癌症包括但不限于：结肠直肠癌、胰腺癌、卵巢癌、黑素瘤、肝癌、食道癌、胃癌、子宫内膜癌和脑癌；以及免疫检测膀胱癌患者尿液和大便中的标志物家族成员。
也可以利用其他标准免疫检测技术如免疫印迹或免疫沉淀检测组织或尿液中的BTM(Harlow，E.和Lane，D.，Usingantibodies：alaboratorymanual.ColdSpringHarborLaboratoryPress：ColdSpringHarbor(1999))。在免疫印迹中，含BTM的组织或体液蛋白质制品通过聚丙烯酰胺凝胶在变性或非变性条件下进行电泳。然后将蛋白质转移到膜支持物如尼龙上。然后如免疫组织化学所述的那样使BTM与单克隆或多克隆抗体直接或间接反应。可选地，在一些制品中，可以将蛋白质直接点样到膜上，而无需预先电泳分离。可以通过密度计量法定量信号。
在免疫沉淀中，含BTM的可溶性制品与抗BTM的单克隆或多克隆抗体一起孵育。然后使反应产物与由琼脂糖或聚丙烯酰胺制成的、共价附着了蛋白质A或蛋白质G的惰性珠一起孵育。蛋白质A或G珠与抗体特异性相互作用，形成结合在珠子上的固定化抗体-BTM-抗原复合物。洗涤之后，可以通过免疫印迹或ELISA检测和定量结合的BTM。
阈值确定
对于使用下调BTM的比值或回归分析的检验，获得的阈值将能够使样品确定为TCC阳性或阴性。这些阈值将通过分析正进行TCC存在研究的患者群组予以确定。阈值可随着不同的检验应用而变；例如，用于群体筛选检验的阈值将利用很大程度上免除了泌尿科症状的患者群组予以确定，而且这些阈值可以有别于TCC复发监视中的患者、或正进行泌尿科症状如血尿存在研究的患者的检验阈值。可以选择阈值以便在所需的临床环境中提供可行水平的检验特异性；也就是说，特异性允许合理的灵敏性，而没有过多的患者拿到假阳性结果。这种特异性可以落在80-90％的范围。获得检验阈值的可选的方法是利用不同检验阈值的灵敏性对特异性作图(ROC曲线)，然后选择曲线的拐点。
作为单独阈值的可选方案，检验可以应用检验区间，提供不同程度的疾病存在可能性，且具有与之相关的不同临床后果。例如，检验可以具有三个区间；一个与高危(如90％)TCC存在相关，第二个与低危TCC相关，而第三个视为疑是患病。“疑是”区间可以附有在规定时间段内复检的建议。
在尿液中检测膀胱癌标志物的方法
在多个实施方案中，可以期望对尿样进行BTM测定。一般而言，在这些体液中测定寡核苷酸、蛋白质和肽的方法在本领域公知。不过，出于举例说明的目的，可以利用夹心酶联免疫吸附试验(ELISA)定量BTM的尿液水平。对于血浆或血清测定，向微量滴定板孔中添加5μL小份适当稀释的样品或系列稀释的标准BTM和75μL过氧化物酶缀合的抗人BTM抗体。经30℃30分钟孵育期之后，各孔用0.05％Tween20的磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤以去除未结合的抗体。然后使结合的BTM和抗BTM抗体复合物与含邻苯二胺的H2O2于30℃一起孵育15分钟。通过添加1MH2SO4终止反应，并用微量滴定板读书器测量492nm处的吸收值。应当理解抗BTM抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗血清。
因为许多蛋白质或(1)为细胞分泌，或(2)自细胞膜切割，或(3)在细胞死亡时自细胞上消失，或(4)包含在脱落细胞内，将会理解也可以在尿液中检测BTM。另外，膀胱癌的诊断可以通过测量样品中BTM的表达或者样品中BTM的累积予以确定。现有技术的诊断方法包括膀胱镜检、细胞学检查和检查这些方法过程中提取的细胞。这类方法有赖于尿液中、或尿道上皮拭样中、或其他情况下膀胱壁活检标本中肿瘤细胞的鉴定。这些方法受累于多种类型的误差，包括取样误差，不同观测人员之间的鉴定误差，等等。
膀胱肿瘤标志物抗体
在其他方面，本发明包括抗BTM抗体的制备。利用本文所述的方法，能够通过微阵列和/或qPCR法鉴定新的BTM。推定的标志物一经鉴定，就能够足量生产，以适于引发免疫应答。在一些情况下，可使用全长BTM，而在其他情况下，BTM的肽片段可能足以用作免疫原。可将免疫原注射到适宜的宿主(如小鼠、兔子等)中，并且如果期望的话，还可以注射佐剂如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，以增强免疫应答。本领域技术人员能够理解，制备抗体是免疫学领域常规的，故此处无需赘述。因此，人们能够生产针对利用本文所述方法鉴定的BTM的抗体。
又在另一实施方案中，可以针对本文鉴定的肿瘤标志物的蛋白质或蛋白质核心、或者针对独特于BTM的寡核苷酸序列制备抗体。虽然某些蛋白质可以被糖基化，但是糖基化模式的变化在某些情况下会导致误检缺乏常见糖基化模式形式的BTM。因此，在本发明的某些方面中，BTM免疫原可以包括去糖基化的BTM或去糖基化的BTM片段。去糖基化可以利用本领域公知的一种或多种糖苷酶实现。可选地，可以在糖基化缺陷型细胞系中表达BTMcDNA，如原核细胞系，包括大肠杆菌(E.coli)等等。
可以制备载体，其中含有BTM编码寡核苷酸。许多这样的载体可以以本领域公知的标准载体为基础。可以利用载体转染多种细胞系以产生BTM生产细胞系，其可用于生产期望量的BTM，以用于研发检测BTM的特异性抗体或其他试剂，或用于标准化所研发的BTM测定法。
试剂盒
基于本发明的发现，可以考虑和生产多种类型的测试试剂盒。首先，可以制备试剂盒，其具有预载检测分子(或“捕获试剂”)的检测装置。在检测BTMmRNA的实施方案中，这样的装置可以包括基质(如玻璃、硅、石英、金属等)，其上结合作为捕获试剂与待检测mRNA杂交的寡核苷酸。在一些实施方案中，通过使mRNA(标记有cy3、cy5、放射性或其他标记)与基质上的寡核苷酸杂交可以实现的mRNA直接检测。在其他实施方案中，mRNA的检测可以通过首先制备期望mRNA的互补DNA(cDNA)实现。然后，标记的cDNA可与基质上的寡核苷酸杂交并进行检测。
抗体也可以在试剂盒中用作捕获试剂。在一些实施方案中，基质(如多孔板)上可附着有特异性的BTM捕获试剂。在一些实施方案中，试剂盒中可包括封闭试剂。封闭试剂可用于降低非特异性结合。例如，使用不含BTM寡核苷酸的任何便利来源的过量DNA如鲑鱼精DNA，可以降低非特异性寡核苷酸结合。使用过量的封闭蛋白质如血清白蛋白，可以非特异性抗体结合。本领域普通技术人员能够理解，众多检测寡核苷酸和蛋白质的方法在本领域公知，可以利用能够特异性检测BTM相关分子的任何策略，并认为落入本发明的范围内。
除了基质，测试试剂盒可以包括捕获试剂(如探针)、洗涤溶液(如SSC、其他盐、缓冲液、洗涤剂等等)，以及检测部分(如cy3、cy5、放射性标记等等)。试剂盒可以还包括使用说明和包装。
用于检测膀胱癌I的BTM比值
在一个系列的实施方案中，用于检验BTMLTBDH4联合过表达BTM的试剂可以掺入到用于检验未分级的尿液或尿液细胞沉淀物的试剂盒中，以检测膀胱癌。可以从诊断为膀胱癌需要监控疾病进程或治疗反应的患者、患有泌尿科症状包括肉眼或显微性血尿的个体、或无症状个体采集尿样。对于正以测量未分级尿液中的BTM的试剂盒进行检验的患者或个体，可采集大约2ml尿样进行检验。对于尿沉淀物检验，可以采取>10ml的尿液。
适宜的试剂盒包括(i)关于使用和结果解释的说明书，(ii)用于解释多基因分析的软件，包括任何回归分析分类器或公式，(iii)用于从未分级的尿液或尿沉淀物中稳定和纯化RNA的试剂，(iv)用于合成cDNA的试剂，包括dNTP和反转录酶，和(v)用于定量BTMcDNA的试剂。在一种形式中，这些试剂可用于定量PCR，包括特异性的跨外显子的寡核苷酸引物，用检测探针标记的第三寡核苷酸，Taq聚合酶以及PCR所需的其他缓冲剂、盐和dNTP。试剂盒还可以利用检测转录物的其他方法，如BTMRNA与标记探针的直接杂交或支链DNA技术；以及(vi)用于检测来自高转录基因如β肌动蛋白的转录物的寡核苷酸和探针，以用作质量控制的度量。
利用BTM比值评价膀胱癌的发展
为评价膀胱肿瘤的发展，通过膀胱壁活检获得组织样品或随着时间从膀胱癌患者采集尿样。对不同时间采集的样品进行BTM比值或其组合的评价。落入规定范围的BTM比值指示膀胱癌的发展。
利用BTM比值评价膀胱癌的治疗
为评价膀胱肿瘤的治疗功效，在起始治疗之前获得组织和/或尿液样品。确定一个或多个BTM的基线水平，并确定多种BTM彼此之间的比值。起始治疗，这可以包括本领域公知的任何治疗，包括对于疾病类型和阶段而言适宜的外科手术、放射治疗或化疗。在治疗过程中，采集组织和/或尿液样品，并分析BTM的存在和量。确定多种BTM的比值，并将结果与：(1)治疗前患者的基线水平或(2)从未患膀胱癌个体群获得的正常值进行比较。
利用BTM比值监测TCC治疗的进程
除了快速诊断和早期检测TCC，在组织、血清或尿液中检测到的BTM标志物比值还可以用于监测患者对于治疗的反应。在这些应用中，可以在起始系统、囊泡内(intravesicular)或血管内化疗、放射治疗或免疫治疗之后每隔一段时间采集尿液和/或血清样品。标志物比值的变化能够指示肿瘤尺寸的减小，指示有效的治疗。变化速率可用于预测每位患者或每种治疗的最佳治疗剂量。
BTM回归分析的应用
除了BTM比值，包括高和低表达BTM家族成员的分析或分类分析也可用于上述应用。
评价的标志物选自已知的人类基因。评价的基因示于图3和4。图3和4中包括基因名称、HUGO标识符、MWG寡聚物编号、NCBImRNA索引序列号和蛋白质索引号。全长序列可见：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/。
实施例
本文所述的实施例仅用于举例说明本发明实施方案的目的，而并非旨在限制本发明的范围。其他实施方案、分析方法和类型落入分子诊断领域普通技术人员的能力范围内，故无需就此详述。基于本文教导的本领域范畴内的其他实施方案视为本发明的一部分。
方法
肿瘤采样
由日本京都大学医院(KyotoUniversityHospital)切除的外科手术标本采集膀胱肿瘤样品和非恶性尿道上皮样品。
尿液采样
从日本京都大学医院获得来自非恶性对照和膀胱癌患者的尿样。健康对照样品由日本志愿者获得(图1)。
RNA提取
肿瘤组织在TriReagent:水(3:1)混合物中匀浆化，然后进行氯仿抽提。利用RNeasyTM方法(Qiagen)从水相中纯化总RNA。还从16种癌细胞系中提取RNA，合并，用作参照RNA。
通过混合尿样和等体积的裂解缓冲液(5.64M盐酸胍，0.5％sarkosyl，50mM乙酸钠(pH6.5)和1mMβ-巯基乙醇；用1.5MHepespH8将pH调至7.0)，从尿液中提取RNA。由于尿液中RNA的量低，向尿液/裂解缓冲液混合物中添加7.5μg细菌总RNA作为载体。然后利用Trizol和RNeasyTM方法提取总RNA。在进行cDNA分析之前，利用QiagenQIAquickTMPCR纯化试剂盒进一步纯化RNA制品。
对通过在3.6％葡聚糖中沉降而自全血中富集的细胞进行Trizol/RNeasyTM提取，从三位健康志愿者的血液中提取RNA。
微阵列载片制备
利用GeneMachines微阵列分配机器人根据生产商的方案向环氧树脂涂层的玻璃载片(MWG生物技术公司)上印制～30,00050mer的寡核苷酸(MWG生物技术公司)。
RNA标记和杂交
利用SuperscriptIITM反转录酶(英骏公司，Invitrogen)在含5-(3-氨基烯丙基)-2’脱氧尿苷-5’三磷酸的反应中从5μg总RNA转录cDNA。反应产物然后在Microcon柱上去离子化，之后与Cy3或Cy5在重碳酸盐缓冲液中于室温一起孵育1小时。利用Qiaquick柱(Qiagen公司)除去未掺入的染料，并在SpeedVac中将样品浓缩至15μl。然后将Cy3和Cy5标记的cDNA与AmbionULTRAhybTM缓冲液混合，于100℃变性2分钟，并在杂交室中与微阵列载片42℃杂交16小时。然后洗涤载片，并在Axon4000ATM扫描仪中以两个功率设置扫描两次。
癌标志物基因的微阵列分析
来自53种膀胱肿瘤和20种非恶性(“正常”)膀胱组织样品的RNA用Cy5标记，并一式双份或一式三份与Cy3标记的参照RNA杂交。标准化之后，随之通过倍数变化和统计学概率估算29,718种每一种基因表达的变化。
标准化方法
通过扣除局部背景强度校正GenepixTM软件所检测的中值荧光强度。排除背景校正后强度低于零的斑点。为便于标准化，对强度比值和斑点总体强度进行对数转换。利用LOCFITTM包中执行的局部回归分析对对数强度比值进行染料和空间偏差校正。对数强度比值相对于斑点总体强度和位置进行同步回归。局部回归的残差(residuals)提供校正的对数倍数变化。为进行质量控制，将各标准化微阵列的比值相对于斑点强度和位置进行作图。随后视觉检查绘图中任何余留的伪差(artifact)。另外，还应用ANOVA模型检测针头(pin-tip)偏差。标准化的所有结果和参数加入Postgres数据库中进行统计学分析。
统计学分析
为改善阵列之间所测倍数变化的比较，换算成log2(比值)以使每个阵列具有相同的总体标准偏差。这种标准化降低组织类型可变性中的平均值。利用基于倍数变化的秩检验提高噪声鲁棒性。该检验包括两步：(i)计算阵列内的倍数变化秩(Rfc)，和ii)从肿瘤组织的中值(Rfc)中扣除正常组织的中值(Rfc)。两种中值秩的差异界定了倍数变化秩得分。还对标准化数据进行了三种另外的统计学检验：1)两样本studentt检验、2)Wilcoxon检验和3)微阵列统计学分析(SAM)。对于每种统计学方法(秩倍数变化、t检验、Wilcoxon检验和SAM)确定的最显著下调的基因赋予每种检验的秩得分。然后所有秩得分相加求秩得分和。
从尿液RNA合成cDNA
尿液总RNA与每种膀胱肿瘤标志物的基因特异性引物退火，在含0.01μg/μl正向引物的50μl反应体系中于70℃一起孵育，然后在冰上冷却1分钟。各cDNA反应体系含有退火的RNA和4μl5×SuperscriptII反转录酶缓冲液(美国英骏公司，Invitrogen)，2μl0.1MDTT(美国英骏公司，Invitrogen)，0.5μlRNaseout(40U/μL)(美国英骏公司，Invitrogen)，4μl10mMdNTP(美国英骏公司，Invitrogen)和0.5μlSuperscriptII反转录酶(200U/μl)(美国英骏公司，Invitrogen)，终体积20μl。反应体系在42℃孵育1小时，70℃孵育10分钟，80℃孵育1分钟。在进行qPCR之前，反应产物用QiagenQIAquickPCR纯化柱(Qiagen公司，维多利亚，澳大利亚)净化，并贮存在-80℃。
定量实时PCR
利用实时或定量PCR(qPCR)进行PCR模板拷贝数的绝对或相对定量。利用PrimerExpressV2.0TM(应用生物系统公司，AppliedBiosystems)设计TaqmanTM探针和引物集合。可能的情况下，所有潜在的剪接变体都包括在所产生的扩增子中，其中优选的扩增子是MWG-Biotech来源的微阵列寡核苷酸所涵盖的区域。引物和探针序列如图2所示。可选地，如果靶基因呈现在涵盖期望扩增子的Assay-on-DemandTM表达测定系统(应用生物系统公司，AppliedBiosystems)中，则可以使用之。在内部设计的测定中，利用SYBR绿标记方案和由参照RNA制备的cDNA来滴定引物浓度。在ABIPrismTM7000序列检测系统中在标准循环条件下进行扩增。当在解离曲线中观察到单独的扩增产物时，利用最佳引物浓度和终浓度250nM的5’FAM-3’TAMRA磷酸TaqmanTM探针(Proligo公司)在625倍浓度范围内生成标准曲线。给出回归系数0.98的标准曲线的测定用于随后的分析。
测定在96孔板中进行。各板含有625倍浓度范围的参照cDNA标准曲线。对于尿液qPCR，各反应使用从～0.5ml未分级的尿液中提取的总RNA。计算各标志物的ΔCt(靶基因Ct-平均参照cDNACt)，并用于随后的比值、回归或分类分析。
血液中标志物的表达
计算机硅片(insilico)确定图3和4所示标志物在全血中的表达。微阵列探针借助于其靶mRNA的GenBank登录号以及来自UniGene的用于确定血库中表达序列标签(EST)数的组织表达谱而与UniGene簇关联起来。图4仅仅显示了具有0或1个表达序列标签(EST)的基因。为了证实LTB4DH在全血中的低表达，利用图2所示的引物和探针对从全血提取的总RNA进行了RT-qPCR。没有观察到显著表达(结果未示出)。
下调膀胱癌标志物的鉴定
为鉴定下调的膀胱癌标志物，我们利用30,000个寡核苷酸芯片对来自53种膀胱肿瘤和20种非恶性膀胱组织样品的RNA进行了微阵列研究。图3显示了300个基因的微阵列数据统计学分析，与非恶性组织相比，它们在膀胱癌组织中显示出显著下调。图3包括HUGO基因名称和符号、蛋白质索引序列号、NCBImRNA索引序列号、MWGBiotech寡核苷酸探针编号、肿瘤和非恶性组织之间基因表达的中值倍数变化、原始未调整Studentt检验的结果、两样本Wilcoxon检验的结果、SAM检验的结果以及秩得分的加和。
用于膀胱癌尿检的优选低表达膀胱肿瘤标志物的鉴定
由于血尿是常见的膀胱癌并发症，最好膀胱癌标志物在全血中不显著升高。另外，由于在比值、回归或分类分析中使用下调的标志物，最好它们在肿瘤细胞和非恶性膀胱细胞中均以足够高的拷贝数存在，以能够可靠地进行尿液检测。为鉴定适宜的标志物，我们在图3的基因中筛选在血液EST文库中极少或不呈现，而且在非恶性组织中具有高于中值的表达的基因子集。通过对阵列上的30,000个寡核苷酸按其微阵列研究中的样品中值强度求秩来估算中值表达。符合标准的标志物示于图4。图4包括HUGO基因名称和符号、蛋白质索引序列号、NCBImRNA索引序列号、中值倍数变化、秩得分、肿瘤组织和非恶性组织中微阵列斑点强度的中值秩、以及血液EST文库中存在的EST数。
阵列数据中所观察到的下调通过图4所示三种基因即LTB4DH、BAG1和FLJ21511的qPCR得到验证。对来自10种肿瘤样品和10种非恶性样品的总RNA测试了这些基因。在这些样品中，与膀胱非恶性组织相比，膀胱肿瘤中的LTB4DH、BAG1和FLJ21511分别显示出2.5倍、1.4倍和6.1倍的平均下调。
使用LTB4DH的尿液qPCR分析
通过排尿或者导尿管采集TCC患者和非恶性泌尿科病情对照的尿液。从42名对照的排尿以及37名TCC患者的排尿或导尿管尿中提取总RNA，并进行定量RT-PCR，使用针对LTB4DH和三种过表达标志物即IGFBP5、MDK和HoxA13的引物和探针。确定IGFBP5/LTB4DH、MDK/LTB4DH和HoxA13/LTB4DH的ΔCt比值。此数据图示为图5的盒须图，其中显示了对照和TCC患者尿样的三种检验中每一种的数据分布之间清楚的差异。最准确的检验为IGFBP5/LTB4DH，它在此样品组中分布显示出87％和88％的灵敏性和特异性(图6a)。为图解说明这些检验中每一种的灵敏性和特异性之间的对应性，图7显示了ROC曲线。IGFBP5/LTB4DH、MDK/LTB4DH和HoxA13/LTB4DH的曲线下面积分别为0.9223、0.9199和0.7497。衡量检验准确性的这些面积表明所有LTB4DH的三种比值均为可用的检验，特别是IGFBP5/LTB4DH和MDK/LTB4DH。
为提高TCC检测的灵敏性和特异性，组合使用两种检验。这些检验组合的最佳灵敏性和特异性示于图6b。图8a-f显示了使用LTB4DH和BAG1的三种检验中每一种的二维空间数据分离。此数据显示，包括下调的BTMLTB4DH或BAG1两者中任一的、两种或多种检验的组合，能够获得90％以上的灵敏性和特异性。而且，由于这些检验单纯测定基因表达标签而不是标志物的绝对水平，将具有尿液浓度变化的鲁棒性。
为了证明包括LTB4DH比值的检验的尿液浓度鲁棒性，单独将IGFBP5(ΔCt)以及IGFBP5/LTB4DH的水平作为尿液浓度的函数进行作图(图9a-b)，并使趋势线与数据拟合。可以观察到，对于来自非恶性对照和TCC患者的尿样，均出现IGFBP5ΔCt随尿样浓度升高而下降，而IGFBP5/LTB4DH比值则不存在这种现象。非恶性样品中这种效应最为明显，因为在IGFBP5和LTB4DH表达方面不存在其他影响因素如肿瘤尺寸和肿瘤异质性。
在一些情况下，当膀胱癌测定应用单个的标志物时，由于采集的脱落膀胱细胞数目的变化，尿样采集方法可以影响检测的标志物的量。这种偏差可以引起小比例样品的假阳性或假阴性结果。应用包括LTB4DH或其他低表达基因的比值将补偿不同方法的不足。为检验这种假想，对通过简单排尿(9份样品)或导尿管(28份样品)自TCC患者采集的样品检验TCC标志物和LTB4DH的存在。单独分析TCC标志物表明排尿样品更严重地呈现低端数据范围(更高的Ct)，与之一致的是这些样品中脱落细胞的平均数目比导尿管样品更低。这图示于图10a-c中IGFBP5、MDK和HoxA13的自身散点图。相比之下，当计算这些标志物与LTB4DH之间的比值时，排尿和导尿管样品分布在相似的Ct比值范围内(图10d-f)，说明计算高表达标志物和低表达标志物如LTB4DH之间的基因表达标签补偿了不同尿样采取方法所带来的标志物水平差异。
来自低级肿瘤患者的尿样的BTM累积通常处于边界线上，这是由于这些样品中仅存在小量脱落细胞。因此这些样品由于采样方法或尿液浓度变化而处于被错误分类的高风险之中。
因此，并入了下调基因的基因表达比值用于检测TCC的实用性很可能在检测低级TCC的应用中较为明显。为证明此效应，用标志物IGFBP5、HoxA13和LTB4DH对一组来自低级TCC患者的43份排尿尿样和123份对照进行检验。所述群组的临床特征总结于图13。单独分析IGFBP5和HoxA13的qPCR数据或它们与LTB4DH的比值，利用ROC曲线下面积衡量检验的准确性(STATA统计包)。结果总结于图14。使用IGFBP5标志物的情况下，LTB4DH使低级(1-2级)Ta期TCC检测的准确性提高9％，使任何阶段低级TCC检测的准确性提高8％。LTB4DH使低级Ta期TCCHoXA13检验的准确性提高3％。
使用LTB4DH的qPCR数据的线性判别分析
线性判别分析(LDA)为统计学技术(FisherR.A.“TheUseofMultipleMeasurementsinTaxonomicProblems”，AnnalsofEugenics7179(1936))，其中生成变量的线性组合，从而两组或多组之间存在最大分离。这种变量的线性组合称为“线性判别”，为输入变量的线性函数，最大程度地分离数据集的类别。可以利用交叉验证法来检验LDA(或任何其他分类技术)表征特定数据集如qPCR数据的能力。在此方法中，部分数据集用于生成分类器，部分数据集用于测量该分类器的有效性。数据集分割为训练集和检验集的过程可重复多次(每次生成新的分类器)。在k折交叉验证中，数据集分成k份，每个子集在为数k轮训练和验证的一轮中用作检验集。这可以扩展为留一法交叉验证(leave-one-outcross-validation，LOOCV)，其中根据数据集中剩余样品生成的分类器对每个样品进行分类(“留出一个”；留出正在检验的样品)。
LDA和LOOCV用来阐释下调的BTM、LTB4DH在改善TCC诊断方面的实用性。首先对图13所述的对照和TCC尿样群组进行qPCR，并增补另外30份3级肿瘤(5>1期，13＝1期，4＝Tis期，8＝Ta期)。对六种基因即LTB4DH、MDK、IGFBP5、HOXA13、TOP2a和CDC2的组合进行了分类器性能检验，通过LOOCV判断。利用后验概率(“留出”的样品为TCC样品)生成ROC曲线，使用的是R统计编程环境的ROCR包。通过参考适当的ROC曲线获得给定特异性下的分类器灵敏性。
在85％的特异性下，测定了利用有或无LTB4DH的上调BTM的组合检测TCC的灵敏性。此分析的结果示于图15。可以观察到，在包括上调BTMMDK、IGFBP5、Top2a、cdc2和HoxA13组合的测定中添加LTB4DH，使总体灵敏性提高1-2％，使检测Ta期肿瘤、1-2级肿瘤和3级肿瘤的灵敏性提高高达3％。
在前述说明书提及具有公知等同物的整体或构件的情况下，这样的等同物特此并入，就如同单独列出一样。
虽然通过举例及其可能的实施方案对本发明进行了说明，但是应当理解，可以对之进行改进和/或改变而不偏离本发明的范围或精神。
工业实用性
检测BTM家族成员的方法包括利用微阵列和/或实时PCR法检测核酸、蛋白质和肽。本发明的组合物和方法可用于诊断疾病，评价治疗功效，以及用于生`产适于测定BTM家族成员表达的试剂和测试试剂盒。

Claims (8)

1.检测样品中至少两种肿瘤标志物TM家族成员的表达水平的试剂在制备用于检测受试者膀胱癌的试剂盒中的用途，其中至少一种TM为低表达的TM，至少一种TM是过表达的TM，其中通过测定低表达TM与过表达TM的表达的比值确立癌症的存在，其中过表达的TM选自CDC2、MDK、HOXA13和IGFBP5，低表达的TM选自LTB4DH和BAG1 。
2.权利要求1的用途，其中所述试剂检测TMmRNA的表达 。
3.权利要求1的用途，其中所述试剂检测TM蛋白的表达 。
4.权利要求1的用途，其中所述试剂检测TM肽的表达 。
5.权利要求1的用途，其中检测使用活检、血液、血清、腹腔冲洗液、脑脊髓液、尿和大便样品中的任一进行 。
6.确定受试者存在膀胱癌的试剂盒，包括：
基质；
至少两种TM捕获试剂，其中至少一种TM是低表达的TM，至少一种TM是过表达的TM；和
使用说明；
其中通过测定低表达TM与过表达TM的表达的比值确立癌症的存在，其中过表达的TM选自CDC2、MDK、HOXA13和IGFBP5，低表达的TM选自LTB4DH和BAG1 。
7.权利要求6的试剂盒，其中所述TM捕获试剂是TM特异性的寡核苷酸 。
8.权利要求6的试剂盒，其中所述TM捕获试剂是TM特异性的抗体 。
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070051286A (ko) 2004-07-23 2007-05-17 퍼시픽 에지 바이오테크놀로지 엘티디. 방광암 검출용 소변 표지
NZ545243A (en) * 2006-02-10 2009-07-31 Pacific Edge Biotechnology Ltd Urine gene expression ratios for detection of cancer
US8768629B2 (en) * 2009-02-11 2014-07-01 Caris Mpi, Inc. Molecular profiling of tumors
IL282783B2 (en) 2006-05-18 2023-09-01 Caris Mpi Inc A system and method for determining a personalized medical intervention for a disease stage
CN107254538A (zh) * 2008-11-12 2017-10-17 卡里斯生命科学瑞士控股有限责任公司 使用外来体来确定表现型的方法和系统
JP5808349B2 (ja) 2010-03-01 2015-11-10 カリス ライフ サイエンシズ スウィッツァーランド ホールディングスゲーエムベーハー セラノーシスのためのバイオマーカー
CA2795776A1 (en) 2010-04-06 2011-10-13 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. Circulating biomarkers for disease
CN102372773B (zh) * 2010-08-11 2013-06-05 中国科学院生物物理研究所 人膀胱癌肿瘤标志物及其抗体和应用
NZ589251A (en) * 2010-11-12 2014-07-25 Pacific Edge Ltd Novel marker for detection of bladder cancer
WO2016143805A1 (ja) * 2015-03-10 2016-09-15 テオリアサイエンス株式会社 膀胱がんの検出方法
EP4289965A3 (en) * 2016-02-12 2024-02-21 CureVac SE Method for analyzing rna
CA3070222A1 (en) 2016-08-05 2018-02-08 The Research Foundation For The State University Of New York Keratin 17 as a biomarker for bladder cancer
JP6885581B2 (ja) * 2017-02-06 2021-06-16 学校法人東京歯科大学 ガストリン測定におけるカットオフ値の推定方法
US20220107320A1 (en) * 2019-02-15 2022-04-07 Incelldx, Inc. Assaying Bladder-Associated Samples, Identifying and Treating Bladder-Associated Neoplasia, and Kits for Use Therein
US12014814B2 (en) * 2020-01-28 2024-06-18 GE Precision Healthcare LLC Methods and systems for tuning a static model

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002027329A2 (en) * 2000-09-25 2002-04-04 Eastern Virginia Medical School Biomarkers of transitional cell carcinoma of the bladder

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE247164T1 (de) 1991-01-08 2003-08-15 Chiron Corp Insulinartigen wachstumsfaktor bindendes protein
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
PT932678E (pt) * 1996-09-24 2006-07-31 Tanox Inc Familia de genes que codificam peptidos relacionados com apoptose, peptidos por eles codificados e metodos para sua utilizacao
US6495532B1 (en) * 1997-03-19 2002-12-17 Sky High, Llc Compositions containing lysophosphotidic acids which inhibit apoptosis and uses thereof
US6492144B1 (en) * 1997-05-30 2002-12-10 Diagen Corporation Methods for detection of nucleic acid sequences in urine
US6251638B1 (en) * 1997-05-30 2001-06-26 Diagen Corporation Methods for detection of nucleic acid sequences in urine
WO2000052204A2 (en) * 1999-02-22 2000-09-08 Orntoft Torben F Gene expression in bladder tumors
AU2001253140A1 (en) * 2000-04-03 2001-10-15 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Tumor markers in ovarian cancer
WO2002086084A2 (en) 2001-04-04 2002-10-31 Quark Biotech, Inc. Sequence characteristics of bladder cancer
DK1410011T3 (da) * 2001-06-18 2011-07-18 Netherlands Cancer Inst Diagnose og prognose for brystcancerpatienter
EP1285970A3 (en) * 2001-06-26 2004-05-19 National Taiwan University Metastasis-associated genes
US20040076955A1 (en) * 2001-07-03 2004-04-22 Eos Biotechnology, Inc. Methods of diagnosis of bladder cancer, compositions and methods of screening for modulators of bladder cancer
US20040018973A1 (en) * 2002-01-25 2004-01-29 University Of Pittsburgh Nuclear matrix protein alterations associated with colon cancer and colon metastasis to the liver, and uses thereof
US20050032065A1 (en) * 2002-06-24 2005-02-10 Afar Daniel E. H. Methods of prognosis of prostate cancer
US20040253606A1 (en) 2002-11-26 2004-12-16 Protein Design Labs, Inc. Methods of detecting soft tissue sarcoma, compositions and methods of screening for soft tissue sarcoma modulators
EP2481814A3 (en) 2003-06-09 2012-10-10 The Regents of the University of Michigan Compositions and methods for treating and diagnosing cancer
US20050014165A1 (en) * 2003-07-18 2005-01-20 California Pacific Medical Center Biomarker panel for colorectal cancer
US9856533B2 (en) * 2003-09-19 2018-01-02 Biotheranostics, Inc. Predicting breast cancer treatment outcome
JP4912894B2 (ja) * 2004-02-19 2012-04-11 イェール ユニバーシティー プロテオーム技術を使用した癌タンパク質バイオマーカーの同定
KR20070051286A (ko) 2004-07-23 2007-05-17 퍼시픽 에지 바이오테크놀로지 엘티디. 방광암 검출용 소변 표지
NZ545243A (en) * 2006-02-10 2009-07-31 Pacific Edge Biotechnology Ltd Urine gene expression ratios for detection of cancer
US20110143360A1 (en) * 2008-04-30 2011-06-16 Nec Corporation Cancer marker, method for evaluation of cancer by using the cancer marker, and evaluation reagent
US9347088B2 (en) * 2008-06-27 2016-05-24 Institut Pasteur Molecular signature of liver tumor grade and use to evaluate prognosis and therapeutic regimen

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002027329A2 (en) * 2000-09-25 2002-04-04 Eastern Virginia Medical School Biomarkers of transitional cell carcinoma of the bladder

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Shariat SF,et al.p53, p21, pRB, and p16 expression predict clinical outcome in cystectomy with bladder cancer.《J Clin Oncol》.2004,第22卷(第6期),1014-1024. *
郭正辉等.VEGF和bFGF在浅表膀胱移行细胞癌中的表达及意义.《癌症》.2003,第22卷(第3期),307-309. *

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