JP5964006B2 - 癌の検出のための尿遺伝子発現比 - Google Patents
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Description
癌患者の生存は、癌を初期に治療すると、大きく増大する。膀胱癌の場合、進行した疾患と診断された患者の約15〜30%と比較して、疾患の初期段階と診断された患者は、>90%以上の5年生存率を有する。それ故、膀胱癌の早期診断につながる進歩によって、患者の予後の改善がもたらされる。尿試料を用いた、実施されている膀胱癌検出方法は、細胞診断である。しかしながら、細胞診断は、浸潤性膀胱癌の検出には75%感度、および表在性膀胱癌の検出にはたった約25%の感度であることが知られている(Lotan and Roehrborn, Urology 61 , 109-118 (2003))。
本発明は、以下のステップを含む、対象における癌の存在を決定する方法、を提供する:
(a) 対象からの試料を提供するステップ;
(b) 前記試料中の、少なくとも一つの腫瘍マーカー(TM)が低発現TMである、少なくとも二つのTMファミリーメンバーの発現レベルを検出するステップ;および
(c) あらかじめ定めた閾値に従って、患者が癌を有するかを立証するステップ。
その上にTMキャプチャー試薬を有する基材;および
該基材に付随する検出器であって、該キャプチャー試薬に結合している低発現TMを検出することができる該検出器。
基材;
少なくとも一つのTMが低発現TMである、少なくとも二つのTMキャプチャー試薬;
および
使用のための取扱説明書。
定義
用語「マーカー」は、生物現象の存在と定量的に、または定性的に関連する分子を意味する。マーカーの例としては、遺伝子、遺伝子断片、RNAまたはRNA断片のようなポリヌクレオチド;ペプチド、オリゴペプチド、タンパクまたはタンパク断片のようなポリペプチドを含む遺伝子産物;または現象の基礎となるメカニズムに直接的に関係していようが、間接的に関係していようが、関連代謝物、副産物または抗体または抗体断片のような他の識別分子が挙げられる。本発明のマーカーとしては、本明細書に開示した核酸配列(例えばGenBank配列)、具体的には全長配列、任意のコード配列、ノンコード配列および断片、またはそれらの任意の相補体、および上に規定したような任意の測定可能なそれらのマーカーが挙げられる。
マイクロアレイ分析および定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qPCR)の組み合わせを用いて、腫瘍において低発現の、膀胱の移行上皮細胞癌(TCC)のマーカーを同定した。驚くべきことには、これらのマーカー、および他の膀胱腫瘍マーカー(BTM)、特に腫瘍において過剰発現しているマーカーとの間の比は、膀胱癌の診断に関するものであることを見出した。
以下の方法は、TMを測定するために用いることができる非限定的な方法である。個々のTMの測定後、高および低発現BTMファミリーメンバーの間の比を測定する。これらの比は癌が存在するかしないかを予測するために使用する。
定量的PCR(qPCR)は、BTM特異的プライマーおよびプローブを用いて、腫瘍試料、血清、血漿および尿試料について行うことができる。コントロール反応において、PCR反応で生成した産物の量は、出発テンプレートの量と相関する(Sambrook, J., E Fritsch, E. and T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001))。PCR産物の定量化は、試薬が律速になる前に、対数期にある時にPCR反応を停止させることによって行うことができる。それからPCR産物をアガロースまたはポリアクリルアミドゲル中で電気泳動させ、臭化エチジウム染色または同等のDNA染色を行い、染色の強度をデンシトメトリーによって測定する。または、PCR反応の進行を、産物の蓄積をリアルタイムで測定するApplied Biosystems1 Prism 7000または the Roche LightCyclerのようなPCR装置を用いて測定することができる。リアルタイムPCRは、Sybr Greenのような色素を合成PCR産物へ挿入してDNA蛍光を測定するか、または消光分子から切断された時に、レポーター分子によって放出される蛍光を測定する;レポーターおよび消光分子は、プライマーオリゴヌクレオチドからのDNA鎖伸長の後、標的DNA分子にハイブリダイズさせるオリゴヌクレオチドプローブに組み込ませておく。オリゴヌクレオチドプローブは、次のPCRサイクルにおいてTaqポリメラーゼの酵素作用により、置換されかつ分解され、消光分子からレポーターを放出させる。Scorpion(登録商標)として知られる一つの変法においては、プローブはプライマーに共有結合している。
RT−PCRは、薬剤治療を受ける、または受けない正常および腫瘍組織において、異なった試料群におけるRNAレベルを比較し、発現の型を特徴づけ、近縁関係にあるRNAを識別し、RNA構造を分析するために用いることができる。
RT−PCR技術の最近の変種は、二重標識蛍光プローブ(すなわちTaqManプローブ)によって、PCR産物の蓄積を測定するリアルタイム定量PCRである。リアルタイムPCRは、競合定量PCRと相対定量PCRの両方に適合する。前者は、基準化のために各標的配列に対して内部競合剤を用い、一方後者は、試料中に含まれる基準化遺伝子、またはRT−PCRについてはハウスキーピング遺伝子を用いる。更なる詳細は、例えばHeld et al., Genome Research 6: 986-994 (1996)によって与えられる。
本発明の一態様によれば、PCRプライマーおよびプローブは、増幅されるべき遺伝子のイントロン配列に基づいて設計する。この実施態様では、プライマー/プローブ設計の第一段階は遺伝子内のイントロン配列の描写である。これは、Kent, W. J., Genome Res. 12 (4): 656-64 (2002)が開発したDNA BLATソフトウエアのような公的に入手可能なソフトウエア、またはその変種を含むBLASTソフトウエアによって行うことができる。その後の段階として、PCRプライマーおよびプローブ設計についての定評のある方法が続く。
Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386)に記載している。
差次的発現はまた、マイクロアレイ技術を用いて同定または確認することができる。従って、CCPMsの発現プロフィールは、新鮮腫瘍組織またはパラフィン包埋腫瘍組織のどちらかで、マイクロアレイ技術を用いて測定することができる。この方法では、対象となるポリヌクレオチド配列(cDNAおよびオリゴヌクレオチド)をマイクロチップ基材上に蒔く、または整列させる。整列した配列(すなわちキャプチャープローブ)は、対象となる細胞または組織(すなわち標的)からの特定のポリヌクレオチドとハイブリダイゼ−ションさせる。RT−PCR法におけるように、RNAの源は、通常、ヒト腫瘍または腫瘍細胞株、および対応する正常組織または細胞株から分離した全RNAである。従って、RNAは、種々の原発腫瘍または腫瘍細胞株から分離することができる。もしRNA源が原発腫瘍である場合は、RNAは、日常の診療において常に調製し保存している、例えば凍結した、または保存したホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織試料および固定(例えばホルマリン固定)組織試料から抽出することができる。
当技術分野においてmRNA抽出のための一般的方法は良く知られており、Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)を含む標準的な分子生物学の教科書に開示されている。パラフィン包埋組織からのRNA抽出法は例えばRupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987), and De Sandres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995)に開示している。特に、RNA抽出は、Qiagenのような業者からの精製キット、バッファーセットおよびプロテアーゼを用いて、メーカーの指示に従って行うことができる。例えば、培養細胞らの全RNAはQiagen RNeasy mini-columnsを用いて分離することができる。他の市販のRNA分離キットとしては、MasterPure Complete DNA and RNA Purification Kit (EPICENTRE (D, Madison, Wl)およびParaffin Block RNA Isolation Kit (Ambion, Inc.)が挙げられる。
組織試料からの全RNAは、RNA Stat-60 (Tel- Test)を用いて分離することができる。腫瘍から調製されたRNAは、塩化セシウム密度勾配遠心法によって分離できる。
免疫組織化学法はまた、本発明の増殖マーカーの発現レベルを検出するのに適している。従って、各マーカーに特異的な、抗体または抗血清、好ましくはポリクロナール抗血清、最も好ましくはモノクロナール抗体を、発現を検出するために用いる。抗体は、例えば放射線標識、蛍光標識、ビオチンのようなハプテン標識、またはセイヨウワサビペルオキシダーゼまたはアルカリホスファターゼのような酵素での、抗体自身の直接標識によって検出することができる。あるいは、未標識の第一次抗体を、第一次抗体に特異的な抗血清、ポリクロナール抗血清またはモノクロナール抗体を含む標識された第二次抗体と組み合わせて用いる。免疫組織化学プロトコルおよびキットは当技術分野で良く知られており、市販されている。
これらの方法は、核酸プローブを支持体に結合させ、試験試料から由来したRNAまたはcDNAと適切な条件下でハイブリダイゼ−ションさせることを含む(Sambrook, J., E Fritsch, E. and T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001))。これらの方法は、組織または液体試料から由来したBTMに適用することができる。RNAまたはcDNA製剤は、通常は検出と定量を可能にするために、蛍光または放射性分子で標識されている。いくつかの応用では、ハイブリダイゼ−ションするDNAは、シグナル強度を増強するために、分岐した蛍光標識構造でタグを付けることができる(Nolte, F.S., Branched DNA signal amplification for direct quantitation of nucleic acid sequences in clinical specimens. Adv. Clin. Chem. 33, 201- 35 (1998))。ハイブリダイゼ−ションしない標識は、蛍光検出またはゲル像のデンシトメトリーによってハイブリダイゼ−ションの量を定量する前に、0.1XSSC、0.5%SDSのような低塩溶液中での強い洗浄によって除去する。支持体はナイロンまたはニトロセルロースのような固体であっても、液体懸濁状態でハイブリダイゼ−ションする小球体またはビーズであってもよい。洗浄と精製を可能にするために、ビーズは磁石であってもよいし(Haukanes, B-I and Kvam, C, Application of magnetic beads in bioassays. Bio/Technology 11, 60-63 (1993))、またはフローサイトメトリーを可能にするために蛍光標識されていてもよい(例えば: Spiro, A., Lowe, M. and Brown, D., A Bead-Based Method for Multiplexed Identification and Quantitation of DNA Sequences Using Flow Cytometry. Appl. Env. Micro. 66, 4258-4265 (2000)を参照)。
簡単に説明すれば、サンドイッチELISAアッセイにおいては、BTMに対するポリクローンまたはモノクローン抗体は固体の支持体(Crowther, J. R. The ELISA guidebook. Humana Press: New Jersey (2000); Harlow, E. and Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999))、または懸濁ビーズに結合している。他の方法は当技術分野において周知であり、更に本明細書で説明する必要はない。モノクロナール抗体は、ハイブリドーマ由来であることもできるし、またはファージ抗体ライブラリーから選択することができる(Hust M. and Dubel S., Phage display vectors for the in vitro generation of human antibody fragments. Methods MoI Biol. 295:71-96 (2005))。非特異的な結合部位は、非標的タンパク製剤および界面活性剤でブロックされる。それからキャプチャー抗体を、BTM抗原を含む尿または組織の調製物とインキュベートする。抗体/抗原複合体を、標的BTMを検出する第二の抗体とインキュベートする前に、混合物を洗浄する。第二の抗体は通常は、酵素反応またはレポーターと結合している第三の抗体のいずれかによって検出される、蛍光分子または他のレポーター分子と結合している(Crowther, Id.)。または、直接ELISAにおいては、BTMを含む調製物は、支持体またはビーズに結合でき、標的抗原は抗体―レポーター抱合体で直接検出される(Crowther, Id.)。
腫瘍を除くための手術の前後に採取された膀胱癌患者からの血清または血漿におけるマーカーファミリーメンバーの免疫検出;限定されないが、結腸直腸、膵臓、卵巣、黒色肉腫、肝臓、食道、胃、子宮内膜および脳を含む、他の癌を有する患者におけるマーカーファミリーメンバーの免疫検出;および膀胱癌患者からの尿および便試料におけるマーカーファミリーメンバーの免疫検出;のために、本方法を用いることもできる。
下方制御されたBTMを用いた、比率または回帰分析のいずれかにおける試験のために、試料をTCCに関して陽性または陰性と呼ぶことを可能にする、閾値を誘導する。これらの閾値は、TCCの存在を調査されている患者のコホートの分析によって決定されるであろう。閾値は異なった試験の適用により変動する可能性がある;例えば集団のスクリーニングにおける試験に使用する閾値は、主として泌尿器症状の無い患者のコホートを用いて決定されるであろうし、これらの閾値は、TCC再発の監視下にある患者、または血尿のような泌尿器症状の存在を調査される患者に対する試験に用いる閾値とは異なっている可能性がある。閾値は、要求される臨床状況において試験の特異性の実用的なレベルを提供するために選択することができる;すなわち擬陽性の結果を受ける患者の数が過剰ではないような、適度な感度を可能にする特異性である。この特異性は80〜90%の範囲内にあればよい。試験の閾値を得る代替法の一つは、異なった試験の閾値について、感度を特異性に対してプロットし(ROC曲線)、それから曲線の変曲点を選択する方法である。
いくつかの実施態様では、BTMに関するアッセイは、尿試料について行うことできることが望ましい。一般的に、これらの液体中のオリゴヌクレオチド、タンパクおよびペプチドに関するアッセイ方法は当技術分野では知られている。しかしながら、例示の目的で、BTMの尿レベルはサンドイッチ型酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いて定量することができる。血漿または血清アッセイのために、適切に希釈した試料または段階希釈した標準BTM5μl、およびペルオキシダーゼ抱合抗ヒトBTM抗体75μlを、マイクロタイタープレートのウエルに加える。30分間30℃のインキュベーション期間の後、結合していない抗体を除くために、ウエルをリン酸バッファー食塩水(PBS)中0.05%Tween20で洗浄する。BTMと抗BTM抗体の結合した複合体は、それからH2O2を含むo-フェニレンジアミンと15分間30℃でインキュベートする。当然のことながら、反応を1M H2SO4を加えて停止し、492nmでの吸光度をマイクロタ-イタープレートリーダーで測定する。抗BTM抗体は、モノクロナール抗体またはポリクロナール抗体であり得る。
更なる態様では、本発明は、BTMに対する抗体の製造を含む。本明細書に記載する方法を用いて、新規のBTMを、マイクロアレイおよび/またはqPCRを用いて同定することができる。ひとたび推定マーカーが同定されると、免疫反応を誘発するのに十分な量の推定マーカーを製造することができる。場合によっては、全長BTMを用いることができ、他の場合は、免疫原としてBTMのペプチド断片が十分であるかも知れない。免疫原は、適切な宿主(例えば、マウス、ウサギ等)に注射することができ、必要に応じて、完全フロイントアジュバント、フロイント不完全アジュバントのようなアジュバントを、免疫反応を増強させるために注射することができる。当然のことながら、免疫技術においては抗体を作成することは、ルーチンであり、本明細書でさらに記述する必要はない。その結果、本明細書に記載した方法を用いて、同定されたBTMに対する抗体を製造することができる。
本発明の発見に基づいて、数種のタイプの試験キットを想定し製造することができる。第一に、検出分子(またはキャプチャー試薬)を予め搭載した検出装置を有するキットを作製できる。BTMmRNAの検出に関する実施態様では、該装置は、基材(例えば、ガラス、シリコン、石英、金属等)を含むことが可能であり、基材の上には、検出されるべきmRNAとハイブリダイゼ−ションするオリゴヌクレオチドがキャプチャー試薬として結合している。いくつかの実施態様では、mRNAの直接検出は、mRNA(cy3、cy5、放射線標識または他の標識で標識されている)を基材上のオリゴヌクレオチドにハイブリダイゼ−ションさせることにより達成することが可能である。他の実施態様では、mRNAの検出は、所望のmRNAに対する相補的DNA(cDNA)をまず作製することによって達成可能である。それから、標識cDNAを、基質上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼ−ションさせ、検出できる。
一連の実施態様では、過剰発現するBTMと組み合わせてBTMLTBDH4を検査するための試薬は、膀胱癌を検出するための、分画されない尿または尿細胞沈殿物の試験のためのキットに組み込むことができる。尿試料は、疾患の進行または治療に対する反応の監視を必要とする、膀胱癌と診断された患者、肉眼または顕微鏡的な血尿を含む泌尿器症状を有する個人、または無症状の個人、から採取することができる。分画されない尿中のBTMを測定するキットを用いて試験される患者または個人については、試験用に尿の約2mlを採取して試験することができる。尿の沈殿物に関する試験については、>10mlの尿を採取することができる。
膀胱腫瘍の進行を評価するために、組織試料を膀胱壁の生検によって得、または膀胱癌を有する患者から尿試料を長い時間をかけて採取する。BTMまたはそれらの組み合わせの比の評価を、異なった時間に採取された試料について行う。特定の範囲内のBTM比は膀胱癌の進行を示す。
膀胱腫瘍のための治療の効果を評価するために、組織および/または尿の試料を治療開始前に得る。一つ以上のBTMのベースライン値を、互いに関して種々のBTMの比を測定するのと同じように、測定する。治療を開始し、治療には、疾患の種類と段階に応じて、手術、放射線治療または化学療法を含めて、当技術分野において知られている任意の治療法を挙げることができる。治療過程の間、組織および/または尿の試料を採取し、BTMの存在および量を分析する。種々のBTMの比を測定し、結果を(1)治療前の患者のベースライン値、または(2)膀胱癌を有しない個人の集団から得た正常値と比較する。
TCCの迅速診断および早期検出に加えて、組織、血清または尿において検出されたBTMマーカー比は、治療に対する患者の反応を監視するために使用することができる。これらの応用において、尿および/または血清試料は、全身、小胞内または血管内化学療法、放射線療法または免疫療法の開始後、周期的に採取することができる。マーカー比の変化は、有効な治療を示す腫瘍サイズの減少を示す可能性がある。変化の比率は各患者または治療法のための最良の治療用量を予想するために用いることができる。
BTM比に加えて、高および低発現BTMファミリーメンバーを含む、回帰または分類分析は上記の応用に用いることができる。
本明細書で記述した実施例は本発明の実施態様を例示するためのものであって、本発明の範囲を制限する意図はない。他の実施態様、方法および分析の方法は分子診断技術における当業者の範囲内にあり、本明細書において詳細に記述する必要はない。本明細書の教えに基づく当技術分野の範囲内にある他の実施態様は、本発明の部分であると考えられる。
腫瘍の採取
膀胱腫瘍試料および非悪性尿路上皮試料は日本の京都大学病院において切除された外科手術標本から採取した。
非悪性コントロールおよび膀胱癌患者からの尿試料は、日本の京都大学病院から得た。健常コントロール試料は日本人志願者から得た(図1)。
腫瘍組織はTriReagent:水(3:1)混合物中でホモゲナイズし、それからクロロホルムで抽出した。その後、全RNAはそれからRNeasy(商標)手順(Qiagen)を用いて水相から精製した。RNAは、また16の癌細胞株からも抽出し、参照RNAとして役立つようにプールした。
エポキシコーティングしたガラススライド(MWG Biotech)を、Gene Machinesマイクロアレイ作製ロボットを用いて、メーカーのプロトコルに従って、〜30,000の50merオリゴヌクレオチド(MWG Biotech)でプリントした。
cDNAは、5μg全RNAから、5−(3−アミノアリル)−2’デオキシウリジン−5’−三リン酸を含む反応において、Superscript II(商標)逆転写酵素(Invitrogen)を用いて転写した。反応混合物を、Cy3またはCy5と炭酸水素塩バッファー中で1時間室温にてインキュベートする前に、Microconカラムで脱イオン化した。組み込まれていない色素はQiaquick カラム(Qiagen)を用いて除去し、SpeedVac中で試料を15μlに濃縮した。Cy3およびCy5で標識されたcDNAは、それからAmbion ULTRAhyb(商標)バッファーと混合し、100℃、2分間で変性させ、ハイブリダイゼ−ションチェンバー内のマイクロアレイスライドと42℃で16時間ハイブリダイゼ−ションさせた。それからスライドを洗浄し、Axon 4000A(商標)スキャナー内で、2出力セッティングで2回走査した。
53の膀胱腫瘍および20の非悪性(「正常」)膀胱組織試料からのRNAをCy5で標識し、Cy3標識参照RNAと二重または三重でハイブリダイゼ−ションさせた。標準化した後、29,718遺伝子のそれぞれの発現の変化を、倍変化率および統計的確率によって推定した。
Genepix(商標)ソフトウエアにより検出した蛍光強度の中央値を、局所的なバックグラウンド強度を引き算することにより補正した。バックグラウンド補正強度がゼロ未満のスポットは排除した。標準化を容易にするために、強度比および総合的スポット強度を対数変換した。対数化した強度比は、LOCFIT(商標)パッケージで実施した局所回帰を用いて、色素および空間的バイアスに関して補正した。対数化した強度比は、総合的スポット強度および場所に関して同時に回帰させた。局所回帰の残余は、補正された対数化した倍変化率を与えた。品質管理のために、各標準化されたマイクロアレイの比をスポットの強度および局在化に関してプロットした。プロットをその後、人為産物の残余のいずれかが存在するかを肉眼的に検査した。更にANOVA モデルをpin-tipバイアスを検出するために適用した。統計分析のために、標準化の全ての結果およびパラメータをPostgresデータベースに挿入した。
アレイ間の測定倍変化率の比較を改良するために、log2(比)を、アレイ当たり同じ総合的標準偏差を有するように、率に応じて決めた。この標準化は平均組織内クラス変動率を減少させた。それから倍変化率に基づくランク検定を、ノイズロバスト性を改善するために用いた。この検定は、(i)アレイ内の倍変化率のランク(Rfc)の計算、およびii)腫瘍組織の(Rfc)中央値から正常組織の(Rfc)中央値を引く、と言う2段階より成る。両ランクの中央値の差は、倍変化率のランクのスコアを規定する。更に三つの統計検定を、標準化されたデータについて行った:1)2サンプルステューデントt-検定、2)Wilcoxon検定、および3)マイクロアレイの統計分析(SAM)。各統計方法で(ランク倍変化率、t-検定、Wilcoxon検定およびSAM)最も有意に下方制御された遺伝子は、各検定においてランクスコアを与えられた。全てのランクスコアを加えて、一つの合計ランクスコアにした。
全尿RNAは、順方向プライマーを0.01μg含む50μlの反応液において、70℃でインキュベートし、それから氷上で2分間冷却することにより、膀胱腫瘍マーカーのそれぞれに対して遺伝子特異的なプライマーとアニールさせた。各cDNA反応液には、最終容積20μl中、アニールしたRNAおよび5x Superscript Il逆転写酵素バッファー(Invitrogen, USA)4μl、0.1MDTT(Invitrogen, USA) 2μl、RNase out(40U/μl(Invitrogen, USA)0.5μl、10mM dNTP(Invitrogen, USA) 4μlおよびSuperscript Il逆転写酵素(200U/μl)(Invitrogen, USA)0.5μlが含まれていた。反応液を42℃で1時間、70℃で10分および80℃で1分インキュベートした。qPCRに先立って、反応液をQiagen QIAquick PCR精製カラム(Qiagen, Victoria, Australia)で精製し、−80℃で保存した。
リアルタイムまたは定量PCTR(qPCR)は、PCRテンプレートコピー数の絶対的または相対的定量のために用いた。Taqman(商標)プローブおよびプライマーセットは、Primer Express V 2.0(商標)(Applied Biosystems)を用いて設計した。可能であれば、全ての潜在的スプライス変種は、結果として得られるアンプリコンに含め、アンプリコン優先権は、MWG-Biotech-由来マイクロアレイオリゴヌクレオチドによって包含される領域に与えた。プライマーおよびプローブの配列は図2に示す。あるいは、もし標的遺伝子が、所望のアンプリコンを包含して、Assay-on-Demand(商標)発現アッセイ(Applied Biosystems)によって表される場合は、それらを用いた。自家設計アッセイにおいて、プライマー濃度は、SYBR green標識プロトコルおよび参照RNAから作製したcDNAを用いて、滴定した。増幅はABI Prism(商標)7000配列検出システムで、標準的なサイクリング条件で行った。解離曲線において単一の増幅産物を観察した場合は、最適プライマー濃度および5’FAM - 3’TAMRA リン酸塩 Taqman(商標)プローブ(Proligo)を最終濃度250nMで用いて、625倍の濃度範囲にわたって標準曲線を作出した。0.98を越える回帰係数を有する標準曲線を与えるアッセイを、次の分析に用いた。
図3および4に示すマーカーの全血における発現を、コンピュータシミュレーションで決定した。マイクロアレイプローブは、それらの標的mRNAのGenBank登録番号を介してUniGeneクラスターに接続し、UniGeneからの組織発現プロフィールを、血液ライブラリーにおける発現配列タグ(ESTs)の数を決定するために用いた。0または1個の発現配列タグ(EST)を有する遺伝子のみを図4に示す。全血におけるLTB4DHの低発現を確認するために、図2に示すプライマーおよびプローブを用いて、全血から抽出された全RNAについて、RT−qPCRを実施した。有意な発現は観察されなかった(結果は示さず)。
膀胱癌の下方制御されたマーカーを同定するために、30,000オリゴヌクレオチドチップを用いて、53の膀胱腫瘍および20の非悪性膀胱組織試料からのRNAについて、マイクロアレイ研究を、我々は行った。図3は、非悪性膀胱組織と比較して、膀胱癌組織において有意な下方制御を示す300の遺伝子に関するマイクロアレイデータの統計分析を示す。図3は、HUGO遺伝子名および略語、タンパク参照配列番号、NCBImRNA参照配列番号、MWG Biotechプローブオリゴヌクレオチド番号、腫瘍および非悪性組織の間の遺伝子発現における倍変化率中央値、本来の補正されないStudentのt検定の結果、2-サンプルWilcoxon検定の結果、SAM検定の結果および合計ランクスコアを含む。
血尿は、膀胱癌に伴う普通の共出現症状であることから、膀胱癌マーカーが全血において有意に上昇していないことが、有利である。更に、下方制御されるマーカーは、比率、回帰または分類分析に用いることから、それらが、腫瘍細胞および非悪性膀胱細胞に十分に高いコピー数で存在することは、尿における信頼性のある検出を可能にするために、有利である。適切なマーカーを同定するために、我々は、血液ESTライブラリーにおいてはほとんど、または全く代表されておらず、かつ非悪性組織において中央値よりも高い発現を有する、サブセットについて、図3における遺伝子をスクリーニングした。発現中央値は、アレイ上の30,000オリゴヌクレオチドを、マイクロアレイ試験において分析された試料における、それらの強度の中央値によってランク付けを行うことにより推測した。この基準に合うマーカーを図4に示す。図4は、HUGO遺伝子名および略語、タンパク参照配列番号、NCBImRNA参照配列番号、倍変化率中央値、ランクスコア、腫瘍組織および非悪性組織におけるマイクロアレイスポット強度のランクの中央値、および血液ESTライブラリーに存在するEST数を含む。
TCC患者および非悪性泌尿器状態を有するコントロールからの尿を、排尿またはカテーテルによって採取した。全RNAを、42のコントロールの排尿採取尿、および37のTCC患者の排尿採取尿またはカテーテル採取尿から抽出し、LTB4DHおよび三つの過剰発現マーカー、IGFBP5、MDKおよびHoxA13に対するプライマーとプローブを用いる定量RT−PCRにおいて使用した。ΔCt比を、IGFBP5/LTB4DH、MDK/LTB4DHおよびHoxA13/LTB4DHについて決定した。このデータは図5のボックスプロットよって図示され、3回の検定のそれぞれにおけるコントロールおよびTCC患者からの尿試料の間のデータの広がりに明瞭な差を示す。最も正確な検定は、試料コホートにおいてそれぞれ87%と88%の感度および特異性を示したIGFBP5/LTB4DHであった(図6a)。これらの検定のそれぞれに関する、感度と特異性の間の対応を図示するために、ROC曲線を図7に示す。IGFBP5/LTB4DH、MDK/LTB4DHおよびHoxA13/LTB4DHに関する曲線下の面積は、それぞれ0.9223、0.9199および0.7497である。検定の正確さを測定するこれらの面積は、全ての3つのLTB4DHとの比率が有用なこと、特にIGFBP5/LTB4DHおよびMDK/LTB4DHが有用なことを示している。
線形識別分析(LDA)は、二つ以上の群の間に最大の分離が存在するように、変数の線形の組み合わせを生成する、統計的手法である(Fisher R.A. "The Use of Multiple Measurements in Taxonomic Problems", Annals of Eugenics 7 179 (1936))。この変数の線形の組み合わせは、「線形判別」と呼ばれ、データセットのクラスの分離を最大にするインプット変数の線形関数である。qPCRデータのような特定のデータセットを特徴付けるために、LDA(またはいずれかの他の分類手法)の能力は、相互検証を用いて検定できる。この方法において、データセットの一部は、分類子を生成するために用い、またデータベースの一部は、分類子の有効性を測るために用いる。データベースを訓練と検定への分割は、複数回反復することができる(毎回新分類子を生成する)。k−倍相互検証において、データベースはk−通りに分割され、各サブセットは、訓練と検証のk回目の一つにおいて、検定セットとして用いる。これは一つを抜き出す相互検証(leave-one-out cross-validation (LOOCV))にまで伸張することができ、ここで各試料は、データベースにおける残りの試料から生成する分類子に従って分類する(“leave one out”;検定される試料を抜き出す)。
BTMファミリーメンバーの検出法には、マイクロアレイおよび/またはリアルタイムPCR法を用いた、核酸、タンパクおよびペプチドの検出を含む。本発明の組成物および方法は、疾患の診断、治療法の有効性の評価、ならびにBTMファミリーメンバーの発現を測定するのに適した試薬および試験キットを製造するために有用である。
Claims (8)
- (a) 対象からの試料を提供するステップ;
(b) 前記試料中の二つの腫瘍マーカー(TM)の発現レベルを検出するステップ、ここで、一つのTMが、ロイコトリエンB4 12−ヒドロキシデヒドロゲナーゼ(LTB4DH)である低発現TMであり、そして、もう一つのTMが、インスリン様増殖因子結合タンパク質5(IGFBP5)である過剰発現TMである;
(c) 過剰発現TMと低発現TMの発現レベルの比率を算出すること、及び
(d) あらかじめ定めた閾値との比較により、患者が癌を有するかを予測するためのデータを提供するステップであって、前記あらかじめ定めた閾値が、癌を有していない複数の者における前記過剰発現TMと低発現TMとの発現レベルの比率であること、
を含む、対象における膀胱癌細胞の存在を予測する方法。 - 検出する前記ステップを、TM mRNAの発現を検出することによって行う、請求項1に記載の方法。
- 検出する前記ステップを、TMタンパク質の発現を検出することによって行う、請求項1に記載の方法。
- 検出する前記ステップを、TMペプチドの発現を検出することによって行う、請求項1に記載の方法。
- 該試料が、生検、血液、血清、腹膜洗浄液、脳脊髄液、尿および便試料のいずれか一つである、請求項1に記載の方法。
- 基材;
二つの腫瘍マーカー(TM)キャプチャー試薬、ここで、一つのTMが、ロイコトリエンB4 12−ヒドロキシデヒドロゲナーゼ(LTB4DH)である低発現TMであり、そして、もう一つのTMが、インスリン様増殖因子結合タンパク質5(IGFBP5)である過剰発現TMである;
および
使用のための指示書;
を含む、対象における膀胱癌細胞の存在を予測するためのキット。 - 前記TMキャプチャー試薬が、TM特異的オリゴヌクレオチドである、請求項6に記載のキット。
- 前記TMキャプチャー試薬が、TM特異的抗体である、請求項6に記載のキット。
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