KR20080098055A

KR20080098055A - 암 검출을 위한 소변 유전자 발현 비율

Info

Publication number: KR20080098055A
Application number: KR1020087022076A
Authority: KR
Inventors: 패리 존 길포드
Original assignee: 퍼시픽 에지 바이오테크놀로지 엘티디.
Priority date: 2006-02-10
Filing date: 2007-02-09
Publication date: 2008-11-06
Also published as: BRPI0707642A2; US9702009B2; EP1991699B1; CA2642535A1; US20110151464A1; AU2007212834A1; CN101410532A; US20160102368A1; EP1991699A4; US20180094323A1; MX2008009990A; AU2007212834B2; WO2007091904A1; JP6062399B2; HK1129707A1; EP1991699A1; JP5964006B2; US20090098553A1; US20200115757A9; IL193138A0

Abstract

본 발명은 저발현된 종양 마커 (TM) 및 하나 이상의 다른 TM의 발현 수준의 분석에 기초하여, 객체에서 암의 존재를 결정하는 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 하나 이상의 저발현 TM, 특히 저발현 방광 TM (BTM)과, 하나 이상의 과발현 TM, 특히 과발현된 BTM의 발현 수준에 대한 비율, 회귀, 또는 분류 분석의 수행을 통한 암, 특히 방광암의 결정에 관한 것이다. 다양한 측면에서, 본 발명은 상기 방법을 수행하기 위한 키트 및 장치에 관한 것이다.

Description

암 검출을 위한 소변 유전자 발현 비율{Urine gene expression ratios for detection of cancer}

본 발명은 암 검출에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 방광암의 검출을 위한 마커의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 방광암의 검출을 위한, 하나 이상의 다른 마커와 조합된 저발현된 마커의 용도에 관한 것이다.

암 환자들의 생존율은 암이 조기에 치료될 때 급격히 향상된다. 방광암의 경우 암 초기로 진단된 환자들은 5년 생존율이 90% 초과이고, 이에 비교하여 진행된 암으로 진단된 환자들은 약 15-30%이다. 따라서, 방광암의 조기 진단으로 이어지는 개발은, 환자에게 개선된 예후를 가져올 수 있다. 소변 시료를 이용한 방광암을 검출하는 확립된 방법은 세포학이다. 그러나 세포학은 침습성 방광암을 검출하는 데 약 75%정도만 민감하고, 표면 방광암을 검출하는 데 약 25% 정도만 민감한 것으로 알려져 있다(Lotan and Roehrborn, Urology 61, 109-118 (2003)).

소변 내의 암 특이적 마커를 동정하는 것은 암 조기 진단의 값진 접근방법을 제공하여 조기치료 및 개선된 예후를 제공한다. 특정 암 마커는 또한 질병의 진전을 모니터링하기 위한 수단을 제공하여, 수술적, 방사능요법적, 및 화학요법적 치료의 효능이 모니터되도록 한다.

현재, 방광암을 검출하는 데 가장 신뢰성이 높은 방법은 생검된 병반에 대한 조직학이 수반된 방광경 시험법이다. 그러나 상기 기법은 시간소비적이고, 침습적이며, 그 민감도는 약 90% 정도뿐이 안되어, 암의 약 10%는 상기 방법으로 검출되지 않는다는 것을 의미한다. 비침습식 방법 중에서, 박피된 악성 세포를 현미경적으로 검출하는 소변 세포학이 현재 선호되는 방법이다. 비록 세포학은 약 95%의 특이성을 가지나, 저급 병변(low grade lesion)에서 민감도가 떨어지고(9-25%), 시료 품질에 크게 의존하며, 관측자 간 변동성이 높다.

몇몇의 소변 단백질 마커가 알려져 있다. 이들 마커에 대한 시험는 세포학보다 높은 민감도를 제공하지만, 이들 마커의 수준 증가는 또한 염증, 요로결석증, 및 양성 전립선 비대증을 포함하는 비악성 질환의 환자에서도 흔히 관찰되기 때문에, 그 특이성이 준최적인 단점이 있다. 예를 들어, 특정한 핵 기저 단백질(nuclear matrix protein)을 검출하는 NMP22는 47-87%의 민감도와 58-91%의 특이성을 갖는다.

소변 시험와 관련된 하나의 단점은, (i) 다른 소변 수집 방법(도관배출, 배뇨, 소변 펠렛);(ⅱ) 소변 채취의 시간 결정 (diurnal timing); (ⅲ) 배뇨 중의 채취 시점(예: 중간소변 대 종료시 소변); 및 (ⅳ) 혈장 용적에 영향을 미치는 다양한 수액 섭취, 신장 기능, 또는 질환과 관련된 소변 농도에 따라 개별의 마커 수준이 유의하게 변동될 수 있다는 것이다. 이러한 변동은 거짓 양성 또는 거짓 음성 시험을 초래할 잠재성이 있다. 비록 이러한 변동의 일부는 엄격한 표준 수행 절차(standard operating procedures)를 사용하여 감소시킬 수 있으나, 이러한 절차 에 대한 환자 순응은 신뢰성이 없을 수 있다. 변동적인 소변 농도의 영향은, 몇몇의 경우에, 요 크레아티닌 대비 마커 수준을 평가함으로써 설명될 수 있지만, 이것은 시험의 비용과 복잡성을 증가시키며, 특히 시료 준비 또는 보관 방법이 마커 검출과 크레아티닌 측정에 대해 다를 때 더욱 그러하다.

암을 조기 발견 및 진단하기 위한 간단한 도구가 필요하다. 본 발명은 또한 마커에 기초한 방법, 장치, 및 키트, 구체적으로 방광암의 검출 및 진단을 보조하기 위한 방광암 마커의 비율, 회귀 또는 분류 분석에 기초한 방법, 장치, 및 키트를 제공한다.

본 발명은

(a) 객체로부터 시료를 제공하는 단계;

(b) 상기 시료에서 두 개 이상의 종양 마커(tumour marker:TM) 패밀리 구성원의 발현 수준을 검출하는 단계로서, 하나 이상의 TM은 저발현된 TM인 것인 단계;

(c) 소정의 역치에 따라서 환자가 암이 있는지 여부를 확립하는 단계를 포함하는, 객체에서 암의 존재를 결정하는 방법을 제공한다.

상기 (c) 단계는 상기 TM의 발현 비율을 결정하거나 TM 발현 수준에 대한 회귀 또는 분류 분석을 수행함으로써 수행될 수 있다.

상기 TM은 BTM일 수 있다. 검출될 상기 암은 방광암일 수 있고, 특정 구현예에서, 하나 이상의 TM이 과발현된 BTM이다. 상기 과발현된 BTM은 도 11 또는 도 12에서 도시된 군으로부터 선택될 수 있다.

특정 구현예에서, 하나 이상의 저발현된 TM은 도 3 또는 도 4에서 도시된 군으로부터 선택되는 BTM이다.

본 발명의 다른 구현예에서, 상기 검출하는 단계는 BTM mRNA, BTM 단백질, 또는 BTM 펩티드의 과발현을 검출함으로써 수행될 수 있다.

상기 시료는 생검, 혈액, 혈청, 복막 세척물, 뇌척수액, 소변, 및 대변 시료 중 어느 하나일 수 있다.

본 발명은 또한

그 위에 TM 포획 시약을 갖는 기판; 및

검출기가 상기 포획 시약과 연관된 TM을 검출할 수 있고, 상기 TM이 저발현된 TM인 것인, 상기 기판과 연관된 검출기를 포함하는, TM 검출 장치를 제공한다.

상기 TM은 BTM일 수 있다.

상기 TM 포획 시약은 올리고뉴클레오티드 또는 항체일 수 있다.

특정 구현예에서 상기 TM은 도 3 또는 도 4에서 도시된 군으로부터 선택되는 BTM일 수 있다.

본 발명은 또한

기판;

하나 이상의 TM은 저발현된 TM인 둘 이상의 TM 포획 시약; 및

사용 설명서를 포함하는, 객체에서 암의 존재를 결정하는 키트를 제공한다.

상기 TM은 BTM일 수 있다.

상기 TM 포획 시약은 TM-특이적 올리고뉴클레오티드 또는 TM-특이적 항체일 수 있다.

키트에 의해 검출된 상기 TM은 도 3 또는 도 4에서 도시된 군으로부터 선택되는 BTM일 수 있다.

키트에 의해 검출된 하나 이상의 TM은 과발현된 TM 또는 과발현된 BTM일 수 있다. 과발현된 BTM은 도 11 또는 도 12에서 도시된 군으로부터 선택될 수 있다.

정의

용어 "마커(marker)"란 생물학적 현상의 존재와 정량적 또는 정성적으로 연관된 분자를 의미한다. "마커"의 예는, 상기 현상에 내재하는 기전에 직접 또는 간접적으로 연관된 유전자, 유전자 단편, RNA, 또는 RNA 단편과 같은 폴리뉴클레오티드; 또는 펩티드, 올리고펩티드 단백질 또는 단백질 단편과 같은 폴리펩티드를 포함하는 유전자 산물; 또는 관련 대사물, 부산물 또는 항체 또는 항체 단편과 같은 다른 동정 분자를 포함할 수 있다. 본 발명의 마커는 본 명세서에 개시된 바와 같은 뉴클레오티드 서열 (예: GenBank 서열), 특히 전장(full-length) 서열, 임의의 코딩 서열, 비코딩 서열 및 단편, 또는 그의 상보체, 및 상기 정의된 바와 같은 임의의 그의 측정가능한 마커를 포함한다.

용어 "민감도(sensitivity)"란 질환을 갖는 객체가 (모델에 의해) 양성으로 판별될 비율을 의미한다. 따라서, 증가된 민감도는 거짓 음성 시험 결과가 감소하는 것을 의미한다.

용어 "특이성(specificity)"이란 질환을 갖지 않는 객체가 (모델에 의해) 음성으로 판별될 비율을 의미한다. 따라서, 증가된 특이성은 거짓 양성 시험 결과가 감소하는 것을 의미한다.

용어 "발현(expression)"이란 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드의 생성, 특히, 유전자 또는 유전자의 일부분으로부터의 RNA (예: mRNA)의 생성을 포함하고, RNA 또는 유전자 또는 유전자의 일부분에 의해 코딩된 폴리펩티드의 생성을 포함하며, 발현과 연관된 검출가능한 물질의 출현을 포함한다. 예를 들어, 폴리펩티드-폴리펩티드 상호작용, 폴리펩티드-뉴클레오티드 상호작용 등으로부터의 예를 들어 복합체의 형성은 용어 "발현"의 범위 내에 포함된다. 또 다른 예는, 혼성화 프로브 또는 항체와 같은 결합 리간드가 유전자 또는 다른 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 또는 단백질 단편으로의 결합하는 것 및 상기 결합 리간드를 가시화하는 것을 포함한다. 따라서, 마이크로어레이 상의, 노던 블롯(Northern Blot)과 같은 혼성화 블롯, 또는 웨스턴 블롯(Western Blot)과 같은 면역블롯 상의, 또는 비드 어레이(bead array) 상의, 또는 PCR 분석에 의한 스팟(spot)의 밀도는 내재하는 생물학적 분자의 "발현" 용어 내에 포함된다.

용어 "과발현(over expression)"은 하나의 세포 또는 세포 유형에서의 마커의 발현이 다른 균등한 세포 또는 세포 유형의 발현보다 더 클 때 사용된다.

용어 "저발현(under expression)"은 하나의 세포 또는 세포 유형에서의 마커의 발현이 다른 균등한 세포 또는 세포 유형의 발현보다 더 작을 때 사용된다.

용어 "TM" 또는 "종양 마커(tumour marker)" 또는 "TM 패밀리 구성원(TM family member)"이란 특정 암과 연관된 마커를 의미한다. TM이라는 용어는 또한 그 조합이 암 검출의 민감도 및 특이성을 개선하는 개개의 마커의 조합을 포함한다. TM이라는 용어는 상기 마커가 특정 종양에만 특이적일 것을 요구하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 오히려, TM의 발현은 다른 유형의 세포, 질환 세포, 악성 종양을 포함한 종양에서 달라질 수 있다.

TM은 방광암이 의심되는 환자로부터의 조직 시료에서 RNA를 추출하고, 상기 RNA 또는 cDNA 복제본을 다수의 올리고뉴클레오티드가 있는 마이크로어레이에 적용시켜, 시료 RNA를 어레이상의 올리고뉴클레오티드에 혼성화되도록 한 다음, 각 어레이 스팟에 결합된 측정된 RNA의 수준을 정량함으로써 확인될 수 있다. 마커는 TM의 존재가 마이크로어레이법을 사용하는 정상, 비악성 조직에서 발견되는 수치의 약 1.2배 이상의 역치 미만일 때 저발현된 것(under expresssing TM)으로 간주한다. 대안적으로, 상기 역치는 정상보다 약 2배 미만, 정상보다 약 3배 미만, 4배 미만 또는 정상보다 약 5배 미만일 수도 있다. "정상"이란 정규(normal) 군집의 90%째 백분위수보다 적은 값을 의미한다. 다른 경우에 정상은 95%째 백분위수의 존재의 수준을 의미할 수 있고 (즉, 약 평균으로부터 2 표준 편차 (SD)), 또 다른 경우에는, 약 97.5%째 백분위수 (즉, 약 3SD) 또는 99%째 백분위수보다 적다.

용어 "저발현된 TM(under expressing TM)"은 방광 종양에서 비악성 방광 조직에서보다 낮은 발현을 나타내는 마커를 의미한다.

용어 "과발현된 TM(over expressing TM)"은 방광 종양에서 비악성 방광 조직에서보다 높은 발현을 나타내는 마커를 의미한다.

용어 "BTM" 또는 "방광 종양 마커(bladder tumour marker)" 또는 "BTM 패밀리 구성원"은 방광암과 관련된 TM을 의미한다. BTM이라는 용어는 또한, 그 조합이 방광암 검출의 민감도 및 특이성을 개선시키는 개별적 마커의 조합을 포함한다. BTM이라는 용어는 상기 마커가 방광 종양에만 특이적일 것을 요구 않는 것으로 이해되어야 한다. 오히려 BTM의 발현은 다른 유형의 세포, 질환 세포, 악성 종양을 포함한 종양에서 달라질 수 있다.

용어 "저발현된 BTM"은 방광 종양에서 비악성 방광 조직에서보다 낮은 발현을 나타내는 마커를 의미한다.

용어 "과발현된 BTM"은 방광 종양에서 비악성 방광 조직에서보다 높은 발현을 나타내는 마커를 의미한다.

용어 "qPCR"은 정량적 중합효소 연쇄반응(quantitative polymerase chain reaction)을 의미한다. 용어 "qPCR" 또는 "QPCR"은 예를 들어, PCR Technique: Quantitative PCR, J.W. Larrick, ed., Eaton Publishing, 1997, and A-Z of Quantitative PCR, S. Bustin, ed., IUL Press, 2004에 기재된 바와 같은 정량적 중합효소 연쇄반응을 가리킨다.

용어 "TCC"는 방광의 이행 세포 암종(transitional cell carcinoma)을 의미한다. TCC는 모든 방광암의 ~95%를 구성한다.

본 명세서에서 사용된 "항체(antibodies)" 및 유사한 용어는 면역글로불린 분자 및 면역 글로불린(Ig) 분자의 면역적 활성 부분, 즉 항원에 특이적으로 결합(면역반응)하는 항원 결합 위치를 포함하는 분자를 의미한다. 이는 다클론성, 단일클론성, 키메라성, 단일사슬, Fc, Fab, Fab', 및 Fab2 단편, 및 Fab 발현 라이브러리를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 항체 분자는 분자에 존재하는 중쇄의 성질에 의해 서로 다른 IgG, IgM, IgA, IgE 및 IgD 중 어느 하나의 클래스에 관련된다. 이들은 IgG1, IgG2 및 다른 것들과 같은 서브클라스를 포함한다. 경쇄는 카파 사슬 또는 람다 사슬일 수 있다. 여기서 항체에 대한 참조는 모든 클래스, 서브클래스 및 유형에 대한 참조를 포함한다. 키메라성 항체, 예를 들면 하나 이상의 기원, 예를 들면, 마우스 또는 인간 서열에 특이적인, 단일클론 항체 또는 그의 단편을 또한 포함한다. 또한 카멜리드 항체, 상어 항체 또는 나노체도 포함된다.

용어 "암(cancer)"과 "암적(cancerous)"은 포유류에서 전형적으로 이상 또는 비제어된 세포성장의 특징이 있는 생리학적 상태를 가리키거나 설명한다. 암 및 암 병태학은 예를 들어, 전이, 이웃 세포의 정상 기능 방해, 사이토카인 또는 다른 분비 물질의 이상수준 방출, 염증 또는 면역 반응의 억제 또는 악화, 신생물(neoplasia), 전암상태, 암상태(malignancy), 림프절과 같은 주위 또는 원거리 조직 또는 기관의 침투 등과 연관될 수 있다.

용어 "종양(tumour)"은 악성 또는 양성을 불문한, 모든 신생물적 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암적 및 암적 세포와 조직을 의미한다.

용어 "마이크로어레이(microarray)"는 기판상에 정연한 또는 비정연한 포획 물질, 바람직하게는, 폴리뉴클레오티드 (예: 프로브) 또는 폴리펩티드의 배열을 가리킨다. 예를 들어 Microarray Analysis, M. Schena, John Wiley & Sons, 2002; Microarray Biochip Technology, M. Schena, ed., Eaton Publishing, 2000; Guide to Analysis of DNA Microarray Data, S. Knudsen, John Wiley & Sons, 2004; and Protein Microarray Technology, D. Kambhampati, ed., John Wiley & Sons, 2004를 참조한다.

용어 "올리고뉴클레오티드"는 제한 없이 단일가닥 디옥시리보뉴클레오티드, 단일- 또는 이중가닥 리보뉴클레오티드, RNA: DNA 혼성체, 이중가닥 DNA를 포함하는 폴리뉴클레오티드, 전형적으로 프로브 또는 프라이머를 가리킨다. 단일가닥 DNA 프로브 올리고뉴클레오티드와 같은 올리고뉴클레오티드는 흔히 화학법으로 예를 들어 상업적으로 이용가능한 자동화 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 합성되고, 또는 시험관 내(in vitro) 발현 시스템, 재조합 기법, 및 세포 및 생물체 내의 발현을 포함하는 다른 다양한 방법에 의해 합성된다.

용어 "폴리뉴클레오티드"는, 단수 또는 복수로 사용될 때, 일반적으로 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리디옥시리보뉴클레오티드를 가리키며, 비변형 RNA 또는 DNA 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 이는 비제한적으로, 단일- 또는 이중가닥 DNA, 및 단일- 또는 이중가닥 영역을 포함하는 DNA, 단일- 또는 이중가닥 RNA, 및 단일- 또는 이중가닥 영역을 포함하는 RNA, 단일가닥, 또는 보다 전형적으로, 이중가닥이거나 단일- 및 이중 가닥 영역을 포함할 수 있는 DNA와 RNA를 포함하는 혼성 분자를 포함한다. 또한 RNA 또는 DNA, 또는 RNA와 DNA 모두를 포함하는 삼중가닥 영역을 포함한다. 구체적으로, mRNA, cDNA, 및 게놈 DNA, 및 그의 단편이 포함된다. 상기 용어는 하나 이상의 변형된 염기, 예를 들어 삼중수소화된 염기, 또는 이노신과 같은 비정상적 염기를 함유하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 코딩하는 또는 코딩하지 않는 서열, 또는 센스 또는 안티센스 서열을 포괄할 수 있다. 본 명세서에서 "폴리뉴클레오티드" 또는 유사한 용어에 대한 각각의 언급은 전장 서열뿐 아니라 임의의 그의 단편, 유도체, 또는 변이체도 포함된다는 것이 인식될 것이다.

본 명세서에서 사용된 "폴리펩티드"는 올리고펩티드, 펩티드, 또는 단백질 서열, 또는 그의 단편을 가리키며, 천연 존재, 재조합, 합성, 또는 반합성 분자를 가리킨다. 여기서 자연적으로 존재하는 단백질 분자의 아미노산 서열을 지칭하기 위해 인용된 "폴리펩티드"의 경우에는, "폴리펩티드" 및 유사 용어는, 아미노산 서열을 전장 분자에 대하여 완전한 천연 아미노산 서열로 제한하려는 의도를 갖지 않는다. 본 명세서에서 "폴리펩티드" 또는 유사한 용어에 대한 각각의 언급은 전장 서열뿐 아니라 그의 단편, 유도체, 또는 변이체도 포함된다는 것이 인식될 것이다.

혼성화 반응의 "엄격성(stringency)"은 당해 기술에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 용이하게 결정될 수 있으며, 일반적으로 프로브의 길이, 세척 온도, 및 염 농도에 의존하는 실험적 계산이다. 일반적으로, 긴 프로브일수록 완전한 어닐링(annealing)을 위해 더 높은 온도를 요구하는 한편, 짧은 프로브일수록 더 낮은 온도를 요구한다. 혼성화는 일반적으로 상보 가닥이 그의 용융 온도 미만의 환경에 존재할 때 변성 DNA가 리어닐링(reannealing)할 수 있는 능력에 의존한다. 프로브와 혼성가능한 서열 사이의 선호하는 상동의 정도가 높을수록, 사용될 수 있는 상대 온도가 높다. 결과적으로, 상대 온도가 높으면 반응 조건이 더 엄격하게 되는 한편, 낮은 온도는 덜 그러하다. 혼성화 반응의 엄격성의 추가적인 상세 내용 및 설명은, 예를 들어, Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995)에서 찾을 수 있다.

본 명세서에서 정의된 바와 같은 "엄격한 조건" 또는 "고엄격 조건"은 전형적으로: (1) 세척에서 낮은 이온강도와 높은 온도, 예를 들어 50℃에서 0.015M 염화나트륨/0.0015M 구연산 나트륨/0.1% 도데실 황산나트륨을 사용하고; (2) 혼성화 중에 포름아미드와 같은 변성제, 예를 들어 42℃에서 50% (v/v) 포름아미드와 0.1% 우혈청 알부민/0.1% Ficoll /0.1% 폴리비닐피롤리돈 /750 mM 염화나트륨, 75 mM 구연산 나트륨을 포함하는 50 mM 인산나트륨 완충액, pH 6.5을 사용하거나; 또는 (3) 42℃에서 50% 포름아미드, 5X SSC(0.75 M NaCl, 0.075 M 구연산 나트륨), 50mM 인산 나트륨 (pH 6.8), 0.1% 이인산나트륨, 5X, Denhardt 용액, 초음파분해한 연어 정자 DNA (50㎍/ml), 0.1% SDS, 및 10% 덱스트란 설페이트를 사용하고, 42℃에서 0.2X SSC (염화나트륨/구연산 나트륨) 및 55℃에서 50% 포름아미드에서 세척한 다음, 55℃에서 EDTA 함유 0.1X SSC를 포함하는 고엄격 세척을 한다.

"적당히 엄격한 조건(moderately stringent condition)"은 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989에 의해 설명된 바로 확인할 수 있고, 상기 기재된 것보다 덜 엄격한 세척 용액과 혼성화 조건(예: 온도, 이온강도, 및 % SDS)을 사용하는 것을 포함한다. 적당히 엄격한 조건의 예는 20% 포름아미드, 5X SSC (150mM NaCl, 15mM 구연산 삼나트륨), 50mM 인산 나트륨 (pH 7.6), 5X Denhardt 용액, 10% 덱스트란 설페이트, 및 20mg/ml 변성 절단된 연어 정자 DNA를 포함하는 용액에 37℃에서 하룻밤동안 인큐베이션한 다음, 필터를 약 37-50℃에서 1X SSC에 세척하는 것이다. 당업자는 프로브 길이 등과 같은 요인을 수용하기 위해 필요한 온도, 이온강도 등을 조절하는 방법을 인지할 것이다.

본 발명의 실시는, 다르게 명시하지 않는 한, 당해 기술 범위 내에 있는 (재조합 기법을 포함한) 분자생물학, 미생물학, 세포생물학, 및 생화학의 통상적 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법은, 문헌에, 예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Sambrook et al., 1989; Oligonucleotide Synthesis, MJ Gait, ed., 1984; Animal Cell Culture, R.I. Freshney, ed., 1987; Methods in Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, 4th edition, D .M. Weir & CC. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987; Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., 1987; and PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullis et al., eds., 1994 에 상세하게 설명되어 있다.

본 발명의 구체예들의 설명

마이크로어레이 분석 및 정량적 중합효소 연쇄 반응(qPCR)을 함께 사용하여, 종양에서 저발현된 방광의 이행 세포 암종(TCC)의 마커가 확인되었다. 놀랍게도 이들 마커와 다른 방광 종양 마커 (BTM), 특히 종양에서 과발현된 마커간의 비율은, 방광암에 대하여 진단적이다.

(마커의 절대 수치를 측정하는 것이 아닌) 상기 비율은 방광암세포를 상징하는 단순한 유전자 발현 '고유신호(signature)'를 나타내며, 이는 놀랍게도 샘플링 기법 또는 소변 농도의 변동에 대해 더 강건하다. 또한, 저발현된 마커와 과발현된 마커의 조합은 환자 및 비악성 대조군으로부터의 시료 간의 분별력을 극대화하여, 시험 신뢰도를 증가시킨다. 여기에 기재된 저발현된 마커는, (i) TCC에서 굳건하고 일정한 하향조절, (ⅱ) 정상 조직에서의 고발현, 및 (ⅲ) 혈뇨를 보이는 환자들에서의 거짓 양성의 위험을 최소화하기 위해 전체 혈액에서의 미미한 발현에 기반하여 선택된 것이다.

두 BTM의 비율을 결정하는 것의 대안으로서, 저발현 및 과발현 BTM은 선형 판별 분석을 포함하는 회귀 분석 또는 분류 기법으로 분석될 수 있고, 이들 분석의 결과 또한 방광암의 존재의 표지일 수 있다는 것이 발견되었다.

상기 시험은 암이 의심되는 또는 암 위험이 있는 환자로부터의 시료에서 하나 이상의 TM이 저발현된 TM인 둘 이상의 TM 마커, 예를 들어 BTM을 측정하는 단계를 포함한다. 저발현된 TM과 다른 TM의 비율은 암 존재의 표지일 수 있다. 두번째 TM은 공지된 임의의 TM일 수 있으나, 바람직하게는 과발현된 BTM이다. 도 3은 본 발명에 사용하기에 적절한 저발현된 많은 마커들을 나타낸다.

상기 시험은 저발현된 TM과 함께 과발현된 TM을 사용함으로써 최적으로 수행된다. 예를 들어 임의의 과발현된 TM이 사용될 수 있다. (여기서 1단계 이상의 종양으로 정의된) 침습적 방광 종양으로부터 확인된 공지의 과발현된 BTM은 도 11에 도시되어 있으며, (여기서 Ta 및 Tis 단계 종양으로 정의되는) 표면 방광 종양으로부터 확인된 과발현된 BTM은 도 12에 도시된다.

또한 놀랍게도 본 발명에서 사용하기에 바람직한 저발현된 BTM은 전체혈액에서 유의하게 상승되지 않은 것들이고, 종양 세포 및 비악성 방광 세포 모두에서 충분히 높은 카피수로 존재한다는 것이 확립되었다. 바람직한 저발현된 BTM은 도 4에 도시된다.

암 마커는 임의의 적절한 기법을 사용하여 시료 내에서 검출될 수 있으며, 올리고뉴클레오티드 프로브, qPCR 또는 암 마커에 대해 생성된 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

시험될 시료는 종양으로 의심되는 조직의 시료로만 제한되지 않는다는 것으로 인식될 것이다. 상기 마커는 혈청으로 분비, 세포막으로부터 이탈, 용혈세포로부터 방출되거나 또는 소변으로 유실되는 세포와 연관될 수 있다. 따라서, 시료는 임의의 신체 시료를 포함할 수 있으며, 생검물, 혈액, 혈청, 복막 세척물, 뇌척수액, 소변 또는 대변 시료를 포함할 수 있다.

또한 본 발명은 인간의 암 검출만으로 제한되지 않고, 개, 고양이, 말, 소, 양, 사슴, 돼지, 및 암이 존재하는 것으로 알려진 임의의 동물을 포함한 동물에서 암의 검출에 적절하다는 것이 이해될 것이다.

암 검출의 일반적 접근법

다음 접근법은 TM을 측정하는 데 사용되는 비제한적인 방법이다. 각 TM의 측정 후에, 고발현 및 저발현 BTM 패밀리 구성원 간의 비율이 결정된다. 이 비율은 암의 존재 또는 부재를 예측하는 데 사용된다.

대안적으로, 고발현 및 저발현된 TM은 회귀 또는 분류 분석에 사용된다. 이들 분석의 결과 또한 암의 존재 또는 부재를 예측하는 데 사용된다.

발현 수준을 결정하기 위한 일반적인 방법론은 하기에 도시되어 있으나, 발현 수준을 결정하기 위한 어떠한 방법도 적절하다는 것이 인식될 것이다.

정량적 PCR ( qPCR )

정량적 PCR (qPCR)은 종양 시료, 혈청, 혈장, 및 소변 시료에 대하여 BTM 특이적 프라이머 및 프로브를 이용하여 수행될 수 있다. 제어된 반응 하에서, PCR 반응에서 형성된 생성물의 양 (Sambrook, J., E Fritsch, E. and T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3^rd. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001))은 시작 주형의 양과 상관관계가 있다. PCR 산물의 정량은 로그상에 있을 때, 시약들이 제한되기 전에 PCR 반응을 중지시킴으로써 수행된다. PCR 생성물은 그 후 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드 겔에서 에티듐 브로마이드 또는 그에 필적하는 염료로 염색된 후 전기영동되고, 염색의 강도는 밀도측정법(densitometry)에 의해 측정된다. 대안적으로, PCR 반응의 진행은 실시간으로 생성물 축적을 측정하는 Applied Biosystems의 Prism 7000 또는 로쉬의 LightCycler와 같은 PCR 기기를 이용하여 측정될 수 있다. 실시간 PCR은 합성된 PCR 산물 내로 Sybr Green 과 같은 DNA 게재 염료(DNA intercalating dye)의 형광도 또는 소광제(quencher) 분자로부터 분절된 리포터 분자에 의해 방출되는 형광도를 측정한다; 상기 리포터 및 소광제 분자들은 프라이머 올리고뉴클레오티드로부터의 DNA 가닥 연장 후에 표적 DNA 분자에 혼성화되는 올리고뉴클레오티드 프로브 내로 삽입되어 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 다음 PCR 사이클에서 탈리되고 Taq 중합효소의 효소작용에 의해 분해되어, 소광제 분자로부터 리포터 분자를 방출시킨다. 스콜피온®으로 알려진 일 변형예에서는, 프로브가 프라이머에 공유결합되어 있다.

역전사 PCR ( RT - PCR )

RT-PCR은 발현의 패턴 특성을 규명하고, 밀접하게 연관된 RNA 간을 구분하며, 및 RNA 구조를 분석하기 위해, 약물 처리 또는 처리없이, 정상 및 종양 조직에서, 다른 시료 집단에서의 RNA 수치를 비교하는 데 사용될 수 있다.

RT-PCR에 있어서, 첫 단계는 RNA의 표적 시료로부터의 분리이다. 시작 물질은 전형적으로 인간 종양 또는 종양 세포주 및 그에 각각 대응하는 정상 세포 또는 세포주로부터 분리된 전체 RNA이다. RNA는 유방, 폐, 결장 (예: 대장 또는 소장), 직결장, 위장, 기도, 항문, 직장, 전립선, 뇌, 간, 신장, 췌장, 지라, 흉샘, 고환, 난소, 자궁, 방광 등으로부터의 종양 시료, 일차 종양으로부터의 조직 또는 종양 세포주 및 건강한 공여자로부터의 혼주된 시료와 같은 다양한 시료로부터 분리될 수 있다. 만일 RNA의 근원이 종양이면, RNA는, 예를 들어, 냉동된 또는 파라핀-함몰되고 고정된 상태로 저장된(예: 포르말린 고정) 조직 시료로부터 추출될 수 있다.

RT-PCR을 통한 유전자 발현 프로파일링에서의 첫 단계는 RNA 주형의 cDNA로의 역전사한 다음, 이를 PCR 반응으로 기하급수적으로 증폭하는 것이다. 가장 통상적으로 사용되는 두 역전사효소는 조류 골수모세포염 바이러스 역전사효소 (AMV-RT) 및 Moloney 뮤린 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV-RT)이다. 역전사 단계는 상황과 발현 프로파일링의 목적에 따라, 특이적 프라이머, 무작위의 헥사머, 또는 올리고-dT 프라이머를 전형적으로 사용하여 시동된다. 예를 들어 추출된 RNA는 GeneAmp RNA PCR 키트 (퍼킨 엘머, 캘리포니아, 미국)를 이용하여 제조자의 지시에 따라 역전사될 수 있다. 유래된 cDNA는 그 후 후속의 PCR 반응에서 주형으로 사용될 수 있다.

비록 PCR 단계에서 다양한 내열적 DNA-의존적 DNA 중합효소가 사용될 수 있으나, 전형적으로는 5'-3' 뉴클레아제 활성을 가지나 3'-5' 교정기작 엔도뉴클레아제 활성이 결핍된 Taq DNA 중합효소를 사용한다. 따라서, TagMan (q) PCR은 전형적으로 Taq 또는 Tth 중합효소 5' 뉴클레아제 활성을 활용하여, 표적 암플리콘(amplicon)에 결합된 혼성화 프로브를 가수분해하나, 동등한 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 임의의 효소가 사용될 수 있다.

두 개의 올리고뉴클레오티드 프라이머가 PCR 반응의 전형적인 암플리콘을 생산하기 위해 사용된다. 제3의 올리고뉴클레오티드, 또는 프로브는, 상기 두 PCR 프라이머 사이에 위치한 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위해 설계된 것이다. 상기 프로브는 Taq DNA 중합효소에 의해 연장불가하며, 리포터 형광 염료와 소광제 형광 염료로 표지(label)된다. 임의의 레이저 유도된 리포터 염료로부터의 발광은 두 염료가 프로브상에 있는 것과 같이 서로 가까이 위치할 때 소광제 염료에 의해 소광된다. 증폭 반응 중에, 상기 Taq DNA 중합효소는 프로브를 주형-의존적 방식으로 절단된다. 결과적인 프로브 단편은 용액에서 해리되며, 방출된 리포터 염료로부터의 신호는 제2의 형광물질(fluorophore)의 소광 효과로부터 벗어난다. 새롭게 합성된 분자 각각에 대해 리포터 염료의 분자 하나가 유리되고, 비소광된 리포터 염료의 검출이 데이터의 정량적 해석의 근거를 제공한다.

TaqMan RT-PCR은 예를 들어, ABI PRISM 7700 서열 검출 시스템 (퍼킨-엘머-응용 바이오시스템, 포스터 시티, 캘리포니아, 미국) 또는 Lightcycler(로슈 분자 바이오케미칼, 맨하임, 독일)와 같은 상업적으로 존재하는 기기를 이용하여 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에서는, 5' 뉴클레아제 과정은 ABI PRISM 7700tam 서열 검출 시스템과 같은 실시간 정량적 PCR 장치상에서 진행된다. 상기 시스템은 열순환 반응기(thermocycler), 레이저, 전하 결합 소자(charge-coupled device: CCD), 카메라, 및 컴퓨터로 구성되어 있다. 상기 시스템은 열순환 반응기에서 96-웰 플레이트의 형식으로 시료를 증폭한다. 증폭 중에, 레이저-유도된 형광 신호가 96 웰들 모두에 대해 광섬유 케이블을 통해서 실시간으로 수집되어, CCD에서 탐지된다. 상기 시스템은 기구를 가동시키고 데이터를 분석하기 위한 소프트웨어를 포함한다.

5' 뉴클레아제 분석 데이터는 초기에 Ct, 또는 역치 사이클로 표현된다. 상기 논의된 바와 같이, 각 사이클 중에 형광 수치가 기록되며 증폭 반응에서 그 시점까지 증폭된 생성물의 양을 나타낸다. 형광 신호가 처음 통계학적으로 유의한 것으로서 기록된 시점이 역치 사이클이다.

실시간 정량 PCR ( qPCR )

더 최근의 RT-PCR의 변형은, 이중-표지(double-labeled)된 발형광 프로브(즉, TaqMan 프로브)을 통해 축적된 PCR 생성물을 측정하는 실시간 정량적 PCR이다. 실시간 PCR은 정량적 경쟁 PCR 및 정량적 비교 PCR 모두와 호환가능하다. 전자는 정규화를 위해 각 표적 서열에 대해 내부 경쟁자를 사용하는 한편, 후자는 RT-PCR에 대해 시료 내에 함유된 정규화 유전자, 또는 살림 유전자(housekeeping gene)를 사용한다. 더 상세한 내용은 예를 들어, Held 등 Genome Research 6: 986-994 (1996)에 의해 제공된다.

발현 수준은 RNA 근원으로서 고정된, 파라핀-함몰 조직을 사용하여 결정될 수 있다. 본 발명의 일 측면에 따르면, PCR 프라이머 및 프로브는 증폭될 유전자에 존재하는 인트론 서열에 기초하여 설계된 것이다. 본 구현예에서, 프라이머/프로브 설계의 첫 단계는 유전자 내의 인트론 서열의 윤곽묘사이다. 이것은 Kent W.J. Genome Res. 12 (4): 656-64 (2002)에 의해 개발된 DNA BLAT 소프트웨어, 또는 그의 변형을 포함한 BLAST 소프트웨어와 같은 공중이 사용가능한 소프트웨어를 통해 수행될 수 있다. 후속 단계는 잘 확립된 PCR 프라이머 및 프로브 설계방법을 따른다.

비특이적 신호를 우회하기 위해, 프라이머 및 프로브를 설계할 때 인트론 내에 반복적인 서열을 매스킹하는 것이 유용하다. 이것은 베일러 의과대학(Baylor College of Medicine)을 통해 온라인 상으로 존재하는, 반복적인 요소들의 라이브러리에 대한 DNA 서열을 스크리닝하고, 반복적인 요소가 마스킹된 조회 서열을 회귀하는 Repeat Masker 프로그램을 사용하여 이루어질 수 있다. 상기 마스킹된 서열은, Primer Express (Applied Biosystems); MGB assay-by-design (Applied Biosystems); Primer3 (Steve Rozen and Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers in: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386) 와 같은 상업적으로 이용가능하거나 또는 공중이 이용가능한 프라이머/프로브 설계 패키지를 이용하여, 프라이머 및 프로브 서열을 설계하는 데 사용될 수 있다.

PCR 프라이머 설계에서 고려되는 가장 중요한 요인은 프라이머 길이, 용융 온도 (Tm), G/C 함량, 특이도, 상보적 프라이머 서열, 및 3'말단 서열을 포함한다. 일반적으로, 최적의 PCR 프라이머는 보통 17-30 염기의 길이를 가지며, 약 20-80%, 예를 들어, 50-60% G+C 염기를 함유한다. 용융점은 50과 80℃ 사이, 예를 들어 약 50 내지 70℃가 보통 바람직하다. PCR 프라이머 및 프로브 설계에 대한 추가적인 지침은, 예를 들어 본 명세서에 그의 전체적 개시가 명백히 참조로서 포함된 Dieffenbach, C. W. et al., General Concepts for PCR Primer Design in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1995, pp. 133-155; Innis and Gelfand, Optimization of PCRs in: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRC Press, London, 1994, pp. 5-11; and Plasterer, T. N. Primerselect: Primer and probe design. Methods Mol. Biol. 70: 520-527 (1997)를 참조할 수 있다.

마이크로어레이 분석

차별적 발현은 또한 마이크로어레이 기법을 이용하여 확인, 또는 확증될 수 있다. 따라서, CCPM의 발현 프로필은 신선한 또는 파라핀-함몰된 종양 조직에서, 마이크로어레이 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 이 방법에서는, 관심의 폴리뉴클레오티드 서열 (cDNA 및 올리고뉴클레오티드 포함)은 마이크로칩 기판상에 도말되거나, 또는 배열된다. 배열된 서열 (즉, 포획 프로브)은 관심 세포 또는 조직(즉, 표적물)으로부터의 특정 폴리뉴클레오티드와 혼성화된다. RT-PCR에서와 동일하게, RNA의 출처는 보통 인간 종양 또는 종양 세포주, 및 그에 대응하는 정상 조직 또는 세포주로부터 분리된 전체 RNA다. 따라서 RNA는 다양한 일차 종양 또는 종양 세포주로부터 분리될 수 있다. 만일 RNA의 출처가 일차 종양이면, RNA는 예를 들어, 일상의 임상 실시에서 평상적으로 표본되고 보전되는 냉동된 또는 보관된 포르말린 고정 파라핀-함몰 (formalin fixed paraffin-embedded:FFPE) 조직 시료 및 고정된 (예: 포르말린-고정) 조직 시료로부터 추출될 수 있다.

마이크로어레이 기법의 구체적인 일 구현예에 있어서, PCR로 증폭된 cDNA 클론 삽입물이 기판에 적용된다. 기판은 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 또는 75개의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 다른 측면에 있어서, 기판은 10,000 이상의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 마이크로칩에 고정된 마이크로어레이된 서열은 엄격한 조건 하에서의 혼성화에 적합하다. 다른 구현예로서, 마이크로어레이에 대한 표적은 50, 100, 200, 400, 500, 1000, 또는 2000 염기 이상의 길이를 가질 수 있고; 또는 50-100, 100-200, 100-500, 100-1000, 100-2000, 또는 500-5000개의 염기 길이를 가질 수 있다. 또 다른 구현예로서, 마이크로어레이를 위한 포획 프로브는 10, 15, 20, 25, 50, 75, 80, 또는 100 염기 이상의 길이를 가질 수 있고; 또는 10-15, 10-20, 10-25, 10-50, 10-75, 10-80, 또는 20-80 염기의 길이를 가질 수 있다.

형광 표지된 cDNA 프로브는 관심 조직으로부터 추출한 RNA의 역전사에 의한 형광성 뉴클레오티드의 삽입을 통하여 생성될 수 있다. 칩에 적용된 표지된 cDNA 프로브는 어레이상에서 DNA의 각 스팟에 특이적으로 혼성화된다. 비특이적으로 결합된 프로브를 제거하기 위한 엄격한 세척 후에, 칩은 동초점 레이저 현미경 또는 CCD 카메라와 같은 다른 탐지 방법을 통해 주사된다. 각 배열된 요소의 혼성화의 정량은 그에 상응하는 mRNA의 풍부함(abundance)의 평가를 가능하게 한다. 이중색 형광을 이용하여, 두 개의 출처의 RNA로부터 생성된 별도의 표지된 cDNA 프로브는 쌍으로 어레이에 혼성화된다. 따라서 각각의 특정 유전자에 해당하는 두 출처로부터의 전사물의 상대적 풍부함은 동시에 결정된다. 이에 대한 예시적 프로토콜은 실시예 4에 상세하게 설명된다.

혼성화의 소형화된 스케일은 많은 양의 유전자에 대한 발현 패턴을 용이하고 신속히 평가하는 것을 가능하게 한다. 이러한 방법은 세포당 몇 카피로만 발현된 희귀한 전사물을 검출하고, 발현 수준에서 약 2배 이상의 차이를 재생가능하게 검출하는 데 요구되는 민감도를 갖는 것으로 나타났다 (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (2): 106-149 (1996)). 마이크로어레이 분석은 제조사의 프로토콜에 따른 상업적으로 이용가능한 기구에 의해, 예를 들어 Affymetrix GenChip 기술, Illumina 마이크로어레이 기술 또는 Incyte 마이크로어레이 기술을 이용하여 수행될 수 있다. 유전자 발현의 대용량 분석을 위한 마이크로어레이 방법의 개발은 암 분류의 분자 마커를 체계적으로 탐색하고, 다양한 종양 유형에서의 결과 예측을 가능하게 한다.

RNA 분리, 정제, 및 증폭

mRNA 추출의 일반적인 방법은 당해 기술에서 잘 알려져 있으며 Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997)를 포함하는 분자생물학의 표준 교재에 개시되어 있다. 파라핀 함몰 조직으로부터의 RNA 추출 방법은 예를 들어, Rupp and Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987), 및 De Sandres et al., BioTechniques 18: 42044 (1995)에 개시되어 있다. 특히, RNA 분리는 Qiagen과 같은 상업적 제조자로부터의 정제 키트, 완충액 세트, 및 단백분해효소를 사용하여, 제조자의 지시에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, 배양 중의 세포로부터의 전체 RNA는 Qiagen RNeasy 미니 칼럼을 사용하여 분리될 수 있다. 다른 상업적으로 이용가능한 RNA 분리 키트는 MasterPure 완전 DNA 및 RNA 정제 키트 (EPICENTRE (D, 매디슨, 위스콘신), 및 Paraffin Block RNA 분리 키트 (암비온 사)를 포함한다. 조직 시료로부터의 전체 RNA는 RNA Stat-60 (Tel-Test)를 이용하여 분리될 수 있다. 종양으로부터 준비된 RNA는, 예를 들어, 염화세슘 밀도 구배 원심분리를 통해 분리될 수 있다.

mRNA 분리, 정제, 프라이머 연장 및 증폭을 포함한, RNA 원천으로서의 고정된, 파라핀-함몰 조직을 이용한 유전자 발현 프로파일링에 대한 대표적인 프로토콜의 단계는 다양한 간행 논문 기사(예: T. E. Godfrey et al. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K. Specht et al., Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001))에서 제공된다. 간략하게, 대표적인 절차는 파라핀-함몰 종양 조직 시료를 10㎛ 두께의 절편으로 절단하는 단계로부터 시작한다. 그 후 RNA를 추출하고, 단백질 및 DNA가 제거된다. RNA 농도를 분석한 후, 필요시 RNA 교정(repair) 및/또는 증폭 단계가 포함될 수 있고, RNA는 유전자 특이적 프로모터를 사용하여 역전사된 다음 RT-PCR이 수행된다. 최종적으로, 데이터를 분석하여 검사된 종양 시료에서 확인된 특성적 유전자 발현 패턴에 기초하여 환자에게 이용가능한 최선의 치료 방법을 규명한다.

면역조직화학 및 프로테오믹스

면역조직화학적 방법 또한 본 발명의 증식 마커의 발현 수준을 검출하는 데 적합하다. 따라서, 항체 또는 항혈청, 바람직하게는, 다클론성 항혈청, 가장 바람직하게는 각 마커에 특이적인 단일클론 항체가 발현을 검출하는 데 사용될 수 있다. 항체는 항체 자체를 예를 들어, 방사성 표지, 형광 표지, 바이오틴과 같은 합텐 표지, 또는 서양 고추냉이 과산화효소 또는 알칼리 인산분해효소와 같은 효소로 직접 표지함으로써 검출될 수 있다. 대안적으로는, 비표지된 일차 항체가, 일차 항체에 특이적인 항혈청, 다클론 항혈청, 또는 단일클론 항체를 포함하는, 표지된 이차 항체와 함께 사용된다. 면역조직화학적 프로토콜 및 키트는 당해 기술에 공지되어 있으며, 상업적으로 이용가능하다.

프로테오믹스(Proteomics)는 특정 시점에서 시료 내 (예: 조직, 생물체, 또는 배양 세포)에 존재하는 폴리펩티드를 분석하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 프로테오믹 기법은 시료 내의 폴리펩티드 발현의 포괄적 변화 (발현 프로테오믹스로도 지칭됨)를 평가하기 위해 사용될 수 있다. 프로테오믹 분석은 보통 (1) 시료로부터 개별적 폴리펩티드를 2-D 겔 전기영동 (2-D PAGE)을 통해 분리; (2) 겔로부터 회수한 개별적 폴리펩티드를 예를 들어 질량 분광계 또는 N-말단 서열조사를 통해 규명; 및 (3) 생물정보학을 이용한 데이터 분석을 포함한다. 프로테오믹 방법은 다른 유전자 발현 프로파일링 방법의 중요한 보충이며, 단독으로 또는 다른 방법과 병행으로 사용되어 본 발명의 증식 마커의 산물을 검출하는 데 사용될 수 있다.

마커에 선택적인 핵산 프로브를 이용한 혼성화 방법

이들 방법은 핵산 프로브를 지지체에 결합하고, 적절한 조건 하에서 시험 시료로부터 유래된 RNA 또는 cDNA와 혼성화하는 단계를 수반한다 (Sambrook, J., E Fritsch, E. and T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3^rd. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001)). 이들 방법은 종양 조직 또는 유체 시료로부터 유래된 BTM에 적용될 수 있다. RNA 또는 cDNA 준비물은 검출 및 정량을 가능하게 하기 위해 보통 형광 또는 방사성 분자로 표지된다. 몇몇 적용에서는, 상기 DNA 혼성화는 신호 강도를 향상시키기 위해 분지형의 형광 표지된 구조물로 표지될 수 있다 (Nolte, F.S., Branched DNA signal amplification for direct quantitation of nucleic acid sequences in clinical specimens. Adv. Clin. Chem. 33, 201-35 (1998)). 비혼성화된 표지는 형광 검출 또는 겔 영상의 밀도분석법(densitometry)에 의한 혼성화의 정량 전에 0.1x SSC, 0.5% SDS와 같은 저염도 용액에서의 광폭적 세척을 통해 제거된다. 상기 지지체는 나일론 또는 니트로셀룰로스막과 같은 고체이거나, 액체 현탁물 중에 있을 때 혼성화되는 미세구(microspheres) 또는 비드로 구성될 수 있다. 세척 및 정제를 가능하게 하기 위해, 비드는 자성이거나 (Haukanes, B-I and Kvam, C., Application of magnetic beads in bioassays. Bio/Technology 11, 60-63 (1993)), 또는 형광 표지될 수 있어, 유세포측정을 가능하게 한다 (예를 들어: Spiro, A., Lowe, M. and Brown, D., A Bead-Based Method for Multiplexed Identification and Quantitation of DNA Sequences Using Flow Cytometry. Appl. Env. Micro. 66, 4258-4265 (2000) 참조).

혼성화 기술의 변형 중 하나는 QuantiGene Plex® 분석법 (Genospectra, Fremont)으로서, 형광 비드 지지체와 분지형 DNA 신호 증폭을 결합한 것이다. 혼성화 기술의 또 다른 변형은 Quantikine® mRNA 분석법 (R&D Systems, Minneapolis)이다. 방법론은 제조자의 설명서에 기재되어 있다. 간략하게는 상기 분석은 디곡시게닌(Digoxigenin)에 접합된 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 사용한다. 혼성화는 비색분석법에서 알칼린 인산분해효소에 결합된 항-디곡시게닌 항체를 이용하여 검출된다.

추가 방법들은 공지된 방법들이며, 본원 발명에 추가적인 기재가 필요하지 않다.

효소면역측정법 ( Enzyme - Linked Immunological Assays : ELISA )

간략하게, 샌드위치 ELISA 분석에서, BTM에 대한 다클론 또는 단일클론 항체는 고형 지지체에 결합되거나 (Crowther, J.R. The ELISA guidebook. Humana Press: New Jersey (2000); Harlow, E. and Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999)) 또는 현탁 비드에 결합된다. 다른 방법들은 공지된 방법들이며, 본원 발명에 추가적인 기재가 필요하지 않다. 단일클론 항체는 하이브리도마로부터 유래되거나 또는 파지(phage) 항체 라이브러리로부터 선택될 수 있다 (Hust M. and Dubel S., Phage display vectors for the in vitro generation of human antibody fragments. Methods Mol Biol. 295:71-96 (2005)). 비특이적 결합 부위는 비표적 단백질 조제물 및 계면활성제로 차단된다. 포획 항체는 그 후 BTM 항원을 함유하는 소변 또는 조직 조제물과 함께 인큐베이션된다. 항체/항원 복합체가 표적 BTM을 검출하는 2차 항체와 인큐베이션되기 전에 상기 혼합물을 세척한다. 상기 2차 항체는 보통 형광 분자 또는 효소 반응에서 또는 리포터에 접합된 3차 항체로 검출될 수 있는 다른 리포터 분자와 접합된다 (Crowther, 상동.). 대안적으로는, 직접적 ELISA에서, BTM을 함유하는 제제는 상기 지지체 또는 비드와 결합되고, 표적 항원은 항체-리포터 접합체로 직접 검출될 수 있다 (Crowther, 상동).

단일클론 항체 및 다클론 항혈청을 생성하는 방법은 공지된 방법이며, 본원에 더 기재할 필요가 없다.

면역 검출 ( Immunodetection )

상기 방법은 또한, 종양을 제거하기 위한 수술 전과 수술 후에 수득된 방광암 환자로부터의 혈청 또는 혈장내의 마커 패밀리 구성원의 면역 검출, 결직장, 췌장, 난소, 흑색종, 간, 기도, 위장, 내장, 및 뇌를 포함하나 그에 제한되지 않는 다른 암 환자에서의 마커 패밀리 구성원의 면역 검출, 및 방광암 환자로부터의 소변 및 대변에서의 마커 패밀리 구성원의 면역 검출에 사용될 수 있다.

BTM은 또한 면역블롯팅(immunoblotting) 또는 면역침강 (immuno-precipitation) 과 같은 다른 표준의 면역 검출 기법을 사용하여 조직 또는 소변 내에서 검출될 수 있다(Harlow, E. and Lane, D., Using antibodies: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999)). 면역블로팅에서, BTM을 함유하는 조직 또는 유체로부터의 단백질 제제는 폴리아크릴아미드 겔을 통하여 변성 또는 비변성 조건 하에서 전기영동된다. 단백질은 그 후 나일론과 같은 막 지지체로 이전된다. BTM은 그 후 면역조직 화학에서 기술된 바와 같이, 단일클론 또는 다클론 항체와 직접적으로 또는 간접적으로 반응한다. 대안적으로는, 몇몇 제제에서, 단백질은 사전 전기영동 분리 없이 막 상으로 직접 점착 (spotted)될 수 있다. 신호는 밀도측정법에 의해 정량될 수 있다.

면역침강에서, BTM을 함유하는 가용성 제제가 BTM에 대한 단일클론 또는 다클론 항체와 함께 인큐베이션 된다. 그런 다음 상기 반응은 아가로즈 또는 폴리아크릴아미드로 제조되고, 단백질 A 또는 단백질 C가 공유 결합에 의해 부착되어 있는 불활성 비드와 함께 인큐베이션 된다. 단백질 A 또는 G 비드는 상기 비드에 결합된 항체-BTM-항원의 고정된 복합체를 형성하는 항체와 특이적으로 상호작용한다. 세척 후에, 결합된 BTM은 면역블롯팅 또는 ELISA에 의해 검출 및 정량될 수 있다.

역치값 결정

비율 또는 회귀 분석에서 하향조절된 BTM을 사용하는 시험에 대해서, TCC에 대해 시료를 양성 또는 음성으로 칭할 수 있게 하는 역치값이 유도될 것이다. 이러한 역치는 TCC의 존재가 조사되는 환자 집단에 대한 분석에 의해 결정될 것이다. 역치는 다른 시험 응용에 따라 달라질 수 있다; 예를 들어, 군 스크리닝에서의 상기 시험의 사용의 역치값은 대체적으로 비뇨기적 증상이 없는 환자들의 집단을 이용하여 결정되고, 이 역치값은 TCC 재발에 대한 감시하에 있는 환자들 또는 혈뇨증과 같은 비뇨기적 증상의 존재에 대해 조사되는 환자에 대한 시험에 사용되는 역치값과 다를 수 있다. 역치는 필요한 임상적인 환경에서 실질적인 수준의 시험 특이성을 제공하기 위해 선택될 수 있다; 즉, 거짓 양성 결과를 할당받는 환자들의 과도한 수 없이 합리적인 민감도를 갖게 하는 특이성을 말한다. 이 민감도는 80-90%의 범위 내에 있을 수 있다. 시험 역치값을 얻을 수 있는 또 다른 방법은 각각 다른 시험 역치값에 대해 특이성에 대한 민감도의 그래프(ROC 곡선)를 작도하고, 곡선의 변곡점을 택하는 것이다.

단일 역치값의 대안으로서, 상기 시험은 질환의 존재의 확률의 정도 차이를 제공하고, 이들과 연관된 다양한 임상적 결과를 갖는 시험 구간을 사용할 수 있다. 예를 들어, 한 시험은 세 개의 구간을 가질 수 있다; TCC 존재의 높은 위험도(예 90%)와 관련된 일 구간, TCC의 저위험도와 관련된 제2구간, 및 질병이 의심되는 것으로 간주되는 제3구간이다. 상기 "의심되는" 구간은 소정의 기간 내에서 반복 시험의 권장과 연관될 수 있다.

소변 내에서의 방광암 마커 검출 방법.

다수의 구현예에 있어서, BTM의 분석법은 바람직하게 소변 시료에서 수행될 수 있다. 보통, 이러한 유체에서 올리고뉴클레오티드, 단백질, 및 펩티드를 분석하는 방법은 공지된 방법이다. 그러나, 설명의 의도로서, BTM의 소변내 농도는 샌드위치-유형의 효소 면역 분석법 (ELISA)를 이용하여 정량할 수 있다. 혈장 또는 혈청 분석은, 적절하게 희석된 시료 또는 계대 희석된 표준 BTM의 5㎕ 분액 (aliquot) 및 75㎕의 과산화효소-접합된 항-인간 BTM 항체가 미량역가 플레이트의 웰에 첨가된다. 30℃에서 30분의 시간동안 인큐베이션한 후, 웰들을 인산-완충염(PBS) 중의 0.05% Tween 20으로 세척하여 비결합된 항체를 제거한다. 결합된 BTM과 항-BTM 항체의 복합체는 그 후 H₂O₂를 함유하는 o-페닐렌디아민과 함께 30℃에서 15분간 인큐베이션한다. 1M H₂SO₄을 첨가함으로써 반응을 중지하고, 미세역가 플레이트 판독기로 492nm에서의 흡광율을 측정하였다. 항-BTM 항체는 단일클론 항체 또는 다클론 항혈청일 수 있다는 것이 인식될 수 있다.

많은 단백질들이 (1) 세포에 의해 분비, (2) 세포막에서 절단, (3) 세포사멸시에 세포로부터 소실 또는 (4) 탈피된 세포 내에 함유되기 때문에, BTM은 소변에서도 검출될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 이에 더해, 방광암의 진단은 시료 내의 BTM의 발현 또는 시료 내의 BTM의 축적을 측정함으로써 결정될 수 있다. 선행 기술의 진단 방법은 방광경(cystoscope), 세포학 및 이러한 절차 중에서 추출된 세포의 검사를 포함한다. 이러한 방법들은 소변 내의 또는 요로상피 내의 솔 시료(brush sample) 내에, 또는 다른 경우에는, 방광 벽의 생검 표본에서 종양세포의 확인에 의존하였다. 이러한 방법은 샘플링 오류, 관측자 간의 확인 오류 등을 포함하는 여러 유형의 오류의 단점이 있다.

방광 종양 마커에 대한 항체

추가적인 측면에 있어서, 본 발명은 BTM에 대한 항체를 제조하는 것을 포함한다. 본원 발명에 설명된 방법을 사용하여, 신규 BTM은 마이크로어레이 및/또는 qPCR 방법을 이용하여 확인될 수 있다. 잠정적인 마커가 규명되면, 이는 면역 반응을 도출하는 데 적절하기에 충분한 양으로 생산될 수 있다. 몇몇의 경우에, 전체 길이의 BTM이 사용될 수 있으며, 다른 경우에는, BTM의 펩티드 단편이 면역원으로 충분할 수 있다. 상기 면역원은 적절한 숙주 (예: 마우스, 토끼 등)에 주사될 수 있고, 필요시, 면역 반응을 증가시키기 위해 프로인트 완전면역 보강제, 프로인트의 불완전면역 보강제와 같은 보강제가 주사될 수 있다. 항체를 제조하는 것은 면역학 기술분야에서 평상적이며 여기서 더 설명할 필요가 없다는 것을 인식할 수 있다. 결과적으로, 여기에 설명된 방법을 이용하여 확인된 BTM에 대한 항체를 제조할 수 있다.

또 다른 구현예에 있어서, 항체들은 본 명세서에서 확인된 종양 마커의 단백질 또는 단백질 코어 또는 BTM에 고유한 올리고뉴클레오티드 서열에 대해 제조될 수 있다. 비록 특정 단백질은 당화(glycosylation)될 수 있으나, 당화 패턴의 변형은 특정 상황에서, 정상적인 당화 패턴이 결핍된 BTM의 형태의 오검출을 초래한다. 따라서, 본 발명의 특정 측면에 있어서, BTM 면역원은 탈당화된 BTM 또는 탈당화된 BTM 단편을 포함할 수 있다. 탈당화는 당업계의 공지의 하나 이상의 글리코시다제를 이용하여 수행될 수 있다. 대안적으로, BTM cDNA는 E. coli 등을 포함한 원핵 세포주와 같은 당화가 결핍된 세포주에서 발현될 수 있다.

벡터는 그 안에 BTM을 코딩하는 올리고뉴클레오티드을 갖도록 제조될 수 있다. 이러한 많은 벡터는 공지의 표준 벡터를 기초로 할 수 있다. 벡터는 다양한 세포주를 전달감염(transfect)시키는 데 사용되어, BTM을 생산하는 세포주를 생산할 수 있고, 상기 BTM 생산 세포주는 특이적 항체의 개발, BTM의 검출을 위한 다른 시약 또는 개발된 BTM의 분석법을 표준화하기 위한, 원하는 양의 BTM을 생산하는 데 사용될 수 있다.

키트

본 발명의 발견에 근거하여, 다수의 유형의 시험 키트가 예견되고 생산될 수 있다. 먼저, 상기 키트는 검출 분자 (또는 "포획 시약")로 미리 적재된(pre-loaded) 검출 장치를 구비하도록 제조될 수 있다. BTM mRNA의 검출을 위한 구현예에 있어서, 그러한 장치는 검출될 mRNA와 혼성화하는 포획 시약으로서의 올리고뉴클레오티드가 상부에 결합된 기판 (예: 유리, 실리콘, 석영, 금속 등)을 포함할 수 있다. 몇몇 구현예에서는, mRNA의 직접 검출은 (cy3, cy5, 방사성표지 또는 다른 표지로 표지된) mRNA를 기판 상의 올리고뉴클레오티드에 혼성화함으로써 달성될 수 있다. 또 다른 구현예에 있어서, mRNA의 검출은 먼저 원하는 mRNA에 상보적인 DNA (cDNA)를 제조함으로써 달성될 수 있다. 그 후, 표지된 cDNA가 기판상의 올리고뉴클레오티드에 혼성화되고 검출될 수 있다.

항체도 포획 시약으로서 키트에서 사용될 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 기판 (예: 멀티웰 플레이트)은 그에 부착된 특이적 BTM 포획 시약을 포함할 수 있다. 어떤 구현예에 있어서, 키트는 차단 시약 (blocking reagent)을 포함할 수 있다. 차단 시약은 비특이적 결합을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 비특이적 올리고뉴클레오티드 결합은 연어 정자 DNA와 같은 BTM 올리고뉴클레오티드를 함유하지 않는 용이한 출처의 과량 DNA를 사용하여 낮출 수 있다. 비특이적 항체 결합은 혈청 알부민과 같은 차단 단백질을 과량 사용함으로써 감소시킬 수 있다. 올리고뉴클레오티드 및 단백질을 검출하는 다수의 방법은 당업계에 알려져 있으며, BTM과 관련된 분자를 특이적으로 검출하기 위한 그 어떠한 전략도 본 발명의 범위 내에서 사용 및 고려될 수 있다는 것을 인식할 수 있다.

기판에 더하여, 시험 키트는 (프로브와 같은) 포획 시약, 세척 용액 (예: SSC, 다른 염, 완충액, 계면활성제 등) 뿐 아니라 검출 모이어티 (예: cy3, cy5, 방사성표지 등)을 포함할 수 있다. 키트는 또한 사용 설명서와 패키지를 포함할 수 있다.

방광암 검출에 사용되는 BTM 비율 1

일 계열의 구현예에서, 과발현된 BTM과 조합된 BTM LTBDH4 시험용 시약은 비분획된 소변 또는 소변 세포 침전물을 시험하기 위한 키트에 통합되어 방광암을 검출할 수 있다. 소변 시료는 질병 진행 또는 치료 반응에 대한 모니터링을 요구하는 방광암 진단을 받은 환자, 거시적 또는 미시적 혈뇨증을 포함한 비뇨기성 증상을 갖는 개체, 또는 비증상적 개체로부터 수집될 수 있다. 비분획된 소변 내에서 BTM을 측정하는 키트로 시험되는 환자 또는 개체에 대하여, 약 2ml의 소변이 시험을 위해 채취될 수 있다. 소변 펠렛상에서의 시험에 대하여, 10ml 초과의 소변이 채취될 수 있다.

적절한 키트는: (i) 사용 및 결과 해석 설명서, (ⅱ) 임의의 회귀 분석 분류기 (classification) 또는 수식을 포함한, 복수 유전자 분석 해석용 소프트웨어, (ⅲ) 비분획된 소변 또는 소변 펠렛으로부터의 RNA의 안정화 및 정제를 위한 시약, (ⅳ) dNTP 및 역전사효소를 포함하는 cDNA의 합성을 위한 시약, 그리고 (v) BTM cDNA의 정량을 위한 시약을 포함한다. 일 형태에서는, 이러한 시약들은 정량 PCR을 위해 사용되고, 엑손에 걸쳐지는 (exon-spanning) 특이적인 올리고뉴크레오티드 프라이머, 검출을 위해 프로브로 표지된 제3 올리고뉴클레오티드, Taq 중합효소 및 그 외 PCR에서 필요한 완충액, 염, 및 dNTP를 포함할 것이다. 상기 키트는 또한 표지된 프로브로의 BTM DNA의 직접 혼성화 또는 분지형 DNA 기술과 같은 전사물의 검출을 위한 다른 방법을 사용할 수 있으며; (ⅵ) 품질 관리 수단으로서 역할하는, β액틴과 같은 고전사된(highly transcribed) 유전자로부터의 전사물의 검출을 위한 올리고뉴클레오티드 및 프로브를 사용할 수 있다.

BTM 비율을 이용한 방광암 진행의 평가

방광 종양의 진행을 평가하기 위해서, 조직 시료가 방광 벽의 생검에 의해 수득되거나, 또는 소변 시료가 방광암에 걸린 환자들로부터 시간에 걸쳐 수집된다.

BTM 또는 그의 조합의 비율의 평가는 다른 시각에 채취된 시료에 대하여 수행된다. 특정 범위 내의 BTM 비율은 방광암의 진행의 표지이다.

BTM 비율을 이용한 방광암 치료의 평가

방광 종양에 대한 치료법의 효능을 평가하기 위해, 치료가 개시되기 전에 조직 및/또는 소변 시료가 수득된다. 서로에 대해 다양한 BTM의 비율이 결정되는 것과 함께, 하나 이상의 BTM의 기준선 수준(baseline level)이 결정된다. 치료가 개시되고, 질병의 유형 및 단계에 적절한 수술, 방사선 치료, 또는 화학 요법을 포함한 당업계에 알려진 임의의 치료법이 포함될 수 있다. 치료 도중에, 조직 및/또는 소변 시료가 수집되고 BTM의 존재 및 양에 대하여 분석된다. 다양한 BTM의 비율이 결정되고, 결과는 (1) 치료 전의 환자의 기저 수준, 또는 (2) 방광암이 없는 개체군으로부터 수득된 정상치와 비교된다.

TCC 치료법의 진행을 모니터링하기 위한 BTM 비율의 사용

TCC의 신속한 진단과 조기 발견에 더하여, 조직, 혈청, 또는 소변 내에 검출되는 BTM 마커 비율은 환자의 치료에 대한 반응을 모니터링하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 응용에서, 소변 및/또는 혈청 시료는 전신적(systemic), 소포내 또는 혈관내 화학요법, 방사성요법, 또는 면역요법의 개시 후에 간격을 두고 취하여질 수 있다. 마커 비율의 변화는 종양의 크기의 감소를 나타낼 수 있으며, 이는 효과적인 치료의 표지이다. 변화의 속도는 각 환자 또는 각 치료에 대한 최적의 치료적 용량을 예측하는 데 사용될 수 있다.

BTM 회귀 분석의 사용

BTM 비율 이외에도, 고발현 및 저발현 BTM 패밀리 구성원을 포함하는 회귀 또는 분류 분석이 전술한 응용에 사용될 수 있다.

평가된 마커는 알려진 인간 유전자로부터 선택된다. 평가된 유전자는 도 3 및 4에 나타나 있다. 도 3 및 4에 포함되어 있는 내용은 유전자 이름, HUGO 식별자, MWG 올리고 수, NCBI mRNA 참조 서열 번호 및 단백질 참고 번호이다. 전장의 서열은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/ 에서 찾을 수 있다.

본 발명은 그의 특정 구현예들과 하기 도면들에 대한 참조로 설명된다:

도 1은 qPCR 분석에 사용된 소변 시료의 특징을 보여주는 표를 도시한다.

도 2는 본 발명에 따른 방광암의 qPCR 분석을 위한 마커의 프라이머 및 올리고뉴클레오티드 프로브의 표를 도시한다.

도 3은 방광암 시료에 마이크로어레이법을 사용하여 확인된 저발현되는 방광 종양 마커의 표를 도시한다.

도 4는 전체 혈액에서는 유의하지 않은 발현을 보이지만 정상적인 방광 조직에서는 높은 발현율을 보이는, 방광암 시료에 마이크로어레이법을 사용하여 확인된 저발현되는 방광 종양 마커의 표를 도시한다.

도 5는 비악성 비뇨기 질환 또는 TCC를 가진 환자들로부터의 소변 시료에 대해 세 개의 방광 이행 세포 암종 (transitional cell carcinoma:TCC) 마커 (HoxA13, IGFBP5 및 MDK)와 저발현되는 마커 LTB4DH의 비율을 나타내는 상자수염도 (box and whisker plots)를 도시한다. 상자들은 25%째, 50%째, 및 75%째 백분위수를 정의하며, 수평 막대는 인접 값을 표시한다. 이상점들은 원에 의해 나타난다. 빈 상자들은 비악성 질환 대조군으로부터의 시료를 나타내며, 그늘진 상자는 TCC 환자들로부터의 시료를 나타낸다.

도 6은 LTB4DH를 포함하는 시험에 대한 TCC 검출의 민감도 및 특이성의 예를 나타낸다. (a) 단일 시험; (b) LTB4DH와 HoxA13, IGFBP5, 및 MDK 세 마커 중 두 개를 사용한 조합 시험.

도 7a-c는 소변 시료에서 LTB4DH를 포함한 비율을 이용한 TCC 검출의 민감도 및 특이성에 대한 ROC 곡선을 나타낸다. 7a. IGFBP5/LTB4DH; 7b. MDK/LTB4DH; 7c. HoxA13/LTB4DH

도 8a-f는 조합 시험에 대한 산점도(scatter plot)를 나타낸다. a-c는 LTB4DH와 HoxA13, IGFBP5, 및 MDK 세 마커 중 두 개를 사용하고, d-f는 LTB4DH 대신 BAG1를 사용하여 반복하였다. 8a. MDK/LTB4DH 및 IGFBP5/LTB4DH; 8b. MDK/LTB4DH 및 HoxA13/LTB4DH; IGFBP5/LTB4DH 및 HoxA13/LTB4DH; 8d MDK/BAG1 및 IGFBP5/BAG1; 8e.MDK/BAG1 및 HoxA13/BAG1; 8f. IGFBP5/BAG1 및 HoxA13/BAG1.

도 9a-b는 IGFBP5에 대한 ΔCt 및 IGFBP5/LTB4DH에 대한 ΔCt 비율과 요 크레아티닌 농도 간의 상관관계를 나타내는 산점도를 도시한다. 9a. TCC 환자로부터의 소변 시료. 9b. 비악성 질환을 가진 환자로부터의 소변 시료.

도 10a-f는 방광 종양 마커 MDK, IGFBP5 및 HoxA13을 단독으로 사용하여 또는 LTB4DH와의 비율로 분석된, TCC 환자로부터의 배뇨된 및 도관된 소변 시료의 분포를 나타내는 자가-자가 산점도를 도시한다.

도 11은 침습적 방광 종양으로부터의 알려진 과발현되는 마커를 도시한다.

도 12는 표면 방광 종양으로부터의 알려진 과발현되는 마커를 도시한다.

도 13은 ROC 곡선 분석에 사용된 저급 TCC 시료 및 대조군의 임상적 특징을 도시한다.

도 14는 ROC 곡선 분석의 결과를 도시한다. LTB4DH가 HoxA13과 IGFBP5와의 비율에 사용되는 경우 증가된 시험 정확도가 수득되는 것을 나타낸다.

도 15는 TCC의 검출을 위한, LTB4DH와 함께 또는 LTB4DH 없이, BTM의 선형 판별 분석의 결과를 나타낸다.

여기에 기술된 실시예들은 본 발명의 구현예를 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하려는 것이 아니다. 다른 구현예, 방법 및 분석 유형은 분자 진단적 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자의 범위 내에 있으며, 이하 상세하게 설명될 필요가 없다. 본원의 교시 사항에 기초한 당해 기술 분야의 범위 내의 다른 구현예들은 본 발명의 일부분인 것으로 간주된다.

방법

종양 수집

방광 종양 시료 및 비악성 요로상피 시료는 일본의 교토 대학병원에서 절단된 수술 표본으로부터 수집하였다.

소변 수집

비악성 대조군 및 방광암 환자로부터의 소변 시료는 일본의 교토 대학병원으로부터 수득하였다. 건강한 대조군 시료는 일본 지원자들로부터 수득하였다 (도 1).

RNA 추출

종양 조직은 TriReagent:증류수 (3:1) 혼합물에서 균질화시킨 후, 클로로포름으로 추출하였다. 그 후 전체 RNA를 RNeasy™ 절차(Qiagen)를 이용하여 수상에서 정제하였다. RNA는 또한 16개의 암 세포주로부터 추출되고 혼주되어 기준 RNA로 사용되었다.

RNA를 소변 시료를 동일한 부피의 용해 완충액 (5.64M 구아니딘-HCl, 0.5% 사르코실, 50mM 아세트산나트륨 (pH 6.5) 및 1mM β-머캡토에탄올; 1.5M Hepes pH 8로 pH 7.0로 조정)을 혼합함으로써 소변으로부터 추출하였다. 소변 내 소량의 RNA로 인하여, 7.5㎍의 전체 박테리아 RNA를 상기 소변/용해 완충액 혼합물에 첨가하여 운반체로서의 역할을 하게 하였다. 전체 RNA를 그 후 Trizol 및 RNeasy™ 절차를 이용하여 추출하였다. RNA 조제물을 Qiagen QIAquick™ PCR 정제 키트를 이용하여 cDNA 합성 전에 추가 정제하였다.

3.6% 덱스트란 중에서의 침강법을 이용하여 전체 혈액로부터 강화된 세포에 대해, Trizol/RNeasy™ 추출을 수행함으로써, 세 명의 건강한 지원자의 상기 혈액으로부터 RNA를 추출하였다.

마이크로어레이 슬라이드 준비

에폭시로 코팅된 유리 슬라이드 (MWG 바이오텍)는 제조사의 프로토콜에 따라, Gene Machines 마이크로어레이 로봇을 사용하여, ~30,000 개의 50량체 올리고뉴클레오티드 (MWG 바이오텍)로 인쇄되었다.

RNA 표지 및 혼성화

cDNA는 5-(3-아미노알릴)-2'디옥시우리딘-5'-삼인산을 함유하는 반응물 중에서 Superscript Ⅱ™ 역전사효소 (인비트로겐)을 이용하여 5㎍ 전체 RNA로부터 전사되었다. 그 후 상기 반응물을 Microcon 칼럼에서 탈이온화시킨 다음, 실온에서 1시간 동안 중탄산염 완충액 중의 Cy3 또는 Cy5와 함께 인큐베이션하였다. 삽입되지 않은 염료는 Qiaquick 칼럼(Qiagen)을 이용하여 제거하고, 상기 시료를 SpeedVac에서 15㎕로 농축시켰다. Cy3 및 Cy5로 표지된 cDNA를 그 후 Ambion ULTRAhyb™ 완충 액과 혼합시키고, 100℃에서 2분간 변성시키고 42℃에서 16시간 동안 혼성화 챔버에서 마이크로어레이 슬라이드에 혼성화시켰다. 그 후 슬라이드를 세척하고, 2 개의 전원 설정에서 Axon 4000A™ 스캐너 중에서 2회 주사하였다.

암 마커 유전자의 마이크로어레이 분석

53개의 방광 종양 및 20개의 비악성 ("정상") 방광 조직 시료로부터의 RNA를 Cy5로 표지하고, Cy3으로 표지된 기준 RNA와 이중복 또는 삼중복으로 혼성화하였다. 정규화 후, 29,718 개의 각 유전자의 발현의 변화는 곱변화 (fold change)및 통계학적 확률에 의해 추정하였다.

정규화 절차

Genepix™ 소프트웨어에 의해 검출된 중간 형광 강도를 국소 배경 강도를 감산함으로써 교정하였다. 0보다 작은 배경 교정된 강도를 가진 스팟(spot)은 배제ㄷ되었다. 정규화를 촉지시키기 위해, 강도 비율과 전체적 스팟의 강도는 로그변환되었다. 상기 로그화된 강도 비율은 LOCFIT™ 패키지에 구현된 국소적 회귀를 이용하여 염료 및 공간적 편견에 대해 교정되었다. 로그화된 강도 비율은 정체 스팟 강도 및 위치에 대하여 동시에 회귀하였다. 국소 회귀의 잔여물은 교정된 로그화 곱변화를 제공하였다. 품질 관리를 위해서, 각 정규화된 마이크로어레이의 비율을 스팟 강도와 국소화에 대해 작도하였다. 그래프는 후속적으로 임의의 잔존하는 허위(artifact)에 대해 가시적으로 검사되었다. 추가적으로, 핀-팁 편차(pin-tip bias)의 검출을 위해 ANOVA 모델을 적용하였다. 정규화의 모든 결과 및 매개변수는 통계적 분석을 위해 Postgres 데이터베이스에 입력되었다.

통계적 분석

어레이 간의 측정된 곱변화의 비교를 개선시키기 위해, log2 (비율)를 크기조정하여 어레이 당 동일한 전체적 표준 편차를 갖도록 하였다. 이 표준화는 평균 조직내 클래스 변동율을 감소시켰다. 그 후 노이즈 강건성을 개선시키기 위해 곱변화에 기초한 순위 검사를 사용하였다. 이 검사는 두 단계로 이루어진다: (i) 어레이 내의 곱변화의 순위의 계산 (Rfc); 및 (ⅱ) 정상 조직에 대한 중간값(Rfc)를 종양 조직의 중간값(Rfc)으로부터 감산하는 것이다. 두 중간값 순위의 차이는 곱변화 순위의 점수를 정의한다. 표준화된 데이터에 대하여 세 개의 추가적인 통계 검사가 또한 수행되었다: 1) 두 시료 스튜던트 t-테스트, 2) Wilcoxon 테스트 및 3) 마이크로어레이의 통계학적 분석 (Statistical Analysis of Microarrays:SAM). 각각의 통계적 방법 (순위 곱변화, t-테스트, Wilcoxon 테스트, 및 SAM)으로 결정된 가장 유의하게 하향조절된 유전자는 각 시험에 대해 순위 점수를 부여받았다. 모든 순위 점수는 그 후 하나의 합산된 순위 점수로 합하였다.

소변 RNA 로부터의 cDNA 합성

전체 소변 RNA를 0.01㎍/㎕의 정방향 프라이머를 포함하는 50㎕의 반응물 중에서 70℃에서 인큐베이션한 후에 얼음위에 2분동안 냉각시킴으로써 각 방광 종양 마커에 대한 유전자-특이적 프라이머에 어닐링시켰다. 각 cDNA 반응물은 최종 부피 20㎕ 중에 어닐링된 RNA 및 4㎕의 5X Superscript Ⅱ 역전사효소 완충액(인비트로겐, 미국), 2㎕의 0.1M DTT (인비트로겐, 미국), 0.5㎕의 RNase out (40U/㎕)(인비트로겐, 미국), 4㎕의 10mM dNTP (인비트로겐, 미국) 및 0.5㎕의 Superscript Ⅱ 역전사효소 (200U/㎕)(인비트로겐, 미국)가 함유하였다. 반응물은 42℃에서 1시간동안, 70℃에서 10분 동안 및 80℃에서 1분 동안 인큐베이션되었다. 반응물을 qPCR 전에 Qiagen QIAquick PCR 정제 칼럼 (Qiagen, 빅토리아, 호주)으로 세척하고, -80℃에서 보관하였다.

정량 실시간 PCR

PCR 주형 카피 수의 절대적 또는 상대적 정량을 위해 실시간 또는 정량적 PCR (qPCR)을 사용하였다. Taqman™ 프로브 및 프라이머 세트를 Primer Express V 2.0™ (Applied Biosystems)을 이용하여 설계하였다. MWG-바이오텍에서 유래된 마이크로어레이 뉴클레오티드에 의해 차지된 영역에 암플리콘 우선권이 부여되는 것과 함께, 가능한 경우, 모든 잠재적 접합(splice) 변이체는 결과적인 암플리콘에 포함되었다. 프라이머 및 프로브 서열은 도 2에 나타나있다. 대안적으로, 표적 유전자가 원하는 암플리콘을 차지하는 Assay-on-Demand™ 발현 분석법 (Applied Biosystems)에 의해 표시되었다면, 이들을 사용하였다. 내부에서 설계된 분석에서, 프라이머 농도를 SYBR 그린 표지 프로토콜 및 기준 RNA로부터 제조된 cDNA를 이용하여 적정하였다. 증폭은 표준 사이클 조건 ABI Prism™ 7000 서열 검출 시스템 상에서 수행하였다. 단일 증폭 생성물이 해리 곡선에서 관찰되었을 때, 표준 곡선은 최적의 프라이머 농도 및 5'FAM - 3'TAMRA 인산염 Taqman™ 프로브 (Proligo)을 최종 농도 250nM에서 이용하여 625배 농도 범위에 걸쳐 발생되었다. 0.98 을 초과하는 회귀 상관계수를 가진 표준 곡선을 생성하는 분석을 후속 분석에 사용하였다.

분석은 96-웰 플레이트에서 수행하였다. 각 플레이트는 625배 농도 범위에 걸친, 기준 cDNA 표준 곡선을 함유하였다. 소변 qPCR에서는, ~0.5 ml의 비분획된 소변으로부터 추출된 전체 RNA를 각 반응에 사용하였다. ΔCt (표적 유전자 Ct-평균 기준 cDNA Ct)을 각 마커에 대하여 계산하고, 후속적 비율, 회귀, 또는 분류 분석에 사용하였다.

혈액 내 마커의 발현

전체 혈액에서의 도 3 및 4에 나타난 마커의 발현을 가상적으로(in silico) 결정하였다. 마이크로어레이 프로브는 그의 표적 mRNA의 GenBank 허가 번호를 통해 UniGene 클러스터로 연결되었고, UniGene으로부터의 조직 발현 프로파일은 혈액 라이브러리 중의 발현 서열 태그 (EST)의 수를 결정하기 위해 사용되었다. 발현 서열 태그(EST)가 0 또는 1개인 유전자만 도 4에 나타내었다. 전체 혈액 내의 LTB4DH의 저발현을 확인하기 위해서, 도 2에 나타난 프라이머와 프로브를 사용하여 전체 혈액으로부터 추출된 전체 RNA에 대하여 RT-qPCR을 수행하였다. 어떠한 유의한 발현도 관찰되지 않았다 (결과 미도시).

하향조절( Down - regulated )된 방광암 마커의 규명

방광암의 하향조절된 마커를 규명하기 위해서, 우리는 53개의 방광 종양 및 20 비악성 방광 조직 시료로부터의 RNA에 대하여 30,000 올리고뉴클레오티드 칩을 사용하여 마이크로어레이 연구를 수행하였다. 도 3은 비악성 조직과 비교하여 방광암 조직에서 유의 하향 조절을 나타내는 300개의 유전자에 대한 마이크로어레이 데이터의 통계적 분석을 나타낸다. 도 3은 HUGO 유전자명과 기호, 단백질 참조 서열 번호, NCBI mRNA 참조 서열 번호, MWG 바이오텍 프로브 올리고뉴클레오티드 번호, 종양 및 비악성 조직간의 유전자 발현에서의 중간값 곱변화, 원 비조정된 스튜던트 t-테스트의 결과, 2-샘플 Wilcoxon 테스트 결과, SAM 테스트 결과, 및 합산한 순위 점수를 포함한다.

방광암에 대한 소변 검사에 사용하기 위한 바람직한 저발현된 방광 종양 마 커의 확인

요로 혈뇨증은 방광암과 흔히 동시 발생하므로, 방광암 마커는 전체 혈액에서 유리하게 상승되어 있지 않은 것이 유리하다. 또한, 하향조절된 마커는 비율, 회귀, 또는 분류 분석에서 사용되므로, 종양세포 및 비악성 방광 세포 모두에 충분히 높은 카피 수로 존재하는 것이 소변에서 신뢰성 있는 검출을 가능하게 할 수 있어 유리하다. 적절한 마커를 찾아내기 위해서, 혈중 EST 라이브러리에는 거의 없거나 없으며, 비악성 조직에서는 중간값 발현보다 높은 발현을 갖는 서브세트에 대해 도 3의 유전자를 스크리닝하였다. 중간값 발현은 마이크로어레이 연구에서 분석된 시료에서 어레이 상의 30,000개의 뉴클레오티드를 중간값 강도 순으로 순위를 정함으로써 계산하였다. 도 4는 상기 기준에 부합한 마커를 나타낸다. 도 4는 HUGO 유전자명 및 기호, 단백질 참조 서열 번호, NCBI mRNA 참조 서열 번호, 중간값 곱변화, 순위 점수, 종양 조직 및 비악성 조직에서의 마이크로어레이 스팟 강도의 중간값 순위, 및 혈중 EST 라이브러리에 존재하는 EST의 수를 포함한다.

어레이 데이터에서 관찰된 하향조절은 도 4에 나타난 3 개의 유전자 LTB4DH, BAG1 및 FLJ21511에 대한 qPCR에 의해 검증되었다. 이들 유전자는 10개의 종양 시료 및 10개의 비악성 시료로부터 얻은 전체 RNA에 대하여 검사되었다. LTB4DH, BAG1 및 FLJ21511은 이들 시료에서 방광 비악성 조직과 비교하여, 방광 종양에서 각각 2.5배, 1.4배, 및 6.1배의 평균 하향조절을 보였다.

LTB4DH 를 이용한 소변의 qPCR 분석

TCC 환자 및 비악성 비뇨기적 상태를 갖는 대조군으로부터 소변을 배뇨 또는 도관배출을 통해 수집하였다. 42개의 대조군의 배뇨된 소변 및 37 개의 TCC 환자의 배뇨된 또는 도관배출된 소변으로부터 총 RNA를 추출하고, 추출된 총 RNA를 LTB4DH 및 세 개의 과발현된 마커 IGFBP5, MDK, 및 HoxA13에 대한 프라이머 및 프로브를 사용하여 정량 RT-PCR에 사용하였다. IGFBP5/LTB4DH, MDK/LTB4DH 및 HoxA13/LTB4DH에 대한 ΔCt 비율을 결정하였다. 이 데이터는 도 5의 상자 도표에 의해 도시되어 있으며, 도 5는 세 시험 각각에서 대조군 및 TCC 환자로부터의 소변 시료 간의 데이터의 퍼짐의 명백한 차이를 보인다. 가장 정확한 검사는 그 시료 집단에서 각각 87%와 88%의 민감도와 특이성을 보인 IGFBP5/LTB4DH 였다 (도 6a). 이들 검사 각각에 대한 민감도와 특이성 사이의 상응을 설명하기 위해, ROC 곡선을 도 7에 나타내었다. 곡선 아래에 있는 면적은 IGFBP5/LTB4DH, MDK/LTB4DH 및 HoxA13/LTB4DH에 대해 각각 0.9223, 0.9199, 및 0.7497이었다. 검사의 정확도를 측정하는 이들 면적은, LTB4DH와의 세 개의 비율 모두, 특히 IGFBP5/LTB4DH와 MDK/LTB4DH가 유용한 검사라는 것을 나타낸다.

TCC 검출의 민감도 및 특이성을 증가시키기 위해, 두 검사의 조합을 사용하였다. 이들 시험 조합의 최적의 민감도 및 특이성은 도 6b에 나타내었다. 도 8a-f는 LTB4DH와 BAG1를 이용한 세 시험 각각에 대한 2차원 공간에서의 데이터의 분리 를 나타낸다. 이 데이터는 하향조절되는 BTM LTB4DH 또는 BAG1을 포함하는 그 이상의 검사의 조합이 90% 초과의 민감도 및 특이성을 달성할 수 있다는 것을 보여준다. 이에 더해, 이들 검사는 마커의 절대적인 수치가 아닌, 간단한 유전자 발현 고유 신호(signature)를 측정하기 때문에, 소변 농도의 변화에 강건할 것이다.

소변 농도에 대한 LTB4DH와의 비율과 관련되는 검사의 강건성을 확증하기 위해, IGFBP5의 단독의 수준(ΔCt)과 IGFBP5/LTB4DH의 수준을 소변 농도의 함수(도 9a-b)로서 작도하고, 추세선을 데이터에 맞추었다. 비악성 대조군 및 TCC 환자로부터의 소변 시료 모두에 대해, IGFBP5/LTB4DH 비율에서 존재하지 않는, 소변의 농도가 증가함에 따라 IGFBP5 ΔCt가 감소하는 것을 볼 수 있다. IGFBP5와 LTB4DH의 발현에 종양 크기 및 종양 이질성과 같은 다른 영향이 존재하지 않기 때문에, 이 효과는 비악성 시료에서 가장 현저하다.

몇몇의 경우, 단일 마커가 방광암 분석에 사용될 때, 소변 시료 수집 방법이 수집된 박피 방광 세포 수의 변동으로 인해 검출되는 마커의 양에 영향을 미칠 수 있다. 이 편차(bias)는 시료들의 작은 일부분에서 거짓 양성 또는 거짓 음성의 결과를 초래할 수 있다. LTB4DH 또는 다른 저발현된 유전자를 포함하는 비율의 사용은 다양한 방법에 대해 보상하는 방법을 제공하여야 할 것이다. 이 가설을 시험하기 위해, TCC 환자로부터 간단한 배뇨 (9개 시료) 또는 도관 배출 (28개 시료)을 통해 수집된 시료를 TCC 마커 및 LTB4DH의 존재에 대하여 검사하였다. TCC 마커 분석에 의하면, 배뇨된 시료들은 데이터 범위의 더 낮은 말단에서 더 많이 표시되었고 (높은 Ct), 이는 이들 시료에서 도관배출된 시료와 비교하여 박피된 세포가 더 낮은 평균 수를 갖는 것과 일치한다. 이것은 도 10a-c의 IGFBP5, MDK 및 HoxA13에 대한 자가-자가 산점도에 도시되어 있다. 대조적으로, 이들 마커와 LTB4DH 사이의 비율을 계산하면, 배뇨된 및 도관배출된 시료는 Ct 비율의 유사한 범위에 걸쳐 전개되었고(도 10d-f), 이는 고발현된 마커와 LTB4DH와 같은 저발현된 마커 사이의 유전자 발현 고유신호의 계산이 다양한 소변 시료 채취 방법론에 의해 도입된 마커 수준의 변이를 보상한다는 것을 설명하는 것이다.

저급 종양을 갖는 환자로부터의 소변 시료는 이들 시료에서 적은 수의 박피 세포의 존재로 인해 BTM의 축적에 있어서 종종 경계선에 있다. 따라서 이들 시료는 시료채취 방법 또는 소변 농도의 변동으로 인해 잘못 분류가 될 위험이 크다.

그러므로, TCC의 검출을 위한 하향조절된 유전자를 통합하는 유전자 발현 비율의 유용성은 저급 TCC의 검출에 적용될 때 현저하게 될 가능성이 크다. 이 효과를 입증하기 위해, 43개의 저급 TCC를 가진 환자로부터 배뇨된 소변 시료 및 123개의 대조군의 집단을 마커 IGFBP5, HoxA13 및 LTB4DH로 시험하였다. 상기 집단의 임상적 특성은 도 13에 요약되어 있다. IGFBP5 및 HoxA13에 대한 qPCR 데이터를 ROC 곡선 아래의 면적을 시험 정확도의 척도로서(STATA 통계 패키지) 사용하여 단독으로 또는 LTB4DH와의 비율로 분석하였다. 결과는 도 14에 요약되어 있다. IGFBP5 마커를 사용하여, LTB4DH는 저급 (1-2급) 단계 Ta TCC 검출의 정확도를 9% 증가시켰고, 임의의 단계의 저급 TCC 검출의 정확도를 8% 증가시켰다. 저급 단계 Ta TCC의 HoxA13 시험의 정확도는 3% 증가하였다.

LTB4DH 를 이용한 qPCR 데이터의 선형 판별 분석( Linear Discriminate Analysis )

선형 판별 분석 (LDA)는 2 이상의 군이 최대한 분리되도록 변수들의 선형 조합이 생성되는 통계적 기법이다 (Fisher R.A. 'The Use of Multiple Measurements in Taxonomic Problems'.Annals of Eugenics 7 179 (1936)). 이 변수들의 선형 조합은 "선형 판별"이라고 불리며, 이는 데이타 세트의 클래스를 최대한 분리하는 입력 변수에 대한 선형 함수이다. LDA (또는 다른 임의의 분류 기법)의 qPCR 데이터와 같은 특정 데이터 세트의 특징을 규명하는 능력은 교차 검증을 사용하여 시험될 수 있다. 이 방법에서, 상기 데이터 세트의 일부는 분류기(classifier)를 생성하는 데 사용될 수 있고, 데이터 세트의 일부는 상기 분류기의 효능을 측정하는 데 사용된다. 데이타를 교육용 및 시험용 세트로 분할하는 것은 수차례 반복될 수 있다 (각 차례마다 새로운 분류기를 생성함). k-곱 교차 검증에서, 테이터 세트는 k 회(k-wise)로 나뉘고, 각 서브세트은 k 회의 교육 및 검증 중 하나에서 시험 세트로 사용된다. 이는 각 시료가 데이터 세트에 잔존하는 시료로부터 생성된 분류기에 따라 분류되는 것인, 하나 제외 교차 검증 (leave-one-out cross-validation: LOOCV)에까지 확장될 수 있다 ("하나 제외"; 시험되고 있는 시료를 제외시키는 것).

LDA와 LOOCV는 TCC의 진단을 향상시키는 데 있어서 하향조절된 BTM, LTB4DH의 활용을 설명하기 위해 사용되었다. 먼저, 도 13에서 기술된, 대조군 및 30개의 3급 종양 (5 > 1급, 13 = 1급, 4= Tis, 및 8=Ta)이 추가 보충된 TCC 소변 시료 집단에 대해 qPCR을 수행하였다. 6개의 유전자 LTB4DH, MDK, IGFBP5, HOXA13, TOP2a 및 CDC2의 조합을 분류기 성능(classifier performance)에 대하여, LOOCV에 의해 판단된 바와 같이 시험하였다. ("제외"된 시료가 TCC 시료일) 후부 확률(posterior probability)을 사용하여 R 통계 프로그래밍 환경의 ROCR 패키지를 이용하여 ROC 곡선을 생성하였다. 주어진 특이성에 대한 분류기의 민감도는 적절한 ROC 곡선에 대한 참조로서 수득하였다.

LTB4DH와 함께 또는 없이 상향조절된 BTM의 조합을 이용한 TCC 검출의 민감도는 85%의 특이성에서 결정되었다. 도 15는 이 분석의 결과를 나타낸 것이다. 도 15에 의하면, LTB4DG를 상향조절된 BTM인 MDK, IGFBP5, Top2a, cdc2 및 HoxA13의 조합을 포함하는 분석에 부가하는 것은 전체적 민감도를 1-2% 증가시키고, Ta 단계 종양, 1-2급 종양 및 3급 종양의 검출 민감도를 3%까지 증가시켰다는 것을 알 수 있다.

앞서 기술한 바에서 공지의 균등물을 갖는 정수(integers) 또는 구성요소에 대한 참조가 된 경우, 그러한 균등물은 개별적으로 개시된 것처럼 본원 발명에 포함된다.

비록 본 발명이 예시를 통해 및 가능한 그의 구현예에 대한 참조로 기술되었으나, 본 발명의 범위 및 개념(spirit)에서 벗어나지 않으면서 개선 및/또는 변경될 수 있다는 것이 이해되어야 한다.

BTM 패밀리 구성원을 검출하는 방법은 핵산, 단백질, 펩티드를 마이크로어레 및/또는 실시간 PCR 방법을 사용하여 검출하는 것을 포함한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 질병의 진단, 치료 효능의 평가, 및 BTM 패밀리 구성원의 발현을 측정하기에 적절한 시약 및 검사 키트의 생산에 유용하다.

Claims

(a) 객체로부터 시료를 제공하는 단계;

(b) 상기 시료에서 두 개 이상의 종양 마커(tumour marker:TM) 패밀리 구성원의 발현 수준을 검출하는 단계로서, 하나 이상의 TM은 저발현된 TM인 것인 단계;

(c) 소정의 역치에 따라서 환자가 암이 있는지 여부를 확립하는 단계를 포함하는, 객체에서 암의 존재를 결정하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 상기 BTM의 발현 비율을 결정함으로써 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 BTM 발현값에 대한 회귀 또는 분류 분석을 수행함으로써 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 TM은 BTM인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 암은 방광암인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 TM들 중 하나 이상의 TM은 과발현된 TM인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 저발현된 TM은 도 3에서 도시된 군으로부터 선택되는 BTM인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 저발현된 TM은 도 4에서 도시된 군으로부터 선택되는 BTM인 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 과발현된 TM은 도 11 또는 도 12에서 도시된 군으로부터 선택되는 BTM인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 검출하는 단계는 TM mRNA의 발현을 검출함으로써 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 검출하는 단계는 TM 단백질의 발현을 검출함으로써 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 검출하는 단계는 TM 펩티드의 발현을 검출함으로써 수행되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 시료는 생검, 혈액, 혈청, 복막 세정물, 뇌척수액, 소변 및 대변 시료 중 어느 하나인 것인 방법.
그 위에 TM 포획 시약을 갖는 기판; 및

상기 기판과 연관된 검출기로서, 상기 검출기는 상기 포획 시약과 연관된 TM을 검출할 수 있고, 상기 TM은 저발현된 TM인 것인 검출기를 포함하는 TM 검출 장치.
제14항에 있어서, 상기 TM은 BTM인 것인 장치.
제14항에 있어서, 상기 TM 포획 시약은 올리고뉴클레오티드인 것인 장치.
제14항에 있어서, 상기 TM 포획 시약은 항체인 것인 장치.
제14항에 있어서, 상기 TM은 도 3에서 도시된 군으로부터 선택되는 BTM인 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 TM은 도 4에서 도시된 군으로부터 선택되는 BTM인 것인 방법.
기판;

하나 이상의 TM은 저발현된 TM인 둘 이상의 TM 포획 시약; 및

사용 설명서를 포함하는, 객체에서 암의 존재를 결정하는 키트.
제20항에 있어서, 상기 TM은 BTM인 것인 키트.
제20항에 있어서, 상기 TM 포획 시약은 TM-특이적 올리고뉴클레오티드인 것인 키트.
제20항에 있어서, 상기 TM 포획 시약은 TM-특이적 항체인 것인 키트.
제20항에 있어서, 상기 저발현된 TM은 도 3에서 도시된 군으로부터 선택되는 BTM인 것인 키트.
제20항에 있어서, 상기 저발현된 TM은 도 4에서 도시된 군으로부터 선택되는 BTM인 것인 키트.
제20항에 있어서 하나 이상의 TM은 과발현된 TM인 것인 키트.
제263항에 있어서, 상기 과발현된 TM은 도 11 또는 도 12에서 도시된 군으로부터 선택되는 BTM인 것인 키트.