BRPI0707642A2 - taxas de expressço de gene de urina para detecÇço de cÂncer - Google Patents

Abstract

TAXAS DE EXPRESSçO DE GENE DE URINA PARA DETECÇçO DE CÂNCER. A presente invenção refere-se aos métodos para determinar a presença de câncer em um indivíduo com base na análise dos níveis de expressão de um marcador de tumor (TM) subexpresso e pelo menos um outro TM. Especificamente, esta invenção refere-se à determinação de um câncer, particularmente câncer de bexiga, realizando-se análise de taxa, regressão ou classificação dos níveis de expressão de pelo menos um TM subexpresso, particularmente um TM de bexiga subexpresso (TM), e pelo menos um TM superexpresso, particularmente um TM superexpresso. Em vários aspectos, a invenção refere-se aos kits e dispositivos para realizar estes métodos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TAXAS DEEXPRESSÃO DE GENE DE URINA PARA DETECÇÃO DE CÂNCER".

CAMPO TÉCNICO

Esta invenção refere-se à detecção de câncer. Especificamente,a invenção refere-se ao uso de marcadores para a detecção de câncer debexiga. Mais especificamente, esta invenção refere-se ao uso de um marca-dor subexpresso em combinação com pelo menos um outro marcador para adetecção de câncer de bexiga.

ANTECEDENTES

Sobrevivência de paciente de câncer é enormemente realçadaquando o câncer é tratado precocemente. No caso de câncer de bexiga, pa-cientes diagnosticados com doença em estágio precoce têm taxas de sobre-vivência de 5 anos de >90%, comparadas a aproximadamente 15-30% parapacientes diagnosticados com doença avançada. Portanto, desenvolvimen-tos que resultam em diagnóstico precoce de câncer de bexiga podem resul-tar em um prognóstico melhorado para os pacientes. O método estabelecidopara detectar câncer de bexiga utilizando-se amostras de urina é citologia.Entretanto, citologia é conhecida ser apenas cerca de 75% sensível paradetectar câncer de bexiga invasivo e apenas cerca de 25% sensível paradetectar câncer de bexiga superficial (Lotan e Roehrborn, Urology 61, 109-118(2003)).

Identificação de marcadores específicos para câncer em urinapode fornecer um método valioso para o diagnóstico precoce de câncer, re-sultando em tratamento precoce e prognóstico melhorado. Marcadores decâncer específicos também fornecem um modo de monitorar a progressãoda doença, permitindo a eficácia de tratamentos cirúrgico, radioterápico equimioterápico ser monitorada.

Presentemente, o método mais seguro para detectar câncer debexiga é cistoscopia acompanhado por histologia de lesões biopsiadas. En-tretanto, esta técnica é demorada, invasiva e sua sensibilidade é apenasaproximadamente 90%, significando que cerca de 10 por cento de cânceresnão são detectados utilizando-se estes métodos. Das metodologias não in-vasivas, citologia de urina, que detecta células malignas esfoliadas micros-copicamente, é o método preferido atualmente. Embora citologia tenha umaespecificidade de cerca de 95%, ela tem sensibilidade pobre (9-25%) paralesões de baixo grau, é extremamente dependente da qualidade da amostrae sofre de variabilidade inter-observador elevada.

Diversos marcadores de proteína de urina são conhecidos. Tes-tes para estes marcadores oferecem melhor sensibilidade do que a citologia,porém tendem a sofrer de especificidade sub-ideal porque níveis elevadosdestes marcadores são também comumente observados em pacientes comdoenças não malignas incluindo inflamação, urolitíase e hiperplasia prostáti-ca benigna. Por exemplo, NMP22, que detecta uma proteína de matriz nu-clear específica, tem uma sensibilidade de 47-87% e uma especificidade de 58-91%.

Uma desvantagem associada com testagem de urina é que ní-veis de marcador individuais podem variar significantemente com: (i) diferen-tes métodos de coleta de urina (cateterizados, a vácuo, péletes de urina); (ii)o cálculo diurno de amostragem de urina; (iii) o ponto de amostragem duran-te esvaziamento (por exemplo fluxo vs amostra final); e (iv) concentração deurina associada com ingestão de fluido variante, função renal ou doençasque afetam o volume plasmático. Estas variações têm o potencial de resultarem testes falso positivo e falso negativo. Embora algumas destas variaçõespossam ser reduzidas utilizando-se procedimentos de operação padrão estri-tos, a concordância do paciente com estes procedimentos pode ser não con-fiável. O efeito de concentração de urina variante pode, em alguns casos,ser calculado avaliando-se níveis de marcador relativos à creatinina urinária,entretanto, isto aumenta o custo e complexidade do teste, particularmentequando a preparação da amostra ou métodos de armazenagem diferem-seda detecção de marcador e medição de creatinina.

Existe uma necessidade de instrumentos simples para a detec-ção precoce e diagnóstico de câncer. Esta invenção fornece também méto-dos, dispositivos e kits com base nos marcadores, especificamente taxas,regressão ou análise de classificação de marcadores de câncer de bexiga,para auxiliar a detecção e diagnóstico de câncer de bexiga.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

A presente invenção provê um método para determinar a pre-sença de um câncer em um indivíduo, compreendendo:

(a) fornecer uma amostra do indivíduo;

(b) detectar o nível de expressão de pelo menos dois membrosda família de marcador de tumor (TM) na referida amostra, em que pelo me-nos um TM é um TM subexpresso;

(c) estabelecer se o paciente tem câncer de acordo com um Ii-miar predeterminado.

Etapa (c) pode ser realizada determinando-se a taxa de expres-são dos referidos TMs, ou realizando-se análise de regressão ou classifica-ção sobre os níveis de expressão de TM.

O TM pode ser um TM. O câncer a ser detectado pode ser cân-cer de bexiga, e em certas modalidades pelo menos um dos TMs é um TMsuperexpresso. O TM superexpresso pode ser selecionado do grupo deline-ado na figura 11 ou figura 12.

Em certas modalidades pelo menos um TM subexpresso é umTM selecionado do grupo delineado na figura 3 ou figura 4.

Em outras modalidades da presente invenção a etapa de detec-ção é realizada detectando-se superexpressão de mRNA de TM, uma prote-ína de TM, ou um peptídeo de TM.

A amostra pode ser qualquer uma de biópsia, sangue, soro, la-vagens peritoneais, fluido cerebroespinhal, urina e amostras de evacuação.

A presente invenção também provê um dispositivo para detectarum TM, compreendendo:

um substrato tendo um reagente de captura de TM nele; eum detector associado com o dito substrato, o dito detector ca-paz de detectar um TM associado com o dito reagente de captura, em que oTM é um TM subexpresso.

O TM pode ser um TM.

O reagente de captura de TM pode ser um oligonucleotídeo ouum anticorpo.

Em certas modalidades o TM pode ser um TM selecionado dogrupo delineado na figura 3 ou figura 4.

A presente invenção também provê um kit para determinar apresença de um câncer em um indivíduo, compreendendo:um substrato;

pelo menos dois reagentes de captura de TM, em que pelo me-nos um TM é um TM subexpresso; einstruções para uso.

O TM pode ser um TM.

O reagente de captura de TM pode ser um oligonucleotídeo es-pecífico de TM ou um anticorpo específico de TM.

O TM detectado pelo kit pode ser um TM selecionado do grupodelineado na figura 3 ou figura 4.

Pelo menos um dos TMs detectados pelo kit pode ser um TMsuperexpresso ou um TM superexpresso. O TM superexpresso pode ser se-lecionado do grupo delineado na figura 11 ou figura 12.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

Esta invenção é descrita com referência às modalidades especí-ficas desta e com referência às figuras, nas quais:

figura 1 representa uma tabela mostrando as características deamostras de urina utilizadas nas análises de qPCR.

figura 2 representa uma tabela de iniciadores e sondas de oligo-nucleotídeo de marcadores para análise de qPCR de câncer de bexiga deacordo com a presente invenção.

figura 3 representa uma tabela de marcadores de tumor de bexi-ga subexpressantes identificados utilizando-se métodos de microarranjo emamostras de câncer de bexiga.

figura 4 representa uma tabela de marcadores de tumor de bexi-ga subexpressantes identificados utilizando-se métodos de microarranjo emamostras de câncer de bexiga que têm expressão insignificante em todo osangue, porém expressão elevada em tecido de bexiga normal.figura 5 representa caixa e plotes de monocristal fibrilar mos-trando as taxas de três marcadores de carcinoma de célula transicional debexiga (TCC) (HoxA13, IGFBP5, e MDK) com o marcador subexpressanteLTB4DH para amostras de urina de pacientes com doença urológica nãomaligna ou TCC. As caixas definem os 25Q, 509 e 759 percentis e as barrashorizontais expressam os valores adjacentes. Valores discrepantes são mos-trados por círculos. As caixas vazias representam amostras de controles dedoença não maligna e as caixas sombreadas representam amostras de pa-cientes com TCC.

figura 6 mostra exemplos das sensibilidades e especificidadesde detecção de TCC por testes que incluem LTB4DH. (a), testes únicos; (b).testes em combinação utilizando-se LTB4DH e dois dos três marcadoresHoxAI3, IGFBP5, e MDK.

figura 7a-c mostra curvas de ROC para a sensibilidade e especi-ficidade de detecção de TCC em amostras de urina utilizando-se taxas queincluem LTB4DH. 7a. IGFBP5/LTB4DH; 7b. MDK/LT4BDH; 7c. Ho-XA13/LTB4DH.

figura 8a-f mostra plotes de dispersão para testes de combina-ção, a-c utilizando-se LTB4DH e dois dos três marcadores HoxAI3, IGFBP5,e MDK, e d-f repetiram-se utilizando-se BAG1 para LTB4DH. 8a.MDK/LTB4DH e IGFBP5/LTB4DH; 8b. MDK/LTB4DH e HoxAI3/LTB4DH;IGFBP5/LTB4DH e HoxAI3/LTB4DH; 8d MDK/BAG1 e IGFBP5/BAG1;8e.MDK/BAG1 e HoxAI 3/BAG1; 8f. IGFBP5/BAG1 e HoxAI 3/BAG1.

figura 9a-b mostra plotes de dispersão mostrando a correlaçãoentre as relações de ACt para IGFBP5 e ACt para IGFBP5/LTB4DH e con-centração de creatinina na urina. 9a. amostras de urina de pacientes comTCC 9b. Amostras de urina de pacientes com doença não maligna

figura 10a-f representa plotes de dispersão auto-auto mostrandoa distribuição de amostras vazias e cateterizadas de urina de pacientes deTCC analisadas utilizando-se o marcador de tumores de bexiga MDK,IGFBP5 e HoxAI3 sozinho ou em relações com LTB4DH.

figura 11 mostra marcadores superexpressos conhecidos de tu-mores de bexiga invasiva.

figura 12 mostra marcadores superexpressos conhecidos de tu-mores de bexiga superficial.

figura 13 mostra as características clínicas de amostras de TCCde baixo grau e controles utilizados em ariálise de curva ROC.

figura 14 mostra os resultados de uma análise de curva ROC.Ilustração da precisão de teste aumentada obtida quando LTB4DH é utiliza-do em relações com HoxAI 3 e IGFBP5.

figura 15 mostra os resultados de uma Análise Discriminada Li-near de BTMs, com e sem LTB4DH, para a detecção de TCC.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Definições

O termo "marcador" significa uma molécula que é associadaquantitativamente ou qualitativamente com a presença de um fenômeno bio-lógico. Exemplos de "marcadores" incluem um polinucleotídeo, tal como umgene, fragmento de gene, RNA, ou fragmento de RNA; ou um produto degene, incluindo um polipeptídeo tal como um peptídeo, proteína de oligopep-tídeo ou fragmento de proteína; ou metabolitos relacionados, por produtosou outras moléculas de identificação, tais como anticorpos ou fragmentos deanticorpo quer relacionados diretamente ou indiretamente a um mecanismoque fundamenta o fenômeno. Os marcadores da invenção incluem as se-qüências de nucleotídeo (por exemplo seqüências GenBank) como descritoaqui, em particular as seqüências de comprimento natural, quaisquer se-qüências codificantes, seqüências não codificantes e fragmentos, ou quais-quer comprimentos destas, e qualquer marcador mensurável destas comodefinido acima.

O termo "sensibilidade" significa a proporção de indivíduos coma doença que testa (pelo modelo) positivo. Desse modo, sensibilidade au-mentada significa menores resultados de teste negativo.

O termo "especificidade" significa a proporção de indivíduos sema doença que testa (pelo modelo) negativa. Desse modo, especificidade au-mentada significa menos resultados de teste positivo.O termo "expressão" inclui a produção de polinucleotídeos e po-lipeptídeos, em particular, a produção de RNA (por exemplo, mRNA) de umgene ou porção de um gene, e inclui a produção de um polipeptídeo codifi-cado por um RNA ou gene ou porção de um gene, e inclui aparecimento deum material detectável associado com expressão. Por exemplo, a formaçãodê um complexo, por exemplo, de uma interação de polipeptídeo-polipeptídeo, interação de polipeptídeo-nucleotídeo, ou similares, é incluídano escopo do termo "expressão". Outro exemplo, a ligação de um ligandode ligação, tal como uma sonda de hibridização ou anticorpo, a um gene ououtro polinucleotídeo, um polipeptídeo ou um fragmento de proteína e a vi-sualização do ligando de ligação. Desse modo, a densidade de um pontosobre uma microarranjo, sobre uma mancha de hibridização tal como umanorthern blot, ou em uma immunoblot, tal como uma western blot, ou emuma disposição de conta, ou por análise de PCR, é incluída dentro do termo"expressão" da molécula biológica de fundamentação.

O termo "superexpressão" é utilizado em que a expressão de ummarcador em uma célula, ou tipo celular, é maior do que aquela de outracélula ou tipo celular equivalente,.

O termo "subexpressão" é utilizado em que a expressão de amarcador em uma célula, ou tipo celular, é menor do que aquele de outracélula ou tipo celular equivalente.

O termo "TM" ou "marcador de tumor" ou "membro da famíliaTM" significa um marcador que é associado com um câncer particular. Otermo TM também inclui combinações de marcadores individuais, cuja com-binação melhora a sensibilidade e especificidade de detectar câncer. É en-tendido que o termo TM não requer que o marcador seja específico apenaspara um tumor particular. De preferência, a expressão de TM pode ser alte-rada em outros tipos de células, células doentes, tumores, incluindo tumoresmalignos.

A TM pode ser identificado extraindo-se RNA de uma amostrade tecido de um paciente suspeito de ter câncer de bexiga, aplicando a cópiade RNA ou cDNA a uma microarranjo tendo diversos oligonucleotídeos nela,permitindo a amostra de RNA hibridizar os oligonucleotídeos na disposição,e em seguida quantificando o nível de RNA avaliado ligado a cada ponto dadisposição. Um marcador é considerado ser um TM superexpressante sesua presença estiver abaixo de um limiar de pelo menos cerca de 1,2 vezesdaquele encontrado em tecido não-maligno, normal, utilizando-se métodosde microarranjo. Alternativamente, o limiar pode ser abaixo de cerca de 2vezes o normal, cerca de 3 vezes menor que o normal, 4 vezes ou mesmocerca de 5 vezes menor do que o normal. Por "normal" entendemos menosdo que 90- percentil da população normal. Em outros casos, normal podesignificar um nível de presença do 95õ percentil (isto é, cerca de 2 DesviosPadrão (SD) da média), e em outros casos, menos do que cerca de 97,5epercentil (isto é, cerca de 3 SD) ou o 99Q percentil.

O termo "TM superexpressante" significa um marcador que mos-tra menor expressão em tumores de bexiga do que em tecido de bexiga não-maligno.

O termo "TM superexpressante" significa um marcador que mos-tra maior expressão em tumores de bexiga do que em tecido não-maligno.

O termo "TM" ou "marcador de tumor de bexiga" ou "membro dafamília de TM" significa um TM que é associado com câncer de bexiga. Otermo TM também inclui combinações de marcadores individuais, cuja com-binação melhora a sensibilidade e especificidade de detectar câncer de be-xiga. Deve-se entender que o termo TM não requer que o marcador sejaespecífico apenas para tumores de bexiga. De preferência, a expressão deTM pode ser alterada em outros tipos de células, células doentes, tumores,incluindo tumores malignos.

O termo "TM subexpressante" significa um marcador que mostramenor expressão em tumores de bexiga do que em tecido de bexiga não-maligno.

O termo "TM superexpressante" significa um marcador que mos-tra maior expressão em tumores de bexiga do que em tecido não-maligno.

O termo "qPCR" significa reação de cadeia de polimerase quan-titativa. O termo "qPCR" ou "QPCR" refere-se à reação de cadeia de polime-rase quantitativa como descrito, por exemplo, em Técnica de PCR: Quantita-tive PCR, J.W. Larrick, ed., Eaton Publishing, 1997, e A-Z of QuantitativePCR, S. Bustin1 ed., IUL Press, 2004.

O termo "TCC" significa carcinoma de célula transicional da be-xiga. TCCs constitui -95% de todos os cânceres de bexigas.

Como utilizados aqui "anticorpos" e termos similares referem-seàs moléculas de imunoglobulina e porções imunologicamesnte ativas de mo-léculas de imunoglobulina (Ig), isto é, moléculas que contêm um sítio de li-gação de antígeno que especificamente liga (imunorreage com) um antíge-no. Estes incluem, porém não estão limitados a, cadeia única, policlonal,monoclonal, quimérica, fragmentos de Fe, Fab, Fab', e Fab2, e uma bibliote-ca de expressão de Fab. As moléculas de anticorpo referem-se a qualquerdas classes IgG, IgM, IgA, IgE, e IgD, que diferem uma da outra pela nature-za de cadeia pesada presente na molécula. Estas subclasses incluem tam-bém, tal como IgGI, lgG2, e outros. A cadeia leve pode ser uma cadeia kapaou uma cadeia lambda. Referência aqui a anticorpos inclui uma referência atodas as classes, subclasses, e tipos. São também incluídos anticorposquiméricos, por exemplo, anticorpos monoclonais ou fragmentos destes quesão específicos a mais do que uma fonte, por exemplo, uma seqüência decamundongo ou humana. São também incluídos anticorpos camelídeos, an-ticorpos ou~nanocorpos de tubarão.

Os termos "câncer" e "cancerosos" referem a ou descrevem acondição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por cres-cimento celular anormal ou desregulado. O câncer e a patologia do câncerpodem estar associados, por exemplo, com a metástase, interferência com ofuncionamento normal de células vizinhas, liberação de citocinas ou outrosprodutos secretores em níveis anormais, supressão ou agravamento de res-posta inflamatória ou imunológica, neoplasia, premalignidade, malignidade,invasão dos tecidos ou órgãos circundantes ou distantes, tal como nodoslinfáticos, etc.

O termo "tumour" refere-se a todo crescimento e proliferação decélula neoplásica, se maligna ou benigna, e todas as células e tecidos pré-cancerosos e cancerosos.

O termo "microarranjo" refere-se a uma disposição ordenada ounão ordenada de agentes de captura, preferivelmente polinucleotídeos (porexemplo, sondas) ou polipeptídeos em um substrato. Veja, por exemplo,Microarray Analysis, M. Schena, John Wiley & Sons, 2002; Microarray Bio-chip Technology, M. Schena1 ed., Eaton Publishing, 2000; Guide to Analysisof DNA Microarray Data, S. Knudsen, John Wiley & Sons, 2004; e proteínaMicroarray Technology, D. Kambhampati, ed., John Wiley & Sons, 2004.

O termo "oligonucleotídeo" refere-se a um polinucleotídeo, tipi-camente uma sonda ou iniciador, incluindo, sem limitação, deoxiribonucleo-tídeos de filamento simples, ribonucleotídeos de filamento simples ou duplo,RNA: híbridos de DNA, e DNAs de filamento duplo. Oligonucleotídeos, talcomo oligonucleotídeos de sonda de DNA de filamento simples, são freqüen-temente sintetizados por métodos químicos, por exemplo utilizando-se sinte-tizadores de oligonucleotídeo automatizados que estão comercialmente dis-poníveis, ou por uma variedade de outros métodos, incluindo sistemas deexpressão in vitro, técnicas recombinantes, e expressão em células e orga-nismos.

O termo "polinucleotídeo," quando utilizado no singular ou plural,geralmente refere-se a qualquer poliribonucleotídeo ou polideoxribonucleotí-deo, que pode ser RNA ou DNA não modificado ou RNA ou DNA modificado.Isto inclui, sem limitação, DNA de filamento simples ou duplo, DNA incluindoregiões de filamento simples e duplo, RNA de filamento simples ou duplo, eRNA incluindo regiões de filamento simples ou duplo, moléculas híbridascompreendendo DNA e RNA que podem ser de filamento simples ou, maistipicamente, de filamento duplo ou inclui regiões de filamento simples ou du-plo. São também incluídas regiões de filamento triplo compreendendo RNAou DNA ou ambos RNA e DNA. São especificamente incluídos os mRNAs,cDNAs, e DNAs genômicos, e quaisquer fragmentos destes. O termo incluiDNAs e RNAs que contém uma ou mais bases modificadas, tal como basestritiadas, ou bases incomuns, tal como inosina. Os polinucleotídeos da in-venção podem abranger codificação ou seqüências não codificantes, ou se-qüências de sentido ou anti-sentido. Será entendido que cada referência aum "polinucleotídeo" ou termo similar, incluso, incluirá as seqüências de ta-manho natural, bem como quaisquer fragmentos, derivados, ou variantesdestes.

"Polipeptídeo," como utilizado aqui, refere-se a uma seqüênciade oligopeptídeo, peptídeo, ou proteína, ou fragmento desta, e a moléculasde ocorrência natural, recombinantes, sintéticas, ou semi-sintéticas. Em que"polipeptídeo" é mencionado aqui para referir-se a uma seqüência de ami-noácido de uma molécula de proteína de ocorrência natural, "polipeptídeo" etermos similares, não se destinam a limitar a seqüência de aminoácido à se-qüência de aminoácido nativa, completa, para a molécula de tamanho natu-ral. Será entendido que cada referência a um "polipeptídeo" ou termo simi-lar, inclusa, incluirá a seqüência de tamanho natural, bem como quaisquerfragmentos, derivados, ou variantes destes.

"Rigorosidade" de reações de hibridização é facilmente determi-nável por alguém versado na técnica, e geralmente é um cálculo empíricodependente do comprimento da sonda, temperatura de lavagem, e concen-tração de sal. Em geral, sondas mais longas requerem temperaturas maio-res para recozimento adequado, enquanto sondas mais curtas necessitamtemperaturas menores. A hibridização geralmente depende da capacidadede DNA desnaturado para recozer quando filamentos complementares estãopresente em um ambiente abaixo de sua temperatura de fusão. Quanto mai-or o grau de homologia desejada entre a sonda e seqüência hibridizável,maior a temperatura relativa que pode ser utilizada. Como um resultado,segue que as temperaturas relativas maiores tenderiam a tornar as condi-ções reacionais mais rigorosas, enquanto que temperaturas menores fariammenos isso. Detalhes adicionais e explanação de rigorosidade de reaçõesde hibridização, são encontrados, por exemplo, em Ausubel e outro, CurrentProtocols in Molecular Biologia, Wiley Interscience Publishers, (1995).

"Condições rigorosas" ou "condições de rigorosidade elevada",como aqui definido, tipicamente: (1) emprega baixa resistência tônica e tem-peratura elevada para lavagem, por exemplo 0,015 M de cloreto de sódio /0,0015 M de citrato de sódio / 0.1% sulfato de dodecila de sódio a 50°C; (2)empregam um agente de desnaturação durante hibridização, tal como for-mamida, por exemplo, 50% (v/v) de formamida com 0,1% de albumina desoro bovino / 0,1% de Ficoll / 0,1% polivinilpirrolidona/50 mM de tampão defosfato de sódio em pH 6,5 com 750 mM de cloreto de sódio, 75 mM de citra-to de sódio a 42°C; ou (3) empregam 50% de formamida, 5X SSG (0,75 Mde NaCI, 0,075 M de citrato de sódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 6,8),0,1% de pirofosfato de sódio, 5X, solução de Denhardt, DNA de esperma desalmão tratado por onda sonora (50 pg/ml), 0,1% de SDS, e 10% de sulfatode dextrana a 42°C, com lavagens a 42°C em 0.2X SSC (cloreto de só-dio/citrato de sódio) e 50% de formamida a 55°C, seguido por uma lavagemde alta rigorosidade compreendendo 0,1 X SSC contendo EDTA a 55°C.

"Condições de rigorosidade moderada" podem ser identificadascomo descrito por Sambrook e outro, Molecular Cloning: A Laboratory Ma-nual, Nova Iorque: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluem o uso de solu-ção de lavagem e condições de hibridização (por exemplo, temperatura, re-sistência iônica, e % de SDS) menos rigorozas que aquelas descritas acima.Um exemplo de condições moderadamente rigorosas é a incubação durantea noite a 37°C em uma solução compreendendo: 20% de formamida, 5XSSC (150 mM de NaCI, 15 mM de citrato de trissódio), 50 mM de fosfato desódio (pH 7,6), 5X solução de Denhardt, 10% de sulfato de dextrana, e 20mg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado desnaturado, seguido porlavagem dos filtros em 1X SSC em cerca de 37 a 50°C. O técnico versadoreconhecerá como ajustar a temperatura, resistência iônica, etc. quando ne-cessário para acomodar fatores tal como comprimento da sonda e similares.

A prática da presente invenção empregará, a menos que de ou-tro modo indicado, técnicas convencionais de biologia molecular (incluindotécnicas recombinantes), microbiologia, biologia celular, e bioquímica, queincluem-se na experiência da técnica. Tais técnicas são explanadas total-mente na literatura, tal como, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ãedição, Sambrook e outro, 1989; Oligonucleotídeo Synthesis, MJ Gait, ed.,1984; Animal Cell Culture, R.l. Freshney, ed., 1987; métodos in Enzymology,Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, 4a edição, D.M. Weir & CC. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987; Gene TransferVectors for Mammalian Cells, J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987; CurrentProtocols in Molecular Biologia, F.M. Ausubel e outro, eds., 1987; e PCR:The Polimerase Chain Reaction, Mullis e outro, eds., 1994.

Descrição de Modalidades da Invenção

Utilizando uma combinação de análise de microarranjo e reaçãode cadeia de polimerase quantitativa (qPCR), marcadores para carcinomada bexiga de célula transicional (TCC) que são subexpressas em tumoresforam identificada. Foi surpreendentemente descoberto que relações entreestes marcadores e outros marcadores de tumores de bexiga (TM)1 especi-almente marcadores que são superexpressos em tumores, são diagnósticospara câncer de bexiga.

As taxas (de preferência avaliando um nível absoluto de ummarcador) identificam uma "assinatura" de expressão de gene simples querepresenta o câncer de células de bexiga, e surpreendentemente é mais for-te para variações em técnicas de amostragem ou concentração de urina.

Além disso, a combinação de um marcador subexpresso e um marcador su-perexpresso maximiza o diferencial entre amostras de pacientes e controlesnão-malignos, aumentando a segurança do teste. Os marcadores subex-pressos descritos aqui foram selecionados com base em (i) sub-regulaçãoforte e consistente em TCC, (ii) expressão elevada em tecido normal, e (iii)expressão insignificante em todo o sangue para minimizar o risco de falsospositivos em pacientes que apresentam hematúria.

Como uma alternativa para determinar a relação dos dois TM,sfoi também descoberto que os TM subexpressos e superexpressos podemser analisados em análise de regressão ou técnicas de classificação incluin-do análise discriminada linear, e os resultados destas análises são tambémindicativos de uma presença de câncer de bexiga.

O teste envolve a avaliação de pelo menos dois marcadores deTM, tal como um TM, em uma amostra de um paciente suspeito de ter um cân-cer ou em risco de ter câncer, em que pelo menos um dos TMs é um TM sub-expresso. A taxa d TM subexpresso e o outro TM é indicativa da presença decâncer. O segundo TM pode ser qualquer TM como conhecido na técnica, po-rém preferivelmente é um TM superexpresso. A figura 3 mostra um número demarcadores subexpressos adequados para uso na presente invenção.

O teste é melhor realizado utilizando-se um TM subexpresso emcombinação com um TM superexpresso. Qualquer TM superexpresso podeser utilizado, por exemplo. Os BTMs superexpessos conhecidos identifica-dos de tumores de bexiga invasivos (definidos aqui como tumores > estágio1), são delineados na figura 11, e TM superexpressos identificados de tumo-res de bexiga superficiais (definidos aqui como tumores estágio Ta e Tis)são mostrados na figura 12.

Foi também surpreendentemente estabelecido que BTMs sub-expressos preferidos para uso na presente invenção são aqueles que nãosão significantemente elevados em todo o sangue, e estão presente em nú-meros de cópia suficientemente elevados em ambas as células de tumor ecélulas de bexiga não-malignas. Os BTMs subexpressos preferidos são de-lineados na figura 4.

Marcadores de câncer podem ser detectados em uma amostrautilizando-se qualquer técnica adequada, e podem incluir, porém não estãolimitados, sondas de oligonucleotídeo, qPCR ou anticorpos construídos con-tra marcadores de câncer.

Será apreciado que a amostra a ser testada não é restrita a umaamostra do tecido suspeito de ser um tumor. O marcador pode ser secretadono soro, solto das membranas celulares, liberado de células Iisadas ou as-sociado com células perdidas na urina. Portanto, uma amostra pode incluirqualuer amostra corpórea, e inclui biópsias, sangue, soro, lavagens perito-neais, fluido cerebroespinhal, urina e amostras de evacuação.

Será também apreciado que a presente invenção não está restri-ta à detecção de câncer em humanos, porém é adequada para a detecçãode câncer em qualquer animal, incluindo, porém não limitado a cães, gatos,cavalos, gado vacum, ovelha, veado, porcos e qualquer outro animal conhe-cido contrair câncer.Métodos Gerais para Detecção de Câncer

Os seguinte métodos são métodos não-limitantes que podem serutilizados para avaliar os TMs. Seguindo a avaliação de TMs individuais,relações entre membros de família de TM de expressão elevada e baixa sãodeterminadas. Estas relações são utilizadas para predizer a presença ouausência de câncer.

Alternativamente, os TMs de expressão elevada e baixa são uti-lizados em análises de regressão ou classificação. Os resultados destas a-nálises são também utilizados para predizer a presença ou ausência de câncer.

Metodologias gerais para determinar níveis de expressão sãodelineadas abaixo, embora seja apreciado que qualquer método para deter-minar os níveis de expressão seja adequado.

PCR Quantitativo (aPCR)

PCR quantitativo (qPCR) pode ser realizado em amostras detumor, em soro, plasma e amostras de urina utilizando-se iniciadores e son-das específicos de TM. Em reações controladas, a quantidade de produtoformado em uma reação de PCR (Sambrook, J., E Fritsch1 E. e T Maniatis,Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3rd. Cold Spring Harbor LaboratoryPress: Cold Spring Harbor (2001)) correlaciona-se com a quantidade de pa-drão de partida. Quantificação do produto de PCR pode ser realizada porinterrupção da reação de PCR quando está em fase log, antes dos reagen-tes tornarem-se limitantes. Os produtos de PCR são então eletroforezadosem géis de agarose ou poliacrilamida, manchados com brometo de etídio ouuma mancha de DNA comparável, e a intensidade de manchamento avalia-da por densitometria. Alternativamente, a progressão de uma reação dePCR pode ser avaliada utilizando-se máquinas de PCR tal como o AppliedBiosystems' Prism 7000 ou o Roche LightCycIer que avalia o acúmulo deproduto em tempo real. A PCR de tempo-real avaliar ou a fluorescência detintura de intercalação de DNA tal como Sybr Green no produto PCR sinteti-zado, ou a fluorescência liberada por uma molécula-repórter quando clivadade uma molécula saciadora; as moléculas repórter e saciadora são incorpo-radas em uma sonda de oligonucleotídeo que hibridiza para a molécula deDNA alvo seguindo a extensão de filamento de DNA dos oligonucleotídeosiniciadores. A sonda de oligonucleotídeo é removida e degradada pela açãoenzimática da Taq polimerase no ciclo de PCR seguinte, liberando o repórterda molécula saciadora. Em uma variação, conhecida como Scorpion®, asonda é covalentemente ligada ao iniciador.

PCR de Transcrição Reversa (RT-PCR)

RT-PCR pode ser utilizada para comparar os níveis de RNA emdiferentes populações de amostra, em tecidos normal e de tumor, com osem tratamento com fármaco, para caracterizar padrões de expressão, paradiscriminar entre RNAs intimamente relacionados, e para analisar a estruturadoRNA.

Para RT-PCR, a primeira etapa é o isolamento de RNA de umaamostra alvo. O material de partida é tipicamente RNA total isolado de tumo-res humanos ou linhagens de célula de tumor, e correspondendo a tecidosnormais ou linhagens celulares, respectivamente. O RNA pode ser isoladode uma variedade de amostras, tal como amostras de tumor de mama, pul-mão, cólon (por exemplo, intestino grosso ou intestino delgado), coloretal,gástrico, esofágico, anal, retal, próstata, cérebro, fígado, rim, pâncreas, ba-ço, timo, testículos, ovário, útero, bexiga etc., tecidos, de tumores primários,ou linhagens de célula de tumor, e de amostras reunidas de doadores sadi-os. Se a fonte de RNA for um tumor, o RNA pode ser extraído, por exemplo,de amostras de tecido congelado ou embutido em parafina arquivadas e fi-xadas (por exemplo, fixadas em formalina).

A primeira etapa em perfil de expressão de gene por RT-PCR éa transcrição reversa do padrão de RNA em cDNA, seguido por sua amplifi-cação exponencial em uma reação de PCR. As duas transcriptases reversasmais comumente utilizadas são transcriptase reversa de vírus de mieloblas-tose aviária (AMV-RT) e transcriptase reversa de vírus de leucemia murinaMoloney (MMLV-RT). A etapa de transcrição reversa é tipicamente prepara-da utilizando-se iniciadores específicos, hexâmeros aleatórios, ou iniciadoresde oligo-dT, dependendo das circunstâncias e no objetivo de perfil de ex-pressão. Por exemplo, RNA extraído pode ser transcrito inversamente utili-zando-se um Kit de PCR de RNA de geneAmp (Perkin Elmer, CA, USA), se-guindo as instruções do fabricante. O cDNA derivado pode então ser utiliza-do como um padrão na subseqüente reação de PCR.

Embora a etapa de PCR possa ser usada, uma variedade de DNApolimerases dependentes de DNA termoestável, ela tipicamente emprega aTaq DNA polimerase, que tem uma atividade de 5'-3' nuclease porém não temuma atividade de endonuclease revisora 3'-5'. Desse modo, TaqMan (q) PCRtipicamente utiliza a atividade de 5' nuclease de Taq ou Tth polimerase parahibridizar uma sonda de hibridização ligada a seu amplicon alvo, porém qual-quer enzima com atividade de 5' equivalente pode ser utilizada.

Dois iniciadores de oligonucleotídeo são utilizados para gerar umamplicon típico de uma reação PCR. Um terceiro oligonucleotídeo, ou sonda, édesignado para detectar seqüência de nucleotídeo localizada entre os dois ini-ciadores de PCR. A sonda não é extensível por enzima Taq DNA polimerase, eé rotulada com uma tintura fluorescente repórter e uma tintura fluorescente sa-ciadora. Qualquer emissão induzida por laser da tintura-repórter é sasciadapela tintura saciadora quando as duas tinturas são localizadas próximas uma àoutra quando elas estão sobre a sonda. Durante a reação de amplificação, aenzima Taq DNA polimerase cliva a sonda de uma maneira dependente do pa-drão. Os fragmentos de sonda resultantes desassociam-se em solução, e osinal da tintura-repórter liberada é livre do efeito de saciamento do segundo flu-oroforo. Uma molécula de tintura-repórter é liberada para cada nova moléculasintetizada, e a detecção da tintura-repórter não saciada fornece a base parainterpretação quantitativa dos dados.

TaqMan RT-PCR pode ser realizado utilizando-se equipamentocomercialmente disponível, tal como, por exemplo, ABI PRISM 7700 Se-quence Detecção System (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City,CA, USA), ou Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Ale-manha). Em uma modalidade preferida, o procedimento de 5' nuclease érealizado em um dispositivo de PCR quantitativo de tempo-real tal como oABI PRISM 7700tam Sequence Detecção System. O sistema consiste emum termociclizador, laser, dispositivo acoplado à carga (CCD)1 câmera, ecomputador. O sistema amplifica amostras em um formato de 96 cavidadesem um termociclizador. Durante a amplificação, o sinal fluorescente induzi-do por laser é coletado em tempo-real por meio de cabos de fibra óticas paratodas as 96 cavidades, e detectado como o CCD. O sistema inclui softwarepara operar o instrumento e para analisar os dados.

Os dados de ensaio de 5' nuclease são inicialmente expressoscomo Ct, ou o ciclo limítrofe. Como descrito acima, os valores de fluores-cência são registrados durante cada ciclo e representam a quantidade deproduto amplificado para aquele ponto na reação de amplificação. O pontoquando o sinal fluorescente é primeiro registrado como estatisticamente sig-nificante é o ciclo limítrofe.

PCR Quantitativa de Tempo-Real (aPCR)

Uma variação mais recente da técnica de RT-PCR é a PCRquantitativa de tempo-real, que avaliar o acúmulo de produto de PCR pormeio de uma sonda fluorigênica rotulada dual (isto é, sonda TaqMan). PCRde tempo-real é compatível tanto com PCR competitiva quantitativa quantocom PCR comparativa quantitativa. O primeiro utiliza um competidor internopara cada seqüência alvo para normalização, enquanto o último utiliza umgene de normalização contino dentro de uma amostra, ou um gene de ma-nutenção para RT-PCR. Outros detalhes são fornecidos, por exemplo, porHeld e outro, Genome Research 6: 986-994 (1996).

Os níveis de expressão podem ser determined utilizando-se te-cidos embutidos em parafina, fixos, como a fonte de RNA. De acordo comum aspeto da presente invenção, os iniciadores de PCR e sondas são de-signados com base nas seqüências de íntron presentes no gene a ser ampli-ficado. Nesta modalidade, a primeira etapa no projeto de iniciador/sonda é odelineamento de seqüências de íntron dentro dos genes. Isto pode ser feitopor software publicamente disponível, tal como o software DNA BLAT de-senvolvido por Kent, W. J., Genome Res. 12 (4): 656-64 (2002), ou pelosoftware BLAST incluindo suas variações. Etapas subseqüentes seguemmétodos bem estabelecidos de iniciador de PCR e projeto de sonda.Afim de evitar sinais não-específicos, é útil mascarar seqüênciasrepetitivas dentro dos íntrons quando designando os iniciadores e sondas.Isto pode ser facilmente realizado utilizando -se o programa Repeat Maskerdisponível on-line através do Baylor College of Medicine, que avalia as se-qüências de DNA contra uma biblioteca de elementos repetitivos e retornauma seqüência de indagação em que os elementos repetitivos são masca-rados. As seqüências mascaradas podem então ser utilizadas para designarseqüências iniciadoras e de sonda utilizando-se quaisquer pacotes de plane-jamento de iniciador/sonda comercialmente ou de outro modo publicamentedisponível, tais como Primer Express (Applied Biosystems); MGB assay-by-design (Applied Biosystems); Primer3 (Steve Rozen e Helen J. Skaletsky(2000) Primer3 on the WWW para usuários em geral e para programadoresbiologistas em: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Pro-tocols: Methods in Molecular Biologia. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386).

Os fatores mais importantes considerados em projeto de inicia-dor de PCR incluem comprimento do iniciador, temperatura de fusão (Tm), eteor de G/C, especificidade, seqüências iniciadoras complementares, e se-qüência de extremidade 3'. Em geral, os iniciadores de PCR ideais são ge-ralmente de 17 a 30 bases de comprimento, e contêm cerca de 20 a 80%, talcomo, por exemplo, cerca de 50 a 60% bases G+C. As temperaturas defusão entre 50 e 80°C, por exemplo, cerca de 50 a 70°C, são tipicamene pre-feridas. Para outras normas para o projeto de iniciador de PCR e sonda ve-ja, por exemplo, Dieffenbach, C. W. e outro, General Concepts for PCR Pri-mer Design em: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor La-boratory Press, Nova Iorque, 1995, pp. 133-155; Innis e Gelfand, Optimizati-on of PCRs em: PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications, CRCPress, London, 1994, pp. 5-11; e Plasterer, Τ. N. Primerselect: Primer andprobe design. Methods Mol. Biol. 70: 520-527 (1997), as descrições inteirasdos quais são pelo presente expressamente incororadas por referência.

Análise de Microarranio

Expressão diferencial pode também ser identificada, ou confir-mada utilizando-se a técnica de microarranjo. Desse modo, o pefil de ex-pressão de CCPMs pode ser avaliado em tecidodetumor fresco ou embutidoem parafina, utilizando-se tecnologia de microarranjo. Neste método, as se-qüências de polinucleotídeo de interesse (incluindo cDNAs e oligonucleotí-deos) são semeadas, ou dispostas, em Um substrato de microchip. As se-qüências dispostas (isto é, sondas de captura) são então hibridizadas compolinucleotídeos específicos de células ou tecidos de interesse (isto é, al-vos). Exatamente como no método de RT-PCR, a fonte de RNA tipicamenteé RNA total isolado de tumores ou linhagens de célula de tumor humanos, ecorrespondentes tecidos normais ou linhagens celulares. Desse modo oRNA pode ser isoladode uma variedade de tumores primários ou linhagensde célula de tumor. Se a fonte de RNA for um tumor primário, o RNA podeser extraído, por exemplo, de amostras de tecido congeladas ou embutidasem parafina fixadas por formalina arquivadas (FFPE) e amostras de tecidofixadas (por exemplo, fixadas por formalina), que são rotineiramente prepa-radas e preservadas em prática clínica todos os dias.

Em uma modalidade específica da técnica de microarranjo, in-serções amplificadas por PCR de clones de cDNA são aplicadas a um subs-trato. O substrato pode incluir até 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50,ou 75 seqüências de nucleotídeo. Em outros aspectos, o substrato podeincluir pelo menos 10.000 seqüências de nucleotídeo. As seqüências micro-arranjadas, imobilizadas sobre o microchip, são adequadas para hibridizaçãosob condições rigorosass. Como outras modalidades, os alvos para as mi-croarranjos podem ser de pelo menos 50, 100, 200, 400, 500, 1000, ou 2000bases de comprimento; ou 50-100, 100-200, 100-500, 100-1000, 100-2000,ou 500-5000 bases de comprimento. Como outras modalidades, as sondasde captura para as microarranjos podem ser de pelo menos 10, 15, 20, 25,50, 75, 80, ou 100 bases de comprimento; ou 10-15, 10-20, 10-25, 10-50,10-75, 10-80, ou 20-80 de bases de comprimento.

As sondas de cDNA fluorescentemente rotuladas podem ser ge-radas através da incorporação de nucleotídeos fluorescentes por transcriçãoreversa de RNA extraídos de tecidos de interesse. As sondas de cDNA rotu-Iadas aplicadas ao chip hibridizam com especificidade para cada ponto deDNA sobre a disposição. Após lavagem rigorosa para remover sondas não-especificamente ligadas, o chip é avaliado por microscopia a laser confocalou por outro métodode detecção, tal como uma câmara CCD. A quantifica-ção de hibridização de cada elemento disposto provê a avaliação de abun-dância de mRNA correspondente. Com fluorescência de cor dual, as sondasde cDNA separadamente rotuladas geradas de duas fontes de RNA são hi-bridizadas em pares para a disposição. A abundância relativa das transcri-ções das duas fontes correspondendo a cada gene especificado é dessemodo determinada simultaneamente. Um protocolo exemplar para isto édescrito em detalhes no Exemplo 4.

A escala miniaturizada da hibridização fornece uma avaliaçãoconveniente e rápida do padrão de expressão para grandes números de ge-nes. Tais métodos foram mostrados terem a sensibilidade requerida paradetectar transcrições raras, que são expressas em algumas cópias por célu-la, e para reproduzivelmente detectar pelo menos aproximadamente diferen-ças de duas vezes no nível de expressões (Schena e outro, Proc. Natl. A-cad. Sei. USA 93 (2): 106-149 (1996)). A análise de microarranjo pode serrealizada por equipamento comercialmente disponível, seguindo os protoco-Ios do fabricante, tal como utilizando-se a tecnologia Affymetrix GenChip,tecnologia de microarranjo Illumina ou tecnologia de microarranjo de Incyte.

O desenvolvimento de métodos de microarranjo para análise de larga escalade expressão de gene torna possível pesquisar sistematicamente quantoaos marcadores moleculares de classificação de câncer e predição de resul-tado em uma variedade de tipos de tumor.

Isolamento. Purificação, e Amplificacão de RNA

Métodos gerais para extração de mRNA são bem conhecidos natécnica e são descritos em livros didáticos padrão de biologia molecular, in-cluindo Ausubel e outro, Current Protocols of Molecular Biology, John Wileye Sons (1997). Métodos para extração de RNA de tecidos embutidos emparafina são descritos, por exemplo, em Rupp e Locker, Lab Invest. 56: A67(1987), e De Sandres e outro, BioTechniques 18: 42044 (1995). Em particu-lar, isolamento de RNA pode ser realizado utilizando-se kit de purificação,grupo de tampão, e protease de fabricantes comerciais, tal como Qiagen, deacordo com as instruções do fabricante. Por exemplo, RNA total de célulasem cultura pode ser isolado utilizando-se mini-colunas Qiagen RNeasy. Ou-tros kits de isolamento de RNA comercialmente disponíveis incluem kit depurificação de DNA e RNA Completo MasterPure (EPICENTRE (D, Madison,Wl), e Kit de isolamento de RNA de Bloco de Parafina (Ambion, Inc.). RNAtotal de amostras de tecido pode ser isolado utilizando-se RNA Stat-60 (Tel-Teste). RNA preparado de tumor pode ser isolado, por exemplo, por centri-fugação de gradiente de densidade de cloreto de césio.

As etapas de um protocolo representativo para perfil de expres-são de gene utilizando-se tecidos embutidos em parafina, fixos como a fontede RNA, incluindo isolamento de mRNA, purificação, extensão de iniciador eamplificação são fornecidas em vários artigos de jornal publicados (por e-xemplo: Τ. E. Godfrey e outro. J. Molec. Diagnostics 2: 84-91 (2000); K.Specht e outro, Am. J. Pathol. 158: 419-29 (2001)). Resumidamente, umprocesso representativo inicia com corte de cerca de 10 pm de espessura deseções de amostras de tecido de tumor embutidas erri parafina. O RNA é emseguida extraído, e proteína e DNA são removidos. Após análise da concen-tração de RNA, reparo de RNA e/ou etapas de amplificação podem ser inclu-ídas, se necessário, e RNA é transcrito ao contrário utilizando-se promotoresespecíficos de gene seguidos por RT-PCR. Finalmente, os dados são anali-sados para identificar as melhores opções de tratamento disponíveis para opaciente com base no padrão de expressão de gene característico identifi-cado na amostra de tumor examinada.

Imunoistoquímica e Proteômicos

Métodos de imunoistoquímica são também adequados para de-tectar os níveis de expressão dos marcadores de proliferação da presenteinvenção. Desta maneira, anticorpos ou anti-soros, preferivelmente anti-soros policlonais, e mais preferivelmente anticorpos monoclonais específicospara cada marcador, são utilizados para detectar expressão. Os anticorpospodem ser detectados por rotulagem direta dos anticorpos por si próprios,por exemplo, com rótulos radioativos, rótulos fluorescentes, rótulos de hap-teno tais como, biotina, ou uma enzima tal como peroxidase de rábano pi-cante ou fosfatase alcalina. Alternativamente, anticorpo primário não rotula-do é utilizado em conjunto com um anticorpo secundário rotulado, compre-endendo anti-soros, anti-soros policlonais ou um anticorpo monoclonal espe-cífico para o anticorpo primário. Kits e protocolos de imunoistoquímica sãobem conhecidos na técnica e são comercialmente disponíveis.

Proteômicos podem ser utilizados para analisar os polipeptídeospresentes em uma amostra (por exemplo, tecido, organismo, ou cultura celu-lar) em um certo ponto do tempo. Em particular, técnicas proteômicas podemser utilizadas para estimar as mudanças globais de expressão de polipeptí-deo em uma amostra (também referidos como proteômicos de expressão).

Análise proteômica tipicamente inclui: (1) separação de polipeptídeos indivi-duais em uma amostra por eletroforese de gel 2-D (2-D PAGE); (2) identifi-cação dos polipeptídeos individuais recuperados do gel, por exemplo, porespectrometria de massa ou seqüenciamento de N-terminal, e (3) análisedos dados utilizando-se bioinformáticas. Métodos proteômicos são suple-mentos valiosos para outros métodos de perfil de expressão de gene, e po-dem ser utilizados, sozinhos ou em combinação com outros métodos, paradetectar os produtos dos marcadores de proliferação da presente invenção.

Métodos de Hibridizacão Utilizando-se Sondas de Ácido Nucléico Seletivaspara um Marcador

Estes métodos envolvem ligação da sonda de ácido nucléico aum suporte, e hibridização sob condições apropriadas com RNA ou cDNAderivado da amostra de teste (Sambrook, J., E Fritsch, E. e T Maniatis, Mo-lecular Cloning: A Laboratory Manual 3â. Cold Spring Harbor LaboratoryPress: Cold Spring Harbor (2001)). Estes métodos podem ser aplicados aTM derivado de uma amostra de tecido de tumor ou fluido. As preparaçõesde RNA ou cDNA são tipicamente rotuladas com uma molécula fluorescenteou radioativa para permitir detecção e quantificação. Em algumas aplica-ções, a hibridização de DNA pode ser rotulada com uma estrutura fluores-centemente rotulada, ramificada para realçar a intensidade de sinal (Noite,F.S., Branched DNA signal amplification for direct quantitation of nucleic acidsequences in clinicai specimens. Adv. Clin. Chem. 33, 201-35 (1998)). Rótu-lo não hibridizado é removido por lavagem extensiva em soluções de salbaixo tal como 0,1 χ de SSC, 0,5% de SDS antes de quantificar a quantidadede hibridização por detecção de fluorescência ou densitometria de imagensde gel. Os suportes podem ser sólidos, tais como membranas de náilon ounitrocelulose, ou consistirem de microesferas ou contas que são hibridizadasquando em suspensão líquida. Para permitir lavagem e purificação, as con-tas podem ser magnéticas (Haukanes, B-I e Kvam, C., Application of magne-tic beads in bioassays. Bio/Technology 11, 60-63 (1993)) ou fluorescente-mente rotuladas para permitir citometria de fluxo (veja por exemplo: Spiro,A., Lowe, M. e Brown, D., A Bead-Based Metod for Multiplexed Identificationand Quantitation of DNA Sequences Using Flow Cytometry. Appl. Env. Mi-cro. 66, 4258-4265 (2000)).

Uma variação de tecnologia de hibridização é o ensaio Quanti-Gene Plex® (Genospectra, Fremont) que combina um suporte de conta fluo-rescente com amplificação de sinal de DNA ramificado. Ainda outra variaçãoem tecnologia de hibridização é o ensaio de mRNA Quantikine® (R&D Sys-tems, Minneapolis). A metodologia é como descrita nas instruções do fabri-cante. Resumidamente o ensaio utiliza sondas de hibridização de oligonu-cleotídeo conjugadas à Digoxigenina. Hibridização é detectada utilizando-seanticorpos anti-Digoxigenina acoplados à fosfatase alcalina em ensaios colo-rimétricos.

Métodos adicionais são bem conhecidos na técnica e não ne-cessitam ser descritos também aqui.

Ensaios Imunolóaicos Ligados à Enzima (ELISA)

Resumidamente, em ensaios ELISA sanduíche, um anticorpopoliclonal ou monoclonal contra o TM é ligado a um suporte sólido (Crow-ther, J.R. The ELISA guidebook. Human Press: New Jersey (2000); Harlow,E. e Lane, D., utilizando-se anticorpos: um manual de laboratório. Cold S-pring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999)) ou contas desuspensão. Outros métodos são conhecidos na técnica e não necessitamser descritos aqui também. Anticorpos monoclonais podem ser derivados dehibridoma ou selecionados de bibliotecas de anticorpo de fago (Hust M. eDubel S., Phage display vectors for the in vitro generation of human frag-ments of antibody. Metods Mol Biol. 295:71-96 (2005)). Sítios de ligação nãoespecíficos são bloqueados com preparações de proteína não alvo e deter-gentes. O anticorpo de captura é em seguida incubado com uma preparaçãode urina ou tecido contendo o antígeno de TM. A mistura é lavada antes docomplexo anticorpo/antígeno ser incubado com um segundo anticorpo quedetecta o TM alvo. O segundo anticorpo é tipicamente conjugado a uma mo-lécula fluorescente ou outra molécula-repórter que pode ser detectada emuma reação enzimática ou com um terceiro anticorpo conjugado a um repór-ter (Crowther, Idi). Alternativamente, em ELISAs diretos, a preparação con-tendo o TM pode ser ligada ao suporte ou conta e o antígeno alvo detectadodiretamente com um conjugado anticorpo-repórter (Crowther, Id.).

Métodos para produção de anticorpos monoclonais e anti-sorospoliclonais são bem conhecidos na técnica e não necessitam ser descritosaqui também.

Imunodetecção

Os métodos podem também ser utilizados parar imunodetecçãode membros da família de marcador em soros ou plasma de pacientes decâncer de bexiga colhidos antes e após cirurgia para remover o tumor, imu-nodetecção de membros da família de marcador em pacientes com outroscânceres, incluindo porém não limitados a, colorretal, pancreático, ovário,melanoma, fígado, esofágico, estômago, endometrial, e cerebral e imunode-tecção de membros da família de marcador em urina e evacuação de paci-entes de câncer de bexiga.

BTMs podem também ser detectados em tecidos ou urina utili-zando-se outras técnicas de imunodetecção padrão tal como imunoblottingou imunoprecipitação (Harlow, E. e Lane, Di, utilizando-se anticorpos: ummanual de laboratório. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold SpringHarbor (1999)). Em imunoblotting, preparações de proteína de tecido ou flui-do contendo o TM são eletroforesadas atravéis de géis de poliacrilamida sobcondições de desnaturação ou não desnaturação. As proteínas são em se-guida transferidas em um suporte de membrana tal como náilon. O TM é emseguida reagido diretamente ou indiretamente com anticorpos monoclonaisou policlonais como descrito para imunoistoquímica. Alternativamente, emalgumas preparações, as proteínas podem ser manchadas diretamente so-bre membranas sem separação eIetroforética anterior. O sinal pode serquantificado por densitometria.

Em imunoprecipitação, uma preparação solúvel contendo o TM éincubada com um anticorpo monoclonal ou policlonal contra o TM. A reaçãoé em seguida incubada com contas inertes feitas de agarose ou poliacrilami-da com proteína G ou proteína A covalentemente ligada. As contas de prote-ína A ou G especificamente interagem com os anticorpos formando umcomplexo imobilizado de anticorpo-TM-antígeno ligado à conta. Seguindo alavagem, o TM ligado pode ser detectado e quantificado por imunoblotting ouELISA.

Determinação do Limiar

Para testes utilizando-se BTMs sub-regulados em análises detaxas ou regressão, limiares serão derivados que permitirão uma amostraser denominada positiva ou negativa para TCC. Estes limiares serão deter-minados pela análise de coortes de pacientes que estão sendo investigadosquanto à presença de TCC. Limiares podem variar para diferentes aplica-ções de teste; por exemplo, limiares para uso do teste em avaliação de po-pulação serão determinados utilizando-se coortes de pacientes que são lar-gamente livres de sintomas urológicos, e estes limiares podem ser diferentesdaqueles utilizados em testes para pacientes que estão sob vigilância pararecorrência de TCC, ou aqueles sendo investigados quanto à presença desintomas urológicos tais como hematúria. Um limiar pode ser selecionadopara fornecer um nível prático de especificidade de teste no cenário clínicorequerido; que é, a especificidade que permite sensibilidade razoável semnúmeros excessivos de pacientes que recebem resultados falsos positivos.

Esta especificidade pode estar dentro da faixa de 80-90%. Um método alter-nativo para obter um limiar de teste é plotar a sensibilidade contra especifici-dade para diferentes limiares de teste (curvas de ROC) em seguida selecio-nar o ponto de inflexão da curva.

Como uma alternativa para limiares únicos, o teste pode utilizarintervalos de teste que fornecem diferentes graus de probabilidade de pre-sença de doença e que têm diferentes conseqüências clínicas associadascom eles. Por exemplo, um teste pode ter três intervalos; um associado comum risco elevado (por exemplo 90%) da presença de TCC, um segundo as-sociado com um risco baixo de TCC e um terceiro considerado como sendosuspeito de doença. O intervalo "suspeito" pode ser associado com uma re-comendação para um teste de repetição em um período de tempo definido.

Métodos para detectar marcadores de câncer de bexiga em urina

Em diversas modalidades, ensaios para TM podem ser deseja-velmente realizados sobre amostras de urina. Em geral, métodos para en-saio para oligonucleotídeos, proteínas e peptídeos nestes fluidos são conhe-cidos na técnica. Entretanto, para propósitos de ilustração, níveis de urina deum TM podem ser quantificados utilizando-se um ensaio imunoabsorventeligado à enzima tipo sanduíche (ELISA). Para ensaios de plasma ou soro,uma alíquota de 5 μL de uma amostra apropriadamente diluída ou TM pa-drão consecutivamente diluído e 75 μί. de anticorpo de TM anti-humano con-jugado à peroxidase são adicionados às cavidades de uma placa de microtí-tulo. Após um período de incubação de 30 minutos em 30°C, as cavidadessão lavadas com 0,05% de Tween 20 em salina tamponada por fosfato(PBS) para remover anticorpo não ligado. Complexos ligados de TM e anti-corpo anti-TM são em seguida incubados com o-fenilendiamina contendoH2O2 durante 15 minutos em 30°C. A reação é interrompida por adição de 1M de H2SO4, e a absorvência em 492 nm é medida com uma leitora de placade microtítulo. Pode ser apreciado que anticorpos anti-TM podem ser anti-corpos monoclonais ou anti-soros policlonais.

Porque muitas proteínas são (1) secretadas por células, (2) cli-vadas das membranas celulares, (3) perdidas de células em morte celular ou(4) contidas dentro de células soltas, será apreciado que BTMs podem tam-bém ser detectados na urina. Adicionalmente, diagnóstico de câncer de be-xiga pode ser determinado medindo-se expressão de BTMs em uma amos-tra, ou acúmulo de BTMs em uma amostra. Métodos da técnica anterior dediagnóstico incluem cistoscopia, citologia e exame de células extraídas du-rante estes procedimentos. Tais métodos contam com identificação de célu-Ias tumorais na urina ou em uma amostra por escovação de urotélio, ou emoutros casos, em espécimens de biópsia da parede da bexiga. Estes méto-dos sofrem de diversos tipos de erros, incluindo erro de amostragem, errosna identificação entre observadores, e similares.

Anticorpos para marcadores de tumor de bexiga

Em aspectos adicionais, esta invenção inclui fabricação de anticor-pos contra BTMs. Utilizando-se métodos descritos aqui, novos BTMs podemser identificados utilizando-se métodos de microarranjo e/ou qPCR. Uma vezque um marcador putativo é identificado, ele pode ser produzido em quantidadesuficiente para ser adequado para extrair uma resposta imunológica. Em algunscasos, um TM de tamanho natural pode ser utilizado, e em outros, um fragmen-to de peptídeo de um TM pode ser suficiente como um imunogênio. O imuno-gênio pode ser injetado em um hospedeiro adequado (por exemplo, camun-dongo, coelho, etc) e se desejado, um adjuvante, tal como adjuvante completode Freund, adjuvante incompleto de Freund pode ser injetado para aumentar aresposta imune. Pode ser apreciado que preparação de anticorpos é rotina nastécnicas imunológicas e não necessita ser descrita aqui também. Como umresultado, alguém pode produzir anticorpos contra BTMs identificados utilizan-do-se métodos descritos aqui.

Em ainda outras modalidades, anticorpos podem ser preparadoscontra a proteína ou o núcleo de proteína dos marcadores de tumor identifi-cados aqui ou contra uma seqüência de oligonucleotídeo incomparável a umTM. Embora certas proteínas possam ser glicosiladas, variações no padrãode glicosilação podem, em certas circunstâncias, resultar em má detecçãode formas de BTMs que carecem de padrões de glicosilação usuais. Destamaneira, em certos aspectos desta invenção, imunogênios de TM podemincluir TM desglicosilados ou fragmentos de TM desglicosilados. Desglicosi-lação pode ser realizada utilizando-se uma ou mais glicosidases conhecidasna técnica. Alternativamente, cDNA de TM pode ser expresso em linhagenscelulares deficientes de glicosilação, tais como linhagens celulares procarió-ticas, incluindo E. coli e similares.

Vetores podem ser preparados tendo oligonucleotídeos de codi-ficação de TM neles. Muitos de tais vetores podem ser baseados nos veto-res padrão conhecidos na técnica. Vetores podem ser utilizados para trans-fectar uma variedade de linhagens celulares para produzir linhagens celula-res de produção de TM1 que podem ser utilizadas para produzir quantidadesdesejadas de TM para desenvolvimento de anticorpos específicos ou outrosreagentes para detecção de BTMs ou para padronização de ensaios desen-volvidos para BTMs.

Kits

Com base nas descobertas desta invenção, diversos tipos dekits de teste podem ser considerados e produzidos. Primeiro, kits que podemser preparados têm um dispositivo de detecção pré-carregado com uma mo-lécula de detecção (ou "reagente de captura"). Em modalidades para detec-ção de mRNA de TM, tais dispositivos podem compreender um substrato(por exemplo, vidro, silício, quartzo, metal, etc) sobre o qual oligonucleotí-deos como reagentes de captura que hibridizam com o mRNA para ser de-tectados são ligados. Em algumas modalidades, detecção direta de mRNApode ser realizada por hibridização de mRNA (rotulado com cy3, cy5, radior-rotulado ou outro rótulo) aos oligonucleotídeos sobre o substrato. Em outrasmodalidades, detecção de mRNA pode ser realizada primeiro preparando-seDNA complementar (cDNA) ao mRNA desejado. Em seguida, cDNA rotuladopode ser hibridizado aos oligonucleotídeos sobre o substrato e detectado.

Anticorpos podem também ser utilizados em kits como reagen-tes de captura. Em algumas modalidades, um substrato (por exemplo, umaplaca de múltiplas cavidades) pode ter um reagente de captura de TM espe-cífico ligado a ele. Em algumas modalidades, um kit pode ter um reagente debloqueio incluso. Reagentes de bloqueio podem ser utilizados para reduzirligação não específica. Por exemplo, ligação de oligonucleotídeo não especí-fica pode ser reduzida utilizando-se excesso de DNA de qualquer fonte con-veniente que não contém oligonucleotídeos de TM, tal como DNA de esper-ma de salmão. Ligação de anticorpo não específica pode ser reduzida utili-zando-se um excesso de uma proteína de bloqueio tal como albumina desoro. Pode ser apreciado que numerosos métodos para detectar oligonu-cleotídeos e proteínas são conhecidos ná técnica, e qualquer estratégia quepode especificamente detectar moléculas associadas a TM pode ser utiliza-da e ser considerada dentro do escopo desta invenção.

Além de um substrato, um kit de teste pode compreender rea-gentes de captura (tais como sondas), soluções de lavagem (por exemplo,SSC, outros sais, tampões, detergentes e similares), bem como porções dedetecção (por exemplo, cy3, cy5, radiorrotuladas, e similares). Kits podemtambém incluir instruções para uso e um pacote.Taxas de TM utilizadas oara deteccão de câncer de bexiga I

Em uma série de modalidades, reagentes para o teste do TMLTBDH4 em combinação com BTMs superexpressantes podem ser incorpo-rados em um kit para o teste de urina não fracionada ou sedimentos celula-res de urina para detectar câncer de bexiga. As amostras de urina podemser coletadas de pacientes com câncer de bexiga diagnosticado que reque-rem monitoração para progressão da doença ou resposta ao tratamento,indivíduos com sintomas urológicos incluindo hematúria macroscópica oumicroscópica, ou indivíduos assintomáticos. Para pacientes ou indivíduossendo testados com um kit que mede os BTMs na urina não fracionada, a-proximadamente 2 ml de urina podem ser coletados para teste. Para testessobre a pélete de urina, > 10 ml de urina podem ser coletados.

Um kit adequado inclui: (i) instruções para uso e interpretação deresultado, (ii) software para interpretação de análises de múltiplos genes,incluindo qualquer classificador de análise de regressão ou reagentes defórmula (iii) para a estabilização e purificação de RNA de urina não fraciona-da ou péletes de urina, (iv) reagentes para a síntese de cDNA incluindodNTPs e transcriptase reversa, e (v) reagentes para a quantificação do cD-NA de TM. Em uma forma, estes reagentes seriam utilizados para PCRquantitativo e incluiriam iniciadores de oligonucleotídeo abrangendo éxonespecíficos, um terceiro oligonucleotídeo rotulado com uma sonda para de-tecção, Taq polimerase e os outros tampões, sais e dNTPs requeridos paraPCR. O kit pode também utilizar outros métodos para detecção dos transcri-tos tais como hibridização direta do RNA de TM com sondas rotuladas outecnologia de DNA ramificado; e (vi) oligonucleotídeos e sonda para a detec-ção de transcritos de um gene altamente transcrito, tal como Bactina, paraservir como uma medida de controle de qualidade.

Avaliação da Progressão de Câncer de Bexiga Utilizando-se Taxas de TM

Para avaliar a progressão de tumores de bexiga, amostras detecido são obtidas por biópsia de parede de bexiga ou amostras de urina sãocoletadas ao longo do tempo de um paciente tendo câncer de bexiga. Avali-ação da taxa de BTMs ou combinações destes é feita para amostras coleta-das em diferentes momentos. Taxas de TM dentro de uma faixa especificadasão indicativas de progressão de câncer de bexiga.

Avaliação de Terapia de Câncer de Bexiga Utilizando-se Taxas de TM

Para avaliar a eficácia de terapia para tumores de bexiga, amos-tras de tecido e/ou urina são obtidas antes do tratamento ser iniciado. Osníveis de referência de um ou mais BTMs são determinados, como são astaxas de vários BTMs com respeito um ao outro. Tratamento é iniciado, epode incluir qualquer terapia conhecida na técnica, incluindo cirurgia, terapiapor radiação ou quimioterapia como apropriado ao tipo e estágio da doença.Durante o curso da terapia, amostras de tecido e/ou urina são coletadas eanalisadas quanto à presença e quantidade de BTMs. Taxas de vários BTMssão determinadas e os resultados são comparados a: (1) os níveis de refe-rência de paciente antes do tratamento ou (2) valores normais obtidos deuma população de indivíduos que não tem câncer de bexiga.

Uso de Taxas de TM para Monitorar a Progressão de Terapias de TCC

Além do diagnóstico rápido e detecção precoce de TCC, taxasde marcador de TM detectadas no tecido, soro ou urina podem ser utilizadaspara monitorar uma resposta do paciente à terapia. Nestas aplicações, a-mostras de urina e/ou soro podem ser coletadas em intervalos seguindo ainiciação de quimioterapia sistêmica, intravesicular ou intravascular, radiote-rapia ou imunoterapia. Uma mudança na taxa de marcador pode indicar umaredução no tamanho do tumor, indicativa de tratamento eficaz. A taxa demudança pode ser utilizada para predizer a dose terapêutica ideal para cadapaciente ou tratamento.

Uso de Análises de Regressão de TM

Além das taxas de TM1 análises de regressão ou classificaçãoque incluem membros da família de TM de expressão baixa e elevada po-dem ser utilizadas para as aplicações descritas acima.

Marcadores avaliados são selecionados de genes humanos co-nhecidos. Os genes avaliados são indicados nas figuras 3 e 4. São inclusosnas figuras 3 e 4 os nomes dos genes, o identificador HUGO, número deoligo MWG, número de seqüência de referência de mRNA de NCBI e o nú-mero de referência de proteína. As seqüências de comprimento natural po-dem ser encontradas em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/.

EXEMPLOS

Os exemplos descritos aqui são para propósitos de modalidadesde ilustração da invenção e não se destinam a limitar o escopo da invenção.Outras modalidades, métodos e tipos de análises incluem-se no escopo depessoas versadas nas técnicas de diagnóstico molecular e não necessitamser descritas em detalhes acerca disto. Outras modalidades dentro do esco-po da técnica que são baseadas nos ensinamentos inclusos são considera-das ser parte desta invenção.

Métodos

Coleção de Tumor

Amostras de tumor de bexiga e amostras de urotélio não malig-no foram coletadas de espécimens cirúrgicas ressecadas no Hospital KyotoUniversity, Japão.

Coleção de Urina

Amostras de urina de controles não malignos e de pacientes decâncer de bexiga foram obtidas pelo Hospital Kyoto University, Japão. Amos-tras de controle sadias foram obtidas pelos voluntários Japoneses (figura 1).

Extração de RNATecidos de tumor foram homogeneizados em uma mistura deTriReagente: água (3:1), em seguida clorofórmio extraído. RNA total foi emseguida purificado da fase aquosa utilizando-se o procedimento RNeasy™(Qiagen). RNA foi também extraído de 16 linhagens celulares de câncer ereunido para servir como um RNA de referência.

RNA foi extraído da urina misturando-se a amostra de urina comum volume igual de tampão de Iise (5,64 M de guanidina-HCI, 0,5% de sar-cosila, 50 mM de acetato de sódio (pH 6,5) e 1 mM de β-mercaptoetanol; pHajustado para 7,0 com 1,5 M de Hepes pH 8). Devido às quantidades baixasde RNA na urina, 7,5 ugs de RNA bacteriano total foram adicionados à mis-tura de urina/tampão de Iise para agir como um veículo. RNA total foi emseguida extraído utilizando-se Trizol e o procedimento RNeasy™. Prepara-ções de RNA foram também purificadas antes da síntese de cDNA utilizan-do-se o kit de purificação de PCR Qiagen QIAquick™.

RNA foi extraído do sangue de três voluntários sadios realizan-do-se uma extração Trizol/RNeasy™ em células enriquecidas de sanguetotal utilizando-se sedimentação em 3,6% de dextrano.

Preparação de Lâmina por Microarranio

Lâminas de vidro revestidas por epóxi (MWG Biotech) forammarcadas com -30.000, 50 mer oligonucleotídeos (MWG Biotech) utilizando-se um robô de microarranjo de Máquinas de gene, de acordo com o protoco-lo do fabricante.

Rotulagem e Hibridizacão de RNA

cDNA foi transcrito de 5 pg de RNA total utilizando-se transcrip-tase reversa Superscript II™ (Invitrogen) em reações contendo 5-(3-aminoalil)- 2' deoxiuridina -5'-trifosfato. A reação foi então desionizada emuma coluna Microcon antes de ser incubada com Cy3 ou Cy5 em tampão debicarbonato durante 1 hora em temperatura ambiente. As tinturas não incor-poradas foram removidas utilizando-se uma coluna Qiaquick (Qiagen) e aamostra concentrada a 15 μl em um SpeedVac. Os cDNAs rotulados porCy3 e Cy5 foram então misturados com tampão Ambion ULTRAhyb™, des-naturado a 100°C durante 2 minutos e hibridizados para as lâminas de mi-croarranjo nas câmaras de hibridização a 42°C durante 16 horas. As lâminasforam então lavadas e analisadas duas vezes em um escâner Axon 4000A™em dois ajustes de força.

Análise de Microarranio de Genes Marcadores de Câncer

RNA de 53 tumores da bexiga e 20 amostras de tecido da bexi-ga não malignas ("normal") foram rotuladas com Cy5 e hibridizadas em du-plicatas ou triplicatas com RNA de referência rotulado por Cy3. Após a nor-malização, a alteração na expressão em cada dos 29.718 genes foi entãoestimada por alteração de duplicação e probabilidade estatística.

Procedimento de Normalização

As intensidades de fluorescência média detectadas pelo softwa-re Genepix™ foram corrigidas por subtração das intensidades de base local.

As manchas com uma intensidade corrigida de base menor do que zero fo-ram excluídas. Para facilitar a normalização, as taxas de intensidade e inten-sidades de mancha totais foram log-transformadas. As taxas de intensidadeem Iog foram corrigidas para tintura e tendência espacial utilizando-se a re-gressão local implementada no pacote LOCFIT™. As taxas de intensidadeem Iog foram regredidas simultaneamente com respeito à intensidade e localde mancha total. Os resíduos da regressão local forneceram alterações deduplicação registradas corrigidas. Para o controle da qualidade, as taxas decada microarranjo normalizada foram plotadas em respeito a intensidade elocalização da mancha. As manchas foram subseqüentemente visualmenteinspecionadas quanto a qualquer artefato restante. Adicionalmente, um mo-delo de ANOVA foi aplicado para a detecção de tendência de ponta de alfi-nete. Todos os resultados e parâmetros da normalização foram inseridos emuma base de dados Postgres para análise estatística.

Análise Estatística

Para melhorar a comparação de alterações de duplicações me-didas entre as disposições, log2 (taxas) foram escalados para ter o mesmodesvio padrão total por disposição. Esta padronização reduziu a variabilida-de de classe no tecido média. Um teste de classificação com base nas alte-rações de duplicação foi então utilizado para melhorar a força do sinal. Esteteste consiste em duas etapas: (i) cálculo da classificação da alteração deduplicação (Rfc) nas disposições e ii) subtração da média (Rfc) para tecidonormal da média (Rfc) para tecido de tumor. A diferença de ambas classifi-cações da média define o escore da classificação de alteração de duplica-ção. Três testes estatísticos adicionais foram também realizados nos dadospadronizados: 1) Duas amostras de teste t de Student, 2) o teste de Wilco-xoη e 3) Análise estatística de Microarranjos (SAM). Os genes mais signifi-cantemente sub-regulados determinados por cada dos métodos estatísticos(alteração de duplicação de classificação, t teste, teste de Wilcoxon, e SAM)foram determinados em um escore de classificação para cada teste. Todosos escores de classificação foram então adicionados em um escore de clas-sificação somado.

Síntese de cDNA de RNA de Urina

O RNA de urina total foi recozido para iniciadores específicos degene para cada dos marcadores de tumor de bexiga incubando-se a 70°Cem seguida resfriando em gelo durante 2 minutos em 50ul de reações con-tendo iniciadores dianteiros em 0,01 Mg/μl. Cada reação de cDNA conteveRNA recozido e 4 μΙ de tampão de transcriptase reversa 5x Superscript Il(Invitrogen, USA), 2 μΙ de 0,1 M de DTT (Invitrogen, USA), 0,5 μΙ de RNase(40υ/μL), (Invitrogen, USA), 4 μl de 10 mM de dNTP (Invitrogen, USA) e 0,5μl de transcriptase reversa Superscript Il (200υ/μl), (Invitrogen, USA) em umvolume final de 20 μΙ. As reações foram incubadas a 42°C durante 1 hora, 10minutos a 70°C e 1 minuto a 80°C. As reações foram limpas antes de qPCRcom colunas de purificação de PCR Qiagen QIAquick (Qiagen, Victoria, Aus-tralia) e armazenadas a -80°C.PCR em tempo real quantitativo

PCR em tempo real ou quantitativo (qPCR) é utilizado paraquantificação absoluta ou relativa de número de cópias modelo de PCR. Osgrupos de iniciador e sonda Taqman™ foram designados utilizando-se Inici-ador Express V 2.0™ (Applied Biosystems). Em que possível, todas as vari-antes de união potenciais foram incluídas no amplicon resultante, com a pre-ferência de amplicon dada às regiões cobertas pelo oligonucleotídeo de mi-croarranjo derivado de MWG-Biotech. As seqüências de sonda e iniciadorsão mostradas na figura 2. Alternativamente, se o gene alvo foi representadopor um ensaio de expressão Assay-on-Demand™ (Applied Biosystems) co-brindo os amplicons desejados, esses foram utilizadas. Nos ensaios desig-nados domésticos, a concentração de iniciador foi titulada utilizando-se aumprotocolo de rotulação verde SYBR e cDNA feito do RNA de referência. Aamplificação foi realizada em um sistema de detecção de seqüência ABIPrism™ 7000 sob condições de ciclagem padrão. Quando os produtos deamplificação única foram observados nas curvas de dissociação, as curvaspadrões foram geradas em uma faixa de concentração de 625 duplicaçõesutilizando-se as concentrações de iniciador ideais e sonda 5'FAM - 3'TAMRAfosfato Taqman™ (ProIigo) em uma concentração final de 250 nM. Os en-saios determinando curvas padrões com coeficientes de regressão acima de0,98 foram utilizados em análises subseqüentes.

Os ensaios foram realizados em placas de 96 cavidades. Cadaplaca conteve uma curva padrão de cDNA de referência, em uma faixa deconcentração de 625 duplicações. Para o qPCR de urina, o RNA total extraí-do de ~ 0,5mls de urina não fracionada foi utilizado em cada reação. O ACt(gene alvo Ct - cDNA Ct de referência médio) foi calculado para cada mar-cador, e utilizado em taxas subseqüentes, análise de regressão ou classificação.

Expressão de marcadores no sangue

A expressão dos marcadores mostrados nas figuras 3 e 4 emtodo o sangue foi determinada in silico. As sondas de microarranjo foramligadas aos feixes UniGene através dos números de acessão GenBank deseus mRNAs alvos, e o perfil de expressão de tecido de de UniGene utiliza-das para determinar o número de rótulos de seqüência (ESTs) em bibliote-cas sangüíneas. Somente os genes com 0 ou 1 rótulos de seqüência ex-pressos (EST) são mostrados na figura 4. Para confirmar a baixa expressãode LTB4DH em todo o sangue, RT-qPCR foi realizado em RNA extraído desangue total utilizando-se os iniciadores e sondas mostrados na figura 2.

Nenhuma expressão significante foi observada observadas (resultados nãomostrados).

Identificação de marcadores câncer de bexiga sub-reaulados

Para identificar os marcadores de câncer de bexiga sub-regulados, foram realizados estudos de microarranjo em RNA de 53 tumoresde bexiga e 20 amostras de tecido de bexiga maligno utilizando-se 30.000de lascas de oligonucleotídeo. A figura 3 mostra a análise estatística dosdados de microarranjo para 300 genes que mostram sub-regulação signifi-cante em tecido de câncer de bexiga comparado com tecido não maligno. Afigura 3 inclui o nome e símbolo de gene HUGO, o número de seqüência dereferência de proteína, o número de seqüência dé referência de mRNA deNCBI, o número de oligonucleotídeo de sonda MWG Biotech, a alteração deduplicação média em expressão de gene entre o tecido de tumor e não ma-ligno, os resultados de um test t de Student não ajustado original, os resulta-dos do teste de Wilcoxon de 2 amostras, os resultados do teste de SAM, e oescore de classificação somado.

Identificação de Marcadores de Tumor de Bexiga Sub-Expressos Preferidospara Uso em Testes de Urina para Câncer de Bexiga

Por que a hematúria urinária é uma co-ocorrência comum com ocâncer de bexiga, é uma vantagem que os marcadores de câncer de bexiganão sejam significantemente elevados no sangue total. Além disso, por queos marcadores sub-regulados estão sendo utilizados em taxas, análise deregressão ou classificação, é uma vantagem que eles estejam presentes emnúmeros de cópias suficientemente elevados tanto nas células de tumorquanto nas células de bexiga não malignas para permitir a detecção confiá-vel na urina. Para identificar os marcadores adequados, foram avaliados osgenes na figura 3 para um subgrupo que teve pouca ou nenhuma represen-tação nas bibliotecas EST de sangue, e foi mais elevado do que a expressãomédia no tecido não maligno. A expressão média foi estimada por classifica-ção dos 30.000 oligonucleotídeos na disposição por sua intensidade médiaem uma amostra analisada no estudo de microarranjo. Os marcadores queatendem aos critérios são mostrados na figura 4. A figura 4 inclui o nome esímbolo de gene HUGO, o número de seqüência de referência de proteína, onúmero de seqüência de referência de mRNA de NCBI1 a alteração de dupli-cação média, o escore de classificação, a classificação média de intensidadede mancha de microarranjo em tecido de tumor e tecido não maligno, e onúmero de ESTs presentes nas bibliotecas de EST de sangue.

A sub-regulação observada nos dados da disposição foi validadapor qPCR para três genes mostrados na figura 4, LTB4DH, BAG1 eFLJ21511. Estes genes foram tested total RNA de 10 amostras de tumor e10 amostra não malignas. LTB4DH, BAG1 e FLJ21511 mostraram uma sub-regulação média em tumores de bexiga comparados ao tecido não malignoda bexiga de 2,5 duplicações, 1,4 duplicação e 6,1 duplicações, respectiva-mente, nestas amostras.

Análise de qPCR de Urina utilizando LTB4DH

A urina de pacientes de TCC e controles com condições urológi-cas não malignas foram coletados ou por esvaziamento ou por cateteriza-ção. O RNA total foi extraído da urina esvaziada de 42 controles e a urinaesvaziada ou cateterizada de 37 pacientes de TCC e utilizada em RT-PCRquantitativo utilizando-se iniciadores e sondas para LTB4DH e três marcado-res superexpressos, IGFBP5, MDK e HoxAI 3. As taxas de ACt foram de-terminadas quanto a IGFBP5/LTB4DH, MDK/LTB4DH e HoxAI3/LTB4DH.

Estes dados são ilustrados pelos plotes da caixa na figura 5, que mostrauma diferença clara na propagação de dados entre as amostras de urina decontroles e pacientes TCC para cada dos três testes. O teste mais exato foiIGFBP5/LTB4DH que demonstrou sensibilidade e especificidade de 87% e88% neste coorte de amostra, respectivamente (Fig. 6a). Para ilustrar a cor-respondência entre a sensibilidade e especificidade para cada destes testes,as curvas ROC são mostradas na figura 7. As áreas sob a curva paraIGFBP5/LTB4DH, MDK/LTB4DH e HoxAI3/LTB4DH são 0,9223, 0,9199, e0,7497, respectivamente. Estas áreas, que medem a precisão do teste, indi-cam que todas as três taxas com LTB4DH são os testes úteis, em particularIGFBP5/LTB4DH e MDK/LTB4DH.

Para aumentar a sensibilidade e especificidade da detecção deTCC, as combinações de dois testes foram utilizadas. As sensibilidades eespecificidades opcionais destas combinações de teste são mostradas nafigura 6b. A figura 8a-f mostra a separação de dados em espaço bi-dimensional para cada dos três testes utilizando-se LTB4DH e BAG1. Estesdados mostram que a combinação de dois ou mais testes que inclui ou dosBTMs LTB4DH sub-regulados ou BAG1, são capazes de obter sensibilida-des e especificidades maiores do que 90%. Além disso, por que estes testessão a medição das assinaturas de expressão de gene simples e não níveisabsolutos de marcadores, eles serão fortes para variação em concentraçãode urina.

Para demonstrar a força de testes envolvendo taxas relaçõescom LTB4DH para concentração de urina, os níveis de IGFBP5 sozinho(ACt) e IGFBP5/LTB4DH foram plotados como uma função de concentraçãode urina (figura 9a-b) e as trendlines ajustadas quanto aos dados. Pode-seobservar que para ambas as amostras de urina de controles não malignos epacientes com TCC1 há uma diminuição no IGFBP5 ACt com concentraçãocrescente de urina que está ausente na relação de IGFBP5/LTB4DH. O efei-to é mais evidente com as amostras não malignas por causa da ausência deoutras influências tal como tamanho de tumor e heterogeneidade na expres-são de IGFBP5 e LTB4DH.

Em alguns casos, quando marcadores únicos são utilizados emensaios de câncer de bexiga, o método de coleta de amostra de urina podeafetar a quantidade de marcador detectado devido às variações no númerode células de bexiga esfoliadas coletadas. Esta tendência pode levar aosresultados positivos falsos ou negativos falsos em uma pequena proporçãode amostras. O uso das taxas incluindo LTB4DH ou outros genes de baixaexpressão forneceria um método para compensar quanto aos métodos dife-rentes. To testar esta hipótese, as amostras coletadas de pacientes de TCCpor esvaziamento simples (nove amostras) ou cateterização (28 amostras)foram testados quanto a uma presença de marcadores TCC e LTB4DH. Aanálise dos marcadores de TCC apenas mostrou que as amostras esvazia-das foram mais pesadamente representadas na extremidade inferior da faixade dados (Ct superior), de acordo com o número médio inferior de célulasesfoliadas nestas amostras em comparação com as amostras cateterizadas.Isto é ilustrado nos plotes de auto-auto dispersão para IGFBP5, MDK e Ho-xA13 na figura 10a-c. Em contraste, quando as taxas entre estes marcado-res e LTB4DH foram calculadas, as amostras esvaziadas e cateterizadasforam propagadas sobre faixas similares de Ct (figura 10d-f), ilustrando queo cálculo de assinaturas de expressão de gene entre os marcadores de ex-pressão elevada e os marcadores de expressão baixa tal como LTB4DH,compensa para variações em níveis de marcadores introduzidos por diferen-tes metodologias de amostragem de urina.

As amostras e urina de pacientes com tumores de baixo grausão geralmente limítrofes em seu acúmulo de BTMs devido à presença denúmeros somente pequenos de células esfoliadas nestas amostras. Estasamostras estão, portanto em alto risco de ser incorretamente classificadasdevido às variações no método de amostragem ou concentração de urina.

A utilidade de taxas de expressão de gene que incorpora os ge-nes sub-regulados para a detecção de TCC é, portanto provável de ser pro-nunciada quando aplicada para a detecção de TCC de grau baixo. Para de-monstrar este efeito, uma coorte de 43 amostras de urina esvaziadas de pa-cientes com TCC de grau baixo de 123 controles foram testadas com osmarcadores IGFBP5, HoxAI 3 e LTB4DH. As características clínicas da coor-te estão sumariadas na Fig. 13. Os dados de qPCR para IGFBP5 e HoxAI3foram analisados sozinhos e nas taxas com LTB4DH utilizando a área sobas curvas de ROC como uma medida de precisão de teste (pacote estatísti-co STATA). Os resultados estão resumidos na Fig. 14. Utilizando-se o mar-cador IGFBP5, LTB4DH aumentou a precisão da detecção de Ta TCCs deestágio de grau baixo (grau 1-2) em 9% e os TCCs de grau baixo de qual-quer estágio em 8%. A precisão de teste de HoXAI 3 de Ta TCCs de estágiode grau baixo foi aumentada em 3%.

Análise Discriminada Linear de Dados de aPCR Utilizando-se LTB4DH

Análise discriminada linear (LDA) é uma técnica estatística (Fi-sher R.A. "The Use of Multiple Measurements in Taxonomic Problems", An-nals of Eugenics 7 179 (1936)) em que uma combinação linear de variáveisé gerada, de modo que exista separação máxima entre dois ou mais grupos.Esta combinação linear de variáveis é denominada o "discriminante linear",que é uma função linear das variáveis de entrada que maximamente separaas classes do grupo de dados. A capacidade de LDA (ou qualquer outra téc-nica de classificação) caracterizar um grupo de dados particular, tal comodados de qPCR, pode ser testada utilizando-se inter-validação. Neste méto-do, parte do grupo de dados é utilizada para gerar um classificador, e partedo grupo de dados é utilizada para medir a eficácia daquele classificador. Adivisão do grupo de dados em grupos de treinamento e teste pode ser repe-tida múltiplas vezes (cada vez gerando um novo classificador). Em inter-validação de k-vezes, o grupo de dados é dividido k a k, e cada subgrupo éutilizado como o grupo de teste em um de k ciclos de treinamento e valida-ção. Isto pode ser estendido à inter-validação excluindo uma (LOOCV) emque cada amostra é classificada de acordo com um classificador gerado dasamostras restantes no grupo de dados ("excluindo uma"; excluindo uma a-mostra que está sendo testada).

LDA e LOOCV foram utilizados para ilustrar a utilidade do TMsub-regulado, LTB4DH, na melhora do diagnóstico de TCC. qPCR foi primei-ro realizada sobre o coorte de controle e amostras de urina de TCC descritasna figura 13 que foram suplementadas com um adicional de 30 tumores degrau 3 (5 > estágio 1, 13 = estágio 1,4 = Tis, e 8 = Ta). Combinações dosseis genes LTB4DH, MDK, IGFBP5, H0XA13, T0P2a e CDC2 foram testa-das quanto ao desempenho do classificador, como avaliado por LOOCV. Aprobabilidade posterior (de que a amostra "excluída" foi uma amostra deTCC) foi utilizada para gerar curvas de ROC utilizando-se o pacote de RO-CR do ambiente de programação estatística R. A sensibilidade do classifica-dor para uma determinada especificidade foi obtida por referência à curva deROC apropriada.

A sensibilidade de detecção de TCC utilizando-se combinaçõesde BTMs super-regulados com e sem LTB4DH foi determinada em uma es-pecificidade de 85%. Os resultados desta análise são mostrados na figura15. Pode ser observado que a adição de LTB4DH aos ensaios incluindocombinações dos BTMs super-regulados MDK, IGFBP5, Top2a, cdc2 e Ho-xA13 aumenta a sensibilidade total em 1-2% e a sensibilidade de detecçãode tumores em estágio Ta, tumores grau 1-2 e tumores grau 3 em até 3%.

Aqui na descrição anterior referência foi feita aos números intei-ros ou componentes tendo equivalentes conhecidos, tais equivalentes sãoaqui incorporados como se individualmente mencionados.

Embora a invenção tenha sido descrita por meio de exemplo ecom referência às possíveis modalidades desta, deve ser apreciado que me-lhoramentos e/ou modificações podem ser feitas sem afastar-se do escopoou do espírito desta.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL

Métodos para detectar membros da família de TM incluem de-tecção de ácidos nucléicos, proteínas e peptídeos utilizando-se métodos demicroarranjo e/ou PCR em tempo real. As composições e métodos destainvenção são úteis no diagnóstico de doença, avaliação da eficácia de tera-pia, e para produção de reagentes e kits de teste adequados para medir aexpressão de membros da família de TM.

Claims (27)

1. Método para determinar a presença de um câncer em um in-divíduo, compreendendo:(a) fornecer uma amostra do indivíduo;(b) detectar o nível de expressão de pelo menos dois membrosda família de TM na referida amostra, em que pelo menos um TM é um TMsubexpresso;(c) estabelecer se o paciente tem câncer de acordo com um li-miar predeterminado.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa (c) érealizada determinando-se a taxa de expressão dos referidos BTMs.

3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a etapa (c) érealizada executando-se análise de regressão ou classificação sobre os va-lores de expressão de TM.

4. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o TM é umTM.

5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o dito cân-cer é câncer de bexiga.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menosum dos TMs é um TM superexpresso.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo me-nos um TM subexpresso é um TM selecionado do grupo delineado na figura 3.

8. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o pelo me-nos um TM subexpresso é um TM selecionado do grupo delineado na figura 4.

9. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o TM super-expresso é TM selecionado do grupo delineado na figura 11 ou figura 12.

10. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referidaetapa de detectar é realizada detectando-se expressão de mRNA de TM.

11. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referidaetapa de detectar é realizada detectando-se expressão de uma proteína deTM.

12. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a referidaetapa de detectar é realizada detectando-se expressão de um peptídeo de TM.

13. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a amostraé qualquer uma de biópsia, sangue, soro, lavagens peritoneais, fluido cere-broespinhal, urina e amostras de evacuação.

14. Dispositivo para detectar um TM, compreendendo:um substrato tendo um reagente de captura de TM nele; eum detector associado com o dito substrato, o dito detector ca-paz de detectar um TM associado com o dito reagente de captura, em que oTM é um TM subexpresso.

15. Dispositivo de acordo com a reivindicação 14, em que o TMé um TM.

16. Dispositivo de acordo com a reivindicação 14, em que o ditoreagente de captura de TM é um oligonucleotídeo.

17. Dispositivo de acordo com a reivindicação 14, em que o ditoreagente de captura de TM é um anticorpo.

18. Dispositivo de acordo com a reivindicação 14, em que o TMé um TM selecionado do grupo delineado na figura 3.

19. Dispositivo de acordo com a reivindicação 14, em que o TMé um TM selecionado do grupo delineado na figura 4.

20. Kit para determinar a presença de um câncer em um indiví-duo, compreendendo:um substrato;pelo menos dois reagentes de captura de TM, em que pelo me-nos um TM é um TM subexpresso; einstruções para uso.

21. Kit de acordo com a reivindicação 20, em que o TM é um TM.

22. Kit de acordo com a reivindicação 20, em que o dito reagentede captura de TM é um oligonucleotídeo específico de TM.

23. Kit de acordo com a reivindicação 20, em que o dito reagentede captura de TM é um anticorpo específico de TM.

24. Kit de acordo com a reivindicação 20, em que o TM subex-presso é um TM selecionado do grupo delineado na figura 3.

25. Kit de acordo com a reivindicação 20, em que o TM subex-presso é um TM selecionado do grupo delineado na figura 4.

26. Kit de acordo com a reivindicação 20, em que pelo menosum TM é um TM superexpresso.

27. Kit de acordo com a reivindicação 26, em que o TM superex-presso é um TM selecionado do grupo delineado na figura 11 ou figura 12.