PROPORCIONES DE EXPRESIÓN DE GEN DE PRUNA PARA DETECCIÓN DE CÁNCER
Campo de la Invención La presente invención se refiere a la detección de cáncer.
En forma específica, la presente invención se refiere al uso de marcadores para la detección de cáncer de vejiga. Más específicamente, la presente invención se refiere al uso de un marcador sub-expresado en combinación con al menos otro marcador para la detección de cáncer de vejiga. Antecedentes de la Invención La supervivencia de pacientes con cáncer se aumenta en gran parte cuando el cáncer se trata en forma temprana. En el caso de cáncer de vejiga, los pacientes diagnosticados con la enfermedad de etapa temprana tienen rangos de supervivencia de 5 años mayores al 90%, en comparación con aproximadamente del 15 al 30% para pacientes diagnosticados con enfermedad avanzada. Por consiguiente, los desarrollos que conducen al diagnostico temprano de cáncer de vejiga pueden conducir a un pronóstico mejorado para los pacientes. El método para establecer para detectar cáncer de vejiga utilizando muestras de orina, es la citología. Sin embargo, la citología es conocida para ser únicamente aproximadamente el 75% sensible en la detección de cáncer de vejiga invasivo y únicamente aproximadamente el 25% sensible en la detección
de cáncer de vejiga superficial (Lotan y Roehrborn, Urology 61, 109-118 (2003)). La identificación de marcadores específicos para cáncer en la orina, pueden proporcionar un método valioso para el diagnostico temprano de cáncer, conduciendo al tratamiento temprano y pronósticos mejorados. Los marcadores de cáncer específicos también proporcionan un medio para monitorear el progreso de la enfermedad, habilitando el monitoreo de la eficacia de tratamientos quirúrgicos, radioterapéuticos y quimioterapéuticos. En la actualizad, el método más confiable para detectar cáncer de vejiga es citoscopia acompañada por histología de lesiones de biopsia. Sin embargo, esta técnica es tardada, invasiva y sensibilidad es únicamente del 90%, lo que significa que aproximadamente el 10 por ciento de los cánceres no son detectados utilizando estos métodos. De las metodologías no invasivas, la citología de orina, la cual detecta en forma microscópica células malignas exfoliadas, es el método preferido normal. Aunque la citología tiene una especificidad de aproximadamente 95%, tiene una sensibilidad eficiente (9-25%) para lesiones de grado bajo, es extremadamente dependiente de la calidad de la muestra y padece de una alta variabilidad inter-observadora. Se conocen varios marcadores de proteína de orina. Las pruebas para estos marcadores ofrecen una mejor sensibilidad
que la citología, aunque tienden a padecer de una especificidad sub-óptima, debido a los niveles elevados de estos marcadores los cuales también se observan comúnmente en pacientes con enfermedades malignas incluyendo inflamación, urolitiasis e hiperplasia prostética benigna. Por ejemplo, NMP22, la cual detecta una proteína de matriz nuclear específica, tiene una sensibilidad de 47-87% y una especificidad de 58-91%. Un inconveniente asociado con las pruebas de orina, es que los niveles marcadores individuales pueden variar significativamente con: (i) diferentes métodos de recolección de orina (cateterizados, vaciados, pelets de orina); (ii) la sincronización diurna de las muestras de orina; (iii) el punto de muestras durante el vaciado (por ejemplo corriente medio versus muestra final); y (iv) concentración de orina asociada con ingesta de fluidos diversa, función renal o enfermedades que afectan el volumen de plasma. Estas variaciones tienen el potencial de conducir a pruebas positivas falsas y negativas falsas. Aunque alguna de esta variación puede reducirse utilizando procedimientos de operación estándar, estrictos, el cumplimiento del paciente con estos procedimientos pueden no ser confiable. El efecto de la diversa concentración de orina, en algunos casos, puede tomarse en cuenta en la evaluación de los niveles marcadores con relación a creatinina urinaria, sin embargo, esto incrementa el costo y complejidad de las pruebas, particularmente cuando la preparación de la muestra o
los métodos de almacenamiento difieren a la detección del marcador y a la medida de creatinina. Existe la necesidad de herramientas simples para la detección temprana y diagnóstico de cáncer. La presente invención proporciona métodos adicionales, aparatos y equipos con base en marcadores, proporciones específicas, análisis de regresión o clasificación de marcadores de cáncer de vejiga, para ayudar a la detección y diagnóstico de cáncer de vejiga. Breve Descripción de la Invención La presente invención proporciona un método para determinar la presencia de un cáncer en un sujeto, caracterizado porque: (a) proporcionar una muestra procedente del sujeto; (b) detectar el nivel de expresión en al menos dos miembros de la familia de marcador de tumor (TM) en la muestra, en donde al menos un TM es un TM sub-expresado; (c) establecer si el paciente tiene cáncer de acuerdo con un valor de umbral predeterminado. El paso (c) puede llevarse a cabo determinando la proporción de expresión de los TMs, o llevando a cabo análisis de regresión o clasificación en los niveles de expresión TM. El TM puede ser un BTM. El cáncer que será detectado puede ser cáncer de vejiga, y en ciertas modalidades al menos uno de los TMs es un BTM sobre-expresado. El BTM sobre-expresado puede ser seleccionado del grupo señalado en la
figura 11 o en la figura 12. En ciertas modalidades al menos un TM sub-expresado es un BTM seleccionado del grupo señalado en la figura 3 o en la figura 4. En otras modalidades de la presente invención, el paso para detectar se lleva a cabo detectando la sobre-expresión de BTM mRNA, una proteína de BTM, o un péptido de BTM. La muestra puede ser cualquiera de una biopsia, sangre, suero, lavados peritoneales, fluido cerebroespinal, orina o muestras de heces. La presente invención también proporciona un aparato para detectar un TM, caracterizado porque comprende: un substrato que tiene un reactivo de captura TM en el mismo; y un detector asociado con el substrato, teniendo la capacidad del detector de detectar un TM asociado con el reactivo de captura, en donde el TM es un TM sub-expresado. El TM puede ser un BTM. El reactivo de captura TM puede ser un oligonucleótido o un anticuerpo. En ciertas modalidades el TM puede ser un BTM seleccionado del grupo señalado en la figura 3 o en la figura 4.
La presente invención también proporciona un equipo para determinar la presencia de un cáncer en un sujeto, caracterizado porque comprende:
un substrato; al menos dos reactivos de captura TM, en donde al menos uno de TM es un TM sub-expresado; y instrucciones de uso. El TM puede ser un BTM. El reactivo de captura TM puede ser un oligonucleótido específico de TM o un anticuerpo específico de TM. El TM detectado por el equipo puede ser un BTM seleccionado del grupo señalado en la figura 3 o en la figura 4. Al menos uno de los TMs detectado por el equipo puede ser un TM sobre-expresado o un BTM sobre-expresado. El BTM sobre-expresado puede ser seleccionado de un grupo señalado en la figura 11 o figura 12. Breve Descripción de las Figuras La presente invención se describe con referencia a modalidades específicas de la misma y con referencia a las figuras, en las cuales- La figura 1, ilustra una tabla que muestra las características de muestras de orina utilizadas en los análisis. La figura 2, ilustra una tabla de cebadores y sondas de oligonucleótido de marcadores para análisis qPCR cáncer de vejiga de acuerdo con la presente invención. La figura 3, ilustra una tabla de marcadores de tumor de vejiga de sub-expresión identificados utilizando métodos de microformación en muestras de cáncer de vejiga.
La figura 4, ilustra una tabla de marcadores de tumor de vejiga de sub-expresión identificados utilizando métodos de microformacion en muestras de cáncer de vejiga que tiene una expresión insignificante en sangre total, pero una alta expresión en tejido de vejiga normal. La figura 5, ilustra trazos de cuadros y patillas que muestran las proporciones de tres marcadores de carcinoma de célula de transición de vejiga (TCC) (HoxA13, IGFBP5, y MDK) con el marcador de sub-expresión LTB4DH para muestras de orina procedentes de pacientes ya sea con enfermedad urológica no maligna o TCC. Los cuadros definen los porcentajes 25, 50 y 75 y las barras horizontales marcan los valores adyacentes. Se muestran indicadores mediante círculos. Los cuadros no llenos representan muestras de controles de enfermedad no maligna, y los cuadros sembrados representan muestras de pacientes con TCC. La figura 6, muestra ejemplos de sensibilidades y especificidades de detección TCC para pruebas que incluyen LTB4DH. (a), pruebas simples; (b). Pruebas de combinación utilizando LTB4DH y dos de los tres marcadores HoxA13, IGFBP5, y MDK. Las figuras 7a a 7c, muestran curvas ROC para la sensibilidad y especificidad de detección de TCC en muestras de orina utilizando proporciones que incluyen LTB4DH. 7a. IGFBP5/LTB4DH; 7b. MDK/LT4BDH ; 7c. HoxA13/LTB4DH .
Las figuras 8a a 8f, muestran trazos de dispersión de pruebas de combinación, a-c utilizando LTB4DH y dos de los tres marcadores HoxA13, IGFBP5, y MDK, y d-f repetidos utilizando BAG1 para LTB4DH. 8a. MDK/LTB4DH y IGFBP5/LTB4DH; 8b. MDK/LTB4DH y HoxA13/LTB4DH; IGFBP5/LTB4DH y HoxA13/LTB4DH; 8d MDK/BAG1 y IGFBP5/BAG 1 ; 8e.MDK/BAG1 y HoxA13/BAG1; 8f. IGFBP5/BAG 1 y HoxA13/BAG1. Las figuras 9a y 9b, muestran trazos de dispersión que muestran la correlación entre ACt para proporciones IGFBP5 y ACt para IGFBP5/LTB4DH y concentración de creatinina de orina. 9a. Muestras de orina de pacientes con TCC 9b. Muestras de orina de pacientes con enfermedad no maligna. Las figuras 10a a 10f, ilustran trazos de dispersión auto-auto que muestran la distribución de muestras de orina vaciadas y cateterizadas de pacientes TCC analizados utilizando los marcadores de tumor de vejiga MDK, IGFBP5 y HoxA13 solo o en proporciones con LTB4DH. La figura 11, muestra marcadores sobre-expresados conocidos procedentes de tumores de vejiga invasivo. La figura 12, muestra marcadores sobre-expresados conocidos de tumores de vejiga superficial. La figura 13, muestra las características clínicas de muestras TCC de grado bajo y controles utilizados en análisis de curva ROC.
La figura 14, muestra los resultados de un análisis de curva ROC. La ilustración de la precisión de la prueba incrementada obtenida cuando LTB4DH se utilizó en proporciones con HoxA13 y IGFBP5. La figura 15, muestra los resultados de un Análisis de
Discriminación Lineal de BTMs, con o sin LTB4DH, para la detección de TCC. Descripción Detallada de la Invención Definiciones El término "marcador" significa una molécula que está asociada en forma cuantitativa o cualitativa con la presencia de un fenómeno biológico. Los ejemplos de "marcadores" incluyen un polinucleótido, tal como un gen, un fragmento de gen, ARN, o fragmento de ARN; o un producto de gen, incluyendo un polipéptido tal como un péptido, proteína de oligopéptido o fragmento de proteína; o metabolitos relacionados, subproductos u otras moléculas de identificación, tal como anticuerpos o fragmentos de anticuerpo ya sea relacionado directa o indirectamente a un mecanismo subyacente al fenómeno. Los marcadores de la presente invención incluyen las secuencias de nucleótido (por ejemplo secuencias GenBank) tal como aquí se describen, en particular, las secuencias de longitud total, cualesquiera secuencias de codificación, secuencias de no codificación y fragmentos, o cualesquiera complementos de los mismos, y cualquier marcador medible de
los mismos, tal como se definió anteriormente. El término "sensibilidad" significa la proporción de individuos con la enfermedad, los cuales obtienen una prueba positiva (a través del modelo). Por lo tanto, la sensibilidad incrementada significa menos resultados de prueba negativo falsos. El término "especificidad" significa la proporción de individuos sin enfermedad quienes obtienen pruebas negativas (a través del modelo) por lo tanto, la especificidad incrementada significa menos resultados de pruebas positivos falsos. El término "expresión" incluye la producción de polinucleótidos y polipéptidos, en particular, la producción de ARN (por ejemplo, mARN) de un gen o parte de un gen, e incluye la producción de un polipéptido codificado por un ARN o gen o parte de un gen, e incluye la aparición de un material detectable asociado con la expresión. Por ejemplo, la formación de un complejo, por ejemplo, de una interacción de polipéptido-polipéptido, interacción de polipéptido-nucleótido o similar, está incluida dentro del alcance del término "expresión". Otro ejemplo, el enlace de un ligando de enlace, tal como sonda de hibridación o anticuerpo, a un gen u otro polinucleótido, un polipéptido o un fragmento de proteína y la visualización del ligando de enlace. Por lo tanto, la densidad de un punto en una microformación, en una mancha de hibridación tal como una
mancha Northern, o un inmunomanchado, tal como una mancha Western, o en una formación de cuentas, o mediante análisis PCR, está incluido dentro del término "expresión" de la molécula biológica subyacente. El término "sobre-expresión" se utiliza cuando la expresión de un marcador en una célula, o tipo celular, es mayor al de otra célula equivalente, o tipo celular. El término "sub-expresión" se utiliza cuando la expresión de un marcador en una célula, o tipo de célula, es menor al de otra célula equivalente, o tipo celular. El término "TM" o "marcador de tumor" o "miembro de familia TM", significa un marcador que esté asociado con un cáncer en particular. El término TM también incluye combinaciones de marcadores individuales, cuya combinación mejora la sensibilidad y especificidad para detectar cáncer. También quedará entendido que el término TM no requiere que el marcador sea específico únicamente de un tumor en particular. Más bien, la expresión de TM puede ser alterada en otros tipos de células, células enfermas, tumores, incluyendo tumores malignos. Un TM puede ser identificado extrayendo ARN de una muestra de tejido de un paciente del que se sospecha tiene cáncer de vejiga, aplicando la copia de ARN o cADN a una microformación que tiene un número de oligonucleótidos en la misma, permitiendo que la muestra de ARN hibride a los
oligonucleótidos en la formación, y posteriormente cuantificando el nivel de ARN medido enlazado a cada punto de la formación. Un marcador se considera una sub-expresión de TM si su presencia está debajo de un valor de umbral de al menos aproximadamente 1.2 veces que lo encontrado en tejido no maligno, normal utilizando métodos de microformación. Como alternativa, el valor de umbral puede ser debajo de aproximadamente 2 veces normal, aproximadamente 3 veces menor al normal, 4 veces o incluso hasta aproximadamente 5 veces menor a normal. Por el término "normal" significa menos del 90 por ciento de la población normal. En otros casos, normal puede significar un nivel de presencia del 95 por ciento (es decir aproximadamente 2 Desviaciones Estándar (SD) del promedio), y en otro casos, menos de aproximadamente 97.5 por ciento (por ejemplo, aproximadamente 3 SD) o el 99 por ciento. El término "TM de sub-expresión" significa un marcador que muestra expresión menor en tumores de vejiga que en tejido de vejiga no maligno. El término "TM de sobre-expresión" significa un marcador que muestra una mayor expresión en tumores de vejiga que en tejido no maligno. El término "BTM" o "marcador de tumor de vejiga" o "miembro de familia BTM" significa un TM que está asociado con cáncer de vejiga. El término BTM también incluye
combinaciones marcadores individuales, cuya combinación mejora la sensibilidad y especificidad para detectar cáncer de vejiga. Quedará entendido que el término BTM no requiere que el marcador sea específico únicamente para tumores de vejiga. Más bien, la expresión de BTM puede ser alterada en otros tipos de células, células enfermas, tumores, incluyendo tumores malignos. El término "BTM de sub-expresión" significa un marcador que muestra menor expresión en tumores de vejiga que en tejido de vejiga no maligno. El término "BTM de sobre-expresión" significa un marcador que muestra una mayor expresión en tumores de vejiga que en tejido no maligno. El término "qPCR" significa reacción de cadena de polimerasa cuantitativa. El término "qPCR" o "QPCR" se refiere a reacción de cadena de polimerasa cuantitativa tal como se describe, por ejemplo, en la Técnica PCR: Quantitative PCR, J.W. Larrick, ed., Eaton Publishing, 1997, y A-Z de Quantitative PCR, S. Bustin, ed., IUL Press, 2004. El término "TCC" significa carcinoma de célula de transición de la vejiga. TCCs constituye ~95% de todos los cánceres de vejiga. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "anticuerpos" y términos similares se refieren a moléculas de inmunoglobulina y porciones inmunológicamente activas de
moléculas de inmunoglobulina (Ig), por ejemplo molécula que contienen un sitio de enlace de antígenos que enlaza específicamente (inmuno-reacción con) un antígeno. Estas incluyen, pero no se limitan a, fragmentos policlonales, monoclonales, quiméricos, de cadena simple, Fe, Fab, Fab', y Fab2, y a una biblioteca de expresión Fab. Las moléculas de anticuerpo se refieren a cualesquiera de las clases IgG, IgM, IgA, IgE, y IgD, que difieren entre sí por la naturaleza de la cadena pesada presente en la molécula. Estas incluyen también sub-clases, tales como lgG1, lgG2, y otras. La cadena ligera puede ser una cadena kappa o una cadena lambda. La referencia en la presente invención a anticuerpos incluye una referencia de todas las clases, subclases, y tipos. También se incluyen anticuerpos quiméricos, por ejemplo, anticuerpos o fragmentos monoclonales de los mismos que son específicos para más de una fuente, por ejemplo, una secuencia de ratón o humano. Se incluyen además anticuerpos de camélido, anticuerpos o nanocuerpos de tiburón. Los términos "cáncer" y "cancerígenos" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que normalmente está caracterizada por crecimiento de células anormal o no regulado. El cáncer y la patología del cáncer se pueden asociar, por ejemplo, con metástasis, interferencia con funcionamiento normal de células vecinas, liberación de citocinas u otros productos se segregación en niveles
anormales, supresión o agravamiento de respuesta inflamatoria o inmunológica, neoplasia, pre-malignidad, malignidad, invasión de tejidos u órganos circundantes o distantes, tales como nodos linfáticos, etc. El término "tumor" se refiere a todo el crecimiento y proliferación de célula neoplástica ya sea maligno o benigno, y todas las células y tejidos pre-cancerígenos y cancerígenos. El término "microformación" se refiere a un ajuste ordenado o no ordenado de agentes de captura, preferentemente polinucleótidos (por ejemplo, sondas) o polipéptidos en un substrato. Ver por ejemplo, la Publicación de Microarray Analysis, M. Schena, John Wiley & Sons, 2002; Microarray Biochip Technology, M. Schena, ed., Eaton Publishing, 2000; Guide to Analysis de DNA Microarray Data, S. Knudsen, John Wiley & Sons, 2004; y Protein Microarray Technology, D. Kambhampati, ed., John Wiley & Sons, 2004. El término "oligonucleótido" se refiere a un polinucleótido, normalmente una sonda o cebador que incluye, sin limitación, desoxirribonucleótidos de hebra simple, ribonucleótidos de hebra simple o doble, ARN; híbridos de ADN, y ADNs de hebra doble. Los oligonucleótidos, tales como oligonucleótidos de sonda de ADN de hebra simple, con frecuencia son sintetizados a través de métodos químicos, utilizando por ejemplo sintetizadores de oligonucleótido automáticos que están comercialmente disponibles, o a través de una variedad de
otros métodos, incluyendo sistemas de expresión in vitro, técnicas recombinantes y expresión en células y organismos. El término "polinucleótido," cuando se utilizan en singular o pluralidad, se refiere generalmente a cualquier poliribonucleótido o polidesoxiribonucleótido, el cual puede ser ARN o ADN no modificado o ARN o ADN modificado. Esto incluye, sin limitación ADN de hebra simple o doble, ADN que incluye regiones de hebra simple y hebra doble, ARN de hebra simple y doble, y ARN que incluyen regiones de hebra simple y hebra doble, moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser de hebra simple, o más normalmente, regiones de hebra doble o que incluyen hebra simple o doble. También se incluyen regiones de hebra triple que comprenden ARN o ADN o tanto ARN como ADN. Incluidos en forma especifica se encuentran mARNs, cADNs, y ADNs genómicos y cualquier fragmento de los mismos. El término incluye ADNs y ARNs que contienen una o más bases modificadas, tales como bases tritiadas, o bases no usuales, tales como inosina. Los polinucleótidos de la presente invención pueden comprender secuencias de codificación o no codificación, o secuencias de sentido o anti-sentido. Quedará entendido que cada referencia a un "polinucleótido" o término similar en la presente invención, incluirá las secuencias de longitud total así como cualesquiera fragmentos derivados o variantes del mismo. El término "polipéptido," tal como se utiliza en la presente
invención, se refiere a una secuencia de oligopéptido, péptido, o de proteína o a un fragmento de la misma, y a moléculas que ocurren naturalmente, recombinantes, sintéticas o semi-sintéticas. Cuando el término "polipéptido" se menciona en la presente invención para referirse a una secuencia de aminoácido de una molécula de proteína" que ocurre naturalmente, el término "polipéptido y términos similares, no pretenden limitar la secuencia de aminoácido a la secuencia de aminoácido nativa, completa para la molécula de longitud total. Quedará entendido que cada referencia a un "polipéptido" o términos similar en la presente invención, incluirá una secuencia de longitud total, así como cualesquiera fragmentos derivados o variantes de los mismos. La "rigurosidad" de las reacciones de hibridación es fácilmente determinable por un experto en la técnica, y generalmente es un cálculo empírico que depende de la longitud de la sonda, temperatura de lavado y concentración de sal. En general, las sondas más grandes requieren mayores temperaturas para un endurecimiento adecuado, en tanto que las sondas más cortas necesitan temperaturas más bajas. La hibridación generalmente depende de la capacidad del ADN desnaturalizado para re-endurecerse cuando están presentes hebras complementarias en un ambiente debajo de su temperatura de fundición. Entre mayor es el grado de homología deseada entre la sonda y la secuencia hibridizable, mayor es la
temperatura relativa que puede ser utilizada. Como resultado, se indica que las temperaturas relativas mayores pueden tender a hacer más estrictas las condiciones de la reacción, en tanto que las temperaturas menores sean menos estrictas. Los detalles y una explicación adicional de la rigurosidad de las reacciones de hibridación se encuentran por ejemplo en la Publicación de Ausubel y asociados, Current Protocols en Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (1995). Las "condiciones estrictas" o "condiciones altamente estrictas", tal como se definen en la presente invención, normalmente: (1) emplean una baja resistencia iónica y una alta temperatura de lavado, por ejemplo, 0.015 M de cloruro de sodio/0.0015 M de citrato de sodio/0.1% de sulfato dodecilo de sodio a una temperatura de 50°C; (2) emplean un agente de desnaturalización durante la hibridación, tal como formamida, por ejemplo, 50% (v/v) de formamida con 0.1% de albúmina de suerote bovino/0.1% Ficoll/0.1% de polivinilpirrolidona/50 mM de amortiguador de fosfato de sodio a un pH de 6.5 con 750 mM de cloruro de sodio, 75 mM de citrato de sodio a una temperatura de 42°C; o (3) emplean 50% de formamida, 5X SSC (0.75 M NaCI, 0.075 M de citrato de sodio), 50 mM fosfato de sodio (pH 6.8), 0.1% de pirofosfato de sodio, 5X, solución de Denhardt, ADN de esperma de salmón sonicado (50 pg/ml), 0.1% SDS, y 10% sulfato de dextrano a una temperatura de 42°C, con lavados a una temperatura de 42°C en 0.2X SSC
(cloruro de sodio/citrato de sodio) y 50% de formamida a una temperatura de 55°C, seguido de lavado de alta rigurosidad que comprende 0.1X SSC que contiene EDTA a una temperatura de 55°C. Las "condiciones moderadamente estrictas" pueden ser identificadas como se describe en la Publicación de Sambrook y asociados, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nueva York: Cold Spring Harbor Press, 1989, e incluyen el uso de una solución de lavado y condiciones de hibridación (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica y % SDS) menos estrictas que las descritas anteriormente. Un ejemplo de condiciones moderadamente estrictas es incubación durante la noche a una temperatura de 37°C en una solución que comprende: 20% de formamida, 5X SSC (150 mM de NaCI, 15 mM de citrato trisódico), 50 mM de fosfato de sodio (pH 7.6), 5X de solución de Denhardt, 10% de sulfato de dextrano, y 20 mg/ml de ADN de esperma de salmón trasquilado desnaturalizado, seguido de lavado de los filtros en 1X SSC a una temperatura de aproximadamente 37-50°C. Los expertos en la técnica reconocerán como ajustar la temperatura, fuerza iónica, etc, según sea necesario para acomodar factores tales como longitud de sonda y similares. La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra manera, técnicas convencionales de biología molecular (por ejemplo incluyendo técnicas
recombinantes), microbiología, biología celular, y bioquímica, las cuales están dentro de la habilidad en la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la literatura, tal como Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2o edición, Sambrook y asociados, 1989; Oligonucleotide Synthesis, MJ Gait, ed., 1984; Animal Cell Culture, R.l. Freshney, ed., 1987; Methods en Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook de Experimental Immunology, 4o edición, D .M. Weir & CC. Blackwell, eds., Blackwell Science Inc., 1987; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells, J. M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987; Current Protocols en Molecular Biology, F.M. Ausubel y asociados, eds., 1987; y PCR: The Polymerase Chain Reaction, Mullís y asociados, eds., 1994. Descripción Detallada de la Invención Utilizando una combinación de análisis de microformación y reacción de cadena de polimerasa cuantitativo (qPCR), los marcadores para carcinoma de célula de transición de la vejiga (TCC) que son sub-expresados en tumores, han sido identificados. Se descubrió sorprendentemente que las proporciones entre estos marcadores y otros marcadores de tumor de vejiga (BTM), especialmente marcadores que son sobre-expresados en tumores, son diagnósticos de cáncer de vejiga. Las proporciones (en lugar de medir un nivel absoluto de un marcador) identifican una "signatura" de expresión de gen
simple que tipifica células de cáncer de vejiga, y es sorprendentemente más robusta a variaciones en técnicas de muestreo o concentración de orina. Además, la combinación de un marcador sub-expresado y un marcador sobre-expresado maximiza el diferencial entre muestras de pacientes y controles no malignos, incrementando la confiabilidad de la prueba. Los marcadores sub-expresados aquí descritos han sido seleccionados sobre las bases de (i) desactivación fuerte y consistente en TCC, (ii) alta expresión en tejido normal, y (iii) expresión insignificativa en sangre total para minimizar el riesgo de positivos falsos en pacientes que se presentan con hematuria. Como una alternativa para determinar la proporción de los dos BTM, también se ha descubierto que los BTMs sub-expresados y sobre-expresados pueden ser analizados en análisis de regresión o técnicas de clasificación que incluyen análisis de discriminación lineales, y los resultados de estos análisis también indican la presencia de cáncer de vejiga. La prueba implica la medición de al menos dos marcadores TM, tal como un BTM, en una muestra de un paciente de que se sospecha tiene cáncer o esta en riesgo de tener cáncer, en donde al menos uno de los TMs es un TM sub-expresado. La proporción de TM sub-expresado y el otro TM, indica la presencia de cáncer. El segundo TM puede ser cualquier TM tal como se conoce en la técnica, aunque preferentemente es un
BTM sobre-expresado. La figura 3, muestra un número de marcadores sub-expresados adecuados para utilizarse en la presente invención. La prueba se lleva a cabo de mejor manera utilizando TM sub-expresado en combinación con un TM sobre-expresado. Cualquier TM sobre-expresado puede ser utilizado, por ejemplo. Los BTMs sobre-expresados de ejemplo identificados a partir de tumores de vejiga invasivos (definidos en la presente invención como tumores = etapa 1), se señalan en la figura 11, y los BTMs sobre-expresados identificados de tumores de vejiga superficial (definido aquí como tumores etapa Ta y Tis) se muestran en la figura 12. También se ha establecido en forma sorprendente que los BTMs sub-expresados preferidos para utilizarse en la presente invención, son los que no están elevados significativamente en la sangre total, y se encuentran en números de copia suficientemente altos tanto en células de tumor como en células de vejiga no malignas. Los BTMs sub-expresados preferidos se señalan en la figura 4. Los marcadores de cáncer pueden ser detectados en una muestra utilizando cualquier técnica adecuada, pero pueden incluir pero no se limitan a, sondas de oligonucleótido qPCR o anticuerpos elevados contra marcadores de cáncer. Se podrá apreciar que la muestra que será aprobada no se restringe a una muestra del tejido del que se sospecha es un
tumor. El marcador puede ser secretado en el suero, desprende de las membranas celulares, liberado de células Usadas o asociado con células pérdidas en la orina. Por consiguiente, una muestra puede incluir cualquier muestra corporal, e incluye biopsias, sangre, suero, lavados peritoneales, fluido cerebroespinal, muestras de orina y heces. También se podrá apreciar que la presente invención no se restringe a la detección de cáncer en humanos, pero es adecuada para la detección de cáncer en cualquier animal, incluyendo pero sin limitarse a perros, gatos, caballos, ovejas, ganado, ciervos, cerdos o cualquier otro animal conocido por tener cáncer. Métodos generales para detección de cáncer Los siguientes métodos son métodos no limitantes que pueden ser utilizados para medir TMs. Después de medir los TMs individuales, se determinaron proporciones entre miembros de la familia de BTM de expresión alta y baja. Estas proporciona se utilizan para anticipar la presencia o ausencia de cáncer. Como alternativa, los TMs de expresión alta y baja se utilizaron en análisis de regresión o clasificación. Los resultados de estos análisis también se utilizan para anticipar la presencia o ausencia de cáncer. Las metodologías generales para determinar niveles de expresión se señalan más adelante, aunque se podrá apreciar
que puede ser adecuado cualquier método para determinar niveles de expresión. PCR cuantitativo (qPCR) El PCR cuantitativo (qPCR) se puede llevar a cabo en muestras de tumor, en suero, en plasma y muestras de orina utilizando cebadores y sondas específicos de BTM. En reacciones controladas, la cantidad de producto formada en una reacción PCR (Sambrook, J., E Fritsch, E. y T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3o. Coid Spring Harbor Laboratory Press: Coid Spring Harbor (2001)) se correlaciona con la cantidad de plantilla de inicio. La cuantificación del producto PCR se puede llevar a cabo deteniendo la reacción PCR cuando está en fase de registro, antes de que los reactivos se vuelvan limitados. Posteriormente los productos PCR son electroforesados en agarosa o geles de poliacrilamida, manchados con bromuro de etidio o una tinción de ADN comparable, y la intensidad de manchado medida mediante densitometría. Como alternativa, el progreso de la reacción la PCR puede medirse utilizando máquinas PCR, tales como Applied Biosystems' Prism 7000 o Roche LightCycler que miden la acumulación de producto en tiempo real. El PCR de tiempo real, mide ya sea la fluorescencia de ADN que intercala las tintas, tales como Sybr Green en el producto PCR, o la fluorescencia liberada por una molécula reportera cuando se disocia de una molécula extintora; las moléculas reporteras y
extinguidotas están incorporadas en una sonda de oligonucleótido que híbrida a la molécula de ADN objetivo después de la extensión de hebra de ADN de los oligonucleótidos de cebador. La sonda de oligonucleótido es desplazada y degradada por la acción enzimática de la polimerasa Taq en el siguiente ciclo PCR, liberando al reportero de la molécula extintora. En una variación, conocida como Scorpion®, la sonda se enlaza covalentemente al cebador. PCR de Transcripción Inversa (RT-PCR) RT-PCR se puede utilizar par comparar niveles de ARN en diferentes poblaciones de muestra, en tejidos normales y de tumor, con o sin tratamiento de fármacos, para caracterizar patrones de expresión, para diferenciar entre ARNs relacionados en forma cercana y para analizar la estructura del ARN. Para RT-PCR, el primer paso es el aislamiento del ARN de la muestra objetivo. El material de partida es normalmente ARN total aislado de líneas de célula de tumor o tumores humanos, y tejidos normales o líneas celulares correspondientes, respectivamente. El ARN puede ser aislado de una variedad de muestras tales como muestras de tumor de seno, pulmón, colon (por ejemplo intestino delgado o intestino grueso), colorectal, gástrico, esofageal, anal, rectal, de próstata, de cerebro, de hígado, de riñon, de páncreas, de bazo, de timo, de testículo, de ovarios, de útero, de vejiga, etc, tejidos de tumores
primarios, o líneas de célula de tumor y de muestras reunidas de donantes saludables. Si la fuente de ARN es un tumor, el ARN puede ser extraído, por ejemplo, de muestras de tejido incrustadas con parafina y fijas congeladas y archivadas (por ejemplo fijadas con formalina). El primer paso en la expresión de gen perfilada mediante RT-PCR, es la transcripción inversa de la plantilla de ARN en cADN, seguido de su amplificación exponencial en una reacción PCR. Las dos transcriptasas inversas más comúnmente utilizadas son transcriptasa inversa de virus de mieloblastosis aviar (AMV-RT) y transcriptasa inversa de virus de leucemia de múrido Moloney (MMLV-RT). El paso de transcripción inversa normalmente se lleva a cabo utilizando cebadores específicos, exámenes aleatorios u oligo-dT cebadores, dependiendo de las circunstancias y la meta del perfilamento de la expresión. Por ejemplo, el ARN extractado puede ser transcrito en forma inversa utilizando un equipo GeneAmp ARN PCR (Perkin Elmer, CA, E.U.A.), siguiendo las instrucciones del fabricante. El cADN derivado puede ser utilizado posteriormente como una plantilla en la reacción PCR subsecuente. Aunque el paso PCR puede utilizar una variedad de polimerasa de ADN dependientes de ADN termoestable, normalmente emplea la polimerasa de ADN Taq, al cual tiene una actividad de nucleasa 5'-3' aunque carece de una actividad de corrección de pruebas de endonucleasa 3'-5'. Por lo tanto, el
PCR normalmente utiliza la actividad de nucleasa TaqMan (q) de 5' o polimerasa Taq o Tth para hidrolizar una sonda de hibridación enlazada a su amplicón objetivo, aunque se puede utilizar cualquier enzima con una actividad de nucleasa 5' equivalente. Se utilizan dos cebadores de oligonucleótido para generar un amplicón típico de una reacción PCR. Se diseña un tercer oligonucleótido, o sonda, para detectar la secuencia de nucleótidos localizada entre los dos cebadores PCR. La sonda es no extendible, por la enzima de polimerasa de ADN Taq, y se etiqueta con una tinta fluorescente reportera y una tinta fluorescente de extinción. Cualquier emisión inducida por láser procedente de la tinta reportera es extinguida por la tinta de extinción cuando las dos tintas se localizan cercanas ya que están en la sonda. Durante la reacción de amplificación, la enzima de polimerasa de ADN Taq disocia la sonda en una forma dependiente de la plantilla. Los fragmentos de sondas resultantes se disocian en la solución, y la señal de la tinta reportera liberada está libre del efecto de extinción del segundo fluoroforo. Una molécula de la tinta reportera es liberada de cada molécula nueva sintetizada, y la detección de la tinta reportera no extinguida proporciona las bases para la interpretación cuantitativa de los datos. Se puede llevar a cabo TaqMan RT-PCR utilizando equipo comercialmente disponible, tal como, por ejemplo, el Sistema de
Detección de Secuencia ABI PRISM 7700 (Perkin-Elmer-Applied Biosystems, Foster City, CA, E.U.A.), o Lightcycler (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemania). En una modalidad preferida, el procedimiento de nucleasa 5' se corre en un aparato PCR cuantitativo de tiempo real tal como el Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM 7700tam. El sistema consiste en un termociclador, láser, aparato acoplado con carga (CCD), cámara y computadora. El sistema amplifica muestras en un formato de 96 depósitos en un termociclador. Durante la amplificación, la señal fluorescente inducida por láser se recolecciona en tiempo real a través de cables de fibra óptica de todos los 96 depósitos, y se detecta en el CCD. El sistema incluye un software para correr el instrumento y para analizar los datos. Los datos del ensayo de nucleasa 5' se expresan inicialmente como Ct, o el ciclo de valor de umbral. Tal como se describió anteriormente, los valores de fluorescencia se registran durante cada ciclo y representan la cantidad de producto amplificada a dicho punto en la reacción de amplificación. El punto cuando la señal fluorescente es registrada primero como estadísticamente significativa, es el ciclo de valor de umbral. PCR Cuantitativo de tiempo real (qPCR) Una variación más reciente de la técnica RT-PCR es el PCR cuantitativo de tiempo real, el cual mide la acumulación de
producto PCR a través de una sonda fluorigénica, etiquetada doble (por ejemplo, la sonda TaqMan). El PCR de tiempo real es compatible tanto con PCR competitivo cuantitativo como con PCR comparativo cuantitativo. El primero utiliza un competidor interno para cada secuencia objetivo para normalización, en tanto que el último utiliza un gen de normalización contenida dentro de la muestra, o un gen local para RT-PCR. Se proporciona detalles adicionales, por ejemplo en la Publicación de Held y asociados, Genome Research 6: 986-994 (1996). Los niveles de expresión se pueden determinar utilizando tejidos incrustados con parafina, fijos como la fuente de ARN. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, los cebadores y sondas PCR se diseñan con base en secuencias de intrón presentes en el gen que será amplificado. En esta modalidad, el primer paso en el diseño de cebador/sonda es la delineación de secuencias intrón dentro de los genes. Esto se puede realizar a través del software públicamente disponible, tal como el software ADN BLAT desarrollado por Kent, W. J., Genome Res. 12 (4): 656-64 (2002), o a través del software BLAST incluyendo sus variaciones. Los pasos subsecuentes siguen métodos bien establecidos de diseño de cebador y sonda PCR. Con el objeto de evitar señales no específicas, es útil cubrir secuencias repetitivas dentro de los intrones cuando se diseñan los cebadores y sondas. Esto se puede lograr
fácilmente utilizando el programa Repeat Masker disponible en línea a través de Baylor College de Medicine, el cual clasifica secuencias de ADN contra una biblioteca de elementos repetitivos y regresa a una secuencia de consulta en la cual se cubren los elementos repetitivos. Las secuencias cubiertas posteriormente pueden ser utilizadas para diseñar secuencias de cebador de sonda utilizando cualesquiera paquetes de diseño de cebador/sonda comercialmente o públicamente disponibles, tales como Primer Express (Applied Biosystems); MGB ensayo por diseño (Applied Biosystems); Primer3 (Steve Rozen y Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 en el WWW para los usuarios generales y programadores biólogos en: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods y Protocols: Methods en Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386). Los factores más importantes considerados en diseño de cebador PCR incluyen longitud se cebador, temperaturas de fundición (Tm), y contenido G/C, especificidad, secuencias de cebador de complementariedad y secuencia de extremo 3'. En general, los cebadores óptimos PCR generalmente tienen de 17 a 30 bases de longitud, y contienen aproximadamente 20-80%, tal como por ejemplo, aproximadamente 50-60% G + C bases. Las temperaturas de fundición entre 50 y 80°C, por ejemplo, de aproximadamente 50 a 70°C, son normalmente preferidas. Para lineamientos adicionales de diseño de cebador y sonda PCR ver las publicaciones de Dieffenbach, C. W. y asociados, General
Concepts for PCR Primer Design in: PCR Primer, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York, 1995, pp. 133-155; Innis y Gelfand, Optimization de PCRs in: PCR Protocols, A Guide to Methods y Applications, CRC Press, Londres, 1994, pp. 5-11; y Plasterer, T. N. Primerselect: Primer y probé design. Methods Mol. Biol. 70:520-527 (1997), cuyas descripciones totales están incorporadas a la presente invención como referencia. Análisis de Microf ormación También se puede identificar la expresión diferencial, o confirmarse utilizando la técnica de microf ormación . Por lo tanto, el perfil de CCPMs puede medirse en tejido de tumor ya sea fresco o incrustado en parafina, utilizando tecnología de microformación. En este método, la secuencia de polinucleótido de interés (incluyendo cADNs y oligonucleótidos) son revestidas, o formadas, en un substrato de microchip. Las secuencias formadas (por ejemplo, sonda de captura), posteriormente son hibridadas con polinucleótidos específicos de células o tejidos de interés (por ejemplo, objetivo). Justo como en el método RT-PCR, la fuente de ARN normalmente es ARN total aislada de tumores o líneas de célula de tumor humanos, y tejidos o líneas de células normales correspondientes. Por lo tanto, el ARN puede ser aislado de una variedad de tumores primarios o líneas de célula de tumor. Si la fuente de ARN es un tumor primario, el ARN puede ser
extractado, por ejemplo, de muestras de tejido incrustadas en parafina fijas con formalina congeladas o archivadas (FFPE) y muestras de tejido fijadas (por ejemplo fijadas con formalina), las cuales son preparadas y conservadas en forma rutinaria en la práctica clínica de todos los días. En una modalidad específica de la técnica de microformación , los insertos amplificados con PCR de clones de cADN se aplican a un substrato. El substrato puede incluir hasta 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o 75 secuencias de nucleótido. En otros aspectos, el substrato puede incluir al menos 10,000 secuencias de nucleótido. Las secuencias microformadas, inmovilizadas en el microchip, son adecuadas para hibridación bajo condiciones estrictas. Como otras modalidades, los objetivos para las microformaciones pueden tener al menos 50, 100, 200, 400, 500, 1000, o 2000 bases de longitud; o 50-100, 100-200, 100-500, 100-1000, 100-2000, o 500-5000 bases de longitud. Como en modalidades adicionales, las sondas de captura para las microformaciones pueden ser de al menos 10, 15, 20, 25, 50, 75, 80, o 100 bases de longitud; o 10-15, 10-20, 10-25, 10-50, 10-75, 10-80, o 20-80 bases de longitud. Las sondas de cADN etiquetadas en forma fluorescente pueden ser generadas a través de incorporación de nucleótidos fluorescentes mediante transcripción inversa de ARN extractado de tejidos de interés. Las sondas de cADN etiquetadas
aplicadas al chip hibridan con especificidad para cada punto de ADN en la formación. Después de un lavado estricto para eliminar las sondas enlazadas en forma no específica, el chip es escaneado mediante microscopía en láser confocal o a través de otro método de detección, tal como una cámara CCD. La cuantificación de hibridación de cada elemento formado permite la evaluación de la abundancia del mARN correspondiente. Con fluorescencia de color doble, las sondas de cADN etiquetadas en forma separada generadas de dos fuentes de ARN, son hibridadas en pares para la formación. La abundancia relativa de las transcripciones de las dos fuentes que corresponde a cada gen específica se determina por lo tanto en forma simultánea. Un protocolo de ejemplo para esto se describe con detalle en el ejemplo 4. La escala miniaturizada de la hibridación produce una evaluación rápida y conveniente del patrón de expresión para grandes números de genes. Dichos métodos se han mostrado tener la sensibilidad requerida para detectar transcripciones raras, las cuales se expresan en una pocas copias por célula, y para detectar en forma reproducible al menos aproximadamente dos veces las diferencias en los niveles de expresión (Schena y asociados, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A. 93 (2): 106-149 (1996)). El análisis de microformación puede llevarse a cabo a través de equipo disponible comercialmente, siguiendo los protocolos del fabricante, tal como utilizando la tecnología
Affymetrix GenChip, tecnología de microformación lllumina o tecnología de microformación de Incyte. El desarrollo de métodos de microformación para análisis de gran escala de la expresión de gen, hace posible buscar en forma sistemática marcadores moleculares de clasificación de cáncer o predicción de resultados en una variedad de tipos de tumor. Aislamiento, Purificación y Amplificación de ARN Los métodos generales para extracción de mARN son conocidos en la técnica y se describen en libro de texto estándar de biología molecular, incluyendo Ausubel y asociados, Current Protocols de Molecular Biology, John Wiley y Sons (1997). Los métodos para extracción de ARN de tejidos incrustados en parafina se describen, por ejemplo, en la Publicación de Rupp y Locker, Lab Invest. 56: A67 (1987), y De Sandres y asociados, BioTechniques 18: 42044 (1995). En particular, el aislamiento de ARN se puede llevar a cabo utilizando un equipo de purificación, conjunto de amortiguador y proteasa de fabricantes comerciales, tales como Qiagen, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por ejemplo, el ARN total de células en cultivo puede aislarse utilizando minicolumns Qiagen RNeasy. Otros equipos de aislamiento de ARN comercialmente disponibles incluyen MasterPure Complete ADN y ARN Purification Kit (EPICENTRE (D, Madison, Wl), y Paraffin Block ARN Isolation Kit (Ambion, Inc.). El ARN total de muestras de tejido se puede aislar utilizando ARN Stat-60 (Tel-
Test). El ARN preparado de tumor puede ser aislado, por ejemplo, mediante centrifugación de gradiente de densidad de cloruro se cesio. Los pasos de un protocolo representativo para perfilar la expresión genética utilizando tejidos fijos, incrustados con parafina como la fuente de ARN, incluyendo aislamiento, purificación de mARN, extensión y amplificación de cebador se proporcionan en varios artículos de revistas publicadas (por ejemplo: T. E. Godfrey y asociados, J. Molec. Diagnostics 2:84-91 (2000); K. Specht y asociados, Am. J. Pathol. 158:419-29 (2001)). En síntesis, un proceso representativo comienza cortando secciones de aproximadamente 10 µ?t? de grosor de muestras de tejido de tumor incrustadas con parafina. El ARN posteriormente es extractado, y la proteína y el ADN son eliminados. Después del análisis de la concentración de ARN, se pueden incluir pasos de reparación y/o amplificación de ARN. Si es necesario, un ARN se transcribe en forma inversa utilizando promotores específicos de gen seguidos de RT-PCR. Finalmente, los datos se analizan para identificar la mejor opción(s) de tratamiento disponibles para el paciente sobre las bases del patrón de expresión de gen característico identificado en la muestra de tumor revisada. Inmunohistoquímica y Proíeómicos Los métodos de inmunohistoquímica también son adecuados para detectar los niveles de expresión de los
marcadores de proliferación de la presente invención. Por lo tanto, los anticuerpos o anti-suero, preferentemente anti-suero policlonal, y más preferentemente anticuerpos monoclonales específicos de cada marcador, se utilizan para detectar la expresión. Los anticuerpos pueden ser detectados mediante etiquetación directa de los propios anticuerpos, por ejemplo, con etiquetas radioactivas, etiquetas fluorescentes, etiquetas de hapteno tales como biotina o una enzima tal como peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina. Como alternativa, se utiliza anticuerpo primario no etiquetado junto con un anticuerpo secundario etiquetado, que comprende anti-suero, anti-suero policlonal o un anticuerpo monoclonal específico del anticuerpo primario. Los protocolos y equipos de inmunohistoquímica son bien conocidos en la técnica y están comercialmente disponibles. Los proteómicos pueden ser utilizados para analizar los polipéptidos presentes en una muestra (por ejemplo, tejido, organismo, o cultivo celular) en un cierto punto de tiempo. En particular, las técnicas proteomicas pueden ser utilizadas para evaluar los cambios globales de expresión de polipéptido en una muestra (también referida como proteómicos de expresión). El análisis proteómico normalmente incluye: (1) separación de polipéptidos individuales en una muestra mediante electroforesis de 2-D (2-D PAGE); (2) identificación de los polipéptidos individuales recuperados de gel, por ejemplo,
mediante espectroscopia de masa o secuenciación N-terminal, y (3) análisis de los datos utilizando bioinformáticas. Los métodos proteómicos son suplementos valiosos de otros métodos de perfilamiento de expresión de gen, y se pueden utilizar, solos o en combinación con otros métodos, para detectar los productos de los marcadores de proliferación de la presente invención. Métodos de Hibridación Utilizando Sondas de Acido Nucleico Selectivas de un Marcador Estos métodos implican enlazar la sonda de ácido nucleico a un soporte, e hibridar bajo condiciones adecuadas con ARN o cADN derivado de la muestra de prueba (Sambrook, J., E Fritsch, E. y T Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual 3o. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (2001)). Estos métodos se puede aplicar a BTM derivado de un tejido de tumor de muestra de fluido. Las preparaciones de ARN o cADN normalmente se etiquetan con una molécula fluorescente o radioactiva que permite la detección y cuantificación. En algunas aplicaciones, el ADN de hibridación puede ser etiquetado con una estructura ramificada, etiquetada en forma fluorescente que aumenta la intensidad de señal (Nolte, F.S., amplificación de señal de ADN ramificado para cuantificación directa de secuencias de ácido nucleico en especímenes clínicos Adv. Clin. Chem. 33, 201-35 (1998)). La etiqueta no hibridada se elimina mediante lavado extenso en soluciones de sal de bajo contenido tal como 0.1 x SSC, 0.5%
SDS antes de cuantificar la cantidad de hibridación mediante detección de fluorescencia o densitometría de imágenes de gel. Los soportes pueden ser sólidos, tal como nylon o membranas de nitrocelulosa, o consistir de microesferas o cuentas que son hibridadas cuando están en suspensión líquida. Para permitir el lavado y purificación, las cuentas pueden ser magnéticas (Haukanes, B-l y Kvam, C, Aplicación de cuentas magnéticas en bioensayos. Bio/Technology 11, 60-63 (1993)) o etiquetadas en forma fluorescente para permitir la citometría de flujo (ver por ejemplo la Publicación de Spiro, A., Lowe, M. y Brown, D., Método a Base de Cuentas para Identificación y Cuantificación Multiplexada de Secuencia de ADN Utilizando Citometría de Flujo Appl. Env. Micro. 66, 4258-4265 (2000)). Una variación de la tecnología de hibridación es el ensayo QuantiGene Plex® (Genospectra , Fremont) que combina un soporte de cuenta fluorescente con amplificación de señal de ADN ramificada. Aún otra variación en tecnología de hibridación es el ensayo Quantikine® mARN (R&D Systems, Minneapolis). La metodología es como se describe en las instrucciones del fabricante. En síntesis, el ensayo utiliza sondas de hibridación de oligonucleótido conjugadas para Digoxigenin. La hibridación se detecta utilizando anticuerpos anti-Digoxigenin acoplados a fosfatasa alcalina en ensayos colorimétricos. Los métodos adicionales son conocidos en la técnica y no necesitan describirse en forma adicional en la presente
invención . Ensayos Inmunológicos Enlazados por Enzimas (ELISA) En síntesis, los ensayos ELISA de emparedado, un anticuerpo policlonal o monoclonal contra el BTM se enlaza en un soporte sólido (Crowther, J. R. The ELISA guidebook. Humana Press: New Jersey (2000); Harlow, E. y Lañe, D., Utilizando anticuerpos: manual de laboratorio. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999)) o cuentas de suspensión. Se conocen otros métodos en la técnica y no necesitan describirse en forma adicional en la presente invención. Los anticuerpos monoclonales pueden ser derivados de hibridoma o seleccionados de bibliotecas de anticuerpos de fago (Hust M. y Dubel S., Vectores de despliegue de fagos para la generación in vitro de fragmentos de anticuerpo humano Methods Mol Biol. 295:71-96 (2005)). Los sitios de enlace no específicos son bloqueados con preparaciones y detergentes de proteína no objetivo. Posteriormente el anticuerpo de captura es incubado con una preparación de orina o tejido que contiene el antígeno BTM. La mezcla se lava antes de que el complejo de anticuerpo/antígeno se incube con un anticuerpo secundario que detecta el BTM superior. El segundo anticuerpo normalmente se conjuga a una molécula fluorescente u otra molécula reportera que puede ya sea ser detectada en una reacción enzimática o con un tercer anticuerpo conjugado para un reportero (Crowther, id). Como alternativa, en ELISAs
directos, la preparación que contiene el BTM puede enlazarse al soporte o cuenta y el antígeno objetivo detectado directamente con un conjugado reportero- anticuerpo (Crowther, Id.). Los métodos para producir anticuerpos monoclonales y anti-suero policlonales son conocidos en la técnica y no necesitan describirse en forma adicional en la presente invención. Inmunodeteccion Los métodos también se pueden utilizar para inmunodeteccion de miembros de la familia de marcadores en suero o plasma de pacientes con cáncer de vejiga tomados antes y después de cirugía para eliminar el tumor, inmunodeteccion de miembros de familia marcador en pacientes con otros cánceres, incluyendo pero sin limitarse a cáncer colorectal, pancreático, de ovario, melanoma, hígado, esofageal, de estómago, endometrial y de cerebro en inmunodeteccion de miembros de familia marcador en orina y heces de pacientes con cáncer de vejiga. Los BTMs también pueden ser detectados en tejidos u orina utilizando otras técnicas de inmunodeteccion estándar tal como inmunomanchado o inmunoprecitación (Harlow, E. y Lañe, D., Utilizando anticuerpos: manual de laboratorio. Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor (1999)). En inmunomanchados, las preparaciones de proteína de tejidos o fluido que contienen BTM son electroforesadas a través de
geles de poliacrilamida bajo condiciones de desnaturalización o sin desnaturalización. Las proteínas posteriormente se transfieren a un soporte de membrana tal como nylon. El BTM posteriormente se hace reaccionar directa o indirectamente con anticuerpos monoclonales o policlonales, tal como se describe para inmunohistoquímica. Como alternativa, en algunas preparaciones, las proteínas pueden ser machadas directamente en membranas sin separación electroforética previa. La señal puede ser cuantificada mediante densitometría. En inmunoprecipitación, se incuba una preparación soluble que contiene BTM, con un anticuerpo monoclonal o policlonal contra el BTM. Posteriormente la reacción se incuba con cuentas inertes elaboradas de agarosa o poliacrilamida con proteína A o proteína G adherida en forma covalente. Las cuentas de proteína A o G interactúan específicamente con los anticuerpos que forman un complejo inmovilizado de anticuerpo-BTM-antígeno enlazado a la cuenta. Después del lavado, el BTM enlazado puede ser detectado y cuantificado mediante inmunomanchado o ELISA. Determinación de Valor de Umbral Para pruebas que utilizan BTMs desactivados ya sea en proporciones o análisis de regresión, los valores de umbral serán derivados de modo que permitan que una muestra sea denominada ya sea positiva o negativa para TCC. Estos valores de umbral podrán ser determinados a través de los análisis de
cohortes de pacientes quienes han sido investigados con respecto a la presencia de TCC. Los valores de umbral pueden variar para diferentes aplicaciones de prueba; por ejemplo, valores de umbral para utilizarse en la prueba en clasificación de población, se determinarán utilizando cohortes de pacientes quienes están libres en gran medida de síntomas urológicos, y estos valores de umbral pueden ser diferentes a los utilizados en pruebas para pacientes quién están bajo vigilancia por recurrencia de TCC, o quienes han sido investigados para la presencia de síntomas urológicos, tales como hematuria. Un valor de umbral puede ser seleccionado para proporcionar un nivel práctico de especificidad de prueba en la instalación clínica requerida; esto es, una especificidad que permite una sensibilidad razonable . sin números excesivos de pacientes que reciben resultados positivos falsos. Esta especificidad puede estar dentro del rango de 80-90%. Un método alternativa para obtener el valor de umbral de prueba es trazar la sensibilidad contra la especificidad para diferentes valores de umbral de prueba (curvas, ROC) posteriormente seleccionar el punto de inflexión de la curva. Como una alternativa a los valores de umbral simples, la prueba puede utilizar intervalos de prueba que proporcionan diferentes grados de probabilidad de presencia de la enfermedad, y los cuales tienen diferentes consecuencias clínicas asociadas con ellas. Por ejemplo, una prueba puede
tener tres intervalos; uno asociado con un alto riesgo (por ejemplo 90%) de la presencia de TCC, un segundo asociado con un bajo riesgo de TCC y un tercero considerado como sospechoso de la enfermedad. El intervalo de "sospechoso" puede estar asociado con una recomendación de una prueba repetida en un período de tiempo definido. Métodos para Detectar Marcadores de Cáncer de Vejiga en Orina En varias modalidades, los ensayos para BTM pueden ser llevados a cabo en forma deseable en muestras de orina. En general, los métodos para ensayar para oligonucleótidos, proteínas y péptidos en estos fluidos son conocidos en la técnica. Sin embargo, para propósitos de ilustración, los niveles de orina de un BTM pueden ser cuantificados utilizando un ensayo inmuno absorbente ensayado por enzimas tipo emparedado (ELISA). Para ensayos de plasma o suero, una alícuota de µ? de una muestra diluida en forma adecuada o BTM estándar diluida en serie y 75 µ? de anticuerpo BTM antihumano conjugado con peroxidasa se agregan a depósitos de una placa de microtitulación. Después de 30 minutos de período de incubación a una temperatura de 30°C, los depósitos se lavan con 0.05% de Tween 20 en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) para eliminar el anticuerpo no enlazado. Los complejos no enlazados de BTM y anticuerpo anti-BTM posteriormente se incuban con un o-fenilenodiamina que
contiene H202 durante 15 minutos a una temperatura de 30°C. La reacción se detiene agregando 1 M H2S04, y la absorbancia en 492 nm se mide con un lector de placa de microtitulación, se podrá apreciar que los anticuerpos anti-BTM pueden ser anticuerpos monoclonales o antisuero policlonal. Debido a que muchas proteínas son ya sea (1) secretadas por células, (2) disociadas de las membranas celulares, (3) perdidas de las células al momento de la muerte celular o (4) contenidas dentro de células desprendidas, se podrá apreciar que los BTMs también pueden detectarse en la orina. Además, el diagnóstico de cáncer de vejiga puede ser determinado midiendo cualquier expresión de BTMs en una muestra, o acumulación de BTMs en una muestra. Los métodos de diagnostico de la técnica anterior incluyen cistoscopia, citología y revisión de células extraídas durante estos procedimientos. Dichos métodos han dependido de la identificación de células de tumor en la orina o en una muestra de cepillo de urotelio, o en otros casos, en especímenes de biopsia de la parte de la vejiga. Estos métodos padecen de varios tipos de errores, incluyendo error de muestreo, errores sin identificación entre observadores y similares. Anticuerpo para Marcadores de Tumor de Vejiga En aspectos adicionales, la presente invención incluye fabricación de anticuerpos contra BTMs. Utilizando los métodos aquí descritos, los BTMs novedosos pueden identificarse
utilizando métodos de microformación y/o qPCR. Una vez que se identifica un marcador putativo, puede ser producido en una cantidad suficiente para ser adecuado para provocar una respuesta inmunológica. En algunos casos, un BTM de longitud total puede ser utilizado, y en otros, un fragmente de péptido de un BTM puede ser suficiente como un inmunógeno. El inmunógeno puede ser inyectado en un huésped adecuado (por ejemplo ratón, conejo, etc., y si se desea un adyuvante, tal como adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund puede ser inyectado para incrementar la respuesta inmune. Se podrá apreciar que la elaboración de anticuerpos es rutina en las artes inmunológicas y no necesita describirse en forma adicional en la presente invención. Como resultado, se pueden producir anticuerpos contra BTMs identificados utilizando los métodos aquí descritos. Aún en modalidades adicionales, los anticuerpos pueden ser elaborado contra la proteína o el centro de la proteína de los marcadores de tumor identificados en la presente invención, o contra una secuencia del oligonucleótido única para un BTM. Aunque ciertas proteínas pueden ser glucosiladas, las variaciones en el patrón de glucosilación pueden, en ciertas circunstancias, conducir a una falta de detección de forma de BTMs que carece de patrones de glusosilación usuales. Por lo tanto, en ciertos aspectos de la presente invención, los inmunogenos BTM pueden incluir BTM desglucosilado o
fragmentos de BTM desglucosilado. La desglucosilación puede lograrse utilizando una o más glucosidasas, conocidas en la técnica. Como alternativa, el cADN BTM puede expresarse en líneas celulares con deficiencia de glucosilación, tal como línea de células procarióticas, incluyendo E. coli' y similares. Los vectores se pueden elaborar teniendo oligonucleótidos que codifican BTM en los mismos. Muchos de dichos vectores pueden estar basados en vectores estándar conocidos en la técnica. Los vectores pueden ser utilizados para transfectar una variedad de líneas celulares para producir líneas de célula que producen BTM, las cuales se pueden utilizar para producir cantidades deseadas de BTM para el desarrollo de anticuerpos específicos u otros reactivos para detección de BTMs o para estandarización de ensayos desarrollados para BTMs. Equipos Con base en los descubrimientos de la presente invención, varios tipos de equipo de prueba pueden ser considerados y producidos. Primero, los equipos pueden ser elaborados de modo que tengan un aparato de detección cargado previamente con una molécula de detección (o "reactivo de captura"). En modalidades para detectar el mARN BTM, dichos aparatos pueden comprender un substrato (por ejemplo, vidrio, silicón, cuarzo, metal, etc) en el cual los oligonucleótidos, en la forma de reactivos de captura que hibridan con el mARN que será detectado, están enlazados. En algunas modalidades, la
detección directa de mARN puede lograrse hibridando mARN (etiquetada con cy3, cy5, radioetiqueta y otra etiqueta) a los oligonucleótidos en el substrato. En otras modalidades, la detección del mARN puede lograrse elaborando primero ADN complementario (cADN) para el mARN deseado. Posteriormente el cADN etiquetado puede ser hibridado para los oligonucleótidos en el substrato y detectado. Los anticuerpos también se pueden utilizar en equipos como reactivos de captura. En algunas modalidades, un substrato (por ejemplo placa de depósitos múltiple) puede tener un reactivo de captura TM específicos, adherido en el mismo. En algunas modalidades, un equipo puede tener un reactivo de bloqueo incluido. Los reactivos de bloqueo pueden ser utilizados para reducir el enlace no específico. Por ejemplo, el enlace de oligonucleótido no específico puede ser reducido utilizando ADN en exceso de cualquier fuente conveniente que no contenga oligonucleótidos BTM, tal como ADN de esperma de salmón. El enlace de anticuerpo no específico puede ser reducido utilizando un exceso de una proteína de bloqueo tal como albúmina de suero. Se podrá apreciar que en la técnica se conocen numerosos métodos para detectar oligonucleótidos y proteína y que se puede utilizar cualquier estrategia que pueda detectar en forma específica moléculas asociadas con BTM y considerarse dentro del alcance de la presente invención. Además de un substrato, el equipo de prueba puede
comprender reactivos de captura (tal como sondas), soluciones de lavado (por ejemplo, SSC, otras sales, amortiguadores, detergentes y similares) así como porciones de detección (por ejemplo, cy3, cy5, radioetiquetas, y similares). Los equipos también pueden incluir instrucciones para utilizarse y un paquete. Proporciones BTM Utilizadas para Detección de Cáncer de Vejiga I En una serie de modalidades, los reactivos para las pruebas del BTM en combinación con BTM LTBDH4 sobre-expresados BTMs, se pueden incorporar en un equipo para las pruebas de orina no fraccionada y sedimentos de célula de orina para detectar cáncer de vejiga. Las muestras de orina pueden ser recolectadas de pacientes diagnosticados con cáncer de vejiga quienes requieren monitoreo para el progreso de la enfermedad o respuesta a tratamiento, individuos con síntomas urológicos incluyendo hematuria microscópica o microscópica o individuos asintomáticos. Para pacientes o individuos que están siendo probados con un equipo que mide los BTMs en orina no fraccionada, aproximadamente 2 mis de la orina puede tomarse para pruebas. Para pruebas en el pelet de la orina, se pueden recolectar >10 mis de orina. Un equipo adecuado incluye: (i) instrucciones de uso e interpretación de resultados, (ii) software para interpretación de múltiples análisis de gen, incluyendo cualquier clasificador de
análisis de regresión o fórmula, (iii) reactivos para la estabilización y purificación de ARN de orina no fraccionada o pelets de orina, (iv) reactivo para la síntesis de cADN incluyendo dNTPs y transcriptasa inversa, y (v) reactivos para la cuantificación den cADN BTM. En una forma, estos reactivos se pueden utilizar para PCR cuantitativo y pueden incluir cebadores de oligonucleótido que abarcan exones específicos, un tercer oligonucleótido etiquetado con una sonda para detección, polimerasa Taq y otros amortiguadores, sales y dNTPs requeridos para PCR. El equipo también puede utilizar otros métodos para detección de transcripciones tales como hibridación directa del BTM ARN con sondas etiquetadas o tecnología de ADN ramificada; y (vi) oligonucleótidos y sondas para la detección de transcripciones de un gen altamente transcrito, tal como actin, que sirve como una medida de control de calidad. Evaluación del Progreso de Cáncer de Vejiga utilizando Proporciones BTM Para evaluar el progreso de tumores de vejiga, las muestras de tejido se obtuvieron mediante biopsia de la pared de la vejiga o se recolectaron muestras de orina con el tiempo de un paciente que tiene cáncer de vejiga. La evaluación de la proporción de BTMs o combinaciones de las mismas se elaboraron para muestras tomadas en diferentes tiempos. Las proporciones BTM dentro de un rango específico son indicativas
de progreso de cáncer de vejiga. Evaluación de Terapia de Cáncer de Vejiga Utilizando Proporciones BT Para evaluar la eficacia de terapia para tumores de vejiga, las muestras de tejido y/u orina se obtuvieron antes de que se inicie el tratamiento. Los niveles de línea de base de uno o más BTMs se determinan, ya que son proporciones de varios BTMs con respecto uno de los otros. Se inicia el tratamiento, y puede incluir cualquier terapia conocida en la técnica, incluyendo cirugía, terapia de radiación o quimioterapia según sea lo adecuado para el tipo y etapa de la enfermedad. Durante el curso de la terapia, las muestras de tejido y/u orina se recolectan y analizan para la presencia y cantidad de BTMs. Las proporciones de varios BTMs se determinan y los resultados se comparan con: (1) los niveles de línea de base de pacientes antes del tratamiento o (2) valores normales obtenidos de una población de individuos que no tienen cáncer de vejiga. Uso de Proporciones BTMI para Monitorear el Progreso de las Terapias TCC Además del rápido diagnóstico y detección temprana de TCC, las proporciones de marcador BTM detectadas en cada tejido, suero u orina se pueden utiliza para monitorear las respuestas de un paciente a la terapia. En estas aplicaciones, se pueden tomar muestras de orina y/o suero en intervalos
después del inicio de quimioterapia, radioterapia o inmunoterapia sistémica, intravesicular o intravascular. Un cambio en la proporción del marcador puede indicar una reducción en el tamaño de tumor, que indica el tratamiento efectivo. El rango de cambio se puede utilizar para anticipar la dosis terapéutica óptica de cada paciente o tratamiento. Uso de Análisis de Regresión BTM Además de las proporciones BTM, se pueden utilizar análisis de regresión o clasificación que incluyen miembros de la familia BTM de expresión alta y baja, para aplicaciones descritas anteriormente. Los marcadores evaluados se seleccionan de genes humanos conocidos. Los genes evaluados son indicados en las figuras 3 y 4. Incluidos en las figuras 3 y 4, se encuentra el nombre del gen, el identificador HUGO, el oligo número MWG, el número de secuencia de referencia de mARN NCBI y el número de referencia de la proteína. Las secuencias de longitud total se pueden encontrar en el sitio http://www. ncbi.nlm. nih.gov/entrez/. EJEMPLOS Los ejemplos aquí descritos son para propósitos de ilustrar modalidades de la presente invención y no pretenden limitar el alcance de la misma. Otras modalidades, métodos y tipos de análisis están dentro del alcance de personas de habilidad ordinaria en las artes de diagnostico molecular y no
necesitan describirse con detalle en la presente invención. Otras modalidades dentro del alcance de la técnica están basadas en las enseñanzas aquí descritas y se consideran como parte de la misma. Métodos Recolección de Tumor Se recolectaron muestras de tumor de vejiga y muestras de urotelio no maligno de especímenes quirúrgicos reseccionados en Kyoto University Hospital, Japón. Recolección de Orina Las muestras de orina de controles no malignos y pacientes con cáncer de vejiga se obtuvieron de Kyoto University Hospital, Japón. Se obtuvieron muestras de control saludables de voluntarios Japoneses (figura 1). Extracción de ARN Los tejidos de tumor fueron homogeneizados en una mezcla de TriReagent: agua (3:1), posteriormente se extractó con cloroformo. El ARN total se purificó posteriormente a partir de la fase acuosa utilizando el procedimiento RNeasy™ (Qiagen). El ARN también se extractó de 16 líneas de célula de cáncer y se reunió para servir como un ARN de referencia. El ARN se extractó de la orina mezclando la muestra de orina con un volumen igual de amortiguador de lisis (5.64M guanidina-HCI , 0.5% sarkosílo, 50 mM de acetato de sodio (pH 6.5) y 1 mM ß-mercaptoetanol; pH ajustado a 7.0 con 1.5M
Hepes pH 8). Debido a las bajas cantidades de ARN en la orina, 7.5 ugs del ARN bacteriano total se agregó a la mezcla de amortiguador de orina/lisis para actuar como un transportador. El ARN total se extractó posteriormente utilizando el procedimiento Trizol y the RNeasy™. Las preparaciones de ARN se purificaron en forma adicional antes de la síntesis de cADN utilizando el equipo de purificación Qiagen QIAquick™ PCR. Se extractó el ARN de la sangre de tres voluntarios saludables llevando a cabo una extracción Trizol/RNeasy ™ en células enriquecidas de sangre total utilizando sedimentación en dextrano al 3.6%. Preparación de Corredera de icroformación Se imprimieron las correderas de vidrio recubiertas con epoxi (MWG Biotech) con -30,000 50 mer de oligonucleótidos (MWG Biotech) utilizando un robot de microformación Gene Machines, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Etiquetación e Hibridación de ARN Se transcribió cADN a partir de 5 pg de ARN total utilizando transcriptasa inversa Superscript II™ (Invitrogen) en reacciones que contienen 5-(3-aminoalil)-2' desoxiuridina-5'-trifosfato. La reacción se desionizó posteriormente en una columna Microcon antes de incubarse con Cy3 o Cy5 en amortiguador de bicarbonato durante 1 hora a temperatura ambiente. Las tintas no incorporadas fueron eliminadas utilizando una columna Qiaquick (Qiagen) y la muestra se
concentró en 15 µ? en un SpeedVac. Posteriormente se mezclaron los cADNs etiquetados con Cy3 y Cy5, con amortiguador Ambion ULTRAhyb™, se desnaturalizaron a una temperatura de 100°C durante 2 minutos y se hibridaron para las correderas de la microformación en cámaras de hibridación a una temperatura de 42°C durante 16 horas. Posteriormente las correderas se lavaron y escanearon dos veces en un escáner Axon 4000A™ en dos ajustes de potencia. Análisis de Microformación de Genes de Marcador de Cáncer El ARN de 53 tumores de vejiga y 20 muestras de tejido de vejiga no maligno ("normal"), se etiquetaron con Cy5 y se hibridaron por duplicado o triplicado con ARN de referencia etiquetado con Cy3. Después de la normalización, el cambio en la expresión en cada uno de los 29,718 genes se estimó posteriormente mediante cambio de doblez y probabilidad estadística. Procedimiento de Normalización Las intensidades de fluorescencia media detectada mediante el software Genepix™ fueron corregidas substrayendo las intensidades del soporte local. Las manchas con una intensidad corregida por fondo menor a cero fueron excluidas. Para facilitar la normalización, se transformaron mediante-log las proporciones de intensidad y las intensidades de mancha general. Las proporciones de intensidad registradas fueron corregidas para tinta e inclinación espacial utilizando regresión
local implementada en el paquete LOCFIT™. Las proporciones de intensidad registradas fueron regresadas en forma simultánea con respecto a la intensidad y ubicación de la mancha general. Los residuos de la regresión local proporcionaron los cambios de doblez registrados corregidos. Para control de calidas, se trazaron proporciones de cada microformación normalizada con respecto a la intensidad y localización de la mancha. Los trazos fueron inspeccionados visualmente en forma subsecuente para cualesquier artefactos restantes. Además, se aplicó un modelo ANOVA para la detección de una inclinación de punta-alfiler. Todos los resultados y parámetros de la normalización se insertaron en una base de datos Postgres para análisis estadístico. Análisis Estadístico Para mejorar la comparación de los cambios de doblez medidos entre formaciones, se escalaron log2 (proporciones) para tener la misma desviación estándar general por formación. Esta estandarización redujo el promedio dentro de la variabilidad de la clase de tejido. Posteriormente se utilizó una prueba - clasificación basada en los cambios de doblez para mejorar la robustez del ruido. Esta prueba consistió en dos pasos: (i) cálculo de la clasificación de cambio de doblez (Rfc) dentro de formaciones y ii) sustracción de la media (Rfc) para el tejido normal de la media (Rfc) para tejido de tumor. La diferencia de ambas clasificaciones medias definen la
clasificación de la clasificación de cambio de doblez. También se llevaron a cabo tres pruebas estadísticas adicionales en datos estandarizados: 1) Dos pruebas-T del estudiante de muestra, 2) la prueba de Wilcoxon y 3) Análisis Estadístico de Microformación (SAM). Los genes desactivados en forma más significativa determinado mediante cada uno de los métodos estadísticos (cambio de doblez de clasificación prueba-t, prueba de Wilcoxon y SAM) fueron determinados como una calificación de clasificación de cada prueba. Todas las calificaciones de la clasificación fueron agregadas posteriormente en una calificación de clasificación sumada. Síntesis de cADN de ARN de orina Se endureció el ARN de orina total para cebadores específicos del gen para cada uno de los marcadores de tumor de vejiga, incubando a una temperatura de 70°C, posteriormente enfriando sobre hielo durante 2 minutos en reacciones de 50 ul que contienes cebadores directos en ?.??µ?/µ?. Cada reacción de cADN contenía ARN endurecido y 4 µ I de amortiguador de transcriptasa inversa 5x Superscript II (Invitrogen, E.U.A.), 2 µ I de 0.1 M DTT (Invitrogen, E.U.A.), 0.5 µ? de RNase (40 ??/µ?), (Invitrogen, E.U.A.), 4 µ? de 10 mM d NTP (Invitrogen, E.U.A.) y 0.5 µ? de transcriptasa inversa Superscript II, (200 U/µ?), (Invitrogen, E.U.A.) en un volumen final de 20 µ?. Las reacciones fueron incubadas a una temperatura de 42°C durante 1 hora, 10 minutos a una temperatura de 70°C y 1 minuto a una
temperatura de 80°C. Las reacciones se limpiaron antes de qPCR con columnas de purificación Qiagen QIAquick PCR (Qiagen, Victoria, Australia) y se almacenaron a una temperatura de -80°C. PCR de Tiempo Real Cuantitativo Se utilizó PCR de tiempo real o cuantitativo (qPCR) para la cuantificación absoluta o relativa del número de copias de plantilla PCR. Se designaron grupos de sonda y cebador Taqman™ utilizando Primer Express V 2.0™ (Applied Biosystems). Cuando fue posible, se incluyeron todas las variantes de división potencial en el amplicón resultante, con preferencia del amplicón proporcionada a las regiones cubiertas por el oligonucleótido de microformación derivado de MWG-Biotech. Las secuencias de cebador y sonda se muestran en la figura 2. Como alternativa, si el gen de objetivo fue representado a través de un ensayo de formación Assay-on-Demand™ (Applied Biosystems) que cubren los amplicones deseados, éstos fueron utilizados. En los ensayos designados locales, se trituró una concentración de cebador utilizando un protocolo de etiquetación verde SYBR y cADN elaborado del ARN de referencia. La amplificación se llevó a cabo en un sistema de detección de secuencia ABI Prism™ 7000 bajo condiciones de ciclado estándar. Cuando se observaron productos de amplificación simples en las curvas de disociación, las curvas estándar fueron generadas sobre un
rango de concentración de 625 dobleces utilizando concentraciones de cebador óptimas y una sonsa Taqman™ de fosfato 5'FAM - 3'TAMRA (Proligo) a una concentración final de 250 nM. Los ensayos que proporciona curvas estándar con coeficientes de regresión en 0.98 se utilizaron en análisis subsecuentes. Los ensayos se llevaron a cabo en placas de 96 depósitos. Cada placa contenía una curva estándar de cADN de referencia, sobre un rango de concentración de 625 veces. Para el qPCR de orina, el ARN total extractado de -0.5 mis de orina no fraccionada se utilizó en cada reacción. Se calculó el ACt (gen objetivo Ct - cADN de referencia promedio Ct) para cada marcador, y se utilizó en proporciones subsecuentes y análisis de regresión o clasificación. Expresión de Marcadores en Sangre La expresión de los marcadores mostrados en las figuras 3 y 4 en sangre total fue determinada en sílico. Las sondas de microformación fueron enlazadas a agrupaciones UniGene a través de los números de accesos GenBank de sus mARNs objetivo, y el perfil de expresión de tejido de UniGene utilizado para determinar el número de etiquetas de secuencia expresadas (ESTs) en bibliotecas de sangre. Únicamente los genes con 0 ó 1 de etiqueta de secuencia expresadas (EST) se muestran en la figura 4. Para confirmar la baja expresión de LTB4DH en sangre total, RT-qPCR se llevó a cabo en ARN total
extractado de sangre total utilizando los cebadores y sondas mostrados en la figura 2. No se observó expresión significativa (resultados no mostrados). Identificación de Marcadores de Cáncer de Vejiga Desactivados Para identificar marcadores desactivados de cáncer de vejiga, llevamos a cabo estudios de microformación en ARN de 53 tumores de vejiga y 20 muestras de tejido de vedija no malignos utilizando el 30,000 chips de oligonucleótido. La figura 3 muestra el análisis estadístico de datos de microformación para 300 genes que muestran desactivación significativa en tejido de cáncer de vejiga comparado con tejido no maligno. La figura 3 incluye el nombre y símbolo del gen HUGO, el número de secuencias de referencia de proteína, el número de secuencia de referencia de mARN NCBI, el número de oligonucleótido de sonda MWG Biotech, el cambio de doblez medio en la expresión genética entre el tejido de tumor y no maligno, los resultados de una prueba-t del estudiante no ajustada original, los resultados de la prueba Wilcoxon de 2 muestras, los resultados se la prueba SAM y la calificación de clasificación sumada. Identificación de Marcadores de Tumor de Vejiga Sub-expresados Preferidos para Utilizarse en Pruebas de Orina para Cáncer de Vejiga Debido a que la hematuria ordinaria es una co-ocurrencia
común con cáncer de vejiga, es una ventaja que los marcadores con cáncer de vejiga no sean elevados significativamente en la sangre total. Además, debido a que los marcadores desactivados están siendo utilizados en proporciones, análisis de regresión o clasificación, es una ventaja que se encuentren en números de copias suficientemente altas tanto en células de tumor como en células de vejiga no malignas para permitir una detección confiable en la orina. Para identificar marcadores adecuados, clasificamos los genes de la figura 3 para un sub-grupo que tuvo poca o nada de representación en bibliotecas EST de sangre, y tuvo más de la expresión promedio en tejido no maligno. Se estimó la expresión media clasificando los 30,000 oligonucleótidos en la formación a través de su intensidad media en las muestras analizadas en el estudio de microformación. Los marcadores que cumplen con los criterios se muestran en la figura 4. La figura 4 incluye el nombre y símbolo del gen HUGO, el número de secuencia de referencia de proteína, el número de secuencia de referencia de mARN NCBI, el cambio de doblez promedio, la calificación de clasificación, la clasificación media de la intensidad de punto de la microformación en tejido de tumor y tejido no maligno, y el número de ESTs presentes en bibliotecas EST de sangre. A desactivación observada en los datos de formación se validó mediante qPCR para tres genes mostrados en la figura 4, LTB4DH, BAG1 y FLJ21511. Estos genes fueron probados en
ARN total de 10 muestras de tumor y 10 muestras no malignas. LTB4DH, BAG1 y FLJ21511 mostraron una desactivación promedio en tumores de vejiga en comparación con tejido no maligno de vejiga, de 2.5 veces, 1.4 veces y 6.1 veces, respectivamente en estas muestras. Análisis qPC de Orina utilizando LTB4DH La orina de pacientes TCC y controles con condiciones urológicas no malignas se recolectó ya sea mediante vaciado o cateterización. El ARN total fue extraído de orina vaciada de 42 controles y la orina vaciada o cateterizada de 37 pacientes TCC y se utilizó en RT-PCR cuantitativo que utiliza cebadores y sondas para LTB4DH y tres marcadores sobre-expresados, IGFBP5, MDK y HoxA13. Las proporciones ACt fueron determinadas para IGFBP5/LTB4DH, MDK/LTB4DH y HoxA13/LTB4DH . Estos datos se ilustran a través de los trazos de cuadro en la figura 5, los cuales muestran una diferencia clara en la dispersión de datos entre las muestras de orina de controles y pacientes TCC para cada una de las tres pruebas. La prueba mas precisa fue IGFBP5/LTB4DH, la cual demostró sensibilidad y especificidad del 87% y 88% en este cohorte de muestra, respectivamente (figura 6a). Para ilustrar la correspondencia entre sensibilidad y especificidad para cada una de estas pruebas, las curvas ROC se muestran en la figura 7. Las áreas debajo de la curva para IGFBP5/LTB4DH, MDK/LTB4DH y HoxA13/LTB4DH son 0.9223, 0.9199, y 0.7497,
respectivamente. Estas áreas que miden la precisión de la prueba, indican que las tres proporciones con LTB4DH son pruebas útiles, en particular IGFBP5/LTB4DH y MDK/LTB4DH. Para incrementar la sensibilidad y especificidad de la detección TCC, las combinaciones de dos pruebas fueron utilizadas. Las sensibilidades y especificidades óptimas de estas combinaciones de prueba se muestran en la figura 7. Las figuras 8a a 8f muestran la separación de datos en un espacio bidimensional para cada una de las tres pruebas utilizando LTB4DH y BAG1. Estos datos muestran que las combinaciones de dos o more pruebas que incluyen cualquiera de los BTMs desactivados, LTB4DH o BAG1, tienen la capacidad de lograr sensibilidades y especificidades de alrededor del 90%. Además, debido a que estas pruebas están midiendo signaturas de expresión de gen simple y no niveles absolutos de marcadores, serán robustas a variaciones en concentración de orina. Para demostrar la robustez de las pruebas que implican proporciones con LTB4DH a concentración de orina, los niveles de IGFBP5 sólo (ACt) y IGFBP5/LTB4DH fueron trazados como una función de la concentración de orina (figuras 9a y 9b) y las líneas indicativas de las gráficas ajustadas a los datos. Se puede apreciar que para ambas de las muestras de orina de controles no malignos y pacientes con TCC, existe una disminución en el IGFBP5 ACt con una concentración de orina en incremento que está ausente en la proporción
IGFBP5/LTB4DH. El efecto es más pronunciado con las muestras no malignas debido a la ausencia de otras influencias tales como tamaño de tumor y heterogeneidad de tumor en la expresión de IGFBP5 y LTB4DH. En algunos casos, cuando se utilizan marcadores simples en ensayo de cáncer de vejiga, el método de recolección de muestra de orina puede afectar la cantidad de marcador detectada debido a las variaciones en el número de células de vejiga exfoliadas recolectadas. Esta inclinación puede conducir a resultados positivos falsos o negativos falsos en una pequeña proporción de muestras. El uso de proporciones que incluyen LTB4DH u otros genes de expresión inferir, deben proporcionar un método para compensar diferentes métodos. Para probar esta hipótesis, las muestras recolectadas de pacientes TCC ya sea mediante vaciado simple (nueve muestras) o cateterización (28 muestras) fueron probadas para la presencia de marcadores de TCC y LTB4DH. El análisis de los marcadores TCC solo mostró que las muestras de vaciado fueron representadas en forma más pesada en el extremo inferior del rango de datos (Ct superior) en forma consistente con un número promedio inferior de células exfoliadas en estas muestras en comparación con las muestras cateterizadas. Esto se ilustra en los trazos de dispersión auto-auto para IGFBP5, MDK y HoxA13 en las figuras 10a a 10c. En contraste, cuando las proporciones entre estos marcadores y LTB4DH se calculan, las muestras vaciadas y
cateterizadas fueron dispersadas sobre rangos similares de proporciones Ct (figuras 10d a 10f), que ilustra que el cálculo de la asignatura de la expresión de gen entre marcadores de expresión alta y marcadores de expresión baja, tales como LTB4DH, compensa las variaciones en los niveles de marcador introducidos mediante diferentes metodologías de muestreo de orina. Las muestras de orina de pacientes con tumores de grado bajo con frecuencia están en la línea de borde y su acumulación de BTMs debido a la presencia únicamente de pequeños números de células exfoliadas en estas muestras. Estas muestras por consiguiente están en alto riesgo de ser clasificadas en forma incorrecta, debido a las variaciones en el método de muestreo o concentración de orina. La utilidad de las proporciones de expresión de gen que incorporan genes desactivados para la detección de TCC por consiguiente es probable que sean pronunciadas cuando se apliquen a la detección de TCC de grado bajo. Para demostrar este efecto, se vacío un cohorte de 43 muestras de orina de pacientes con TCC de grado bajo y 123 controles fueron probados con los marcadores IGFBP5, HoxA13 y LTB4DH. Las características clínicas de cohorte se resumen en la figura 13. Los datos qPCR de IGFBP5 y HoxA13 son analizados solos y en proporciones con LTB4DH utilizando el área bajo la curva ROC, como una medida de precisión de la
prueba (paquete de estadísticas STATA). Los resultados se resumen en la figura 14. Utilizando el marcador IGFBP5, LTB4DH incrementó la precisión de detección de Ta TCCs de etapa de grado bajo (grado 1-2) en un 9% y TCCs de grado bajo de cualquier etapa, en un 8%. La precisión de las pruebas HoXA13 de Ta TCCs de etapa de grado bajo, incrementó en un 3%. Análisis de Discriminación Lineal de Datos qPCR Utilizando LTB4DH El análisis de discriminación lineal (LDA) es una técnica estadística (Fisher R.A. "El Uso de Múltiples Medidas en Problemas Taxonómicos", Annals de Eugenios 7 179 (1936)) en donde se genera una combinación lineal de variables, de modo que exista una máxima separación entre dos o más grupos. Esta combinación de variable lineal es denominada el "discriminante lineal", el cual es una función lineal de las variantes de entrada que separa en forma máxima las clases del conjunto de datos. La capacidad de LDA (o cualquier otra técnica de clasificación para caracterizar un conjunto de datos en particular, tal como datos qPCR, se puede probar utilizando una validación cruzada. En este método, se utiliza parte del conjunto de datos para generar un clasificador, y se utiliza parte del conjunto de datos para medir la efectividad de dicho clasificador. La división del conjunto de datos en grupos de capacitación y pruebas, puede repetirse varias veces (generando cada vez un nuevo
clasificador). En la validación cruzada de doblez-k, el conjunto de datos es dividido tipo k, y cada sub-conjunto es utilizado como el conjunto de prueba en una de las vueltas k de la capacitación y validación. Esto puede ser extendido para dejar fuera una validación cruzada (LOOCV), cuando cada muestra es clasificada de acuerdo con un clasificador generado de las muestras restantes en el conjunto de datos ("dejando uno afuera"; dejando fuera la muestra que está siendo probada). Se utilizaron LDA y LOOCV para ilustrar la utilidad de BTM, LTB4DH, desactivado en la mejoría del diagnóstico de TCC. qPCR se llevó a cabo primero en el cohorte de control y las muestras de orina TCC descritas en la figura 13, las cuales se suplementaron con 3 tumores adicionales de grado 30 ( (5 > etapa 1, 13 =etapa 1, 4 = Tis, y 8 = Ta). Las combinaciones de los seis genes LTB4DH, MDK, IGFBP5, HOXA13, TOP2a y CDC2 fueron probadas con respecto al desempeño del clasificador, tal como se juzga mediante LOOCV. Se utilizó la probabilidad posterior (ya que la muestra "dejada afuera" fue una muestra TCC) para generar curvas ROC que utilizan el paquete ROCR del ambiente de programación estadístico R. La sensibilidad del clasificador para una especificidad determinada se obtuvo mediante referencia a la curva ROC adecuada. La sensibilidad de detección de TCC utilizando combinaciones de BTMs desactivados con y sin LTB4DH, se determinó en una especificidad del 85%. Los resultados de este
análisis se muestran en la figura 15. Se puede apreciar que la adición de LTB4DH a ensayos que incluyen combinaciones de los BTMs MDK, IGFBP5, Top2a, cdc2 y HoxA13 activados, incrementó la sensibilidad total en un 1 a 2% y la sensibilidad de detección de los tumores Etapa Ta, tumores grado 1-2 y tumores grado 3 en un 3%. Cuando se hace referencia en la descripción anterior a enteros o componentes que tienen equivalentes conocidos, dichos equivalentes son incorporados en la presente invención como si fueran establecidos en forma individual. Aunque la presente invención ha sido escrita a manera de ejemplo y con referencia a posibles modalidades de la misma, se podrá apreciar que se pueden realizar mejorías y/o modificaciones sin apartarse del alcance o del espíritu de la misma. APLICABILIDAD INDUSTRIAL Los métodos para detectar miembros de la familia BTM incluyen detección de ácidos nucleicos proteínas y péptidos, utilizando métodos de microformación y/o PCR de tiempo real. Las composiciones y métodos de la presente invención son útiles en diagnósticos de una enfermedad, evaluación de eficacia de una terapia y para producir reactivos y equipos de prueba adecuados para medio de expresión de miembros de la familia BTM .