KR101289454B1

KR101289454B1 - 소세포폐암 및 비소세포폐암 진단 마커로서의 보체 ｃ９

Info

Publication number: KR101289454B1
Application number: KR1020100137147A
Authority: KR
Inventors: 조제열
Original assignee: (주) 프로탄바이오
Priority date: 2009-12-28
Filing date: 2010-12-28
Publication date: 2013-07-24
Also published as: KR20110076830A

Abstract

본 발명은 암 특이적 바이오 마커, 보체 C9에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 보체 C9의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 소세포폐암 또는 비소세포폐암 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 마커의 검출 방법 및 상기 마커를 이용한 소세포폐암 또는 비소세포폐암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

소세포폐암 및 비소세포폐암 진단 마커로서의 보체 Ｃ９ {Complement C9 as markers for the diagnosis of small cell lung cancer and non-small cell lung cancer}

본 발명은 암에 특이적인 바이오 마커 보체 C9(Complement Component 9)에 관한 것으로, 보체 C9의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 소세포폐암 또는 비소세포폐암 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 키트, 상기 마커의 검출 방법 및 상기 마커를 이용한 소세포폐암 또는 비소세포폐암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

우리나라 암(악성신생물) 사망자 수는 2002년 우리나라 총 사망자 246,515명(조사망률 인구 10만 명당 512명) 가운데 25.5%(남성 사망자의 29.6%, 여성 사망자의 20.5%)인 62,887명으로 암으로 인한 사망(사망률 인구 10만 명당 130.7명)이 사망원인 1위를 차지하고 있다. 암 사망순위는 폐암, 위암, 간암, 대장암 및 췌장암 순으로, 이들 5대 암에 의한 사망이 전체 암 사망의 약 70%를 차지하고 있다. 또한 남성에 있어 주요 암 사망원인은 폐암, 위암, 간암 및 대장암 등으로 이들 4대 암에 의한 사망자 수(28,147명)가 전체 남성 암 사망자 수(40,177명)의 70%를 차지하고 있으며, 여성에 있어 주요 암 사망원인은 위암, 폐암, 간암, 대장암 및 췌장암 등으로 이들 5대 암에 의한 사망자 수(13,630명)가 전체 여성 암 사망자 수(22,710명)의 60%를 차지하고 있다.

이러한 암의 종류는 현재까지 밝혀진 것만 해도 수십 종에 이르며, 주로 발병 조직의 위치에 따라 구분된다. 암은 성장속도가 매우 빠르고, 주변 조직에 침윤하면서 전이 (metastasis)가 일어나 생명을 위협하게 된다. 이러한 암의 종류로는 뇌척수종양, 두경부암, 폐암, 유방암, 흉선종, 식도암, 취암, 대장암, 간암, 췌장암, 담도암, 신장암, 방광암, 전립선암, 고환암, 생식세포종, 난소암, 자궁 경부암, 자궁 내막암, 림프종, 급성 백혈병, 만성 백혈병, 다발성 골수종, 육종, 악성 흑색종 및 피부암등이 있다. 또한 이러한 암의 발병 기전 또는 형태에 따라 다른 분류 체계에 의해 구분되기도 한다.

특히 폐암은 19세기까지만해도 드문 질환이었으나, 20세기 들어 흡연이 보편화되면서 급격히 증가하기 시작하여 우리나라에서도 폐암의 발생이 가파르게 상승하고 있는 추세이다. 또한 폐암은 다른 암에 비해 치료가 잘 되지 않아, 발병률은 1위가 아니나, 사망자는 암 환자 중 가장 많은 것으로 알려져 있다.

암세포가 어떠한 경로로 어떻게 생기게 되는가 하는 것은 아직 확실히 밝혀지지는 않고 있으나, 정상세포의 증식조절의 기능을 가진 유전자의 변형에 의해, 증식조절이 되지 않는 세포가 생겨 암이 발생하는 것으로 보는 것이 일반적인 견해이다. 이러한 암은 그 진행 정도에 따라, 암세포가 점막 내에 국한 되어있는 상태를 조기암으로 분류하고 있는데, 다양한 암에 있어, 조기암 상태에서 발견된 환자의 치료의 예후는 비교적 좋은 것으로 나타난다. 따라서 암의 조기 진단 및 치료는 암의 사망률을 낮추고, 암의 치료비용을 낮추는데 기여할 것으로 평가된다. 그러나 암은 많은 경우에 있어서 초기에는 증상이 없는 경우가 대부분이며, 있다고 하더라도 경미하여 약간의 소화불량이나 상복부 불편감을 느끼는 정도이므로 대부분의 사람들이 이를 간과하여 암의 사망률을 높이는 원인이 되고 있다.

현재까지의 암의 검사수단은 물리적인 것이 대부분이다. 그 예로 위장 X-선 촬영으로 이중조영법, 압박촬영법 또는 점막촬영법 등이 있고, 내시경을 사용하여 내부 장기를 직접 육안으로 확인함으로써, X선 검사에서 나타나지 않는 아주 작은 병변까지 발견할 수 있을 뿐 아니라 암이 의심스러운 장소에서 직접 조직검사를 시행할 수도 있어, 그 진단률을 높이고 있다. 하지만 이 방법은 위생상의 문제와 검사가 진행되는 동안 환자로 하여금 고통을 감수해야 하는 단점이 있다.

또한, 현재까지의 진행되고 있는 암의 치료는 대부분 수술로써 병소를 절제해 내는 것이며, 특히 완치를 목표로 하는 경우 외과적인 절제방법이 유일하다. 이러한 외과적 절제에 있어, 완치를 목표로 하는 수술에서는 가능한 한 넓은 범위를 포함하여 절제하는 것이 원칙이나 수술 후 광범위한 절제로 인한 후유증을 고려하여 그 절제 범위를 정하기도 한다. 다만 이러한 경우에도 암이 다른 장기에 전이되었을 경우에는 근치수술이 불가능하며, 따라서 이때에는 항암제투여 등 다른 방법을 택하게 되는데 현재까지 시판되고 있는 항암제는 일시적인 증상의 완화나 절제술 후 재발의 억제와 생존기간을 연장하는 일시적 효과만 있을 뿐, 근본적인 암의 치료에 있어서는 한계가 있고, 항암제 투여에 따른 부작용 및 경제적 부담으로 환자에게 이중적 고통을 주기도 한다.

따라서, 암을 치료하기 위해서는, 치료 이전의 단계에서 높은 민감도와 특이도를 가진 암의 진단 방법의 개발이 무엇보다 중요하며, 이러한 진단은 암의 초기에 발견될 수 있는 것이어야 한다. 이러한 암의 발병여부 및 진행단계의 정확한 판별이 가능하게 하는 암의 진단제 및 외과적 절제술이나 항암제의 단점을 보완한 치료제의 개발을 위한 바이오 마커의 선별 및 진단 마커를 측정하는 제제의 개발은 난치병인 암을 정복하는 필수 불가결한 수단이라 할수 있다.

이에, 본 발명자들은 암을 효과적으로 진단할 수 있는 바이오 마커를 개발하고자 예의 노력한 결과, 암 조직 뿐 아니라, 혈청에서도 검출이 가능하고, 민감도 및 특이도 또한 높은 수준을 유지하는 바이오 마커를 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 보체 C9 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 마커 보체 C9을 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 마커 보체 C9을 이용하여 암 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 보체 C9(Complement component 9)의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 암의 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 암 진단 마커는 정상 위 조직의 세포에 비하여, 암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 보체 C9 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다.

보체(complement)란 생체 내에서 면역작용에 관여하는 20여종의 단백질로 구성된 단백질 복합체로서, 크게 C1(component 1) 내지 C9(component 9)이라 불리는 소단위체로 구성되어 있다. 이러한 보체들은 보체 고정(complement fixation)에 의해, 항원-항체 복합체가 생산된 세균의 세포막에 결합하여 세포 용해(cell lysis)를 일으키고, 항원-항체 복합체에 보체가 결합하여 식세포(중성 백혈구 또는 대식세포 등)의 작용을 촉진시키는 옵소니제이션(opsonization)을 수행하는 것으로 알려져 있다. 본 발명은 이처럼 면역반응에 관여하는 것으로 알려져 있는 보체의 구성 성분 중 하나인 C9의 발현양상에 따라 암을 진단할 수 있는 마커용 조성물에 대한 것이다. 보체를 구성하는 여러 구성 요소 중 일부에 대해서는 암의 발병 및 진행에 따라 그 발현이 증가한다고 알려져 있었으나, 보체 C9에 대해서는 알려진 바 없다. 이에, 본 발명자들은 보체 C9가 다양한 암에 대해 마커로 작용할 수 있음을 밝혔으며, 특히 편평상피세포암종에서 그 발현이 특이적으로 증가하는 것으로 확인하였다(도 10). 상기와 같은 본 발명자들의 실험 결과에 따라, 바람직하게 본 발명의 보체 C9 마커는 폐암, 유방암, 간암, 위암, 신장암 및 자궁암의 진단이 가능하며, 보다 바람직하게 폐암의 진단 마커로 이용할 수 있다. 더욱 바람직하게 본 발명의 마커는 소세포폐암 및 폐의 편평상피세포암의 진단 마커로 사용가능하다. 아울러 본 발명의 암 마커는 암 조직에 있어서도 그 발현이 증가하나, 보다 바람직하게는 혈청에서 그 발현 수준이 유의적으로 증가함으로 확인하였는바, 개체에 침습적인 진단 방법을 사용하지 않고도 효과적으로 암의 발병 또는 전이 여부를 확인할 수 있다.

폐에서 기원하는 악성 종양인 폐암은 그 조직형태에 따라 크게 소세포폐암(small cell lung cancer)와 비소세포 폐암(non-mall cell lung cancer)으로 구분된다. 상기와 같은 구분은 비록 소세포폐암이 발병 조직의 위치에 의해 폐암의 일부로 구분되기는 하나, 다른 폐암과는 임상 경과, 치료법 및 예후 면에서 확연히 구분되는 특징이 있어 별개의 암으로 구분하고 있다. 한편 비소세포폐암은 조직형에 따라 선암, 편평상피세포암, 대세포암으로 나뉜다.

구체적으로 소세포폐암은 비소세포암과는 달리 대부분 진단 당시 수술적 절제가 어려울 정도로 진행되어 있는 경우가 많으며, 급속히 성장하여 전신 전이를 잘하나, 화학요법이나 방사선 치료에 잘 반응하는 것으로 알려져 있다. 소세포폐암은 악성도가 강하며, 발견 당시 림프관이나 혈액 순환을 통하여 다른 장기, 반대편 폐, 종격동으로 전이되어 있는 상태로 발견되는 경우가 많다. 주로 기도(기관지나 세기관지)에서 처음 발병하는 것으로 알져져 있다. 대체적으로 종괴가 크며 회백색을 띠고 기관지벽을 따라 증식하며, 주요 전이 장기로는 뇌, 간, 뼈, 폐, 부신, 신장 등의 순서로 전이되는 것으로 알려져 있다.

한편, 비소세포폐암은 상술한 바와 같이 선암, 편평상피세포암(squamous cell acrcinoma), 선암(adenocarcinoma) 및 대세포암(large-cell carcinoma)로 나뉘고, 편평상피세포암은 주로 폐 중심부에서 발견되며, 남성에게 흔하고, 흡연과 관련이 많은 것으로 알려져 있다. 임상증상으로서 편평상피세포암은 주로 기관지 내강으로 자라 기관지를 막음으로써 나타나게 된다. 이에 반해 선암은 폐말초 부위에서 주로 발생하고, 여성 또는 비흡연자에게서도 잘 발생하며, 크기가 작아도 전이가 되어 있는 경우가 많다. 선암은 최근 그 발생 빈도가 증가하는 추세에 있다. 마지막으로 대세포암은 폐암의 4 내지 10% 정도로 발생하는 암의 종류로서 폐표면 근처(폐 말초)에서 주로 발생하고, 절반 가량은 큰 기관지에서 발생한다. 세포 크기가 대체적으로 크며, 그 중 일부는 빠르게 증식 및 전이되는 경향이 있어 다른 비소세포폐암에 비해 예후가 나쁜 것로 알려져 있다.

본 발명의 보체 C9을 포함하는 암 진단 마커는 상기 폐암 전반적으로 높은 발현을 나타내는 것으로 보아 대부분의 폐암에 있어서 진단이 가능함을 확인하였으며, 그 중, 특히 소세포폐암 및 편평상피세포암에 대해 민감도 및 특이도가 높은 진단 결과를 나타냄을 확인하였다.

보다 상세하게 본 발명자는 다음과 같은 입증을 통하여 보체 C9이 암 진단을 위한 마커로 이용될 수 있음을 규명하였다.

구체적으로, 혈청 시료를 수집하여, 혈청에 다량으로 존재하고 있는 알부민(albumin) 및 IgG를 제거하고, 나머지 혈청 단백질 중 암에서 특이적으로 발현이 증가하는 단백질을 동정하였다. 이후 퓨코실화된 당단백질을 분리하고, 전기영동에 의해 분리된 당단백질들은 트립신(trypsin)을 이용하여 펩타이드로 절단하였다. 절단 후, 펩타이드 질량 분석 및 단백질 동정을 수행하였고 그 결과 암에서 특이적으로 발현이 증가하는 단백질로 본 발명의 보체 C9을 동정하기에 이르렀다(도 1).

본 발명에서 용어, "보체 C9의 발현수준을 측정하는 제제" 란 상기와 같이 암 세포에서 발현이 증가하는 마커인 보체 C9의 발현 수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 바람직하게는 마커에 특이적인 항체, 프라이머 또는 프로브를 말한다.

보체 C9의 발현 수준은 보체 C9 유전자의 mRNA 또는 유전자에 의해 코딩되는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 알 수 있고, 상기 발현 수준은 하나의 유전자 단독으로 또는 어느 하나 이상의 수준을 측정함으로써 알 수 있다. 본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 암 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블럿팅(Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 보체 C9 유전자의 핵산 서열은 NC_000005.9의 핵산 서열 또는 NM_001737.3의 mRNA 서열 등으로 알려져 있으므로, 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 보체 C9 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프로브" 란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 보체 C9 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 암 진단 마커 검출용 조성물은 보체 C9 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다.

본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

단백질 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 항체이다. 본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커인 보체 C9에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수 항체도 포함된다.

본 발명의 암 진단 마커의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 암 진단 마커인 보체 C9의 발현 수준을 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트에는 암 진단 마커의 발현 수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 보체 C9의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한 정량 대조구로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단용 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

또 다른 구체적인 일례로서, 본 발명에서 보체 C9의 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여 환자의 시료로부터보체 C9의 발현 수준을 정상 세포의 발현 수준과 비교하여 암 마커 보체 C9을 검출하는 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로는, 유전자의 발현 수준을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.

본 발명에서 용어 환자의 시료란 암 마커 유전자인 보체 C9의 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 유전자 발현 수준을 암 의심환자에서의 유전자 발현 수준과 비교함으로써 암 의심 환자의 실제 암 환자 여부를 진단할 수 있다. 즉, 암으로 추정되는 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하고, 정상 세포로부터 본 발명의 마커의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 본 발명의 마커의 발현 수준이 정상 세포의 것보다 암으로 추정되는 세포 유래에서 더 많이 발현되면 암으로 추정되는 세포를 암으로 예측할 수 있는 것이다.

mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블럿팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 암 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 암 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 암 의심 환자의 실제 암 발병 여부를 진단할 수 있다.

mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 암 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 칩을 이용하는 것이다.

상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 암 진단 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 암 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다.

한편, DNA 칩은 상기 암 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 암의 발병 여부를 판독할 수 있다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블럿, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 암 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 암 의심 환자의 실제 암 발병 여부를 진단할 수 있다.

바람직하게 상기 항체-항원 반응을 통한 단백질 마커 규명은, 그 이전 단계에서 당화된 단백질을 우선적으로 분리 및 선별한 이후에 수행될 수 있다. 단백질은 전사후 번역(post transcriptional modification) 과정에서 단백질 고유의 특징에 따라 단백질에 따라 당화(glycosylation)가 진행되며 일부 암의 경우, 이러한 당화 양상이 정상 개체의 그것과 달라짐으로써 일어날 수 있다. 따라서 본 발명자들은 암과 단백질의 당화의 관계에 착안하여, 상기 항체-항원 반응을 수행하기 이전 단계에서 당화된 단백질을 우선적으로 분리하였으며, 특히 당화 중 퓨코실화(fucosylation) 여부에 따라 퓨코실화가 진행된 단백질을 대상으로 암 마커를 동정하였다. 이러한 당화 진행 여부에 따른 단백질 동정 방법은 당업계에서 수행되는 통상적인 방법이 제한 없이 사용될 수 있고, 바람직한 본 발명의 실시예에서는 퓨코실화된 당단백질을 분리하기 위하여 렉틴 블럿을 수행하였다(실시예 3).

본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄ W(CN)₈ , [Os(bpy) ₃ ] ²⁺ ,[RU(bpy) ₃] ²⁺, [MO(CN) ₈ ] ^4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I , ¹⁸⁶Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블럿을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀룰로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 암 발병 여부를 확인할 수 있다. 상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역조직 염색을 실시하는 것이다. 정상 조직 및 암으로 의심되는 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.

또한, 바람직하게는, 상기 암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 투여 후 보체 C9 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 것을 포함하는, 암 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

구체적으로, 암 치료 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 보체 C9의 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 암 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. 보체 C9의 농도를 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질을 암의 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 암 치료 후보 물질의 부재 하에 암 세포에서의 본 발명의 마커 보체 C9의 발현 수준을 측정하고, 또한 암 치료 후보 물질의 존재 하에서 본 발명의 마커 보체 C9의 발현 수준을 측정하여 양자를 비교한 후, 암 치료 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 마커의 발현 수준이 암 치료 후보 물질의 부재 하에서의 마커 발현 수준보다 감소시키는 물질을 암의 치료제로 예측할 수 있는 것이다.

본 발명은 암의 전이 및 예후를 판단할 수 있는 진단 마커를 발굴하고 제공함으로써, 암의 치료 및 예후관리에 유용한 자료의 지표로 사용될 수 있는 효과를 기대한다. 본 발명에 따른 암 마커 보체 C9을 사용하면 암의 유무를 정확하고 손쉽게 측정할 수 있으며, 암 특이적 항암제 개발연구에 있어 특정 타겟으로 활용할 수 있고, 나아가 암의 종양 형성의 연구에 활용될 수 있고, 암의 조기 진단에 큰 기여를 할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 마커 단백질을 검출하기 위한 전체 스킴을 나타낸 모식도이다.
도 2는 정상인 및 소세포폐암 환자의 혈청(레인 1), 혈청 내 알부민 및 IgG(레인 2) 및 알부민 및 IgG가 제거된 혈청 시료(레인 3)의 단백질을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 당화의 한 종류인 퓨코실화를 나타낸 개념도이다.
도 4는 렉틴-전기영동(Lectine-electrophoresis)을 통한 L3 단편(fraction)의 퓨코실화된 AFP(fucosylated AFP)를 동정한 그림이다.
도 5는 간암(Hepatocellular carcinoma)에서의 비정상적 퓨코실화(aberrant fucosylation)의 발생기전(J.Biochem. 2008. 143. 725-729)을 나타낸 모식도이다.
도 6은 AAL 렉틴과 결합한 퓨코실화된 당단백질들을 분리하는 과정을 나타낸 모식도이다.
도 7은 퓨코실화된 당단백질의 분리 여부 및 발현 정도를 확인하기 위한 과정을 나타낸 모식도이다.
도 8은 시료에 존재하는 퓨코실화된 당단백질을 확인하기 위한 렉틴 블럿 분석 결과를 나타내는 사진이다.
도 9는 소세포폐암 환자와 건강인의 혈청에서 보체 C9 단백질의 발현 정도를 웨스턴 블럿으로 확인한 결과로서, 각 그룹 당 38명으로 하여 확인한 결과를 나타낸다.
도 10은 폐암 중 편평상피세포암 환자의 보체 C9 발현 양상을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 11은 폐암 중 선암 환자의 시료에서 보체 C9 발현 양상을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 12는 정상인, 선암 환자, 소세포폐암 환자 및 편평상피세포암 환자에서 발현된 C9 보체의 양을 나타내는 그래프이다.
도 13은 단백질 칩 어레이에 정상인 및 편평상피세포암 환자의 시료를 가한 결과를 나타낸다.
도 14는 정상인, 소세포폐암 환자, 편평상피세포암 환자, 유방암 환자, 간암 환자, 위암 환자, 신장암 환자 및 난소암 환자의 시료로부터 보체 C9 보체의 발현 양상을 웨스턴 블럿으로 확인한 결과이다.
도 15는 샌드위치 엘라이자(sandwich ELISA) 기법을 응용한, 하이브리드 렉틴 엘라이자 실험을 수행하는 과정을 나타내는 모식도이다.
도 16은 정상인(HEC), 선 암 환자(ADC), 소세포폐암 환자(SCLC) 및 편평상피세포암 환자(SQLC)의 각 시료에 포함된 C9 보체의 퓨코실화 정도를 나타내는 그래프이다.
도 17은 정상인(HEC), 유방암 환자(BC), 간암 환자(HCC), 위암 환자(STC) 및 편평상피세포암 환자(SQLC)의 각 시료에 포함된 C9 보체의 퓨코실화 정도를 나타내는 그래프이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 혈청 시료의 수집

서울삼성병원으로부터 13인의 정상인(normal) 및 13인의 폐암 환자(cancer)의 혈청 검체를 제공받았다. 제공된 시료를 사용할 때까지 -70℃에 보관하였다.

실시예 2: 알부민( albumin ) 및 IgG 제거

혈액 내에는 많은 종류의 단백질이 존재하며, 이들은 다양한 농도 분포로 존재한다. 예를 들어 가장 농도가 높은 단백질인 알부민은 약 30-40 mg/ml의 고농도로 존재하고, 이는 혈액 내 단백질의 절반을 차지하고, IgG(Immunoglobulin G) 역시 혈청내에 고농도로 포함되어 있다. 반면, 암 및 특정 질환의 발병 여부 또는 진행 여부 등, 신체 내 특수한 상황에 의해 발현이 증가하여, 신체 내 상황을 직접적으로 반영하는 사이토카인(cytokine), 특히 인터루킨(interleukin)과 같은 물질의 농도는 약 10 ng/ml에 불과하므로, 상기 사이토카인과 같은 물질 또는 암 주변 환경에 의해 발생되는 암 특이적으로 발현되는 마커 단백질을 연구하는데 있어서, 혈액 내에 대량으로 존재하는 알부민 및 IgG 등의 단백질의 제거가 우선되어야만 한다는 문제점이 있었다.

이에, 본 발명자들은 상술한 문제점을 극복하기 위하여, 단백질 제거용 키트(ProteoPrep Immunoaffinity Albumin & IgG Depletion Kit, Sigma, USA)를 사용하여 혈청에 존재하는 단백질 중 알부민과 IgG를 제거하였다. 구체적으로, 상기 키트에 포함된 컬럼(column)에 상기 수득한 각각의 혈청 검체를 넣으면 알부민 및 IgG만이 컬럼의 레진에 결합되고, 나머지 단백질은 컬럼을 통과하여 빠져나온다. 따라서, 컬럼을 통과한 시료를 수집하여 알부민 및 IgG가 제거된 혈청시료를 얻을 수 있었다(도 2).

도 2는 정상인과 환자의 시료로부터 알부민과 IgG을 제거한 결과를 나타내는 전기영동사진으로서, Healthy의 레인 1은 알부민과 IgG을 제거하기 이전의 정상인 시료의 혼합혈청을 나타내고, Healthy의 레인 2는 단백질 제거용 키트의 컬럼에 결합된 정상인 시료의 혼합혈청에서 유래된 알부민과 IgG를 나타내며, Healthy의 레인 3은 알부민과 IgG가 제거된 정상인 시료의 혼합혈청을 나타낸다. 또한, Small cell lung cancer의 레인 1은 알부민과 IgG을 제거하기 이전의 환자 시료의 혼합혈청을 나타내고, Small cell lung cancer의 레인 2는 단백질 제거용 키트의 컬럼에 결합된 환자 시료의 혼합혈청에서 유래된 알부민과 IgG를 나타내며, Small cell lung cancer의 레인 3은 알부민과 IgG가 제거된 환자 시료의 혼합혈청을 나타낸다. 도 2에서 보듯이, 정상인 및 환자의 혈청 내 알부민 및 IgG의 대부분이 제거됨을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 퓨코실화된 ( Fucosylated ) 당단백질 분리

당단백질(Glycoprotein)은 펩타이드의 곁사슬(peptide의 side chain)에 공유결합(covalent bond)으로 당쇄가 결합되어 있는 단백질을 의미하며, 당쇄는 당화(Glycosylation)라는 전사 후 수식(Post transcriptional modification)을 거쳐 단백질에 부착된다. 상기와 같은 당화 기전에 의해 생체에서 생성된 당단백질은 세포 외 분비 단백질(extracellular secreted proteins) 또는 막에 부착된 단백질(integral proteins)로 존재하며, 면역 반응(immune reaction), 또는 세포-세포 작용(cell-cell interaction)에 관여하는 등 많은 기능적 부분 등을 담당하는 것으로 알려져 있다. 퓨코실화(Fucosylation)는 당쇄로서 퓨코스(fucose)가 단백질에 결합되는 당화과정(glycosylation process)을 의미하는데, 생체 내에서 일어나는 당화과정 중 가장 흔하게 일어나는 것으로서, 다양한 퓨코실트랜스퍼라제(fucosyltransferase)의 작용, GDP-퓨코스(GDP-fucose) 합성 및 GDP-퓨코스 트랜스포터(GDP-fucose transpoter)가 관여하는 것으로 알려져 있다(도 3).

이러한 퓨코실화는 1979년 처음으로 암과의 관계가 규명된 이후로 암에서 가장 주요한 당화과정 중 하나로서 보고되었다. 예를 들어, 간암의 마커로 잘 알려진 AFP(alpha-fetoprotein)는 간암의 microenvironment에 의해 비정상적 퓨코실화(aberrant fucosylation)가 일어나는 것으로 알려져 있다(도 4 및 도 5).

한편, 렉틴(Lectin)은 sugar-결합 단백질(sugar-binding protein)로 종류에 따라 서로 다른 sugar 모이어티(moiety)에 특이적으로 결합하는 성질을 가지고, 생체 내에서 세포나 단백질 사이의 인식과정에 관여하는 것으로 알려져 있다. 이러한 렉틴에는 여러 종류가 있으며, 해당 종류에 따라 각각의 당쇄를 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 가지고 있다. 따라서, 상기 렉틴을 이용할 경우, 특이적 당화를 확인 할 수 있을 뿐 아니라 샘플의 농축과 바이오마커를 이용한 진단에 활용할 수 있음에 착안하여, 본 발명자들은 렉틴의 일종인 AAL(Aleuria Aurantia Lectin)이 충진된 컬럼을 이용하여 상기 알부민과 IgG가 제거된 환자의 혈청시료로부터 퓨코실화된 당단백질을 선발하고자 하였다.

구체적으로, 세척된 빈 스핀 컬럼(empty spin column)에 AAL을 충진하고, 이를 안정화시킨 다음, 이에 알부민 및 IgG가 제거된 환자의 혈청 시료를 가하고, 12시간동안 반응시키고, 상기 컬럼에 결합된 단백질을 용출시킴으로써, AAL에 결합된 퓨코실화된 당단백질들을 수득하였다(도 6).

그런 다음, 수득한 퓨코실화된 당단백질들을 확인하기 위하여, 상기 시료를 전기영동하고, 상기 전기영동된 시료에 퓨코실화된 당단백질과 결합할 수 있는 AAL-비오틴 복합체(ALL-biotin complex) 및 상기 비오틴에 결합할 수 있는 스트렙타비딘-HRP 복합체(streptavidin-HRP complex)를 순차적으로 가한 다음, ECL(Electrochemiluminescence) 기법을 이용하여 HRP의 활성을 확인함으로써(도 7), 퓨코실화된 당단백질의 존재를 확인하였다(도 8).

도 8은 시료에 존재하는 퓨코실화된 당단백질을 확인하기 위한 렉틴 블럿 분석 결과를 나타내는 사진으로서, 레인 1은 알부민과 IgG을 제거하기 이전의 정상인 시료의 혼합혈청을 나타내고, 레인 2는 알부민과 IgG을 제거하기 이전의 환자 시료의 혼합혈청을 나타내며, 레인 3은 알부민과 IgG가 제거된 정상인 시료의 혼합혈청을 나타내고, 레인 4는 알부민과 IgG가 제거된 환자 시료의 혼합혈청을 나타내며, 레인 5는 AAL 컬럼에 결합하지 않은 정상인 시료의 혼합혈청을 나타내고, 레인 6은 AAL 컬럼에 결합하지 않은 환자 시료의 혼합혈청을 나타내며, 레인 7은 AAL 컬럼에 결합한 정상인 시료의 혼합혈청을 나타내고, 레인 8은 AAL 컬럼에 결합한 정상인 시료의 혼합혈청을 나타낸다. 도 8에서 보듯이, AAL-컬럼에 결합된 시료에는 퓨코실화된 당단백질이 상대적으로 높은 함량으로 포함되어 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 4: 단백질 질량분석 및 후보물질 발굴

AAL 렉틴 기법을 이용하여 퓨코실화된 당단백질 시료를 획득한 후 이를 트립신에 의한 절단을 수행(trypsin digestion)하여, 프로테오믹스(proteomics) 방법을 기반으로 하여 LC-MS/MS 질량분석기를 이용하여 시료의 당단백질을 분석하였다. 그리고 데이터베이스 서치와 여러 소프트웨어를 기반으로 단백질을 확인하는 방법을 수행하였다. 이후 폐암군과 정상군의 당단백질 결과를 비교분석하여 폐암군에 특이적인 당단백질인 보체 C9(complemnet component 9(C9))을 발굴하였다.

실시예 5: 정상인과 폐암환자에서 발현된 C9 보체의 비교

상기 실시예 4에서 발굴된 C9을 폐암의 진단용 마커로서 활용할 수 있는지를 확인하기 위하여, 다수의 소세포폐암(small cell lung cancer), 편평상피세포암(squamous cell acrcinoma) 또는 선암(adenocarcinoma)의 환자에서 발현되는 C9 단백질의 양을 웨스턴 블롯 방법을 이용하여 정상인의 것과 비교하였다.

실시예 5-1: 정상인과 소세포폐암 환자에서 발현된 C9 보체의 비교

각각 38명의 정상인과 소세포폐암 환자로부터 각각의 혈청시료를 수득하고, 실시예 2의 방법으로 각 시료로부터 알부민과 IgG를 제거한 다음, 각 시료를 대상으로 하여 항-C9 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 수행하여, 정상인과 소세포폐암 환자에서 발현된 C9 보체의 양을 비교하였다(도 9a 및 9b).

도 9a는 정상인(HE) 혈청시료 중의 일부와 소세포폐암 환자(SCC) 혈청시료 중의 일부를 대상으로 각각 수행한 웨스턴 블롯 결과를 나타내는 사진이고, 도 9b는 웨스턴 블롯으로 발색된 밴드의 농도를 덴시토메터로 측정한 결과(densitometry)를 나타내는 그래프이다.

도 9a 및 9b에서 보듯이, C9는 정상인 보다는 소세포폐암 환자에서 현저하게 높은 수준으로 발현됨을 확인할 수 있었으므로, 상기 C9를 소세포폐암의 진단용 마커로서 활용할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5-2: 정상인과 편평상피세포암 환자에서 발현된 C9 보체의 비교

121명의 정상인과 120명의 편평상피세포암 환자로부터 각각의 혈청시료를 수득하고, 실시예 2의 방법으로 각 시료로부터 알부민과 IgG를 제거한 다음, 각 시료를 대상으로 하여 항-C9 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 수행하여, 정상인과 편평상피세포암 환자에서 발현된 C9 보체의 양을 비교하였다(도 10a 및 10b).

도 10a는 정상인(HE) 혈청시료 중의 일부와 편평상피세포암 환자(SQLC) 혈청시료 중의 일부를 대상으로 각각 수행한 웨스턴 블롯 결과를 나타내는 사진이고, 도 10b는 웨스턴 블롯으로 발색된 밴드의 농도를 덴시토메터로 측정한 결과(densitometry)를 나타내는 그래프이다.

도 10a 및 10b에서 보듯이, C9는 정상인 보다는 편평상피세포암 환자에서 현저하게 높은 수준으로 발현됨을 확인할 수 있었으므로, 상기 C9를 편평상피세포암의 진단용 마커로서 활용할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5-3: 정상인과 선암 환자에서 발현된 C9 보체의 비교

121명의 정상인과 120명의 선암 환자로부터 각각의 혈청시료를 수득하고, 실시예 2의 방법으로 각 시료로부터 알부민과 IgG를 제거한 다음, 각 시료를 대상으로 하여 항-C9 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 수행하여, 정상인과 선암 환자에서 발현된 C9 보체의 양을 비교하였다(도 11a 및 11b).

도 11a는 정상인(HE) 혈청시료 중의 일부와 선암 환자(LAC) 혈청시료 중의 일부를 대상으로 각각 수행한 웨스턴 블롯 결과를 나타내는 사진이고, 도 11b는 웨스턴 블롯으로 발색된 밴드의 농도를 덴시토메터로 측정한 결과(densitometry)를 나타내는 그래프이다.

도 11a 및 11b에서 보듯이, C9는 정상인 보다는 선암 환자에서 현저하게 다량으로 발현됨을 확인할 수 있었으므로, 상기 C9를 선암의 진단용 마커로서 활용할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5-4: 정상인과 각종 폐암 환자에서 발현된 C9 보체의 웨스턴 블롯을 통한 비교

상기 실시예 5-1 내지 5-3의 결과에서 보듯이, 본 발명의 C9는 소세포폐암, 편평상피세포암 및 선암의 환자에서 현저하게 높은 수준으로 발현되므로, 각 폐암 환자의 시료를 대상으로 하여 C9 보체의 발현정도를 직접적으로 비교하였다.

구체적으로, 각각 20명의 정상인, 선암 환자, 소세포폐암 환자 및 편평상피세포암 환자로부터, 각각의 혈청시료를 수득하고, 실시예 2의 방법으로 각 시료로부터 알부민과 IgG를 제거한 다음, 각 시료를 대상으로 하여 항-C9 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 수행하여, 정상인, 선암 환자, 소세포폐암 환자 및 편평상피세포암 환자에서 발현된 C9 보체의 양을 상호 비교하였다(도 12a 및 12b).

도 12a는 정상인(HEC), 선암 환자(ADC), 소세포폐암 환자(SCLC) 및 편평상피세포암 환자(SQLC)로부터 수득한 각 혈청시료 중의 일부를 대상으로 각각 수행한 웨스턴 블롯 결과를 나타내는 사진이고, 도 12b는 웨스턴 블롯으로 발색된 밴드의 농도를 덴시토메터로 측정한 결과(densitometry)를 나타내는 그래프이다.

도 12a 및 12b에서 보듯이, C9는 정상인 보다는 모든 폐암 환자에서 현저하게 높은 수준으로 발현됨을 확인할 수 있었다. 특히, 편평상피세포암의 환자에서는 정상인은 물론 다른 폐암 환자 보다도 높은 수준으로 C9이 발현됨을 확인할 수 있었으므로, 상기 C9를 폐암의 진단용 마커로서 활용할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 5-5: 정상인과 각종 폐암 환자에서 발현된 C9 보체의 단백질 칩 어레이를 통한 비교

상기 실시예 5-4의 결과에서 보듯이, 본 발명의 C9는 편평상피세포암의 환자에서 가장 높은 수준으로 발현되므로, 이를 다시 한번 확인하기 위하여, 단백질 칩 어레이 방법으로 편평상피세포암 환자와 정상인의 시료에 C9 보체의 발현정도를 직접적으로 비교하였다.

즉, 각각 100명의 정상인 및 편평상피세포암 환자로부터, 각각의 혈청시료를 수득하고, 실시예 2의 방법으로 각 시료로부터 알부민과 IgG를 제거한 다음, 각 시료를 대상으로 하여 항-C9 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 수행하여, 정상인과 소세포폐암 환자에서 발현된 C9 보체의 양을 비교하였다(도 13a, 13b 및 13c).

도 13a는 단백질 칩 어레이에 정상인 및 편평상피세포암 환자의 시료를 가한 결과를 나타내는 사진이고, 도 13b는 단백질 칩에 발색된 정도를 덴시토메터로 측정한 결과(densitometry)를 나타내는 그래프이며, 도 13c는 C9에 대한 Receiver-operator characteristic (ROC) 커브를 나타내는 그래프이다. 여기서 검출도는 정상인(HEC)에 대한 편평상피세포암의 검출율로서, 민감도는 53%이고, 특이도는 약 89%이다. Area-under-the-curve (AUC) 값은 0.708이었다.

도 13a 내지 13c에서 보듯이, C9는 정상인 보다는 편평상피세포암 환자에서 현저하게 높은 수준으로 발현됨을 다시 한번 확인할 수 있었다.

실시예 6: 다양한 암 환자와 정상인에서 발현된 C9 보체의 비교

상기 실시예 5로부터, 본 발명의 C9를 대부분의 폐암의 진단용 마커로서 활용할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 C9를 폐암 이외의 다른 암의 진단에도 활용할 수 있는지의 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 12명의 정상인, 12명의 소세포폐암 환자, 12명의 편평상피세포암 환자, 9명의 유방암 환자, 9명의 간암 환자, 9명의 위암 환자, 6명의 신장암 환자 및 3명의 난소암 환자로부터, 각각의 혈청시료를 수득하고, 실시예 2의 방법으로 각 시료로부터 알부민과 IgG를 제거한 다음, 각 시료를 대상으로 하여 항-C9 항체를 이용한 웨스턴 블롯을 수행하여, 정상인, 소세포폐암 환자, 편평상피세포암 환자, 유방암 환자, 간암 환자, 위암 환자, 신장암 환자 및 난소암 환자에서 발현된 C9 보체의 양을 상호 비교하였다(도 14a 및 14b).

도 14a는 정상인(HE), 소세포폐암 환자(SCC), 편평상피세포암 환자(SQC), 유방암 환자(BC), 간암 환자(HCC), 위암 환자(SC), 신장암 환자(RCC) 및 난소암 환자(OC)로부터 수득한 각 혈청시료 중의 일부를 대상으로 각각 수행한 웨스턴 블롯 결과를 나타내는 사진이고, 도 14b는 웨스턴 블롯으로 발색된 밴드의 농도를 덴시토메터로 측정한 결과(densitometry)를 나타내는 그래프이다.

도 14a 및 14b에서 보듯이, C9는 정상인 보다는 모든 암 환자에서 현저하게 높은 수준으로 발현됨을 확인할 수 있었다. 특히, 난소암, 편평상피세포암 및 소세포폐암의 환자에서는 정상인은 물론 다른 암 환자 보다도 높은 수준으로 C9이 발현됨을 확인할 수 있었고, 신장암, 위암, 유방암 및 간암 환자에서도 정상인 보다는 현저하게 높은 수준으로 발현됨을 확인할 수 있었으므로, 상기 C9를 폐암은 물론 다양한 암의 진단용 마커로서 활용할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 7: C9 보체의 퓨코실화 ( Fucosylated ) 정도의 비교

실시예 3에서 상술한 바와 같이, 퓨코실화는 암에서 가장 주요한 당화과정 중 하나라고 알려져 있으므로, 3종의 폐암 환자의 시료에서 검출되는 C9 보체의 퓨코실화를 상호 비교하고, 서로 다른 암의 환자의 시료에서 검출되는 C9 보체의 퓨코실화를 상호 비교하였다.

실시예 7-1: 폐암의 종류에 따른 C9 보체의 퓨코실화 ( Fucosylated ) 정도의 비교

샌드위치 엘라이자(sandwich ELISA) 기법을 응용한, 하이브리드 렉틴 엘라이자 실험으로 각 폐암 환자의 시료에 포함된 C9 보체의 퓨코실화 정도를 측정하고, 상호비교하였다(도 15).

즉, 항-C9 항체를 코팅한 플레이트에 각 20명의 정상인, 선암 환자, 소세포폐암 환자 및 편평상피세포암 환자의 시료를 각각 가하여 반응시키고, 이에 퓨코실화된 당단백질과 결합할 수 있는 AAL-비오틴 복합체(ALL-biotin complex) 및 상기 비오틴에 결합할 수 있는 스트렙타비딘-HRP 복합체(streptavidin-HRP complex)를 순차적으로 가한 다음, 엘라이자 검출기로 HRP의 활성을 확인함으로써, C9 보체의 퓨코실화 정도를 측정하였다(도 16).

도 16은 정상인(HEC), 선암 환자(ADC), 소세포폐암 환자(SCLC) 및 편평상피세포암 환자(SQLC)의 각 시료에 포함된 C9 보체의 퓨코실화 정도를 나타내는 그래프이다. 도 16에서 보듯이, 정상인의 시료에 포함된 C9 보체에 비하여 각 폐암 환자의 시료에 포함된 C9 보체는 퓨코실화 정도가 높은 수준을 나타내지만, 서로 다른 종류의 폐암 환자의 시료간에는 C9 보체의 퓨코실화 정도가 유의한 차이를 나타내지 않음을 확인하였다.

실시예 7-2: 암의 종류에 따른 C9 보체의 퓨코실화 ( Fucosylated ) 정도의 비교

상기 실시예 7-1의 결과로부터, 서로 다른 종류의 폐암 환자의 시료간에는 C9 보체의 퓨코실화 정도가 유의한 차이를 나타내지 않음을 확인하였으므로, 서로 다른 종류의 암 환자의 시료에 포함된 C9 보체의 퓨코실화 정도가 유의한 차이를 나타내지는지의 여부를 확인하고자 하였다.

구체적으로, 항-C9 항체를 코팅한 플레이트에 각 15명의 정상인, 유방암 환자, 간암 환자, 위암 환자 및 편평상피세포암 환자의 시료를 각각 가하여 반응시키고, 이에 퓨코실화된 당단백질과 결합할 수 있는 AAL-비오틴 복합체(ALL-biotin complex) 및 상기 비오틴에 결합할 수 있는 스트렙타비딘-HRP 복합체(streptavidin-HRP complex)를 순차적으로 가한 다음, 엘라이자 검출기로 HRP의 활성을 확인함으로써, C9 보체의 퓨코실화 정도를 측정하였다(도 17).

도 17은 정상인(HEC), 유방암 환자(BC), 간암 환자(HCC), 위암 환자(STC) 및 편평상피세포암 환자(SQLC)의 각 시료에 포함된 C9 보체의 퓨코실화 정도를 나타내는 그래프이다. 도 17에서 보듯이, 정상인의 시료에 포함된 C9 보체에 비하여 모든 암 환자의 시료에 포함된 C9 보체는 퓨코실화 정도가 높은 수준을 나타내었고, 특히, 위암 환자(STC)와 편평상피세포암 환자(SQLC)의 시료에 포함된 C9 보체의 퓨코실화 정도가 상대적으로 높은 수준을 나타냄을 확인할 수 있었다.

Claims

보체 C9 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐의 편평상피세포암 진단용 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 보체 C9 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 포함하는 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유전자 mRNA의 발현 수준을 측정하는 제제는 보체 C9 유전자에 특이적으로 결합하는 프로브를 포함하는 것인 조성물.
제1항에서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 보체 C9 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물.
삭제
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 폐의 편평상피세포암 진단용 키트.
제6항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 키트.
폐의 편평상피세포암 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 상기 폐의 편평상피세포암이 의심되는 환자의 시료로부터 보체 C9 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 측정하는 단계; 및 상기 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 수준을 정상 대조구 시료의 해당 유전자의 발현 수준 또는 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 폐의 편평상피세포암 마커로서 보체 C9 마커를 검출하는 방법.
제8항에 있어서, 상기 유전자 발현 수준의 측정은 상기 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 mRNA 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 DNA 칩에 의한 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 프라이머를 이용한 역전사효소 중합반응에 의한 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준의 측정은 해당 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 것인 방법.
제8항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법 중 어느 하나를 이용하는 것인 방법.
삭제
폐의 편평상피세포암을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질의 투여 후 보체 C9 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는, 폐의 편평상피세포암 치료제의 스크리닝 방법.