CN1622955A - 肿瘤标志物及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种新的肿瘤标志物－ULBP－4蛋白，编码ULBP－4蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种ULBP－4蛋白的方法。本发明还公开了ULBP－4蛋白及其编码序列的用途，如用于诊断和治疗肿瘤。本发明还提供了含ULBP－4蛋白或其抗体的药物组合物。
Description
肿瘤标志物及其用途
技术领域
本发明属于生物技术和医学领域， 具体地说， 本发明涉及一种新的肿瘤标志 物 -ULBP-4蛋白， 编码 ULBP - 4蛋白的多核苷酸和经重组技术产生这种 ULBP-4蛋 白的方法。 本发明还公开了 ULBP-4 蛋白及其编码序列的用途， 如用于诊断和治 疗肿瘤， 以及含 ULBP-4蛋白或其抗体的药物组合物。 背景技术
二十世纪 50年代以来医学科学有了飞跃的发展， 癌症治疗的进展也是卓有成 效的， 并发现了不少直接与癌症发生相关的癌基因与抑癌基因。
早在 40 年前， Lewis Thomas & Macfarlane Burnet 就提出了免疫系统对癌 症的发生有监测和抑制的作用。 近两三年来关于 NK细胞和 T细胞的研究结果为 这一假说提供了新的支持证据， 并揭示了参与这一过程的可能的分子机制。
NK细胞（自然杀伤细胞）是免疫的第一道防线。 NK细胞分泌细胞毒素， 能够快 速地识别、 杀死它们的靶细胞。 由于 NK细胞的作用无需抗原或有丝分裂原刺激， 亦不依赖抗体或补体， 因此它本身应能够分辨异常和正常组织。 目前一般认为 NK 细胞的活性是通过表面上抑制性和激活性受体的平衡来调节的。 MHC-I 与 细 胞表面的受体结合，包括鼠 Ly49 (识别 H- 2K，H- 2D)和人 KIR (Immunoglobulin_like receptor, 识别 HU-A， - B， 或- C)在内， 从而抑制它的活性。 在病毒感染细胞 和肿瘤细胞中， MHC-I 的表达通常被破坏， 不能和 NK细胞表面的抑制性受体结 合从而激活 NK细胞并被其杀死。
除了 NK细胞之外， T细胞可阻止致癌因素诱发的皮肤肿瘤的发生。 在人类和 小鼠中， Υ δ -Τ细胞受体（T Cell Receptor, TCR)阳性的 T细胞位于皮肤、 消 化道上皮组织及粘膜表面， 参与局域性免疫。 目前的实验结果表明这些 Τ细胞在 消灭外界致癌剂转化的细胞中也有重要的作用。 研究还显示， Υ δ -TCR+ Τ 细胞 可阻止肠道上皮肿瘤的发生。 两个 MHC- 1相关分子， 即 MICA/MICB, 被发现可作 为细胞异常的信号， 引起免疫应答。
Bauer 等人（Bauer S， et al.， Science 1999 Jul 30 ; 285 (5428)： 727 - 9) 通过代表性差异分析技术（representational difference analysis , RDA)鉴定 出 MICA/MICB的受体 NKG2D, —种在此之前对它的表达和功能均为未知的孤儿 C 型凝集素样 NK细胞受体（orphan C- type lectin- like NKcell receptor)。
目前已经发现了数个 MHC-I以及其相关分子特异性的 NK细胞受体和其他的 NK 细胞受体不同， NKG2D是位于所有 NK细胞、 γ δ -TCR+ Τ细胞、 CD8+ β -TCR+ Τ 细胞表面的一种激活性受体， 和跨膜转接蛋白 DAP10 相作用（Wu J， et al.，
确 认 本
Science 1999 Jul 30 ; 285 (5428)： 730-2)。 DAP10蛋白的胞质部分含有一个 YxxM 基序， 可激活 PI3激酶传导途径。
小鼠中并没有人类 MICA/B同源基因。然而，在小鼠中发现另一个被称为 RAE - 1 的糖蛋白家族（Cerwenka A， et al.， Immunity. 2000 Jun ; 12 (6)： 721-7)， 同 样作为 NKG2D的配体（ligand)而作用， 表现出与 MHC- 1较弱的同源。 目前为止， 已经发现了 5种小鼠 RAE-1异型蛋白（RAE-1- α、 - β、 _ Υ、 - δ、 - ε )和一个相 关蛋白， Η60。 表达分析显示 RAE-l基因在正常的成体组织中不表达或表达很低， 在一些肿瘤组织构成性的表达， 其表达量在维甲酸（retinoic acid)的作用下提 高。在正常皮肤中没有 RAE-1的表达，经致癌剂 TPA诱导后在小鼠的肿瘤中表达。 近来 Diefenbach 等（Diefenbach A, et al. , Nature 2001 Sep 13 ; 413 (6852)： 165 - 71)和 Cerwenka等人（Cerwenka A, et al.， Proc Natl Acad Sci USA 2001 Sep 25 ; 98 (20)： 11521- 6)的研究显示， 在表达 MHC Class I 的肿瘤中， 如果 同时表达 RAE-1 , 该肿瘤也能在体外被 NK细胞排除。 和 NK细胞相同， 小鼠 γ δ -TCR+ Τ 细胞能够杀死体内培养的鳞状细胞癌细胞（Squamous cell carcinoma line) , 在特定情况下， RAE- 1还可引起 γ δ - TCR+ Τ细胞对移植肿瘤的记忆。
在人类中也发现了 Rae- 1的同源基因， 即人 ULBP-1、 -2、 -3。 作为人类巨细 胞病毒（Cytomegalovirus, CMV)糖蛋白 UL16的结合蛋白首先被发现， ULBP基因 和匪 C- 1家族相关， 但和同样能与 UL16结合的 MICB没有很近的联系。 ULBP也 是 NKG2D 的配体， 能够刺激 NK 细胞表达细胞因子（cytokine)和化学因子 (chemokine)。 ULBP在抗 NK细胞的靶细胞中的表达能使其受到 NK细胞的攻击。 巨细胞病毒感染的细胞可能正是通过 UL16蛋白遮蔽了细胞表面的 ULBP或 MIC抗 原从而逃避免疫系统的攻击。
综上所述， 在人类和小鼠中开展的这些研究表明， 无论针对的是病毒还是肿 瘤， 在 NK细胞、 γ δ -TCR+ Τ细胞、 CD8+ a β -TCR+ Τ细胞介导的免疫防护中， NKG2D 都起到了一个关键的作用。 然而到目前为止， NKG2D 的激活机制还不甚明 确。
90 年代以来， 肿瘤免疫学的研究取得了一些突破性进展， 肿瘤免疫治疗又进 入一个新的高潮。 很多免疫治疗方法已进入临床试验， 主要是通过多种方法在体 内或体外训练、 激活患者的免疫细胞以识别恶性细胞， 并使其大量扩增， 最终清 除或抑制恶性细胞。
在肿瘤免疫学研究方面， 1991 年首次发现了人类肿瘤免疫排斥抗原。 以后的 很多研究已证明， 大多数肿瘤细胞具有与正常细胞不同的成分， 可以引起免疫系 统对之识别并攻击， 称之为肿瘤免疫排斥抗原。 利用肿瘤免疫排斥抗原可以在患 者体内外诱导产生出可杀伤肿瘤的免疫细胞。 因此肿瘤免疫排斥抗原是肿瘤免疫 治疗中最为关键的成分。
迄今为止， 已在黑色素瘤及包括前列腺癌、 胸腺癌、 卵巢癌、 肠胃癌在内的 各种肿瘤组织中发现了不少肿瘤抗原。 目前已发现的人类肿瘤免疫排斥抗原可分 为四种类型。 第一类抗原来自于正常基因产物的体细胞突变， 第二类抗原来自于 和致癌过程相关的基因突变。 这两类抗原均为患者特异性抗原， 不适合普遍性治 疗。 第三类抗原为那种在正常组织中也有表达， 但在肿瘤中表达量升高的基因的 产物。 如果不涉及突变， 这类抗原在各种癌症病人中是具有普遍性的， 但它们通 常是组织特异的， 且并非为肿瘤所特有， 在临床应用上意义不大。 第四类抗原具 有严格的肿瘤特异性， 和一般的致癌过程相关。 因此， 这类抗原在人类肿瘤中广 泛的表达， 最适合于作为肿瘤标志物以及抗肿瘤免疫攻击的靶点。 然而， 目前已 发现的抗原中很少是属于这一类的。
因此， 本领域迫切需要开发新的第 4类肿瘤免疫排斥抗原作为肿瘤标志物， 用于肿瘤的诊断和治疗。 发明概述
本发明的目的是提供一种新的人肿瘤标志物 ULBP-4 蛋白以及其片段、 类似 物和衍生物。
本发明的另一目的是提供编码这些多肽的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供生产这些多肽的方法以及该多肽和编码序列的用 途。 本发明经过广泛而深入的研究， 发现并分离出了新的可作为肿瘤标志物的抗 原基因： ULBP- 4。 该基因在正常组织中不表达或表达量很低， 在肿瘤组织中广泛 表达。其表达产物为一个膜蛋白，也可能分泌到细胞外。表达在细胞表面的 ULBP-4 膜蛋白能高效的与 NKG2D受体结合。 在此基础上完成了本发明。
在本发明的第一方面，提供新颖的分离出的 ULBP- 4多肽，它包含：具有 SEQ ID
NO : 2或 4氨基酸序列的多肽、 或其保守性变异多肽、 或其活性片段、 或其活性 衍生物。 较佳地， 该多肽具有 SEQ ID NO : 2或 4中 1-263位或 24-263位的氨基 酸序列。
在本发明的第二方面， 提供编码分离的这些多肽的多核苷酸， 该多核苷酸包 含一核苷酸序列， 该核苷酸序列与选自下组的一种核苷酸序列有至少 70%相同性： (a)编码上述人 ULBP- 4多肽的多核苷酸； 和 (b)与多核苷酸 (a)互补的多核苷酸。 较佳地， 该多核苷酸编码具有 SEQ ID NO : 2或 4中 1-263位或 24-263位氨基酸 序列的多肽。 更佳地， 该多核苷酸的序列是选自下组的一种： （a) 具有 SEQ ID NO : 1中 403- 1194位的序列； （b) 具有 SEQ ID NO : 1中 1-1434位的序列； （c) 具有 SEQ ID NO : 1中 473-1194位的序列； （d) 具有 SEQ ID NO : 3中 1-792 位的序列； （e) 具有 SEQ ID NO : 1中 70- 792位的序列。
在本发明的第三方面， 提供了含有上述多核苷酸的载体， 以及被该载体转化 或转导的宿主细胞或者被上述多核苷酸直接转化或转导的宿主细胞。
在本发明的第四方面， 提供了制备 ULBP- 4蛋白的方法， 该方法包含： （a)在 适合表达蛋白的条件下， 培养上述被转化或转导的宿主细胞； （b)从培养物中分 离出 ULBP-4蛋白。
在本发明的第五方面， 提供了与上述的人 ULBP- 4 多肽特异性结合的抗体。 还提供了可用作引物或探针的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中连续的 15-1434 个核苷酸。
在本发明的第六方面， 提供了模拟、 促进、 拮抗人 ULBP-4 多肽活性的化合 物， 以及抑制人 ULBP-4多肽的表达的化合物。 还提供了筛选和 /或制备这些化合 物的方法。 较佳地， 该化合物是人 ULBP- 4多肽的编码序列或其片段的反义序列。
在本发明的第七方面， 提供了检测样品中是否存在 ULBP- 4 蛋白的方法， 它 包括： 将样品与 ULBP- 4 蛋白的特异性抗体接触， 观察是否形成抗体复合物， 形 成了抗体复合物就表示样品中存在 ULBP-4蛋白。 还提供了一种检测肿瘤的方法， 包括步骤： 检测病人的样品（如血液、 尿液、 体液、 唾液等）中是否存在 ULBP-4 蛋白。
在本发明的第八方面， 本发明还提供了一种检测肿瘤的试剂盒， 它含有特异 性扩增 ULBP- 4 的引物对和 /或 ULBP- 4特异性抗体。 此外， 还可含有特异性探针 和 /或 PCR缓冲液等。
在本发明的第九方，面， 提供了本发明多肽和编码序列的用途。 例如本发明多 肽可被用于筛选促进人 ULBP- 4多肽活性的激动剂， 或者抑制人 ULBP- 4多肽活性 的拮抗剂、 或者被用于肽指紋图谱鉴定。 本发明的人 ULBP-4 蛋白的编码序列或 其片段， 可被作为引物用于 PCR扩增反应， 或者作为探针用于杂交反应， 或者用 于制造基因芯片或微阵列。
在本发明的第十方面， 提供了一种药物组合物， 它含有安全有效量的本发明 的人 ULBP-4拮抗剂以及药学上可接受的载体。 优选的 ULBP-4拮抗剂是抗 ULBP-4 的抗体和 ULBP-4反义序列。 这些药物组合物可治疗肿瘤。
本发明的其它方面由于本文的技术的公开， 对本领域的技术人员而言是显而 易见的。 附图说明
图 1 是 ULBP-4的电泳图。
图 2 显示了一种人 ULBP- 4的 cDNA编码序列（SEQ ID NO : 3) ， 与 SEQ ID NO : 1 中 403-1194位序列相比的不同之处用下划线标出。
图 3 显示了一种人 ULBP- 4的氨基酸序列（SEQ ID NO : 4)， 与 SEQ ID NO : 2 序列相比的不同之处用下划线标出。
图 4 显示了 ULBP-4在多种肿瘤细胞株中的表达谱。 各泳道是： 1、 U373(星 形细胞瘤)； 2、 JURKAT (急性 T细胞白血病）； 3、 LOVO (结肠癌）； 4、 HELA (子 宫颈腺癌）； 5、 SW480(结肠癌）； 6、 DU145 (前列腺癌）； M: 分子量标准。
图 5显示了 ULBP- 4在多种组织中的表达谱。 其中各泳道是： 1. 肝脏； 2. 骨 骼肌； 3. 胎盘; 4. 脾脏; 5. 白细胞 ;6. 胰脏; 7. 淋巴结 ;8. 心脏; 9. 肺; 10. 脑; 11. 胸 腺; 12. 骨髓； M: 分子量标准。
图 6显示了 ULBP- 4特异性结合于 NKG2D。 发明详述
在本发明中， 术语 " ULBP- 4蛋白"、 "ULBP- 4多肽"或 "肿瘤标志物 ULBP-
4"可互换使用， 都指具有人肿瘤标志物 ULBP- 4氨基酸序列（SEQ ID N0 : 2或 4) 的蛋白或多肽。 它们还包括不含有信号肽（1-23位）的成熟 ULBP-4。
如本文所用， "分离的"是指物质从其原始环境中分离出来（如果是天然的 物质， 原始环境即是天然环境）。 如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽 是没有分离纯化的， 但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质 中分开， 则为分离纯化的。
如本文所用， "分离的 ULBP- 4蛋白或多肽"是指 ULBP- 4多肽基本上不含天 然与其相关的其它蛋白、 脂类、 糖类或其它物质。 本领域的技术人员能用标准的 蛋白质纯化技术纯化 ULBP-4 蛋白。 基本上纯的多肽在非还原聚丙烯酰胺凝胶上 能产生单一的主带。
本发明的多肽可以是重组多肽、 天然多肽、 合成多肽， 优选重组多肽。 本 发明的多肽可以是天然纯化的产物， 或是化学合成的产物， 或使用重组技术从 原核或真核宿主（例如， 细菌、 酵母、 高等植物、 昆虫和哺乳动物细胞）中产生。 根据重组生产方案所用的宿主， 本发明的多肽可以是糖基化的， 或可以是非糖 基化的。 本发明的多肽还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。
本发明还包括人 ULBP-4 蛋白的片段、 衍生物和类似物。 如本文所用， 术语 "片段" 、 "衍生物"和 "类似物"是指基本上保持本发明的天然人 ULBP-4 蛋 白相同的生物学功能或活性的多肽。 本发明的多肽片段、 衍生物或类似物可以是 (i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基（优选保守性氨基酸残基）被取代的 多肽， 而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的， 或（ii) 在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽， 或（iii)成熟多肽与另一个化 合物（比如延长多肽半衰期的化合物， 例如聚乙二醇）融合所形成的多肽， 或（iv) 附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽（如前导序列或分泌序列或用 来纯化此多肽的序列或蛋白原序列， 或与抗原 IgG片段的形成的融合蛋白）。 根 据本文的教导， 这些片段、 衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。
在本发明中，术语 "人 ULBP- 4多肽"指具有人 ULBP- 4蛋白活性的 SEQ ID NO.
2或 4序列的全长多肽或成熟多肽。 该术语还包括具有与人 ULBP-4蛋白相同功能 的、 SEQ ID NO. 2或 4序列的变异形式。 这些变异形式包括 (但并不限于）： 若干 个（通常为 1-50个， 较佳地 1-30个， 更佳地 1-20个， 最佳地 1-10个）氨基酸的 缺失、 插入和 /或取代， 以及在 C末端和 /或 N末端添加一个或数个 (通常为 20个 以内， 较佳地为 10个以内， 更佳地为 5个以内）氨基酸。 例如， 在本领域中， 用 性能相近或相似的氨基酸进行取代时， 通常不会改变蛋白质的功能。 又比如， 在 C末端和 /或 N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。 该术语 还包括人 ULBP-4蛋白的活性片段和活性衍生物。
该多肽的变异形式包括： 同源序列、 保守性变异体、 等位变异体、 天然突变 体、 诱导突变体、 在高或低的严紧度条件下能与人 ULBP-4 DNA杂交的 DNA所编 码的蛋白、 以及利用抗人 ULBP-4 多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。 本发明还提 供了其他多肽， 如包含人 ULBP-4 多肽或其片段的融合蛋白。 除了几乎全长的多 肽外， 本发明还包括了人 ULBP-4多肽的可溶性片段。 通常， 该片段具有人 ULBP - 4多肽序列的至少约 10个连续氨基酸， 通常至少约 30个连续氨基酸， 较佳地至 少约 50个连续氨基酸， 更佳地至少约 80个连续氨基酸， 最佳地至少约 100个连 续氨基酸。
发明还提供人 ULBP- 4蛋白或多肽的类似物。 这些类似物与天然人 ULBP- 4多 肽的差别可以是氨基酸序列上的差异， 也可以是不影响序列的修饰形式上的差 异， 或者兼而有之。 这些多肽包括天然或诱导的遗传变异体。 诱导变异体可以通 过各种技术得到， 如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变， 还可通过定点诱 变法或其他已知分子生物学的技术。 类似物还包括具有不同于天然 L-氨基酸的残 基 (如 D-氨基酸）的类似物， 以及具有非天然存在的或合成的氨基酸类似物。 应理 解， 本发明的多肽并不限于上述例举的代表性的多肽。
修饰 (通常不改变一级结构）形式包括： 体内或体外的多肽的化学衍生形式如 乙酰化或羧基化。 修饰还包括糖基化， 如那些在多肽的合成和加工中或进一步加 工步骤中进行糖基化修饰而产生的多肽。 这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖 基化的酶（如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。 修饰形式还包括具有磷 酸化氨基酸残基（如磷酸酪氨酸， 磷酸丝氨酸， 磷酸苏氨酸）的序列。 还包括被修 饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的多肽。
在本发明中， "人 ULBP-4蛋白保守性变异多肽"指与 SEQ ID NO : 2或 4的氨 基酸序列相比， 有至多 10个， 较佳地至多 8个， 更佳地至多 5个， 最佳地至多 3个 氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。 这些保守性变异多肽最好 根据表 1进行氨基酸替换而产生。
表 1
编码 ULBP-4 的成熟多肽的多核苷酸包括： 只编码成熟多肽的编码序列； 成 熟多肽的编码序列和各种附加编码序列； 成熟多肽的编码序列（和任选的附加编 码序列）以及非编码序列。 术语 "编码多肽的多核苷酸" 可以是包括编码此多肽 的多核苷酸， 也可以是还包括附加编码和 /或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及上述多核苷酸的变异体， 其编码与本发明有相同的氨基酸序列 的多肽或多肽的片段、 类似物和衍生物。 此多核苷酸的变异体可以是天然发生的 等位变异体或非天然发生的变异体。 这些核苷酸变异体包括取代变异体、 缺失变 异体和插入变异体。 如本领域所知的， 等位变异体是一个多核苷酸的替换形式， 它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插入， 但不会从实质上改变其编码多
肽的功能。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少 50%， 较佳地至少 70%, 更佳地至少 80%， 最佳地至少 90%或 95%相同性的多核苷酸。 本发明特别涉 及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。 在本发明中， "严格 条件"是指： （1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱， 如 0. 2 X SSC, 0. 1%SDS, 60 °C；或（2)杂交时加有变性剂， 如 50% (v/v)甲酰胺， 0. 1%小牛血清 /0. 1% Ficoll, 42°C等； 或（3)仅在两条序列之间的相同性至少在 90%以上，更好是 95% 以上时才发生杂交。 并且， 可杂交的多核苷酸编码的多肽与 SEQ ID N0 : 2或 4所 示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。
本发明还涉及与上述的序列杂交的核酸片段。 如本文所用， "核酸片段" 的 长度至少含 15个核苷酸， 较好是至少 30个核苷酸， 更好是至少 50个核苷酸， 最好是至少 100个核苷酸以上。 核酸片段可用于核酸的扩增技术 (如 PCR)以确定 和 /或分离编码 ULBP-4蛋白的多核苷酸。
本发明的人 ULBP-4核苷酸全长序列或其片段通常可以用 PCR扩增法、 重组法 或人工合成的方法获得。 对于 PCR扩增法， 可根据本发明所公开的有关核苷酸序 列， 尤其是开放阅读框序列来设计引物， 并用市售的 cDNA库或按本领域技术人员 已知的常规方法所制备的 cDNA库作为模板， 扩增而得有关序列。 当序列较长时， 常常需要进行两次或多次 PCR扩增， 然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接 在一起。
一旦获得了有关的序列， 就可以用重组法来大批量地获得有关序列。 这通常 是将其克隆入载体， 再转入细胞， 然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离 得到有关序列。
此外， 还可用人工合成的方法来合成有关序列， 尤其是片段长度较短时。 通 常， 通过先合成多个小片段， 然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前， 已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白（或其片段， 衍生 物）的 DNA序列。然后可将该 DNA序列引入本领域中已知的各种现有的 DNA分子（或 如载体)和细胞中。 此外， 还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
应用 PCR技术扩增 DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。 用于 PCR 的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择， 并可用常规方法合 成。 可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的 DNA/RNA片段。
本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体， 以及用本发明的载体或 ULBP-4 蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞， 以及经重组技术产生本发明所述多肽 的方法。
通过常规的重组 DNA技术， 可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产 重组的 ULBP- 4多肽。 一般来说有以下步骤：
(1) .用本发明的编码人 ULBP- 4 多肽的多核苷酸 (或变异体）， 或用含有该多
核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；
(2) .在合适的培养基中培养的宿主细胞；
(3) .从培养基或细胞中分离、 纯化蛋白质。
本发明中， 人 ULBP-4 多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。 总之， 只要 能在宿主体内复制和稳定， 任何质粒和载体都可以用。 表达载体的一个重要特征 是通常含有复制起点、 启动子、 标记基因和翻译控制元件。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含人 ULBP-4编码 DNA序列和合适 的转录 /翻译控制信号的表达载体。 这些方法包括体外重组 DNA技术、 DNA合成技 术、 体内重组技术等。 所述的 DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上， 以指导 mRNA合成。 表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外， 表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因， 以提供用于选择转 化的宿主细胞的表型性状， 如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、 新霉素抗性以 及绿色荧光蛋白（GFP)， 或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。
包含上述的适当 DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体， 可以用于转 化适当的宿主细胞， 以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞， 如细菌细胞； 或是低等真核细胞， 如酵母细胞； 或是高等真核细胞， 如哺乳动物细胞。 代表性例子有： 大肠杆菌， 链霉菌属的细 菌细胞； 真菌细胞如酵母； 植物细胞； 果蝇 S2或 Sf9的昆虫细胞； CH0、 COS. 或 293细胞的动物细胞等。
用重组 DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。 当宿主 为原核生物如大肠杆菌时， 能吸收 DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获， 用 0^12法处理， 所用的步骤在本领域众所周知。 另一种方法是使用 MgCl2。 如果需 要， 转化也可用电穿孔的方法进行。 当宿主是真核生物， 可选用如下的 DNA转染 方法： 磷酸钙共沉淀法， 常规机械方法如显微注射、 电穿孔、 脂质体包装等。
获得的转化子可以用常规方法培养， 表达本发明的基因所编码的多肽。 根据 所用的宿主细胞， 培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。 在适于宿主细胞 生长的条件下进行培养。 当宿主细胞生长到适当的细胞密度后， 用合适的方法 (如 温度转换或化学诱导）诱导选择的启动子， 将细胞再培养一段时间。
在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、 或在细胞膜上表达、 或分泌到细胞 夕卜。 如果需要， 可利用其物理的、 化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯 化重组的蛋白。 这些方法是本领域技术人员所熟知的。 这些方法的例子包括但并 不限于： 常规的复性处理、 用蛋白沉淀剂处理 (盐析方法）、 离心、 渗透破菌、 超 处理、 超离心、 分子筛层析 (凝胶过滤）、 吸附层析、 离子交换层析、 高效液相层 析 (HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
重组的人 ULBP- 4蛋白或多肽有多方面的用途。 这些用途包括（但不限于）： 用于筛选对抗 ULBP- 4蛋白功能的抗体、 多肽或其它物质。
另一方面， 本发明还包括对人 ULBP- 4 DNA或是其片段编码的多肽具有特异 性的多克隆抗体和单克隆抗体， 尤其是单克隆抗体。 这里， "特异性"是指抗体 能结合于人 ULBP-4基因产物或片段。 较佳地， 指那些能与人 ULBP-4基因产物或 片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。 本发明的抗体可以通过 本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体， 而且还包括具有免疫活性的抗 体片段， 如 Fab'或 (Fab) 2片段； 抗体重链； 抗体轻链； 遗传工程改造的单链 Fv 分子； 或嵌合抗体。
抗人 ULBP-4 蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中， 检测活检标本中的人 ULBP-4蛋白。
本发明抗体可用于治疗或预防人 ULBP- 4 蛋白相关疾病如肿瘤。 一种方法是 用巯基交联剂如 SPDP, 攻击抗体的氨基， 通过二硫键的交换， 将毒素结合于抗体 上， 这种杂交抗体可用于杀灭人 ULBP- 4蛋白阳性的细胞， 如肿瘤细胞。
利用本发明蛋白， 通过各种常规筛选方法， 可筛选出与 ULBP - 4 蛋白发生相 互作用的物质， 如受体、 抑制剂、 激动剂或拮抗剂等。
本发明蛋白及其抗体、 抑制剂、 激动剂、 拮抗剂或受体等， 当在治疗上进行 施用（给药）时， 可提供不同的效果。 通常， 可将这些物质配制于无毒的、 惰性的 和药学上可接受的水性载体介质中， 其中 pH通常约为 5-8， 较佳地 pH约为 6_8， 尽管 PH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。 配制好的药物 组合物可以通过常规途径进行给药， 其中包括（但并不限于）： 肌内、 腹膜内、 静 脉内 、 皮下、 皮内、 或局部给药。
ULBP- 4拮抗剂（如抗体和反义序列）可直接用于疾病治疗， 例如， 用于肿瘤方 面的治疗。 此外， 还可联用其他治疗剂， 如 TNF- a、 TNF- β等。
本发明还提供了一种药物组合物， 它含有安全有效量的本发明 ULBP-4拮抗 剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。 这类载体包括 (但并不限于）： 盐水、 缓冲 液、 葡萄糖、 水、 甘油、 乙醇、 及其组合。 药物制剂应与给药方式相匹配。 本发 明的药物组合物可以被制成针剂形式， 例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂 的水溶液通过常规方法进行制备。 诸如片剂和胶囊之类的药物组合物， 可通过常 规方法进行制备。 药物组合物如针剂、 溶液、 片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。 活性成分的给药量是治疗有效量， 例如每天约 1微克 -10毫克 /千克体重。
本发明还涉及定量和定位检测人 ULBP-4 蛋白水平的诊断试验方法。 这些试 验是本领域所熟知的， 且包括 FISH测定和放射免疫测定。 试验中所检测的人 ULBP- 4蛋白水平， 可以用于诊断肿瘤。
一种检测样品中是否存在 ULBP-4蛋白的方法是利用 ULBP-4蛋白的特异性抗 体进行检测， 它包括： 将样品与 ULBP-4蛋白特异性抗体接触； 观察是否形成抗 体复合物， 形成了抗体复合物就表示样品中存在 ULBP-4蛋白。
ULBP-4蛋白的多核苷酸可用于 ULBP-4蛋白相关疾病的诊断和治疗。 本发明 的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或 DNA芯片上， 用于分析组 织中基因的差异表达分析和基因诊断。 用 ULBP-4蛋白特异的引物进行 RNA-聚合 酶链反应（RT-PCR)体外扩增也可检测 ULBP- 4蛋白的转录产物。
本发明还提供了一种检测肿瘤的试剂盒， 它含有特异性扩增 ULBP- 4 的引物 对和 /或 ULBP-4特异性抗体。 此外， 还可含有特异性探针和 /或 PCR缓冲液等。
对 ULBP-4的测序结果表明， 它和 ULBP-1, -2和- 3三个基因的同源性较差， 但均可和 NKG2D结合， 定位在染色体上的同一位置。 表达分析结果表明， ULBP-4 基因仅在肿瘤组织中表达， 在正常细胞中不表达或表达量很低。 ULBP-4基因与鼠 中 RAE- 1家族及 H60基因的比对结果显示， ULBP-4可能就是人类中的 H60同源基 因。 已有的报道（O' Callaghan CA, et al. , Immunity 2001 Aug ; 15 (2) ： 201- 11)表明， 鼠 H60和 RAE- 1家族竞争性地与 NKG2D受体结合， 而 H60与 NKG2D的 亲和力比 RAE- 1家族要高 10倍左右。 由于人类 ULBP-1、 -2、 -3是 RAE- 1基因的 同源基因， 因此 ULBP- 4与 NKG2D受体的结合能力可能也会高于 ULBP_1、 -2、 _3。
此外， 感兴趣的是， ULBP基因和 RAE-1基因家族一样， 是 GPI-锚定的膜蛋 白。 在磷脂酶 C的作用下可分泌到体液中。 因此， ULBP-4可能是一个有效的肿瘤 标志物， 在众多的癌症的诊断和治疗中发挥作用。
鉴于 ULBP-4可能是一个肿瘤细胞特有的免疫排斥性抗原， 分泌到体液中。 因此， 血样或尿液中的 ULBP-4 的直接测定除了可以作为肿瘤的辅助诊断和愈后 的观察指标之外， 也可作为肿瘤早期诊断的依据。
除了作为诊断手段， ULBP- 4在肿瘤的外科手术上也有很大的应用价值， 有助 于确定肿瘤的浸润的深度， 具体边缘及隐藏的部分。 放射免疫指导外科 (radioi醒 unoguided surgery, RIGS)是将标记放射性同位素标记的肿瘤相关抗 原的抗体， 注射到体内进行显像分析， 它可以准确定位肿瘤浸润的范围。
在肿瘤的免疫治疗方面， 作为免疫排斥抗原， ULBP- 4或 ULBP4的融合蛋白可 与位于 NK细胞、 γ δ -TCR+ Τ细胞、 CD8+ α β -TCR+ Τ细胞表面的 NKG2D受体结 合， 激活这些细胞的活性， 释放出细胞毒素并杀死肿瘤细胞， 同时扩增这类抗肿 瘤细胞在体内的数量。 由于 ULBP-4仅位于肿瘤细胞表面， 它也可作为生物导弹 的导向系统， 在治疗肿瘤时将治疗药物集中于肿瘤区域提高治愈率， 同时降低药 物对全身的伤害。
在肿瘤疫苗方面， ULBP-4可用于制备分子瘤苗。 肿瘤疫苗是主动免疫的主要 内容， 分为细胞瘤苗、 亚细胞瘤苗、 分子瘤苗和基因瘤苗四种类型。 前二者为早 期的肿瘤疫苗， 临床效果参差不齐， 远期疗效多数不理想。 分子瘤苗是根据抗体 与抗原的作用关系， 制备抗肿瘤原独特型的抗抗体， 作为独特型瘤苗， 在临床上 也见到一定疗效。 肿瘤抗原肽可以产业化生产， 不会有肿瘤种植的危险， 不存在 肿瘤细胞的抑制成分。 用 ULBP- 4作为肿瘤抗原肽， 得到的分子疫苗不受 MHC 限
制， 且可以应用于多种肿瘤。 除了分子瘤苗外， 把 ULBP- 4基因串联在一起插入 病毒载体作为基因瘤苗也是一种较好的瘤苗方式。
另外， ULBP-4的膜外部分可用作免疫剌激因子， 与 NKG2D结合， 从而激活 NK 细胞、 T细胞等免疫细胞， 达到增强免疫力的效果。 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。 下列实施例中未注明具体条件的实验方法， 通常按照常规条件如 Sambrook等人， 分子克隆实验室手册（New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件， 或按照制造厂商所建议的条件。 实施例 1: ULBP-4基因的获得和定位
将 ULBP家族的三个基因 ULBPl , ULBP2 , ULBP3的蛋白序列对 HUMAN- EST库 做 tblastn,以寻找相关的 EST。结果在 ULBP123定位的染色体 contig (NT007285. 7) 的区段上游找到三条 EST: BI258059 , BE545401 , AL602601。 用 assembly软件拼 接， 然后同 contig(NT007285. 6)—起分析， 以获得 ULBP-4 编码区。 对拼接序列 进行编码蛋白预测， 发现从 403 碱基开始有一大读框， 但无终止码， 估计 3'端 不全。 利用 ensembl 的 genescan工具分析该染色体区段外显子预测情况， 发现 该染色体区段有一外显子密集区， 且有一段连续的外显子， 显示该基因的 3'端 可在染色体上延伸， 结果获得该基因的完整编码区。 具体序列如 SEQ ID NO : 1 所示。 其 0RF位于第 403- 1194位， 编码一个 263氨基酸的蛋白质（SEQ ID N0 : 2)， 其中氨基酸 1-23 为信号肽。 根据 ULBP- 4 的 EST 信息， 将其定位于染色体 6， q25. 1。 实施例 2: ULBP-4的多态性
合成如下引物， 以用常规方法构建的人体淋巴细胞株 Jurkat cDNA文库为模 板， 通过常规 PCR法克隆出基因 ULBP_4。
5'-cgggatccatgcgaagaatatccctgacttctag -3'(SEQ ID NO: 5)
5'-gccaagcttagacgtcctcaagggccagagac -3'(SEQ ID NO: 6)
从图 1中结果看出， 扩增片段大小约为 800bp， 和预测的 792bp—致。
将 PCR扩增片断克隆入载体后测序， 获得 SEQ ID N0 : 3所示序列， 与 SEQ ID
NO : 1相比， 有 7个位点核苷酸不同（图 2)。 编码的 ULBP- 4蛋白有 6个氨基酸不 同（图 3)。 与 MICA/B, ULPB家族极具多态性相符， 这证实 ULBP-4也具有多态性。 实施例 3: 对 ULBP-4的序列分析
将 ULBP-4与 RAE-1家族及 H60进行同源比对， 发现 ULBP- 4与 RAE-1没有同 源性， 但与 H60有 23. 8%同源性。 这暗示人的 ULBP-4可能是 H60的同源基因。
7 实施例 4: ULBP- 4的表达
ULBP- 的信号肽序列后加入了一段单克隆抗体识别序列（FLAG) , 改造后的 cDNA被插入逆转录病毒表达载体， 然后转染入小鼠 BaF/3 细胞， 利用免疫沉淀 和蛋白电泳方法证实了 ULBP-4 cDNA在哺乳细胞中的表达， 实验所得的分子量与 预测的相吻合， 约 32kDa。 实施例 5: ULBP-4的表达谱
用 ULBP- 4编码区内部引物， 通过 RT- PCR法， 分析 ULBP- 4在多种肿瘤细胞 和正常组织中的表达情况：
正向： 5' -atgcgaagaatatccctgacttctagc-3' (SEQ ID NO : 7)
反向： 5' -attttgccaccagacacagatgagaa-3' (SEQ ID NO : 8)
从图 4可见， 以管家基因 GAPDH (右）作为正对照， 在各个癌细胞株中均可得 到明显的阳性片段。 而以 ULBP- 4基因编码区内引物进行 PCR时， 在 U373 (星状 细胞瘤）、 JURKAT, HELA (宫颈鳞癌细胞）、 SW480 (结肠癌）、 DU145 (前列腺癌）这 5 个细胞株文库中可扩增出阳性片段， 说明在这些癌细胞中有 ULBP-4基因的表 达。
从图 5可见， ULBP- 4在正常组织中没有表达。 由于 ULBP-4在肿瘤组织中特 异性表达， 因此可作为肿瘤标记物。 实施例 6: ULBP-4与 NKG2D结合
分别用含有 ULBP-1、 -2、 -3 和 ULBP-4cDNA 的逆转录病毒表达载体转染小 鼠 Ba/F3细胞株。 转染细胞用可溶性的 NKG2D-Ig融合蛋白（图中粗线表示）或人 类 Ig (作为对照， 图中细线表示）标记后通过流式细胞仪， 免疫荧光法标记。
从图 6中可见， 未转染的 Ba/F3细胞株与 NKG2D- Ig融合蛋白及人类 Ig均不 结合， 而转染 ULBP- 1、 -2、 -3的细胞株可与 NKG2D_Ig融合蛋白结合， 显示其产 物均是 NKG2D 受体的配体， 与已有的报道吻合。 与此同时， ULBP- 4基因转染的 细胞株也可与 MG2D特异性地结合， 这不仅证实了 ULBP- 4 cDNA在哺乳动物细胞 内的表达， 同时说明该基因产物也是 NKG2D的配体。 实施例 7 ULBP-4蛋白重组表达和纯化
在该实施例中， 以实施例 2中的 PCR扩增产物为模板， 用序列如下的 5'和 3' 端的 PCR寡核苷酸引物进行扩增， 获得人 ULBP- 4 DNA作为插入片段。
5'端寡核苷酸引物序列为： 5， -ccgggatccTTGGAGATCATGGTTG GTGGTCACT- 3' (SEQ ID NO : 9)。 该引物含有 BamHI 限制性内切酶的酶切位点， 在该酶切位点 之后是不含信号肽序列的部分编码序列；
3'端引物序列为： 5' -ggccaagcttCCATCTATCTGGTAGACTAGAAGAA-3' (SEQ ID NO: 10)。 该引物含有 Hindlll限制性内切酶的酶切位点、 翻译终止子和人 ULBP- 4的 部分编码序列。
人 ULBP- 4 蛋白 cDNA PCR 产物纯化后经 BamHI， Hindlll 双酶切再与质粒 pProEXHTa (GIBCOBRL)按常规方法重组形成载体 pProEXHTa_ULBP_4并转化至感受 态大肠杆菌 DH5 α， 挑取阳性克隆鉴定后纯化并测序 (ΑΒΙ公司的 377型测序仪， BigDye Terminator试剂盒， PE公司）。 测序证实插入完整的 ULBP-4编码序列。
挑表达 ULBP- 4的阳性 DH5a克隆接种于 10ml LB培养基中， 37°C 300rpm振 荡培养过夜， 1:100稀释于接种于 LB培养基振荡培养 2. 5hr， 加 lOOmM IPTG至 0. ImM后 37°C诱导 2- 3hr， 5, 000g 4°C 离心 lOmin去上清， 置冰上用 50ml 上 样缓冲液 （0. 5M NaCl, 20mM咪唑 2. 7 mM KC1， 10. ImM Na2HP04, 1. 8mM KH2P04, pH8. 0) 重悬， 超声（B. Braun Labsonic U)破碎，然后 12， OOOg 4。C离心 lOmin, 上清用 0. 8μηι滤膜过滤后， 过 1ml Ni2+ 金属螯合 Sepharose 4B层析柱， 上样 缓冲液充分洗涤后， 加入 500ul咪唑洗脱缓冲液 （0. 5M NaCl, 500mM咪唑 2. 7 mM KC1， 10. ImM Na2HP04, 1. 8mM KH2P04, pH8. 0)室温静置 30分钟后收集洗脱液， 重 复洗脱 2-3 次， 得到人 ULBP- 4蛋白。 实施例 8抗 ULBP-4蛋白抗体的产生
将实施例 7 中获得的重组人 ULBP- 4蛋白用来免疫动物以产生抗体， 具体方 法如下。 重组分子用层析法进行分离后备用。 也可用 SDS- PAGE凝胶电泳法进行 分离， 将电泳条带从凝胶中切下， 并用等体积的完全 Freund' s佐剂乳化。 用 50- 100μ§/0. 2ml乳化过的蛋白，对小鼠进行腹膜内注射。 14天后，用非完全 Freund' s 佐剂乳化的同样抗原， 对小鼠以 50- 100μ§/0. 2ml 的剂量进行腹膜内注射以加强 免疫。 每隔 14 天进行一次加强免疫， 至少进行三次。 获得的抗血清的特异反应 活性用它在体外沉淀人 ULBP- 4 蛋白基因翻译产物的能力加以评估。 结果发现， 抗体可特异性地与本发明蛋白发生结合。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考， 就如同每一篇文献被 单独引用作为参考那样。 此外应理解， 在阅读了本发明的上述讲授内容之后， 本 领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改， 这些等价形式同样落于本申请所 附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
- 权 利 要 求 书1.一种分离的人 ULBP-4多肽， 其特征在于， 它包含： 具有 SEQ ID NO: 2或 4 氨基酸序列的多肽、 或其保守性变异多肽、 或其活性片段、 或其活性衍生物。
- 2.如权利要求 1所述的多肽，其特征在于，该多肽具有选自下组的氨基酸序列- SEQ ID NO: 2或 4中 1-263位或 24-263位氨基酸序列。
- 3.—种分离的多核苷酸， 其特征在于， 它包含一核苷酸序列， 该核苷酸序列 与选自下组的一种核苷酸序列有至少 70%相同性：(a)编码如权利要求 1和 2所述多肽的多核苷酸； '(b)与多核苷酸 (a)互补的多核苷酸。
- 4.如权利要求 3所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码具有 SEQ ID NO:2或 4中 1-263位或 24-263位氨基酸序列的多肽。
- 5.如权利要求 3所述的多核苷酸， 其特征在于， 该多核苷酸的序列选自下组的 一种：(a) 具有 SEQ ID NO: 1中 403-1194位的序列；(b) 具有 SEQ ID NO: 1中 1-1434位的序列；(c) 具有 SEQ ID NO: 1中 473-1194位的序列；(d) 具有 SEQ ID NO: 3中 1-792位的序列；(e) 具有 SEQ ID NO: 1中 70-792位的序列。
- 6.—种载体， 其特征在于， 它含有权利要求 3所述的多核苷酸。
- 7.—种遗传工程化的宿主细胞， 其特征在于， 它含有权利要求 6所述的载体。
- 8. —种 ULBP-4蛋白的制备方法， 其特征在于， 该方法包含：(a)在适合表达的条件下， 培养权利要求 7所述的宿主细胞；(b)从培养物中分离出 ULBP-4蛋白。
- 9.一种能与权利要求 1所述的 ULBP-4蛋白特异性结合的抗体。
- 10.—种检测样品中是否存在 ULBP-4蛋白的方法， 其特征在于， 包括： 将样品与 ULBP-4蛋白特异性结合的抗体接触， 观察是否形成抗体复合物， 形成了抗体复合物就表示样品中存在 ULBP-4蛋白。
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