JP2000509970A

JP2000509970A - ヒトカヘキシー関連タンパク質

Info

Publication number: JP2000509970A
Application number: JP09536295A
Authority: JP
Inventors: エイカーブラム、イングリッド・イー; マリー、リン・イー
Original assignee: Incyte Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Incyte Corp
Priority date: 1996-04-05
Filing date: 1997-04-01
Publication date: 2000-08-08
Also published as: CA2250868A1; AU2557997A; WO1997038100A1; US5834192A; EP0891424A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、乳房腫瘍ライブラリーから単離された、ヒトカヘキシー(悪液質)関連タンパク質（ＨＣＡＰ）を同定し、コードするポリヌクレオチドを提供する（大文字の略号及び小文字の略号の意味は明細書に記載されている）。本発明は、ＨＣＡＰをコードする核酸配列を含む、遺伝子工学的処理をなされた発現ベクター及び宿主細胞を提供する。本発明はまた、重度のまたは中程度の肥満症の治療における精製ＨＣＡＰの治療的使用、及び腫瘍誘導性カヘキシーの治療におけるアンチセンス分子、抗体、アゴニスト、またはインヒビターの治療的使用を提供する。本発明はまた、このポリヌクレオチドやそのフラグメント、若しくはこのポリペプチドに特異的に結合する抗体を含む診断用組成物を利用する診断アッセイについても記述している。

Description

【発明の詳細な説明】ヒトカヘキシー関連タンパク質技術分野本発明は分子生物学の分野に属するものであり、本発明は特に、ヒトカヘキシー関連タンパク質の核酸及びアミノ酸配列に関するものである。背景技術癌に関連する特性食欲減退は、カヘキシーとして知られている。体重減少の原因は、癌に起因する、味覚及び嗅覚の問題、消化管の機能障害、必要エネルギー量を満たすに不十分な栄養摂取量を含むいくつかの寄与因子が関係してきた。グルコースでなく脂肪酸の酸化のような生化学的異常によって嫌気性グルコース代謝が高まり、また酸化的リン酸化の減少が認められた。しかし、これらの知見の何れもが、門段の大きさを説明するものではない。典型的には、癌患者は十分な食物を摂取せず、非嗜好性、吐き気、及び肉類の嫌悪を訴える。経腸または静脈内経路による栄養補給法は、たとえ悪性疾患の経過には影響を及ぼさないものであっても、良性疾患の好適な管理方法であった。栄養補給は、外科手術手順または化学療法を受けている食欲不振の患者における救命手段である。現在までに、炎症細胞及び腫瘍細胞から放出される発熱性サイトカインは、カヘキシーの一因となっていると考えられていた。実際には、実験動物に与えると、サイトカイン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）またはカケクチンが、カヘキシーの実験モデルを作り出す。現在、ＴＮＦαがインスリンのような他の分子とともに、関連タンパク質、癌悪液性因子（ＣＣＦ；Todorov Ｐらの論文、 (1996)Nature379:739-742）の活性を媒介することが明らかになった。ＣＣＦは、脂質移動因子（McDivitt ＴＭら(1995)Cancer Res55:1458-63）として特徴付けらたもので、初めに同定され精製された２４ｋＤのタンパク質である。ＣＣＦは、マウスの腺癌（ＭＡＣ１６）細胞から単離された。そしてＣＣＦは血流に分泌され、筋肉異化の誘発によりカヘキシーを誘発する。ＣＣＦがマウスに投与されると、定常の食物と水を摂取しているにも関わらず体重が減少し、除脂肪体重の減少を超える脂肪組織の減少がみられ、かつ顕著な低血糖が生じる。ＣＣＦの導入の一日前に抗ＣＣＦ抗体をマウスに投与すると、るいそう（wasting）が寛解される。ＣＣＦは、プロテナーゼ、キモトリプシン、トリプシン、及びペプシンによるタンパク分解に対する耐性を有する。ウェスタンブロットにおいて、マウス抗ＣＣＦ抗体はまた、カヘキシーを伴う癌患者の尿において２４ｋＤのヒトタンパク質を認識する。この２４ｋＤバンドは、健常者の被験者、カヘキシーを発症していたに患者、または非るいそう性ＭＡＣ１３腫瘍をもつマウスの尿においては存在しなかった。ここに開示する新規なヒトカヘキシー遺伝子の発見は、癌誘発性カヘキシーの研究や介入のための機会を与えてくれる。この核酸配列を用いて、臨床的徴候が出てくる前にるいそう（wasting）の発症を診断するのに役立つＰＣＲ法に基づくアッセイを設計することができる。このタンパク質のアンチセンス分子やインヒビターを与えることによってるいそうを寛解させられるが、これは外科的処置や化学療法を受けている癌患者の健康に著しい効果を及ぼす手段となる。発明の開示本発明は、その核酸配列が乳房腫瘍ライブラリー（BRSTTUT01）に由来するポリヌクレオチドのなかから同定された新規なヒトカヘキシー関連タンパク質に関するものである。本発明はまた、疾病の研究、診断、予防、及び治療における、そのポリヌクレオチド（記号は小文字のｈｃａｐ）及びポリペプチド（記号は大文字のＨＣＡＰ）の使用にも関する。ヒトカヘキシー関連タンパク質をコードするこの新規なポリヌクレオチドは、インサイト社クローンＮＯ．607227において、コンピュータサーチにより始めに同定された。このコンピュータサーチでは、マウスの癌悪液性因子（ＣＣＦ）に由来する既知の２０個のＮ末端アミノ酸残基と、翻訳されたインサイト社配列とのアミノ酸アライメントを探した。ｈｃａｐのコード化領域は、９０個のアミノ酸からなる成熟タンパク質（配列番号：２）をコードする。ｈｃａｐヌクレオチド配列の顕著な特徴は、２つの潜在性開始コドン（一方はＡ₅₅から始まり他方はＡ₆₄から始まる）及びＧ₃₈₇の停止コドンの存在である。この新規なＨＣＡＰは、１６〜１９個のアミノ酸残基（Ｍ₁またはＭ₄からＣ₁₈またはＡ₁₉まで）をコードするシグナル配列と、Ｙ₂₀からＡ₃₉までのアミノ酸残基とマウスＣＣＦ（Todo rov Ｐらの論文、(1996)Nature379:739-742）との、２点Ｎ₃₂及びＣ₃₄の２点を除いた一致またはアライメントとにより特徴付けられる。シグナル配列の分泌及び切断の終了後、Ｃ₃₄残基は、約２４ｋＤのポリペプチドを生成するための二量体化に関与している可能性がある。本発明及びその使用は、ＨＣＡＰがＣＣＦタンパク質の既知の部分に類似性を有するという事実に部分的に基づいている。その使用はまた、ヒト乳房腫瘍ライブラリー（BRSTTUT01）におけるｈｃａｐ転写物の存在にも基づいている。ｈｃａｐ核酸配列、そのオリゴヌクレオチド、フラグメント、部分、またはアンチセンス分子は、ｈｃａｐの発現を検出するための体液または生検組織の診断アッセイにおいて使用され得る。例えば、ｈｃａｐ配列を用いて、実際にるいそうが発症する前に癌患者におけるｍＲＮＡ転写物の存在を検出したり、治療の際にｈｃａｐレベルを監視することができる。本発明はまた、ＨＣＡＰをコードする核酸を含む発現ベクター及び宿主細胞にも関する。このようなトランスフェクト宿主細胞は、ＨＣＡＰの産生及び回収に役立つ。本発明は、重症または中程度の肥満症の治療のため、高度に制御された条件の下で、抗体の産生及びアンタゴニスト及びインヒビターの選別のために精製ＨＣＡＰを用いることも、その範囲に含む。本発明は更に、自然発生ＨＣＡＰの検出のための診断キットを提供する。また本発明によれば、ポジティブコントロールとして精製ＨＣＡＰを使用し、例えば尿や血液やＨＣＡＰが発現される生検組織の抽出物のような体液におけるＨＣＡＰレベルを監視するために抗ＨＣＡＰ抗体を使用する。更に、カラム式ろ過装置に付着した抗ＨＣＡＰ抗体は、腎臓透析の限外濾過に類似した方式で患者の血液からＨＣＡＰを除去することができる。本発明はさらに、ＨＣＡＰの発現が関与する状態や疾病の治療のための方法を含む。これらの方法では特に、ＨＣＡＰによる筋肉るいそう効果を治療するために、例えばアンチセンス配列、抗体、アンタゴニスト、及びインヒビターのような医薬品組成物を投与する過程を含む。本発明は、ｈｃａｐを生成する腫瘍に送達され得るアンチセンス配列を含むベクターを含む医薬品組成物を提供する。例えば、ｈｃａｐ結合配列はアデノウイルスに導入され得、その表面に腫瘍標的分子を備えたリポソームを用いて特定の腫瘍に送達され得る。これらの結合配列の効果的なトランスフェクション及び発現は、翻訳の前にｈｃａｐ転写を不活化するか、下方制御することができる。他の医薬品組成物には、分泌されたＨＣＡＰの存在を低減または除去するために血管を通して循環され得る抗体、アンタゴニスト、インヒビターが含まれる。図面の簡単な説明第１Ａ図及び第１Ｂ図は、ヒト乳房腫瘍に由来するカヘキシー関連タンパク質（ＨＣＡＰ）の核酸配列（配列番号：１）及び予測アミノ酸配列（配列番号：２）を示した図である。核酸及びアミノ酸のアライメントは、MacDNAsis（日立エンジニアリング社製）を用いて作成された。第２図は、マウスの癌悪液性因子（ＣＣＦ；Todorov Ｐらの論文、(1996)Natu re379:739-742）の既知の２０個のアミノ酸残基とＨＣＡＰ（配列番号：２）とのアミノ酸配列アライメントを示した図である。配列は、DNASTARソフトウェア（DNASTAR社、Madison ＷＩ）のマルチシーケンスアライメントプログラム（mul tisequence alignment program）を用いてアライメントが作成された。発明の実施の形態本発明は、その核酸配列が乳房腫瘍ライブラリー（BRSTTUTO1）に由来するポリヌクレオチドのなかから同定された新規なヒトカヘキシー関連タンパク質に関するものである。本発明はまた、疾病の研究、診断、予防、及び治療における、そのポリヌクレオチド（記号は小文字のｈｃａｐ）及びポリペプチド（記号は大文字のＨＣＡＰ）の使用にも関する。ペプチドシークエンシングを用いて決定された２４ｋＤのマウスのＣＣＦ（To dorov Ｐらの論文、(1996)Nature379:739-742）に由来する２０個のＮ末端アミノ酸残基を用いて、インサイト社のデータベースを検索した。インサイト社クローンＮｏ．607227（第１Ａ図及び第１Ｂ図）の翻訳物は、それらのアミノ酸配列と９０％以上の類似性を有しており、続けて行われた分析により、予測されたシグナル配列をコードする、適当な距離だけ上流に存在する潜在性翻訳開始部位が同定された。インサイト社クローンＮｏ．607227が、ポリヌクレオチドの予測された同じ５’位置においてＣＣＦと９０％の相同性を有しているという事実は、インサイト社クローンＮｏ．607227がマウスのＣＣＦのヒトホモログを表していることを示している。乳房腫瘍組織から調製されたライブラリーにおいてこのクローンが同定されたことがこのことを支持している。更に、乳癌患者に由来する一致した非腫瘍性サンプルから調製されたｃＤＮＡライブラリーにおいてこの配列が存在しないことが、このことを支持している。インサイト社クローンＮｏ．607227において見出されたｈｃａｐ分子のコード化領域は、９０個のアミノ酸からなる成熟タンパク質（配列番号：２）をコードする。ｈｃａｐヌクレオチド配列の顕著な特徴は、２つの潜在性開始コドン（一方はＡ₅₅から始まり他方はＡ₆₄から始まる）及びＧ₃₈₇の停止コドンの存在である。この新規なＨＣＡＰは、１６〜１９個のアミノ酸残基（Ｍ₁またはＭ₄からＣ₁₈ またはＡ₁₉まで）をコードするシグナル配列と、Ｙ₂₀からＡ₃₉までのアミノ酸残基とマウスＣＣＦ（Todorov Ｐらの論文、(1996)Nature379:739-742）との、２点Ｎ₃₂及びＣ₃₄の２点を除いた一致またはアライメントとにより特徴付けられる。シグナル配列の分泌及び切断の終了後、Ｃ₃₄残基は、約２４ｋＤのポリペプチドを生成するための二量体化に関与している可能性がある。本発明及びその使用は、ＨＣＡＰが、マウスＣＣＦタンパク質の既知の部分に対して類似性を有するという事実に、部分的に基づいている。本発明の使用は、ヒト乳房腫瘍ライブラリー（BRSTTUT01）のみにおけるｈｃａｐ転写物の存在にも、部分的にその基礎を置いている。ｈｃａｐ核酸配列、そのオリゴヌクレオチド、フラグメント、部分、またはアンチセンス分子は、ｈｃａｐの発現を検出するための体液または生検組織の診断アッセイにおいて使用され得る。例えば、ｈｃａｐ配列を用いて、実際にるいそうが発症する前に癌患者におけるｍＲＮＡ転写物の存在を検出したり、治療の際にｈｃａｐレベルを監視することができる。本発明はまた、ＨＣＡＰをコードする核酸を含む発現ベクター及び宿主細胞にも関する。このようなトランスフェクト宿主細胞は、ＨＣＡＰの産生及び回収に役立つ。本発明は、重症または中程度の肥満症の治療のため、高度に制御された条件の下で、抗体の産生及びアンタゴニスト及びインヒビターの選別のために精製ＨＣＡＰを用いることも、その範囲に含む。本発明は更に、自然発生ＨＣＡＰの検出のための診断キットを提供する。また本発明によれば、ポジティブコントロールとして精製ＨＣＡＰを使用し、例えば尿や血液やＨＣＡＰが発現される生検組織の抽出物のような体液におけるＨＣＡＰレベルを監視するために抗ＨＣＡＰ抗体を使用する。更に、カラム式ろ過装置に付着した抗ＨＣＡＰ抗体は、腎臓透析の限外濾過に類似した方式で患者の血液からＨＣＡＰを除去することができる。本発明はさらに、ＨＣＡＰの発現が関与する状態や疾病の治療のための方法を含む。これらの方法では特に、ＨＣＡＰによる筋肉るいそう効果を治療するために、例えばアンチセンス配列、抗体、アンタゴニスト、及びインヒビターのような医薬品組成物を投与する過程を含む。本発明は、ｈｃａｐを生成する腫瘍に送達され得るアンチセンス配列を含むベクターを含む医薬品組成物を提供する。例えば、ｈｃａｐ結合配列はアデノウイルスに導入され得、その表面に腫瘍標的分子を備えたリポソームを用いて特定の腫瘍に送達され得る。これらの結合配列の効果的なトランスフェクション及び発現は、翻訳の前にｈｃａｐ転写を不活化するか、下方制御することができる。他の医薬品組成物には、分泌されたＨＣＡＰの存在を低減または除去するために血管を通して循環され得る抗体、アンタゴニスト、インヒビターが含まれる。本明細書における「核酸配列」なる用語は、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列、及びそのフラグメントまたは一部分の配列を意味し、且つ、一本鎖または二本鎖でありセンス鎖かアンチセンス鎖の何れかを表すゲノムのまたは合成のＤＮＡかＲＮＡを意味する。同様に、本明細書におけるアミノ酸配列とは、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列を意味する。（Ｐ５Ｆ）本明細書における「ペプチド核酸配列」とは、リジンのようなアミノ酸残基やアミノ基が加えられたオリゴマーを含む分子を意味する。これらの小分子は抗遺伝子剤とも称され、それらに対する核酸の相補的（鋳型）鎖と結合することによって転写物伸長を停止させる（Nielsen ＰＥ et al.(1993)Anticance r Drug Des 8:53.63）。本明細書において、ＨＣＡＰとは、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、好ましくはヒトを含む任意の種、特に哺乳類から得られるＨＣＡＰを意味する。ＨＣＡＰは自然発生形態であるか、或いは天然、合成、半合成、又は組換え体何れかの源に由来するＨＣＡＰである。ここで、「天然または自然発生」とは、天然に見出されるアミノ酸配列を意味する。本発明は、その範囲にＨＣＡＰ変異体を含む。好適なＨＣＡＰ変異体は、ＨＣＡＰアミノ酸配列（配列番号：２）に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列の類似性を有するものであり、より好ましい変異体は９０％のアミノ酸配列の類似性を有するものであり、最も好ましいのは９５％の類似性を有する変異体である。ＨＣＡＰの「変異体」は、１または２個所以上のアミノ酸の「置換」によって異なるアミノ酸配列を有し得る。変異体は、例えばロイシンからイソロイシンへの置換のような、構造的または化学的特性が類似したアミノ酸で置換される「保存的」変化を有し得る。頻度はより少ないが、変異体は、例えばグリシンからトリプシンへの置換のような、「非保存的」変化を有し得る。類似したマイナーな変異体は、アミノ酸の欠失や挿入、或いはその双方を含み得る。例えばＤＮＡＳＴＡＲｓｏｆｔｗａｒｅのような従来のコンピュータプログラム技術を用いて、生物学的或いは免疫学的活性を損なわずに、置換、挿入、または除去できるアミノ酸の数を決定する方法がわかっている。「生物学的に活性」なる用語は、自然発生ＨＣＡＰの構造的な、調節の、または生化学的機能を有するＨＣＡＰを意味する。同様に、「免疫学的活性」とは、天然、組換体、または合成ＨＣＡＰ、またはその任意のオリゴペプチドの、適当な動物や細胞における特定の免疫反応を誘発し、特定の抗体に結合する能力として定義される。本明細書において「誘導体」なる用語は、ＨＣＡＰまたはコード化されたＨＣＡＰの化学的修飾を意味する。このような修飾の例には、水素からアルキル基、アシル基、またはアミノ基への置換がある。ＨＣＡＰ誘導体は、天然ＨＣＡＰの必要不可欠な生物学的特性を保持しているポリペプチドをコードしている。本明細書において「精製」なる用語は、その天然の環境から取り除かれ、天然にはそれが結びついて存在する少なくとも１つの他の成分から単離または分離された核酸配列またはアミノ酸配列を有する分子を意味する。ＨＣＡＰコーディング配列ＨＣＡＰの核酸配列及び予測アミノ酸配列を第１Ａ図〜第１Ｂ図に示す。本発明によれば、ＨＣＡＰのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、ＨＣＡＰを発現する組換え分子を生成することができる。ここに開示する特定の実施例では、ＨＣＡＰの部分的配列が、ヒト乳房腫瘍ライブラリー（BRSTTUT01）に由来するインサイト社クローンＮｏ．607227の中から初めに単離された。前記ライブラリーについては、１９９５年１１月１５日に出願された、Stuart Ｓらによる“Polynucleotides and Polypeptides Derived from Human Breast”なる名称の米国特許出願第６０／００６，８１０号に記載されており、本明細書と一体に参照されたい。ＤＮＡ配列決定のための方法は周知であり、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ，Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（商標）のクラノウフラグメント（ＵＳBiochemical社,Clevel and ＯＨ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin elmer社，Foster City ＣＡ）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Amersham社，Chicago ＩＬ）、或いはGibco BRL（Gaith ersburg ＭＤ）Methods社から市販されているＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システムのような組換えポリメラーゼとプルーフリーディングエキソヌクレアーゼとの組み合わせのような酵素を使用する。対象となるＤＮＡテンプレートにアニールされたオリゴヌクレオチドプライマからＤＮＡを延長する方法は、一本鎖テンプレート及び二本鎖テンプレートとの両方に対して開発されてきている。連鎖終了反応の生成物は電気泳動を用いて分離され、それに組み込まれた標識された前駆体を介して検出される。最近の機械化反応調製、配列決定並びに解析における改善によって、１日当たりに決定できる配列数が増えた。好適にはこの処理は、ＨａｍｉｌｔｏｎＭｉｃｒｏＬａｂ２２００（Hamilton社，Reno ＮＶ）、ＰｅｌｔｉｅｒＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ２００；ＭＪ Reserch社，Watertown ＭＡ）並びにＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Perkin Elmer）、及びＣａｔａｌｙｓｔ８００及び３７７及び３７３ＤＮＡシーケンサのような装置を用いて自動化される。特定のｃＤＮＡライブラリの品質は、ｃＤＮＡのパイロットスケール分析を実行することにより、さらにはクローン含有ベクター、λ或いはＥ．ｃｏｌｉＤＮＡ、ミトコンドリア或いは反復ＤＮＡ、並びに公的データベースに厳密に一致、或いは相同的に一致するクローンのパーセンテージを検査することにより決定される。ポリヌクレオチド配列の延長ポリヌクレオチド配列ｈｃａｐは、部分的なヌクレオチド配列と、プロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当業者には周知の様々な方法とを用いて延長することができる。Gobinda等（1993;ＰＣＲ Methods Appli c 2:318-22）は既知の部位に隣接する未知の配列を検索するために汎用プライマーを用いる直接的な方法として「制限部位」ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を開示している。ここでは、まずゲノムＤＮＡが、既知の領域に対して特異的なプライマー及びリンカー配列に対するプライマーの存在下で増幅される。増幅された配列は、その同じリンカープライマー及び最初のプライマーの内部に含まれる別の特異的プライマーを用いてＰＣＲの２巡目にかけられる。ＰＣＲの各回の生成物は、適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列決定される。逆ＰＣＲ法は、既知領域に基づく分岐プライマーを用いて配列を増幅、または延長するために用いることができる（Triglia等（1988）Nucleic Acids Res 16:8186）。プライマーは、Ｏｌｉｇｏ４．０（National Bioscience s社，Plymouth ＭＮ）或いは別の適切なプログラムを用いて設計され、長さが２２−３０ヌクレオチドで、５０％以上のＧＣ含有率を有し、かつ約６８−７２℃ の温度で標的配列にアニールする。この方法ではいくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域における適切なフラグメントを生成する。次いでこのフラグメントは分子内ライゲーションにより環状にされ、ＰＣＲ鋳型として使用される。キャプチャＰＣＲ法（Lagerstrom Ｍ等（1991）ＰＣＲ Methods Applic 1:111 -19）は、ヒト及び酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ内の既知の配列に隣接するＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅をするための方法である。またキャプチャＰＣＲでは、多数の制限酵素の消化及びライゲーションによってＰＣＲ前にＤＮＡ分子の未知の部分に、工学的処理をなされた二本鎖配列を配置する必要がある。 Parker ＪＤ等（1991;Nucleic Acids Res 19:3055-60）は、歩行ＰＣＲ、すなわち未知の配列の検索ができる標的遺伝子歩行のための方法を教示している。ＰｒｏｍｏｔｅｒＦｉｎｄｅｒ（登録商標）、Clontech社（Palo Alto CA）から入手できる新しいキットでは、ＰＣＲ、入れ子状（nested）プライマ一並びにプロモータファインダライブラリーを用いて、ゲノムＤＮＡ内を歩行させる。この過程は、ライブラリーをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エクソン接合部を探し出すのに有用である。別のＰＣＲ方法としては、Guebler等による１９９５年６月７日出願の米国特許第０８／４８７，１１２号「Improved Method for Obtaining Full Lengthc D NA Sequences」に開示されたものがあり、この明細書を本明細書と一体に参照されたい。この方法では、ＸＬ−ＰＣＲ（登録商標）（Perkin lmer社,Foster Cit y ＣＡ）を用いて、ヌクレオチド配列を増幅、並びにまた延長する。完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするための好適なライブラリーは、サイズ選択された、より大きなｃＤＮＡを含むライブラリーである。またランダムに初回刺激を与えられた(primed)ライブラリーは、遺伝子の５’及び上流領域を含むより多くの配列を含むという点で好適である。ランダムに初回刺激を与えられたライブラリーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを生成しない場合、特に有用ある。ゲノムライブラリーは、プロモータ結合領域の５’を延長するために有用である。サイズがどのくらいかを分析したり、或いは配列決定やＰＣＲ処理の産物のヌクレオチド配列を確認するための新しい方法はキャピラリー電気泳動法である。迅速な配列決定のためのシステムは、Perkin elmer社、Beckman Instruments社（Fullerton ＣＡ）並びに他の企業から入手できる。キャピラリー電気泳動法では、電気泳動分離のための流動性ポリマー、レーザで活性化される４つの異なる蛍光色素（各ヌクレオチドに対して１つ）を使用し、ＣＣＤカメラによる放射線の波長の検出を行う。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えばPerkin elmer 社製のGenotyper（登録商標）及びSequence Navigator（登録商標））を用いて電気信号に変換され、サンプルのロードからコンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコンピュータ制御される。キャピラリー電気泳動法は特定のサンプルの限定された量の中に存在するＤＮＡの小片の配列決定に特に適している。この方法により３０分間でＭ１３ファージＤＮＡの３５０ｂｐを再現可能な形で配列決定できたことが報告されている（Ruiz-Martinez ＭＣ等（1993）Anal C hem65:2851-8）。ヌクレオチド配列の発現本発明に従って、ＨＣＡＰ、そのポリペプチドのフラグメント、融合タンパク質或いはその機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列を、適切な宿主細胞内でのＨＣＡＰの発現を誘導する組換えＤＮＡ分子を生成するために用いることができる。遺伝子コードの固有の縮重のために、概ね同一か或いは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も、ＨＣＡＰのクローン化や発現のために用いることができる。当業者には理解できるように、非自然発生コドンを有するＨＣＡＰコード化ヌクレオチド配列を生成することは有益であり得る。特定の原核宿主或いは真核宿主において好適なコドン（Murray Ｅ等（1989）;Nu cleic Acids Res 17:）を、例えば、ＨＣＡＰ発現率を高めたり、或いは自然発生配列から生成された転写産物より長い半減期のような望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写産物を生成したりするように選択することができる。また本発明の範囲に含まれるものとして、中程度から最高度の厳密性の条件の下で、第１Ａ図及び第１Ｂ図のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なポリヌクレオチド配列がある。ハイブリダイゼーション条件は、Berger及びKimmel（ 1987，Guid et Ｍolecular Cloning Techniques，Methods in Enzymology， Vol 152，Academic Press，San Diego ＣＡ）により教示され、ここで引用して組み込んでいるように、核酸結合複合体の融点（Ｔｍ）に基づいており、以下に説明するように、定義された「厳密性」を与える。「最高度の厳密性」は典型的に約Ｔｍ５℃（プローブのＴｍより５℃下）で発生し、「高度の厳密性」はＴｍの約５〜１０℃下で発生し、「中程度の現密性」はＴｍの約１０〜２０℃下で発生し、「低度の現密性」はＴｍの約２０〜２５℃ 下で発生する。当業者には理解できるように、最高度に厳密なハイブリダイゼーションは、同一のポリヌクレオチド配列を同定、すなわち検出するために用いることができるが、一方中程度（或いは低度）に厳密なハイブリダイゼーションは類似の、すなわち近縁なポリヌクレオチド配列を同定、すなわち検出するために用いられる。ここで用いるような用語「ハイブリダイゼーション」は「核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する過程」（CoombeＪ（1994）Dictionary of Biotechnology，StocktonPress社，Ne w York）を含む概念である。従って定義により、ハイブリダイゼーションは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術で実行されるような増幅のプロセスを含むものである。このＰＣＲ技術についてはDieffenbach ＣＷ and ＧＳＤ veksler（1 995,ＰＣＲ Primer,a Laboratory Manual,Cold，Ｓpringｋ＿arborPress社,New york）の論文に記載されており、本明細書と一体に参照されたい。本明細書において「欠失」とは、１または２以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基が欠ける、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化として定義される。本明細書において「挿入」或いは「付加」とは、天然ＨＣＡＰに比べて、結果的に１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ酸残基の加わるようなヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。本明細書において「置換」とは、１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ酸を異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置換することによって生ずる変化を指す。本発明において用いられ得る変化したｈｃａｐポリヌクレオチド配列は、異なるヌクレオチド残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に同一の、または機能的に等価のＨＣＡＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとなる。そのタンパク質も、サイレント変化を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に機能的に等価なＨＣＡＰとなる。慎重なアミノ酸置換は、ＨＣＡＰの生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性並びにまた両親媒性についての類似性に基づいてなされ得る。例えば負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、同じ親水値を持つ帯電しない極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン並びにチロシンが含まれる。本発明の範囲に含まれるものとして、ｈｃａｐのアレルがある。ここで用いる「アレル」或いは「アレル配列」とは、ｈｃａｐの別の形態である。アレルは変異、すなわち核酸配列の変化に起因し、一般に変化したｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生成し、そのｍＲＮＡ或いはポリペプチドの構造或いは機能は変更される場合もあれば、されない場合もある。遺伝子によっては、アレル形態がないもの、１つあるもの、或いは多数存在するものがある。アレルを生じる変異は一般に、アミノ酸の欠失、付加並びに置換に起因する。このタイプの変化はそれぞれ単独で、或いは他の遺伝子の組み合わせで、与えられた配列内一回またはそれ以上の回数生じ得る。本発明のヌクレオチド配列は、様々な理由によりＨＣＡＰコーディング配列を変更するために遺伝子工学的処理をなされ得、限定はしないが遺伝子生成物のクローニング、プロセッシング並びにまた発現を変更する別形態を含む。例えば、変異は、当業者には周知の技術、例えば特定部位突然変異誘発を用いて導入され、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン選好の変化等をもたらすことができる。本発明の別の実施例では、変更ｈｃａｐ或いは組換えｈｃａｐが、異種の配列に結合され、融合タンパク質をコードする配列となる。例えば、ＨＣＡＰ活性のインヒビターを選び出すべくペプチドライブラリをスクリーニングするために、市販の抗体により認識される異種のペプチドを発現するキメラＨＣＡＰタンパク質をコード化することが役立つことがある。融合タンパク質はＨＣＡＰ配列と異種のタンパク質配列との間の位置に切断部位を包含するように設計することもでき、これによってＨＣＡＰを切断して、異種の部分から分けて精製することが可能となる。本発明の別の実施例では、ＨＣＡＰコード化配列は、当業者によく知られた化学的方法を用いて、（Caruthers等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223、C rea,Horn（1980）Nuc Acids Res 9:2331、Matteucci,Caruthers（1980）Tetrahe dron Lett 21:719、Chow，Kempe（1981）Nuc Acids Res9:2807-2817参照）全体的に、或いは部分的に合成することができる。別法では、ＨＣＡＰアミノ酸配列を、全体的に或いは部分的に合成する化学的方法を用いてタンパク質自体を生成することができる。例えば、ペプチド合成は、様々な固相技術（Roberge ＪＹ等（1995）Science 269:202-204）を用いて実行できるが、自動化した合成も、例えば、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ４３１Ａペプチド合成器を用いて、製造者により提供される使用説明書に従って達成される。新たに合成されたペプチドは、分離のための高速液体クロマトグラフィにより精製することができる（例えばCreighton（1983）Proteins Structure And Molecular Principles, ＷＨ Freeman and Co,New york参照）。合成されたペプチドの構成は、アミノ酸解析或いは配列決定処理により確認することができる（例えばthe Edman degrad ation procedure; Creighton，上述）。さらにＨＣＡＰのアミノ酸配列、或いはその任意の部分を、その直接の合成の際に変更したり、また他の細胞内メディエータ或いはその任意の部分に由来する配列と化学的方法を用いて結合して、変異体ポリペプチドを生成することができる。発現系生物学的に活性のＨＣＡＰを発現するために、ＨＣＡＰコード化ヌクレオチド配列、或いはその機能的等価物は、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコード化配列の転写及び翻訳に必要不可欠な要素を含むベクターに挿入される。ＨＣＡＰコード化配列及び適切な転写や翻訳の制御要素を含む発現ベクターを構成するために当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、in vitro 組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo組換え即ち遺伝子組換え技術が含まれる。このような技術は、Maniatis等（1989）Molecular Cloning，Ａ Labora tory Manual，Cold Spring Harbor Press,Planview ＮＹ及びAusubel ＦＭ等Cur rent Protocol in Molecular Biology,John Wilky ＆Sons,New John Wilky ＆S ons,New Yorkに記載されている。種々の発現ベクター／宿主系が、ＨＣＡＰコード化配列を保持し発現するために利用される。このようなものには、限定はされないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換したバクテリア、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスＣａＭＶ、タバコモザイクウイルスＴＭＶ）をトランスフェクトした、或いはバクテリア発現ベクター（例えばＴｉ、或いはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換した植物細胞系、或いは動物細胞系を含む。これらの系の「制御エレメント」或いは「調節配列」は、その力及び特異性は様々で、ベクターの非翻訳領域、エンハンサ、プロモータ及び３’非翻訳領域であり、これらは転写及び翻訳を実行するために宿主細胞のタンパク質と相互作用する。利用されるベクター及び宿主に応じて、構成的及び誘導性プロモータを含む、任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントが用いられ得る。例えば、バクテリア系においてクローニングする際には、Blue script（商標）phagemid（Stratagene社,LaJolla CA）のｈｙｂｒｉｄｌａｃＺプロモータ及びｐｔｒｐ−ｌａｃｈｙｂｒｉｄ並びに同様の誘導性プロモータが用いられる。バキュロウイルスポリヘドリンプロモータは昆虫細胞において用いられる。植物細胞のゲノム（例えば熱ショック，ＲＵＢＩＳＣＯ及びストレージタンパク質遺伝子）に由来する、或いは植物ウイルス（例えばウイルス性プロモータ或いはリーダ配列）に由来するプロモータ或いはエンハンサはベクターにクローン化され得る。哺乳動物細胞では、哺乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルス由来のプロモータが最適である。ｈｃａｐの多数の複製を含む株細胞を生成する必要がある場合には、ＳＶ40或いはＥＢＶに基づくベクターを、適切な選択マーカーと共に用いる。細菌系では、ＨＣＡＰを発現するための用途に応じて多数の発現ベクターが選択され得る。例えば抗体を誘発するために大量のＨＣＡＰが必要とされる場合は、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を可能とするベクターが望まれる。そのようなベクターには、限定はしないが、E.coilクローニング及び発現ベクターBluescript（商標）（このベクターにおいて、ＨＣＡＰコード化配列が、アミノ基末端メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列を用いてフレーム内においてベクターに結合されてハイブリッドタンパク質が生成される）や、pINベクター（Van Heeke＆Schuster（1989）Ｊ Biol Chem 264:550 3-5509）等が含まれる。またpGEXベクター（Promage社、Madison Ｗ1）もグルタチオンＳ−トランスファーゼ（ＧＳＴ）を有する融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現するため用いられる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへの吸着に続き、遊離グルタチオンの存在下における溶出により溶解した細胞から容易に精製できる。その系において生成されたタンパク質はへパリン、トロンビン或いはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、対象となるクローン化ポリペプチドは随意にＧＳＴ部分から放出され得る。酵母菌、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因子、アルコールオキシダーゼ及びＰＧＨのような構成的或いは誘導性プロモータを含む多数のベクターが用いられる。再検討する場合には、Ausubel等（前出）及びGrant等（1987）Methods Enzymol 153:516-544を参照されたい。植物発現ベクターを用いる場合には、ＨＣＡＰコード化配列の発現は、多数の任意のプロモータにより推進される。例えばCaMVの35Ｓ及び19Ｓプロモータ（Br isson等（1984）Nature 310:511.514）のようなウイルス性プロモータは、単独で、或いはTMV（Takamatsu等（1987）ＥＭＢＯＪ6:307-311）からのオメガ−リーダー配列と共に用いられる。別法では、RUBISCO（Coruzzi等（1984）ＥＭＢＯＪ 3:1671-1680）、Broglie等（1984）Science 224:838-843）の小サブユニット、或いは熱ショックプロモータ（Winter Ｊ及びSinibaldi ＲＭ（1991）Results Probl Cell Differ 17:85-105）のような植物プロモータが用いられる。これらの構成は直接ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞内に導入される。そのような技術を再検討する場合には、Hobbs Ｓ及びMurr y ＬＥ，．McGraw Yearbook of Science and Technology（1992）McGraw Hill N Y,pp191-196及びWeissbach and Weissbach（1988）Methods for Plant Molecula rBiology，Academic Press ＮＹ,pp421-463を参照されたい。ＨＣＡＰを発現するために用いることができる別の発現系は昆虫系である。そのような系の一つでは、Autographa californica核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）がベクターとして用いられ、Spodoptera frugiperrdq細胞或いはTr ichoplusia の幼虫において外来遺伝子を発現する。ＨＣＡＰコード化配列は、ポリヘドリン遺伝子のような、ウイルスの非必須領域にクローニングされ、ポリヘドリンプロモータの制御下に置かれる。ｈｃａｐの挿入が成功した場合には、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、コートタンパク質膜が欠如した変異体ウイルスを生成する。変異体ウイルスはそれからＳ.frugiperda細胞或いはTrichoplusia の幼虫への感染させるために用いられ、その中でＨＣＡＰが発現される（Smith 等（1983）J Virol 46:584、Engelhard ＥＫ等（1994）Proc Nat Acad Sci91:32 24-7）。哺乳類宿主細胞では、多数のウイルス性発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、ＨＣＡＰコード化配列は、後期プロモータ及び三連リーダ配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体内に結合される。ウイルス性ゲノムの非必須E1或いはE3領域における挿入により、結果的に感染した宿主細胞におけるＨＣＡＰを発現することができる生存可能なウイルスになる（Logan及びShenk（1984）Proc Nat Acad Sci 81:3655-3659）。さらにラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサのような転写エンハンサを哺乳類宿主細胞内の発現を増加させるために用いることができる。また、挿入されるｈｃａｐ配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始信号も必要である。これらの信号には、ＡＴＧ開始コドン及び隣接の配列が含まれる。ｈｃａｐ及びその開始コドン及び上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合には、追加の翻訳制御信号は不要である。しかしながらコード化配列、或いはその一部のみが挿入される場合には、ＡＴＧ開始コドンを含む外来の翻訳制御信号が与えられなければならない。さらに、開始コドンは正確なリーディングフレーム内部にある必要があり、全インサートの転写を確実に行わなければならない。外来転写素子及び開始コドンは、自然及び合成両方の様々な起源に由来するものであり得る。発現の効果は、その細胞系に適切なエンハンサを含めることにより強められる（Scharf等（19 94）Results Probl Cell Differ 20:125-62、Bitter等（1987）Methods Enzymol 153:516-544）。さらに宿主細胞株は、望ましい形に、挿入された配列を変更したり、発現したタンパク質のプロセシングを行う能力を求めて選択される。このようなポリペプチドの修飾は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（リピデーション）並びにアシル化を含む。またタンパク質のプレプロ形態を切り離す翻訳後プロセッシングは、正確な挿入、折り畳み、並びにまた機能を正しく発揮するために重要である。ＣＨＯ,ＨｅＬａ,ＭＤＣＫ,293 ,ＷＩ38等のような異なる宿主細胞は、そのような翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特徴的な機構を有しており、導入される外来タンパク質の修飾やプロセシングを確実に実行するべく選択される。長期的で高収率の変異体タンパク質の生産を確保するためには、安定した発現が望ましい。例えばＨＣＡＰを安定的に発現する株細胞は、ウイルス由来の複製物、或いは内在性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質転換される。ベクターの導入に続いて、細胞は、選択培地に切り替えられる前に、濃縮培地内で１〜２日間成長させられる。選択マーカーは選択物への耐性を与え、導入された配列をＤＮＡ内に安定的に結合する細胞を同定できるようにする。細胞の耐性凝集塊はその細胞型に適切な組織培養技術を用いて増殖することができる。形質転換された細胞株を回収するために任意の数の選択系を用いることができる。限定はしないが、選択系は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler等（1977）Cell 11:223）及びアデニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ（Lowy等（1980）Cell 22:817）遺伝子を含み、それぞれtk^-及びaprt^- 細胞において用いられる。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の基礎として用いることができる。例えばｄｈｆｒはメトトレキセートに対する耐性を与え（Wigler等(1980)Natl Acad Sci 77:3567）、ｎｐｔはアミノグリコシッド剤、ネオマイシン及びＧ−４１８に対する耐性を与え（Colberre-Gar apin等（1981）Ｊ Mol Biol 150:1）、ａｌｓ或いはｐａｔはクロルスルフロン（chlorsulfuron）、フォスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosp hinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与える（上記Murry）。さらに選択可能な遺伝子として、例えば細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするｔｒｐＢ、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（hi stinol）を利用できるようにするｈｉｓＤが記載されている(Hartman及びMullig an(1988)Proc Nalt Acad Sci 85:8047)。最近になって、形質転換体を同定するためばかりではなく、特定ベクター系が要因となる一過性の或いは安定なタンパク質発現の量を定量するために広く用いられるβ−グルクロニダーゼ、アントシアニン及びルシフェリンのような標識を用いる、可視標識が非常によく用いられるようになった(Rhodes ＣＡ等(1995)Methods Mol Biol 55:121-31)。本発明のポリヌクレオチド配列を含む形質転換体の同定標識遺伝子発現の存在／不在は、対象の遺伝子も存在することを示唆するが、その存在及び発現の確認はすべきである。例えばもしｈｃａｐが標識遺伝子配列内に挿入されるなら、ｈｃａｐを含む組換え細胞が標識遺伝子の機能の存在により同定できる。別法では標識遺伝子は、単一プロモータの制御下でｈｃａｐ配列と直列に配置することができる。誘導または選択に応じての標識遺伝子の発現は、直列に配置されたｈｃａｐの発現をも示す。この他、ＨＣＡＰのコード化配列を含み、さらにＨＣＡＰを発現する宿主細胞が、当業者には周知の様々な手順により同定できる。これらの手順は、限定はしないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及び、核酸及びタンパク質の検出並びにまた定量するための膜、溶液或いは破片ベース技術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイを含む。ｈｃａｐポリヌクレオチド配列の存在は、ｈｃａｐのプローブ、一部、或いはフラグメントを用いるＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション或いは、増幅により検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイでは、ｈｃａｐ配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーを使用し、ｈｃａｐＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形質転換体を検出する。本明細書において「オリゴヌクレオチド」或いは「オリゴマー」とは、プローブ或いはアンプリマー（ampl imer）として用いることができる、少なくとも１０ヌクレオチド、多い場合には６０ヌクレオチド、好適には１５〜３０ヌクレオチド、より好適には２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列を指す。精製ＨＣＡＰの活性は、メスのマウスにおいてアッセイされ得る。このアッセイは、Todorovら（前出）の論文に記載のように、１．５時間間隔で、１５０μ ｌのリン酸塩緩衝化生理食塩水に懸濁された７μｇのＨＣＡＰを静脈内投与する過程を含む。通常どおりの食物や水の摂取にもかかわらず２４時間で体重が減少するのは、ＨＣＡＰが活性でカヘキシーを発症していることを示す。タンパク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれかを用いて、ＨＣＡＰポリペプチドの発現を検出し、測定するための種々のプロトコルが当業者には周知である。このようなプロトコルの例としては、酵素結合免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光表示式細胞分取器法（ＦＡＣＳ）を含む。ＨＣＡＰポリペプチド上で２つの非干渉なエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナル用イムノアッセイ（two-site，monoclonal-based immunoassay）は好適ではあるが、競合的結合アッセイも用いられる。これらアッセイの並びに他のアッセイは、Ha mpton R等(1990,Serologivcal Methods,a Laboratory Manual,ＡＰＳ Press，St Paul MN)及びMaddox ＤＥ等（1983,Ｉ Exp Med 158:1211）等に記載されている。さらに多くの標識及び結合技術は当業者には周知であり、種々の核酸及びアミノ酸検査法において用いることができる。ｈｃａｐに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプローブを生成するための手段には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、末端標識化或いは標識されたヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅などがある。別法では、ｈｃａｐ配列、或いはその任意の部分が、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクターにクローニングされる。そのようなベクターは当分野では周知であり、市販されており、Ｔ７，Ｔ３或いはＳＰ６並びに標識されたヌクレオチドのような適切なＲＮＡポリメラーゼの付加により、in vitroでのＲＮＡプローブ合成のために用いることができる。 Pharmacia Biotech社（Piscataway ＮＪ）、Promega社（Madison ＷＩ）並びにＵＳ Biochemical社（Cleveland ＯＨ）のようないくつかの企業がこれらの手順に対する商用のキット及びプロトコルを提供している。適切なリポーター分子、すなわち標識には、放射性核種、酵素、蛍光性、化学ルミネセンス或いは色素性因子及び基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子或いはそれに類似のものが含まれる。そのような標識の使用を教示する特許には、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号並びに第４，３３６，２４１号がある。また、組換え免疫グロブリンが米国特許第４，８１６，５６７号に示されており、本明細書とともに参照されたい。ＨＣＡＰの精製ＨＣＡＰヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地からコード化タンパク質を発現及び回収するために適切な条件下で培養される。組換え細胞により生成されるタンパク質は、用いられる配列並びにまたベクターに応じて、細胞内に分泌、つまり含有されるようにすることができる。ｈｃａｐを含む発現ベクターは、原核細胞か、真核細胞の細胞膜を通してのＨＣＡＰを分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計される。他の組換え構成物では、ｈｃａｐを、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合することができる(Kroll ＤＪ等(1993)ＤＮＡ Cell Biol 12:4 41-53、融合タンパク質を含むベクターに関する上記論議も参照されたい）。またＨＣＡＰは、タンパク質精製を容易にするために加えられた１または２以上の付加的なポリペプチドドメインを備えた組換えタンパク質として発現される。そのような精製を容易にするドメインには、限定はしないが、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド（Porath Ｊ（1992）Protain Expr Purif 3:263-281）、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、並びにＦＬＡＧＳ延長／アフィニティ精製システムにおいて用いられるドメイン（Immunex社、Seattle ＷＡ）が含まれる。精製ドメイン及びＨＣＡＰ間の第ＸＡ因子或いはエンテロキナーゼのような切断可能なリンカー配列を含めるのは精製を容易にするのに役立つ。ＨＣＡＰの使用ＨＣＡＰ配列の診断及び治療的な使用の原理は、核酸及びアミノ酸配列、それらのマウスＣＣＦ（Todorovら、前出）の既知の２０個のアミノ酸に対する相同性、及びBRSTTUT01ｃＤＮＡライブラリーにおけるｈｃａｐの存在に基づいている。第１Ａ図及び第１Ｂ図に提示された核酸配列、その相補配列、フラグメントまたはオリゴマー、及び抗ＨＣＡＰ抗体を診断用組成物として用いて、ｈｃａｐの発現用の生物学的サンプルの抽出物または体液をアッセイすることができる。精製ポリヌクレオチド及びポリペプチドを、ｈｃａｐの発現の確認及び定量のための、それらの各核酸またはタンパク質を基礎とするアッセイにおけるポジティブコントロールとして用いることができる。精製核酸配列、アンチセンス分子、ＰＮＡ、精製タンパク質、抗体、アンタゴニストまたはインヒビターを、医薬品組成物として使用することができる。核酸配列、その相補配列、フラグメント又はオリゴマー、及び抗ＨＣＡＰ抗体は、るいそうを引き起こす腫瘍の同定やカヘキシーの診断において役立つ。これらの同じ分子を、カヘキシー性の「るいそう」と、拒食症、胃及び膵臓疾患、副腎皮質刺激ホルモン欠乏症や甲状腺中毒症を含む内分泌機能障害、及び吸収不良症候群を含む代謝障害のような他の原因による「るいそう」とを区別するためのアッセイにおいて用いることができる。このタンパク質の発現及び精製は、定量のためのアッセイにおけるポジティブコントロールとしての使用や、肥満症の治療のための医薬品組成物としてのその使用を考慮している。除脂肪筋肉質量より大きい脂肪組織の減少を示したマウスモデルの研究から、重症の或いは中程度の肥満症に、ＨＣＡＰを制御しつつ投与することは、非外科手術的な体重減少のための手段となり、且つ食事療法（又はカロリー不足）に伴う重症の不安症や鬱を避けることができる。ＨＣＡＰは、一般的な消化管酵素による分解に対してかなりの耐性を有しているため、上述の抗ＨＣＡＰ抗体を用いた診断アッセイは、体内のＨＣＡＰ量を監視したり、除脂肪筋肉組織に対する脂肪組織の減少を強調するレベルに治療を調節するための手段となる。抗ＨＣＡＰ抗体、ＨＣＡＰのアンタゴニスト又はインヒビターは又、癌患者の腫瘍で作られるＨＣＡＰ又はその効果を抑制するための治療においても役立つ。癌患者が化学療法を受けている間或いはその前後において通常通りの食事をし定常体重を維持する能力は、生存のために明らかに有益である。特定の抗体、アンタゴニスト、又はインヒビター療法や薬物投与の効果は、血液や尿のような体液における遊離ＨＣＡＰの量を測定することにより監視され得る。抗ＨＣＡＰ抗体の別の用途は、患者の血液の血漿分離又は精製における使用である。この場合、中和医薬品組成物を患者に投与するのでなく、ＨＣＡＰ分子が腎臓透析に類似した方法で血液から除去される。抗ＨＣＡＰ抗体はミニろ過カラムにおいて安定化処理され、患者の血液がカラムを通されて、そこで血液が患者に戻る前にＨＣＡＰが除去される。ＨＣＡＰ及びそのインヒビターの治療目的の発現や送達については、医薬品組成物の項でさらに説明する。治療法は、関与する器官や組織、状態の特異的診断、及び患者の状態をモニタする外科医によって変わる。ＨＣＡＰの抗体ＨＣＡＰに対する抗体の生成のために、当分野においてよく知られる手順が用いられる。このような抗体には、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント並びにＦａｂ発現ライブラリにより生成されるフラグメントが含まれる。中和抗体、すなわちＨＣＡＰポリペプチドの生物活性を抑制する抗体は、特に診断及び治療に好適である。抗体を生成するために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む種々の宿主は、免疫学的特性を保持するＨＣＡＰポリペプチド或いはその任意の部分、フラグメント或いはオリゴペプチドを注入することにより免疫することができる。宿主種に応じて、種々のアジュバントが免疫学的反応を促進するために用いられる。そのようなアジュバントには、限定はしないが、フロイントアジュバント、水酸化アルミニウムのような無機質ゲルアジュバント、リゾレシチンのような表面活性物質アジュバント、プルロニックポリオルアジュバント、ポリアニオンアジュバント、ペプチドアジュバント、油性乳剤アジュバント、キーホールリンペットヘモシニアンアジュバント並びにジニトロフェノールアジュバントが含まれる。ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウムパルヴムは潜在的に有用なヒトアジュバントである。ＨＣＡＰに対するモノクローナル抗体は、培地中の連続株細胞による抗体分子の産生を行うための任意の技術を用いて調製される。これらは、限定はしないが、Koehler及びMilstein（1975，Nature 256:495-497）に当初掲載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor等（1983）Immunol To day 4:72、Cote等（1983）Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cote等（1985）Mon oclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan Ｒ Liss Inc,pp77-96）を含む。さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための「キメラ抗体」の生成、即ちヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングのために開発された技術が用いられる（Morrison等（1984）Proc Natl Acad Sci 81: 6851-6855）、Neuberger等（1984）Nature 312:604．608、Takeda等（1985）Nat ure 314:452.454）。別法では、一本鎖抗体の生成のために記載された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）が、ＨＣＡＰ特異的一本鎖抗体を生成するために適用される。また抗体は、リンパ球集団におけるin vivo生成を誘導することにより、或いはOrlandi等（1989，Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837）並びにWinter Ｇ及びM ilstein Ｃ（1991，Nature 349:293-299）に開示されているような組換え免疫グロブリンライブラリー或いは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによっても生成することができる。ＨＣＡＰに対する特異結合部位を含む抗体フラグメントも生成することができる。例えばこのようなフラグメントには、限定はしないが、抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）₂フラグメント及びＦ（ａｂ’）₂ フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるＦａｂフラグメントが含まれる。別法では、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速に、しかも容易に同定できるように、Ｆａｂ発現ライブラリーが構築される（Huse ＷＤ等（1989）Science 256:1275-1281）。ＨＣＡＰ特異的抗体は、ＨＣＡＰポリペプチドの発現が関連する状態及び疾患の診断のために有用である。確立された特異性を有するポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射定量測定法のための種々のプロトコルが当分野ではよく知られている。そのようなイムノアッセイでは、一般に、ＨＣＡＰとその特異的抗体（或いは類似のＨＣＡＰ結合分子）との間の複合体の形成、並びに複合体形成の測定が行われる。特異的ＨＣＡＰタンパク質上の２つの非干渉性エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナル用イムノアッセイが好適ではあるが、競合結合アッセイも用いられる。これらの検査法はMaddox ＤＥ等(19 83,Ｊ Exp Med 158:1211)に記載されている。ＨＣＡＰ特異的抗体を用いる診断アッセイ特定のＨＣＡＰ抗体は、ＨＣＡＰの発現の誘発により特徴付けられる状態或いは疾患の診断や、ＨＣＡＰで治療された患者のモニタのためのアッセイに役立つ。ＨＣＡＰの診断アッセイは、ヒトの体液、細胞、組織或いはそのような組織の切片または抽出物において、ＨＣＡＰを検出するための抗体或いは標識を利用する方法を含む。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾の有無に拘わらず用いることができる。多くの場合、ポリペプチド及び抗体は、共有結合、或いは非共有結合かのいずれかでそれらをリポーター分子と結合することにより標識される。非常に多くのリポーター分子が周知となっており、そのいくつかについては上述した。それぞれのタンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体を用いて、ＨＣＡＰポリペプチドを測定するための種々のプロトコルが当分野では周知である。その例として、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）並びに蛍光表示式細胞分取器法（ＦＡＣＳ）がある。ＨＣＡＰポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナル用イムノアッセイは好適ではあるが、競合的結合アッセイも用いられる。これらのアッセイは、他にもあるが、Maddox ＤＥ等（1983,Ｉ Exp Med 158:121 1）に記載されている。カヘキシーの診断の基礎を提供するために、ＨＣＡＰ発現についての通常値、すなわち標準値が確立されなければならない。これは複合体形成のために適切な条件下で、ヒト或いは動物どちらでもよいが、正常の被験者から得られる体液或いは細胞抽出物と、ＨＣＡＰに対する抗体とを結合することにより得ることができる。これは当分野ではよく知られた技術である。標準的な複合体形成量は、一連のポジティブコントロールの希釈系とそれを比較することにより定量され、抗体の既知の量が既知の濃度の精製ＨＣＡＰと結合される。その後正常サンプルから得られた標準値を、腫瘍誘導性カヘキシー（tumor induced cachexia）による影響を潜在的に受けた被験者からのサンプルから得られた値と比較する。標準値と被験値との偏差によって疾患状態の存在を確認できる。薬物スクリーニングＨＣＡＰ、その触媒作用性または免疫原性フラグメント或いはオリゴペプチドは、種々の任意の薬物スクリーニング技術において治療用化合物のスクリーニングのために用いることができる。そのような試験において用いられるフラグメントは、溶液、固体支持体への付着、細胞表面への付着、或いは細胞内への定着において制限はない。ＨＣＡＰと試験される薬剤との間の触媒活性、すなわち結合複合体形成の低下が測定される。薬物スクリーニングのための別の方法は、ＨＣＡＰポリペプチドへの安定的な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを提供するものであり、１９８４年９月１３日公告の欧州特許出願第８４／０３５６４号（ Guysen）に詳細に記載されており、本明細書に一体に引用されている。概要としては、多数の別々の小ペプチド試験用化合物をプラスチックピン或いはいくつかの他の表面のような、固体基質上で合成する。ポリペプチド試験化合物をＨＣＡＰフラグメントと反応させ、洗浄する。次いで結合ＨＣＡＰを当分野で周知の方法により検出する。また精製ＨＣＡＰを前述の薬物スクリーニング技術において使用するために、プレート上に直接コーティングすることもできる。別法では、ペプチドを捕捉し、固形支持体上にペプチドを固定するために非中和抗体を用いる。また本発明は、ＨＣＡＰに結合し得る中和抗体特性が、ＨＣＡＰとの結合について特に試験化合物と競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの使用も意図している。このようにして、抗体を用いて１または２以上の抗原性決定基をＨＣＡＰと共通に有する任意のペプチドの存在を検出することができる。ＨＣＡＰコード化ポリヌクレオチドの使用ポリヌクレオチドｈｃａｐ、或いはその一部が診断並びにまた治療目的で用いられる。診断目的の場合、本発明のｈｃａｐは、ＨＣＡＰ活性が関係する状態や疾病における遺伝子発現を検出し、かつ定量するために用いられる。この診断アッセイは、腫瘍誘導性カヘキシーによる「るいそう（wasting）」と、拒食症、胃及び膵臓疾患、副腎皮質刺激ホルモン欠乏症や甲状腺中毒症を含む内分泌機能障害、及び吸収不良症候群を含む代謝障害のような他の原因による「るいそう」とを区別するのに役立つ。本発明の範囲には、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子、ＰＮＡが含まれる。本発明の別の側面は、ＨＣＡＰまたは近縁な分子をコードする、ゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出できるハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを提供することである。そして、そのプローブの特異性、すなわち非常に高い保存領域（例えば５’調節領域における１０個の独特のヌクレオチド）に由来するのか、或いは低度に保存的な領域（例えば特に３’領域におけるシステイン残基の間の領域）に由来するのかということや、ハイブリダイゼーション或いは増幅の(高度の、中程度の或いは低度の)厳密性によって、そのプローブが天然ｈｃａｐのみを同定するものであるか、或いはアレル配列や近縁な配列も同定するものであるかが決まってくる。診断ＨＣＡＰコード化ポリヌクレオチド配列を、ＨＣＡＰの発現がるいそう（wast ing）引き起こす状態や疾病の診断や、治療のモニタ用として使用することができる。例えば、ＨＣＡＰをコードするポリヌクレオチド配列を、ｈｃａｐ発現を検出するための生検から得られた組織や体液の、ハイブリダイゼーションアッセイ或いはＰＣＲアッセイにおいて用いることができる。そのような定性的及び定量的方法の形態は、サザンブロット法或いはノーザンブロット法、ドットブロット法或いは他の膜用技術、ＰＣＲ技術、浸漬法、ピン或いはチップ技術及びＥＬＩＳＡ技術を含む。これらの技術は全て、当分野ではよく知られており、実際に市販されている多くの診断キットの基礎となっている。このようなアッセイは、特定の治療行為の有効性を評価するために修正され、動物実験、臨床試験、或いは個々の患者の治療をモニタする際に用いることができる。疾患を診断するための基礎を与えるために、ＨＣＡＰ発現に対する正常な或いは標準的なプロフィールが確立されなければならない。これは、正常な被験者、すなわち動物或いはヒトから得られる体液或いは細胞抽出物を、ハイブリダイゼーション或いは増幅に適切な条件下で、ｈｃａｐ或いはその一部と結合することにより達成される。標準的なハイブリダイゼーションの定量は、正常被験者に対して得られる値と、既知の精製ｈｃａｐ量が用いられる同一の実験におけるポジティブコントロール希釈系列で得られる値とを比較することにより定量することができる。正常なサンプルから得られた標準値は、ｈｃａｐ発現により影響を受けている被験者からのサンプルから得られる値と比較される。標準値と被験者値との偏差からカヘキシーの存在、またはそれが存在することを示す数値の範囲が確立される。カヘキシーの存在が確立された場合は、現存する治療用薬剤が投与され、治療プロファイル或いは数値が生成される。最終的にアッセイは、その数値が正常、すなわち標準パターンに進むか、或いは戻るかを評価するために規則的に繰り返される。治療プロファイルは治療の有効性を示すために用いられ、数日間或いは数ヶ月の期間に渡って継続される。米国特許第４，６８３，１９５、４，８００，１９５並びに４，９６５，１８８号に記載のあるようなＰＣＲ法により、ＨＣＡＰ配列に基づくオリゴヌクレオチドのための追加の使用法が提供される。このようなオリゴマーは一般には化学的に合成されるが、酵素を用いて発生させたり、或いは組換えソースから生成することもできる。一般にオリゴマーは、通常特定の遺伝子或いは状態を同定するために最適な条件下で用いられる２つのヌクレオチド配列、即ちセンス方向（５ ’→３’）のヌクレオチド及びアンチセンス方向（３’←５’）のヌクレオチドからなる。同一の２つのオリゴマー、入れ子状のオリゴマーの組、或いはオリゴマーの縮重プールでさえ、近縁なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出や定量のためのより低い厳密性の条件下であっても用いることができる。さらに特定の分子の発現を定量するための方法には、放射性標識（radiolabel ing）（Melby ＰＣ等1993 J Immunol Methods 159:235-44）或いはビオチン標識（Duplaa Ｃ等1993 Anal Biochem 229-36）ヌクレオチドの利用、制御核酸の同時増幅（coamplification）の利用、並びに実験結果を補完して書かれた標準的なグラフ曲線の利用が含まれる。多数のサンプルの定量は、ＥＬＩＳＡ形式のアッセイを実行することにより迅速に行うことができ、対象のオリゴマーが様々な希釈溶液中に現れ、分光光度分析或いは比色分析反応により迅速に定量することができる。例えば、リウマチ様滑膜から取出された体液におけるＨＣＡＰの量の増加は、活性化リンパ液の存在と組織破壊の進行を示している。このタイプの確定的診断により、健康の専門家が患者を治療したり病状の悪化を防ぐことが可能となる。同様に、当業者に周知のアッセイを用いて、患者の病状の進行を治療の際にモニタすることができる。治療ここに開示するポリヌクレオチドは、様々な状態や疾病の治療に役立ち得る。アンチセンス分子（抗ｈｃａｐ）を癌性細胞に導入することによって、ＨＣＡＰ発現を低減、あるいは無くす遺伝子治療が可能となる。このような例では、アンチセンス分子を含む細胞が溢れることにより、アミノ酸配列の翻訳が抑止される。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルスに由来する発現ベクター、或いは細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられる。当業者によく知られた方法は、ＨＣＡＰを発現する組換えベクターを構築するために用いることができる。例えば Maniatis等（上記）及びAusubel等（上記）に記載された技術を参照されたい。完全長ｃＤＮＡ配列、並びにまたその調節エレメントを含むポリヌクレオチドにより、研究者は遺伝子機能のセンス調節（Youssoufian Ｈ及び HF Lodish 199 3 Mol Cell Biol 13:98-104）、或いはアンチセンス調節（Eguchi等（1991）Ann u Rev Biochem 60:631.652）の調査用のツールとしてｈｃａｐを用いることができる。このような技術は、現在当分野ではよく知られており、センス或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きなフラグメントを、コーディング領域或いは制御領域に沿った様々な位置から設計することができる。必要な断片を高レベルで発現する発現ベクターを細胞または組織にトランスフェクトすることにより、ＨＣＡＰをコードする遺伝子の機能を停止させることができる。このような作製物は、翻訳不可能なセンス或いはアンチセンス配列とともに細胞から溢れ出し得る。ＤＮＡへの組み込みがない場合ですら、このようなベクターは、全ての複製物が内在性ヌクレアーゼにより分解されるまで、ＲＮＡ分子を転写し続ける。このような過渡的発現は、非複製ベクター（Mettler I，p ersonal communication）でも１ヶ月以上、適当な複製エレメントがベクター系の一部である場合には更に長い期間継続し得る。上述のように、ｈｃａｐの制御領域、例えばプロモータ、エンハンサ或いはイントロンに対するアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを設計することにより遺伝子発現を修飾することができる。転写開始部位、例えばリーダ配列の＋１０〜−１０領域の間に由来するオリゴヌクレオチドが好適である。またアンチセンス分子は、転写産物がリボソームへの結合するのを防止することにより、ｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計される。同様に、抑制は、「三重らせん」塩基対合としても知られる、Ｈｏｇｅｂｏｏｍ塩基対合方法論を用いて達成することができる。三重らせん対合は、二重らせんがポリメラーゼ、転写因子、或いは調節分子を結合するために十分に開放する機能を抑制する。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療法は、Gee ＪＥら（Huber ＢＥ and BI Carr(1994) Molecular and Immun ologic Approaches，Futura Publishing Co,Mt KiscoＮＹ）により再検討されている。リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションが行われ、その後エンドヌクレアーゼによる切断（ endonucleolytic cleavage）がなされる。発明の範囲内には、ｈｃａｐのエンドヌクレアーゼによる切断を、特異的に及び効果的に引き起こす工学的に処理されたハンマーヘッド状モチーフ（hammerhead motif）リボザイム分子も含まれている。任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位の最初の同定は、配列ＧＵＡ、ＧＵＵ並びにＧＵＣが後続するリボザイム切断部位に対する標的分子を走査することにより行われる。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列は、そのオリゴヌクレオチドの機能を停止させる２次構造の特徴について評価される。また候補の標的の適切性の評価は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に対する接触性を試験することにより行われる。本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、ＲＮＡ分子を合成するのための当分野で周知の方法により調製することができる。これらの技術には、固相ホスホラミダイト（phosphoramidite）化学合成のような化学的合成オリゴヌクレオチドの技術が含まれる。別法では、ＲＮＡ分子を、ＨＣＡＰをコードするＤＮＡ配列のin vivo及びin vitro転写により生成することができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する多種のベクターに組み込まれる。別法では、構造的に或いは誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構成物が、株細胞、細胞或いは組織内に導入される。ＲＮＡ分子は細胞内安定性を高め及び半減期を長くするために修飾することができる。実行可能な修飾には、限定はしないが、その分子の５’並びにまた３’ 末端のフランキング配列の付加、或いは分子のバックボーン内にホスホジエステラーゼ連鎖ではなくホスホロチオネート（phosphorothioate）或いは２’Ｏ−メチルを使用することを含む。このコンセプトは、ＰＮＡの産生において固有のものであり、内在性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデニン、グアニン、シチジン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び類似の修飾形態とともに、イノシン、クエオシン（queosine）、及びワイブトシン（Wybu tosine）のような非伝統的な塩基を含めることによって、これら全ての分子に拡張することができる。細胞或いは組織内にベクターを導入するための方法には、以下に議論される方法が含まれ、これらの方法は、in vivo、in vitro、及びex vivo治療法に対しても適切なものである。ex vivo治療法の場合には、患者から採取された幹細胞にベクターを導入し、自家移植のためにクローンとして増殖して同じ患者に戻す方法が、ここで引用により開示されている米国特許第5,399,493号及び第5,437,994 号に記載されている。トランスフェクションによる、またはリポソームによる送達は、従来より周知の技術である。更に、ここに開示するｈｃａｐのヌクレオチド配列は、新技術、即ち、限定はしないが、それがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対合相互作用のような特性を含む、現在周知のヌクレオチド配列の特性に依存する技術であれば、まだ開発されていない分子生物学的技術においても用いることができる。近縁なポリヌクレオチド配列の検出及びマッピングｈｃａｐの核酸配列は、天然ゲノム配列のマッピングのためのハイブリダイゼーションプローブを生成するために用いることができる。この配列は、よく知られる技術を用いて、特定の染色体或いはその染色体の特定領域に対してマッピングすることができる。このような技術には、拡散させた染色体（chromosomal sp reads）に対するin situハイブリダイゼーション（Verma等（1988）Human Chrom osomes:Ａ Manual of Basic Technique，Pergamon Press，New York）、フローソート（now-sorted）染色体調製法、或いは酵母菌人工染色体（ＹＡＣｓ）、細菌性人工染色体（ＢＡＣｓ）、細菌性Ｐ１構造体或いはPrice ＣＭ（1993;Blood Rev 7:127-34）及びTrask BJ（1991;Trends Ganet 7:149-54）に概要が示されている単染色体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体構造が含まれる。染色体調製物のin situハイブリダイゼーション及び確定された染色体マーカーを用いる連鎖解析のような物理的地図作成技術は、遺伝子地図を延長する際に大変重要である。ヒトゲノムのＳＴＳに基づく地図の最近の例は、Whitehead-MI T Center for genomic Reserch（Hudson ＴＪら(1995)Science 270:1945-1954）から最近出版されている。多くの場合、特定のヒト染色体の数或いは腕が知られていなくても、マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配置から、関連する標識を明らかにすることができる。新しい配列は、染色体の腕、或いはその一部への物理的マッピングにより割当てることができる。これは位置クローニング或いは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を調査する研究者に貴重な情報を提供する。ひとたび毛細血管拡張性運動失調（ＡＴ）のような疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばＡＴ〜１１ｑ２２−２３への遺伝子連鎖により粗く局所化されれば、その領域にマッピングされる任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは調節遺伝子を表すことができる（Gatti等（1988）N ature 336:577-580）。本発明のヌクレオチド配列は、正常者、保菌者或いは感染した個体間の転座、逆位等による染色体位置の違いを検出するために用いることもできる。医薬品組成物本発明は、ヌクレオチド、タンパク質、抗体、アンタゴニスト、インヒビターを、単独で、或いは安定化化合物のような少なくとも１つの他の薬剤とともに含んでいる医薬品組成物を、その範囲に含む。この医薬品組成物は、任意の無菌の生体適合性担体に含めて投与されるが、このような担体には、限定はしないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水が含まれる。これらの分子は、患者に対して、単体で、或いは他の薬品やホルモンと結合して、医薬品添加物或いは製薬学的に許容される担体と混合される他の薬品組成物に入れて投与され得る。本発明の一実施例では、製薬学的に許容される担体とは、製薬学的に不活性なものである。医薬品組成物の投与医薬品組成物は経口投与、或いは非経口投与される。非経口投与の方法には、局所的投与、動脈内（腫瘍への直接の）投与、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与、くも膜下内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与或いは鼻腔内投与を含む非経口投与を含む。活性成分に加えて、これらの薬品組成物は、薬学的に用いられ得る調合物内への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び補助剤を含む適切な製薬学的に許容される担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、「Remington's Pharmaceutical Sciences」（Mack Publis hing Co,Easton ＰＡ）の最新版において見出すことができる。経口投与用の薬品組成物は、当分野でよく知られる製薬学的に許容される担体を用いて適切な剤形に製剤される。このような担体により、薬品組成物は、治療を受ける患者による経口及び鼻腔摂取のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、液体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤或いは類似の剤形として処方される。経口投与するための製薬調製は、活性化合物と固形の賦形剤とを結合することによって得ることができるが、所望に応じて、必要なら適切な補助剤を添加した後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、錠剤或いは糖衣剤核を得ることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、サクロース、マンニトール或いはソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク質充填剤、とうもろこし、小麦、米、じゃがいも等からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントのようなゴム、並びにゼラチン或いはコラーゲンのようなタンパク質である。必要ならば、クロスリンクしたポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸或いはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられる。糖衣剤核は、濃縮砂糖溶液のような適切な錠皮を与えられるが、溶液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混合物が含み得る。錠剤の識別のため、すなわち活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために染料或いは色素が錠剤或いは糖衣錠皮に加えられてもよい。経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル及びゼラチンからなる柔らかい、密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビトールのような錠皮を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはでんぷんのような充填剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、並びに付加的には安定剤と混合された活性処方組成物を含み得る。柔らかいカプセルでは、活性化合物は、安定剤があるなしにかかわらず、脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或いは懸濁される。非経口投与用の剤形は、水溶性の活性化合物の水溶液を含む。注射用として、本発明の薬品組成物を水溶液、好適にはハンクの溶液、リンガー溶液或いは生理緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液に入れて製剤することができる。水性の注入懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を増加する物質が含み得る。更に、活性成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁剤として調製される。適切な親油性の溶媒或いは媒介物は、胡麻油のような脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。また懸濁剤は、所望に応じて、それにより溶解度を増加し、非常に濃縮された溶液の調製ができるようになる適切な安定剤或いは薬剤を含んでもよい。局所的投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸透剤を用いて調合が行われる。このような浸透剤は、従来より周知である。製造と保管本発明の薬品組成物は周知の方法、例えば従来の混合処理、溶解処理、顆粒化処理、糖衣形成処理、研和処理、乳化処理、封入処理(entrapping)処理或いは凍結乾燥処理により製造される。この医薬品組成物は塩類として提供されることもあり、限定はしないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む、多くの酸とともに形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性或いはプロトニック溶剤において、より可溶性が高くなる傾向がある。他の場合には、好適な製剤は、１ｍＭ−５０ｍＭのヒスチジン、０．１％−２％のショ糖、使用前に緩衝剤と結合させたｐＨ範囲４．５−５．５にある２％−７％のマンニトールにおける凍結乾燥粉末である。製薬学的に許容される担体内に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調製された後、適切な容器内に入れられて、さらに提示した疾病状態の治療のためにラベル付けされる。ＨＣＡＰの投与の場合、このようなラベルには、投与の量、頻度、方法が表示される。治療上効果的な投与量本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、活性成分を所望の目的を達成するに効果的な量だけ含む組成物である。効果的な投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行うことができる。任意の化合物の場合、治療的に有効な投与量は、初めに、新生物細胞、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のアッセイから推定される。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおいて効果的な投与量や投与経路を決定することができる。治療的に有効な投与量とは、疾病状態を寛解するタンパク質、その抗体、アンタゴニスト、またはインヒビターの量である。そのような化合物の毒性及び治療有効性は例えばＬＤ５０（個体郡の５０％の致死投与量）及びＥＤ５０（個体群の５０％において治療的に効果のある投与量）を決定するための、細胞培地或いは実験動物における標準的な製薬学的手順により決定することができる。毒性と治療有効性との間の投与量比は治療指数であり、比ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい。これらの細胞培地のアッセイ及び付加的な動物研究から得られるデータは、ヒトへの使用に対する投与量の範囲を決める際に用いることができる。そのような化合物の投与量は、毒性がほとんど或いは全くなく、ＥＤ５０を達成する循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並びに投与経路に応じてこの範囲内で変化する。正確な投与量は治療されるべき患者を考慮して個々の医師により選択される。投与量及び投薬量は、十分なレベルの活性部分を与え、かつ所定の効果を維持するために調整される。考慮すべき付加的な要因は、疾患状態の重症度、または患者の年齢、体重並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、並びに治療への耐性／反応を含む。長期的に作用する薬品組成物は３〜４日毎に、１週間毎に、或いは半減期及び特定の処方のクリアランス速度に応じて２週間に１度、投与してもよい。通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲にあって、全投与量は最大約１ｇであり、投与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは供給の方法に関するガイダンスは、文献において見出すことができる。米国特許第４，６５７，７６０、５，２０６，３４４或いは５，２２５，２１２号を参照されたい。当業者は、ヌクレオチドに対しては、タンパク質やそのインヒビター用の剤形とは異なる財形を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、細胞、状態、位置等によって決まってくる。ＨＣＡＰを、重症、あるいは中程度の肥満症の患者において発現させるか、適切な剤形で送達することが企図されている。臨床設定では、ＨＣＡＰレベルの硬直的監視により、担当外科医が、脂肪組織の減少を促進し、筋肉質量には最小限の影響しか与えないような範囲にＨＣＡＰレベルを調節することが可能となる。同様に、癌患者へのＨＣＡＰのアンタゴニストまたはインヒビターの東洋、及び治療状態の監視により、腫瘍誘導性カヘキシーを最小限に抑えることができる。以下に本発明の実施例を示す。但し、以下の実施例は単なる例示であって、本発明をこの実施例に限定しようとするものではない。産業上の応用１ BRSTTUT01 ｃＤＮＡライブラリーの構築 BRSTTUT01 ｃＤＮＡライブラリーを、う５５歳の女性から切除された乳房腫瘍（lot#0005;Mayo Clinic，Rochester ＭＮ）から構築した。冷凍組織を、Brin kmann Homogenaizer Polytron-ＰＴ3000(Brinkmann Instruments社、WestburyＮＹ）を用いて即座に破砕し、グアニジウムイソチオシアネートを含む緩衝液に溶解した。可溶化液を５．７Ｍの塩化セシウムクッションに負荷し、Beckman L8-7 0M Ultracetrifuge（Beckman Instruments社）においてBeckman ＳＷ28ロータを用いて、周囲温度で２５０００ｒｐｍの回転数で１８時間遠心分離した。ＲＮＡを一度はｐＨ４．０の酸性フェノールで、一度はｐＨ８．０のフェノールクロロホルムで抽出し、０．３Ｍの酢酸ナトリウムと２．５倍量のエタノールを用いて沈殿させ、そのＲＮＡを水に再懸濁し、３７℃で１５分間ＤＮアーゼ処理した。そして、Qiagen Oligotex kit（QIAGEN社、Chatsworth CA ）を用いてＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡライブラリーを構築した。このＲＮＡは、Gibco/BRLのcatalog#18248-013のSuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloningにおいて、その推奨プロトコルにしたがって処理した。ｃＤＮＡはSepharose CL4Bカラム（catalog#275105,Pharmac ia）上で分画化し、これらのｃＤＮＡで４００ｂｐを超えるものはをpSport Ｉにリゲートした。次いで、このファスミドpSport ＩをDH5a（商標）コンピテント細胞（catalog#18258-012，Gibco/BRL）に入れて形質転換させた。２ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定プラスミドＤＮＡは細胞から放出され、Miniprep Kit（Cat＃77468;Advanced Genetic Technology社，Gaithersbung ＭＤ）を用いて精製した。このキットは９６０精製のための試薬を有する９６穴ブロックからなる。以下の変更点を除いて、推奨プロトコルを用いた。１）９６個の穴には、２５ｍｇ／Ｌのカルベニシリン及び０．４％のグリセロールを有する無菌のTerrific Broth（Cat#22711,LI FE TECHNOLOGIES（登録商標），Gaithersbung ＭＤ）の１ｍｌのみをそれぞれ充填した。２）その細菌は、その穴に接種し、溶解緩衝剤の６０μｌを用いて分離した後、２４時間培養した。３）ブロックの中味が一次フィルタプレートに加えられる前に、Beckman GS-6Rを用いて２９００ｒｐｍで５分間の遠心分離を行った。４）イソプロパノールをトリス緩衝液に加える付加的な過程は定例的に実施しなかった。プロトコルの最終過程後、サンプルを、貯蔵のためにBeckman ９６穴ルブロックに移した。ｃＤＮＡは、４つのPeltier Thermal Cycler（PTC200;MJ Research社，Watert own ＭＡ）及びApplied Biosystems377或いは373ＤＮＡ Sequencing Systems（P erkin Elmer社）を組み合わせてHamilton Micro Lab2200（Hamilton社,Reno ＮＶ）を用いる、Sanger Ｆ及びＡＲ Coulson(1975;J Mol Biol 94:441f)の方法により配列決定され、リーディングフレームが画定された。３ｃＤＮＡクローン及び推定タンパク質の相同性検索各ｃＤＮＡを、ABI INHERIT（商標）670配列解析システム（Perkin Elmer）に組み込まれた検索アルゴリズムを用いて、GenBankの配列と比較した。このアルゴリズムでは、Pattern Specification Language（ＴＲＷ社、LosAngeles ＣＡ）を用いて相同な領域を決定していた。配列の比較をどのように行うかを決定する３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセット、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの組を用いて、対象の配列に対して相同な領域を含む配列をＤＮＡデータベースから検索し、適切な配列には、初期値とともにスコアが付けられた。これによって、これらの相同な領域をドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、相同な領域と偶然の一致とを区別した。相同性検索の結果は、Smith-Watermanアライメントを用いて表示した。ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、INHERIT670配列解析システムをＤＮＡ配列の相同性検索で用いたのと同様に用いて確かめた。Pattern Specificatio n Language及びパラメータウィンドウを用いて、タンパク質データベースから相同性領域を含む配列を検索し、その結果には初期値とともにスコアを付けられた。ドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、有意な相同性を有する領域と偶然の一致とを区別した。ＢＬＡＳＴは、ＢａｓｉｃＬｏｃａｌＡｌｉｇｎｍｅｎｔＳｅａｒｃｈＴｏｏｌ（ＡｌｔｓｃｈｕｌＳＦ（１９９３）ＪＭｏｌＥｖｏｌ３６：２９０−３００；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ＳＦ等（１９９０）ＪＭｏｌＢｉｏｌ２１５：４０３−１０）を表しており、これを用いて局部的な配列アライメントを検索した。ＢＬＡＳＴはヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを生成して配列類似性を求める。そのアライメントの局所性のために、ＢＬＡＳＴは厳密な一致を求める際に、すなわちホモログを求める際に特に有効である。ＢＬＡＳＴは間隙を含まない一致を求めるのに役立つ。ＢＬＡＳＴアルゴリズム出力の基本的な単位は、Ｈｉｇｈ−ｓｃｏｒｉｎｇＳｅｇｍｅｎｔＰａｉｒ（ＨＳＰ）である。ＨＳＰは２つの配列フラグメントからなり、両フラグメントは任意ではあるが、そのアライメントが局所的に最大となっている等しい長さものであり、そのアライメントスコアはユーザにより設定された閾値すなわちカットオフスコアを満足、即ち、カットオフスコアを超えている。ＢＬＡＳＴアプローチは問い合わせ配列とデータベース配列との間のＨＳＰを見つけ出すものであり、見出された任意の一致の統計的有意性を評価し、そのユーザが設定した有意性の閾値を満足する一致のみを報告するものである。パラメータＥはデータベース配列一致を知らせるための統計的に有意な閾値を確定するパラメータである。Ｅは全データベース検索の情況においてＨＳＰ（或いはＨＳＰの組）の発生の機会の期待される頻度の上側の境界として解釈される。その一致がＥを満足する任意のデータベース配列がプログラム出力において報告される。ＢＬＡＳＴを用いて、マウスＣＣＦの２０個の既知のＮ末端アミノ酸を、ＬＩＦＥＳＥＱ（商標）データベースから検索した。インサイト社クローンＮｏ．６０７２２７の翻訳物は、これらのアミノ酸と９０％以上の類似性を有していた。そして、後に行った分析により、予測シグナル配列をコードする領域から上流の適当な距離の位置において、潜在性翻訳開始部位が同定された。インサイト社クローンＮｏ．６０７２２７が、ポリヌクレオチドの同じ予測位置において殆ど同一のアミノ酸配列を有しているという事実は、インサイト社クローンＮｏ．６０７２２７がマウスＣＣＦに近いヒトホモログを表していることを示している。４調節エレメントを回復するまでのＨＣＡＰの延長完全長ｈｃａｐの核酸配列（配列番号：１）は、ゲノムライブラリから５’配列を得るためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いることができる。一方のプライマーはアンチセンス方向（ＸＬＲ）の延長を開始するために合成され、他方のプライマーはセンス方向（ＸＬＦ）に配列を延長するために合成される。これらのプライマーにより、周知のＨＣＡＰ配列を「外側に」延長し、対象の制御領域の新しい未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成できるようになった。初期プライマーは、Ｏｌｉｇｏ４．０（National Bioscienc es社、Plymouth ＭＮ）、或いは他の適切なプログラムを用いて、長さが２２− ３０ヌクレオチドで５０％以上のＧＣ含有率を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計することができる。結果的にヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体化を生じる任意のヌクレオチドのストレッチの延長は避けられる。腫瘍ライブラリーはｈｃａｐのコード領域を延長または検証するのに適しており、また５’上流配列を延長し増幅するためにはヒトゲノムライブラリを用いる。必要なら、既知領域をさらに延長するためにプライマーの第２の組が設計される。ＸＬ−ＰＣＲキット（Perkin Elmer社）の指示に従って、酵素と反応混合物とを完全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られる。４０ｐｍｏｌの各プライマと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始する場合、ＰＣＲはＰｅｌｔｉｅｒＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒ（ＰＴＣ２００；ＭＪ Reserch社、Watertown ＭＡ）を用いて、以下のパラメータで実行される。ステップ１９４℃で１分間（初期変性）ステップ２６５℃で１分間ステップ３６８℃で６分間ステップ４９４℃で１５秒間ステップ５６５℃で１分間ステップ６６８℃で７分間ステップ７ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復ステップ８９４℃で１５秒間ステップ９６５℃で１分間ステップ１０６８℃で７分１５秒間ステップ１１ステップ８〜１０を１２サイクル反復ステップ１２７２℃で８分間ステップ１３４℃（その温度を保持）反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）アガロースミニゲルにおける電気泳動で解析して、反応物が配列を延長することに成功したか否かを決定する。最も大きな生成物或いはバンドを選択して、ゲルから切り出した。さらなる精製には、ＱＩＡＱｕｉｃｋ（登録商標）（QIAGEN社）のような市販のゲル抽出法を用いる。ＤＮＡ回収の後、クレノウ酵素を用いて一本鎖ヌクレオチドの延び出しを切り取り、再結合及びクローニングを容易にする平滑末端を作った。エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌのリゲーション緩衝液内に再溶解し、１μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加えて、その混合物を、室温で２〜３時間、或いは１６℃で一昼夜インキュベートする。コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞（４０μｌの適切な溶媒内にある）を、３μｌのリゲーション混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培地（Sembrook Ｊ等、上記）で培養する。３７℃で１時間のインキュベーションの後、全ての形質転換混合物を、２ｘＣａｒｂを含むＬｕｒｉａＢｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天上にのせる。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択し、適切な市販の無菌の９６穴マイクロタイタープレートの個々のウェル内に入れられた１５０μｌの液状ＬＢ／２ｘＣａｒｂ培地で培養する。さらに後日、５μｌの各オーバーナイト培養物を非無菌９６穴プレート内に移し、水で１：１０に希釈した後、各５μｌのサンプルをＰＣＲアレイ内に移す。ＰＣＲ増幅の場合、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの４単位を含む１８μｌの濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用いられる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以下の条件に従って行う。ステップ１９４℃で６０秒間ステップ２９４℃で２０秒間ステップ３５５℃で３０秒間ステップ４７２℃で９０秒間ステップ５ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復ステップ６７２℃で１８０秒間ステップ７４℃（そのまま保持）ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動させる。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクローンを選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行う。５ハイブリダイゼーションプローブの標識付け配列番号：１に由来するハイブリダイゼーションプローブは、ｃＤＮＡ，ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングするために用いられる。約２０の塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識付けについて特に記すが、大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、５０ｐｍｏｌの各オリゴマと、２５０ｍＣｉの[γ‐³²Ｐ]アデノシン三リン酸（Amersh am社，Chicago ＩＬ）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont ＮＥＮ（商標）、Boston ＭＡ）とを組み合わせて用いてラベルする。標識付けられたオリゴヌクレオチドを、ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５超精細樹脂カラム（Pharmacia社）を用いて精製する。それぞれ毎分１０⁷カウントを含む各部分を、以下のエンドヌクレアーゼ（Ａｓｅｌ，ＢｇｌＩＩ，ＥｃｏＲＩ，ＰｓｔＩ，Ｘｂａ１或いはＰｖｕＩＩ；DuPont ＮＥＮ（商標））の１つを用いて消化されるヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ハイブリダイゼーション解析において用いる。各消化物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画化して、ナイロン膜（Nytran Plus,Schleicher＆Schuell,Durham ＮＨ）に移す。ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くために、ブロットは、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまで段階的に厳密性が増す条件下で、室温にて順次洗浄される。ＸＯＭＡＴＡＲ（登録商標）フィルム（Kodak，Rochester ＮＹ）を、数時間かけてＰｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒｃａｓｓｅｔｔｅ（Molecular Dynamics，Sunnyvale ＣＡ）においてブロットに露光された後、ハイブリダイゼーションパターンが視覚的に比較される。６アンチセンス分子ｈｃａｐ配列或いはその任意の一部は、天然ｈｃａｐのin vivo発現を抑制するために用いることができるアンチセンス分子の設計のための基礎となる。約２０塩基対からなるアンチセンスオリゴマーの使用について特に記すが、大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いることができる。ｈｃａｐの５’コード化配列または非翻訳リーダ配列に基づく相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、天然ｈｃａｐの発現を抑制することができる。この相補的なオリゴヌクレオチドは、プロモーターか結合するのを防ぐことにより転写を抑制したり、リボソームが転写物に結合するのを防ぐことにより転写物の翻訳を抑制するように設計される。７ＨＣＡＰの発現ＨＣＡＰの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクター内にサブクローニングし、そのベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって行われる。クローニング用のpSportベクターを、コンピテントＥ．ｃｏｌｉにおいてＨＣＡＰを発現するのに用いる。lacＺクローニング部位の上流に、このベクターはlacＩ遺伝子及びプロモータを含む。標準的な方法を用いて単離され、ＩＰＴＧをトランスフェクトされたコンピテント菌株の誘導により、ＨＣＡＰが産生される。増殖を容易にするため、ＨＣＡＰの成長培地への分泌を誘導するために細菌シグナル配列を加えてもよい。８ＨＣＡＰ活性精製ＨＣＡＰの活性は、メスのマウスにおいてアッセイされる。７μｇのＨＣＡＰを、１５０μｌのリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁し、Todorovら（前出）の論文に記載のように、１．５時間間隔で尾の静脈に４回静脈内投与する。ネガティブコントロールには、ＰＢＳのみを投与する。各投与の前の各動物の体重を測定し、通常の食物と水の摂取にもかかわらず２４時間で体重の低下が見られた場合、それはＨＣＡＰが活性で、カヘキシーを発症させるカロリー不足が生じていることを示している。９ＨＣＡＰ特異的抗体の産生標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化には、ＰＡＧＥ電気泳動法（Mani atis上述）を用いて精製されたＨＣＡＰを用いるが、モノクローナル法の方がより簡単に利用することができる。ＨＣＡＰから翻訳されたアミノ酸配列をＤＮＡＳＴＡＲソフトウエア（DNASTAR社）を用いて解析して免疫抗原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを当業者には周知の手段により合成して、当業者に周知の方法で抗体をを産生するために用いる。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープのような、適切なエピトープを選択するための解析は、Ausubel ＦＭ等（上記）の論文に記載されている。通常、約１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、ｆｍｏｃ−ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いるＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのペプチドシンセサイザーＭｏｄｅｌ４３１Ａを用いて合成し、Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ： Ausubel ＦＭ等、上記）を用いた反応によりキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ、Sigma）に結合する。フロイントの完全アジュバントにおけるオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫する。得られた抗血清の抗ペプチド活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、１％ＢＳＡを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧを用いて反応させる。８特異的抗体を用いるＨＣＡＰの精製天然ＨＣＡＰ或いは組換えＨＣＡＰは、ＨＣＡＰに対する特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより精製することができる。イムノアフィニティーカラムは、ＣｎＢｒ−ａｃｔｉｖａｔｅｄＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Pharmacia Biotech社）のような活性化クロマトグラフ樹脂とＨＣＡＰ抗体とを共有結合させることにより構成される。結合後、その樹脂を製造者の指示に従って、ブロックし洗浄する。ＨＣＡＰを含む培地をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをＨＣＡＰを優先的に吸収できる条件下（例えば界面活性剤の存在下での高イオン強度緩衝剤）で洗浄する。このカラムを、抗体／ＨＣＡＰ結合を切るような条件下（例えばｐＨ２〜３の緩衝剤、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオン）で溶離させ、ＨＣＡＰを回収する。９ＨＣＡＰと相互作用する分子の同定ＨＣＡＰ、或いはその生物学的に活性なフラグメントを、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬を用いて標識する（Bolton,ＡＥ及びHunter,ＷＭ（1973）Biochem Ｊ 133:529）。９６穴プレートのウェル内に前に入れておいた候補分子を、標識したＨＣＡＰとともに培養し、洗浄し、標識したＨＣＡＰ複合体を有する任意のウェルをアッセイする。異なる濃度のＨＣＡＰを用いて得られるデータを用いて、候補分子とＨＣＡＰとの会合の数、アフィニティー並びに会合度の値を計算する。上記のすべての刊行物及び特許明細書は、本明細書と一体に参照されたい。本発明の記載した方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は、本発明の範囲及び精神から逸脱しないことは当業者には明らかであろう。本発明は特に好適な実施例に関連して記載されているが、本発明の請求の範囲は、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際には、本発明を実施するために記載された方法の種々の変更例は、分子生物学或いは関連する分野の当業者には明らかなように、以下の請求項の範囲内に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/395 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｎ 45/00 45/00 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ０７Ｋ 16/18 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 15/02 Ｇ０１Ｎ 33/15 ＺＣ１２Ｐ 21/08 33/53 ＤＣ１２Ｑ 1/68 33/566 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 33/53 15/00 Ｃ 33/566 5/00 ＢＡ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ，ＵＳ【要約の続き】

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする精製ポリヌクレオチド。２．前記核酸配列が、配列番号：１の配列または、それに相補的な配列からなることを特徴とする請求項１に記載のポリヌクレオチド。３．腫瘍誘導性カヘキシーの診断のための試験方法であって、ａ）ハイブリダイゼーション複合体の形成に適切な条件の下で、生物学的サンプルと、請求項１のポリヌクレオチドまたはそのフラグメントとを結合させる過程と、ｂ）前記生物学的サンプルにおいて前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記複合体の検出がカヘキシーの診断となる、該過程とを含むことを特徴とする診断のための試験方法。４．請求項１のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。５．請求項４の発現ベクターで形質転換された宿主細胞。６．配列番号：２に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドを生成する方法であって、ａ）前記ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項５の宿主細胞を培養する過程と、ｂ）前記宿主細胞の培地からポリペプチドを回収する過程とを含むことを特徴とするポリペプチドの生成方法。７．配列番号：２のアミノ酸配列を含む精製ポリペプチド。８．請求項７のポリペプチド及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬品組成物。９．患者に請求項８の医薬品組成物を効果的な量だけ投与する過程を含む重症または中程度の肥満症の患者の治療方法。１０．請求項１のポリヌクレオチドの少なくとも一部に対して相補的な核酸配列を含むアンチセンス分子。１１．請求項１０のアンチセンス分子及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬品組成物。１２．患者に、請求項１１の医薬品組成物を効果的な量だけ投与する過程を含む、配列番号：１のポリヌクレオチドの誘発及び発現が関係する腫瘍誘導性カヘキシーの患者の治療方法。１３．請求項７の精製ポリペプチドに対して特異的な抗体。１４．請求項１３の抗体及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬品組成物。１５．患者に請求項１４の医薬品組成物を効果的な量だけ投与する過程を含む、腫瘍誘導性カヘキシーの患者の治療方法。１６．カヘキシーが関係する状態または疾病の診断のための試験方法であって、ａ）カヘキシー関連タンパク質を含み得る生物学的サンプルを準備する過程と、ｂ）抗体がタンパク質に結合し抗体−タンパク質複合体を形成するに適切な条件の下で、前記生物学的サンプルと請求項１３の抗体とを結合させる過程とを含むことを特徴とするカヘキシーが関係する状態または疾病の診断のための試験方法。１７．前記状態または疾病が、腫瘍誘導性カヘキシーまたは肥満症からなる群から選択されたものであることを特徴とする請求項１６に記載の方法。１８．請求項７の精製ポリペプチドに対して特異的なインヒビター。１９．請求項１８のインヒビター及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬品組成物。２０．患者に請求項１９の医薬品組成物を効果的な量だけ投与する過程を含む、腫瘍誘導性カヘキシーの患者の治療方法。