JP2002509427A

JP2002509427A - 新規なヒト・レプチンレセプター遺伝子関連タンパク質

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Publication number: JP2002509427A
Application number: JP50826198A
Authority: JP
Inventors: エイカーブラム、イングリッド・イー
Original assignee: Incyte Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Incyte Corp
Priority date: 1996-08-01
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 2002-03-26
Also published as: US20030166847A1; EP0920503A2; WO1998005792A3; WO1998005792A2; US5874535A; CA2261573A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、新規なヒト・レプチンレセプター遺伝子関連タンパク質(ＬＲＧＲＰ)を同定し、コードするポリヌクレオチドを提供する。本発明はまた、発現ベクター、宿主細胞、アゴニスト、及びアンタゴニストを提供する。本発明はまた、代謝障害、結合組織障害、及び生殖障害の治療のための方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】新規なヒト・レプチンレセプター遺伝子関連タンパク質技術分野本発明は、新規なヒト・レプチンレセプター遺伝子関連タンパク質の核酸及びアミノ酸配列と、エネルギー代謝、生殖、結合組織、及び発達の病気や癌の診断、予防、及び治療におけるこれらの配列の利用とに関するものである。背景技術肥満（ob）遺伝子産物のレプチンは、体重の調節のための重要な循環シグナルである（Zhang Y.等.(1994)Nature 372:425-432）。マウスの、非機能性ob遺伝子に対するホモ接合は、過食及び代謝効率の過剰を原因とする病的な肥満や糖尿をもたらす。１９９５年、Tartaglia L.A.等．(Cell 83:1263-1271)は、マウスレプチンに対する高いアフィニティーを有するレセプター（OB-R）について記述した。そして、レプチンの体重減少効果が、視床下部におけるOB-Rを介したシグナル伝達により媒介され得ることを示唆する証拠が得られた（Lee G.H．等.(199 6)Nature 379:632-635）。食欲の減少に加えて、レプチンは、ラットにおける体脂肪を消失させることが分かった（Chen G．等.(1996)Proc．Natl.Acad.Sci.93: 14795-14799）。レプチンを発現するアデノウイルスベクターの注射したラットでは、同量の食物をとっているがレプチンを発現するベクターを注射していないラットと比較して体脂肪の減少が見られた。スプライスバリアントの発現の調節は、シグナル伝達分子の活性において重要な役割を有し得、且つ幾つかの病気の病因に関係する（Khachigian L.M.等.(199 2)Pathology 24:280-290）。例えば、スルホニル尿素レセプター遺伝子の新たなスプライスバリアントを作り出す突然変異により、家系性の持続的な高インスリン低血糖が分離される（Thomas P.M ．等.(1995)Science 268:426-429）。少なくとも９つの異なるマウスOB-Rのスプライスされた形態が報告されている（Lee等.，前出）。スプライスバリアントB219は、マウスの卵黄嚢、初期の胎児の肝臓、高濃度の造血幹細胞、種々のリンパー造血株細胞、及び成人の生殖器官において発現され、造血及び生殖に直接関与し得る（Cilffi J.A．等.(1996)Nat ure Medicine 2:585-589）。造血におけるレプチンの役割についての更なる証拠が最近Gainsford T等.，により報告された。それによれば、レプチンはマウスの腹膜マクロファージによる寄生物の食作用やサイトカイン産生を促進することが分かった（1996,Proc.Narl.Acad.Sci.93:14564-14568）。生殖におけるレプチンの役割についての別の証拠は、Chehab F.F.等が提示した。その報告によれば、レプチン処理することにより、ob/ob雌マウスにおける生殖不能が修正される（1 996,Nature Genet.12:318-320）。研究者によれば、レプチンは、体脂肪を低減させるのでなく、必要な視床下部及び下垂体ホルモンの濃度を回復させることによって生殖不能を増進する。最近、レプチンが、マウス及びヒトの双方において思春期の誘導に関与していることが分かった。レプチンを定期的に注射した処理済み雌マウスは、出生後３７日で性的成熟に達したが、処理していないマウスは出生後約４０日になって性的成熟の兆候を示す（Chehab F．等.,(1997)Science 275:88-90）。ヒトにおいては、思春期の少年においてテストストロン濃度が上昇するのと同時にレプチンの濃度が急激に上昇する（Flier J.，未公開）。異なるスプライス済み転写物を作り出すOB-Rの突然変異は、重症の肥満症及び db/dbマウス（Chen H．等.(1996)Cell 84:491-495）及びfa/faツッカーラット（ Zucker rat）（Chua S.C．等.(1996)Science 271:994-996）の糖尿病の表現型に関与している。ヒト及びマウスの染色体間のシンテニーに基づき、ヒトのOB-Rは、ヒト染色体1p31にマッピングされる（Lee 等.，前出）。線虫及びサッカロミセスセレビシエにおけるゲノムシークエンシングの努力の結果、推定上の読み枠（ORF）C30B5.2及びYJR044cのそれぞれが分かった（Wilso n R.等.,(1994)Nature 368:32-38;Huang M.E．等.(1995)Yeast 11:775-781）。Y JR044c及びC30B5.2は、２７％のアミノ酸配列同一性及び７１％のアミノ酸配列類似性を有し、類似した疎水性グラフのパターンを共通に示す。YJR044cは、推定上の膜関連タンパク質として特性化された（Wilson等.Supra）。C30B5.2アミノ酸配列は、グリセリンの二級炭素基から脂肪酸を放出させる酵素のファミリーであるホスホリパーゼＡ２に対するコンセンサスパターン（CCxxHxxC）を有する。例えばレプチンレセプターのようなシグナル伝達分子の多くの活性は、その分子のスプライスバリアントの発現により調節されると考えられている。新たなレプチンレセプター遺伝子関連タンパク質は、癌や、エネルギー代謝障害、生殖障害、結合組織の障害及び発達における障害の診断及び治療の基礎を提供し得る。発明の開示本発明は、新規なヒト・レプチンレセプター遺伝子関連タンパク質(以下ＬＲＧＲＰと称する)を開示する。このＬＲＧＲＰは、その核酸コーディング配列の一部が、ヒト・レプチンレセプターｃＤＮＡ（GI1139595）の非コーディング領域と共通である。更に、ＬＲＧＲＰは、線虫ORF C30B5.2（GI 733555）及びサッカロミセスセレビシエORF YJR044c（GI 1197072）の膜関連タンパク質と相同性を有する。従って、本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を有する、実質的に精製されたレプチンレセプター遺伝子関連タンパク質を提供する。本発明はまた、配列番号 :１の２２番目のMetから１３１番目のTrpに至るポリペプチド及び配列番号：１の他の断片に関するものである。本発明の一実施例は、ＬＲＧＲＰをコードする単離され、実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例では、このポリヌクレオチドは配列番号:２のヌクレオチド配列である。更に、本発明は、配列番号:２における、１６３番目のＣ乃至８７４番目のＡのヌクレオチドからなる断片に対して厳しい条件下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列を提供する。本発明はまた、ＬＲＧＲＰをコードする核酸配列、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、その断片、一部分、又はそのアンチセンス分子、及びＬＲＧＲＰをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター及び宿主細胞に関連する。本発明はまた、ＬＲＧＲＰに特異的に結合する抗体、実質的に精製されたＬＲＧＲＰ、その断片、アゴニスト、又はこの他ＬＲＧＲＰのアゴニストを、適切な製薬学的担体と共に含む医薬品組成物、ＬＲＧＲＰ、その断片、アゴニスト、又はＬＲＧＲＰのアンタゴニストの生成方法に関するものである。本発明はまた、ＬＲＧＲＰに対するアンタゴニストを投与することにより癌及び結合組織の疾患を治療するための方法、及びＬＲＧＲＰに対するアゴニストを投与することにより代謝、生殖、及び発達の疾患を治療するための方法を提供する。図面の簡単な説明第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図は、MacDNAsisソフトウエア（日立ソフトウエアエンジニアリング社）を用いて作製した、新規なレプチンレセプター遺伝子関連タンパク質ＬＲＧＲＰのアミノ酸配列（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）を示す図である。第２図は、LIFESEQ^TMデータベース（Incyte Pharmaceuticals,Palo Alto CA）を用いて電子的に作製した、インサイト社クローンＮｏ．４９２７０３（配列番号：２）のノーザン解析の結果を示した図である。量のパーセンテージは、ライブラリーにおいて見いだされた転写物の数に１００を乗じ、その積をライブラリーにおける転写物の総数で除すことにより計算される。第３図は、ヒト・レプチンレセプター遺伝子ＬＲＧＲＰのｃＤＮＡ、及び線虫 ORF C30B5.2のｃＤＮＡの模式図であり、選択されたスプライス部位及びコーディング配列における類似性、及び相違点を強調して示してある。第４図は、DNAStarソフトウエア（DNAStar Inc,Madison WI）のマルチシーケンスアライメントプログラムを用いて作製された、ＬＲＧＲＰのアミノ酸配列（配列番号：１）、線虫ORF C30B5.2のアミノ酸配列（GI 733555；配列番号：３）及びサッカロミセスセレビシエORFYJR044cアミノ酸配列（GI 1197072；配列番号：４）の間のアミノ酸配列アライメントを示した図である。第５図は、ＬＲＧＲＰ（配列番号：１）の疎水性プロットグラフ（MacDNAsis ソフトウエアを用いて作製）を示した図であり、Ｘ軸はアミノ酸の位置、Ｙ軸は負の方向に疎水性のレベルを表している（第５図及び第６図）。第６図は、線虫ORF C30B5.2のアミノ酸配列（配列番号：３）の疎水性プロットグラフを示した図である。第７図は、ヒトＬＲＧＲＰ及びエキソン／イントロン接合部のヌクレオチド配列をコードする遺伝子のゲノムの構成を示した図である。第８図は、ＬＲＧＲＰ、OB-R、及びB219転写物をＰＣＲプライマーと共に示した模式図であり、それらの各アニーリング部位が示され、推定されるＰＣＲ産物の長さが示されている。第９図は、以下のサンプルが走ったアガロースゲルを示した図であり、そのサンプルとは、１００ｂｐのＤＮＡラダー及び６つの造血性遺伝子（CAM,Raji,HL6 0,HSB2,Jurkat及びK562）、子宮頚癌（Hela）、と褐色前脂肪細胞、及び脂肪細胞株細胞からのＰＣＲ産物である。このＰＣＲ産物のサイズは矢印で示されている。発明の実施の形態定義本明細書において、「核酸配列」とは、一本鎖若しくは二本鎖の、センス鎖、又はアンチセンス鎖であるゲノムの若しくは合成起源のＤＮＡ若しくはＲＮＡや、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びその断片又は一部分を意味する。同様に、本明細書において「アミノ酸配列」とは、ペプチド若しくはタンパク質配列を意味する。本明細書において「ペプチド核酸」とは、リジンのようなアミノ酸残基及びアミノ基が加えられたオリゴマーを含む分子を意味する。これらの小分子は、抗遺伝子剤とも称され、核酸のこれらの相補的な（鋳型の）鎖に結合することにより転写物の伸張を停止させる（Nielsen PE等(1993)Anticancer Drug Des 8:53-63 ）。本明細書で用いられるとき、ＬＲＧＲＰとは、任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、及び好ましくはヒトを含む哺乳類に由来する、天然の、合成の、半合成の、又は組換え体を起源とする実質的に精製されたＬＲＧＲＰのアミノ酸配列を意味する。ＬＲＧＲＰの「変異体」は、１又は２箇所以上のアミノ酸の「置換」により異なるものとなったアミノ酸配列を有し得るものである。この変異体は「保存的」変化を含むものであり得、この保存的変化においては例えばロイシンをイソロイシンで置き換える場合のように置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性を有する。稀に、変異体が「非保存的」に変化する場合もあり、この非保存的変化では例えばグリシンがトリプトファンで置換される。類似した小変化には、アミノ酸の欠失、挿入、若しくはその両方も含まれ得る。例えばDNAStarソフトウエアのような従来より周知のコンピュータプログラムを用いて、生物学的或いは免疫学的活性を損なわずに、置換、挿入、又は除去できるアミノ酸及びそのアミノ酸の数を決定することができる。用語「生物学的に活性」とは、自然発生のＬＲＧＲＰの構造的機能、調節機能、又は生化学的機能を有するＬＲＧＲＰを意味する。同様に「免疫学的活性」とは、天然の、組換えの、又は合成のＬＲＧＲＰ、若しくはその任意のオリゴペプチドが適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体に結合する能力として定義される。本明細書において、「誘導体」なる用語は、化学的に修飾されたＬＲＧＲＰをコードする核酸、又はコードされたＬＲＧＲＰを意味する。このような修飾の例には、水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換がある。核酸誘導体は、天然ＬＲＧＲＰの必須の生物学的特性を保持しているポリペプチドをコードする。本明細書において、用語「アゴニスト」とは、ＬＲＧＲＰに結合したとき、ＬＲＧＲＰの活性を変調し、ＬＲＧＲＰに変化をもたらす分子を指す。アゴニストには、ＬＲＧＲＰに結合するタンパク質、核酸、炭水化物、又は任意の他の分子が含まれ得る。本明細書において、用語「アンタゴニスト」又は「インヒビター」とは、ＬＲＧＲＰに結合したとき、ＬＲＧＲＰの生物学的又は免疫学的活性を遮断又は変調する分子を指す。アンタゴニスト及びインヒビターには、ＬＲＧＲＰに結合するタンパク質、核酸、炭水化物、又は任意の他の分子が含まれ得る。本明細書において、「実質的に精製」なる用語は、この天然の環境から取り除かれ、天然にはそれが結合して存在する少なくとも１つの他の成分から単離又は分離されて、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９０％遊離した核酸配列又はアミノ酸配列を有する分子を意味する。「厳格性（stringency）」とは、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃下）からＴｍの約２０〜２５℃下の範囲で発生する。当業者には理解できるように、厳格性のあるハイブリダイゼーションでは、同一のポリヌクレオチド配列を同定、つまり検出したり、或いは類似の、すなわち近縁なポリヌクレオチド配列を同定、つまり検出するために用いることができる。本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション(ハイブリッド形成)」は「核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する過程」（CoombsJ（1994）Dictiona ry of Biotechnology ,Stockton Press社,New York）を含む概念である。増幅とは、核酸配列の複製を作り出すこととして定義され、通常周知のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により実行される（Dieffenbach CW and GS Dveksler(1995) ,PCR Primer a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press社,New york）。本明細書において「欠失」とは、１または２以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基が欠ける、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化として定義される。本明細書において「挿入」或いは「付加」とは、自然発生のＬＲＧＲＰと比較して、結果的に１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ酸残基の加わるようなヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。本明細書において「置換」とは、１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ酸を異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置換することによって生ずる変化を指す。説明本発明は、新規なヒト・レプチンレセプター遺伝子関連タンパク質（ＬＲＧＲＰ）の発見、ＬＲＧＲＰをコードするポリヌクレオチド、及び癌や代謝障害、生殖障害、結合組織障害、及び発達障害の診断、予防、又は治療のためのこれらの組成物の利用にその基礎をおいている。本発明のヒトＬＲＧＲＰをコードする核酸は、hNT2株細胞ｃＤＮＡライブラリー（HNT2NOT01）から、アミノ酸配列アライメントのコンピュータ検索によって、インサイト社クローンＮｏ．４９２７０３として初めに同定された。コンセンサス配列（配列番号：２）は、インサイトの核酸配列の延長から得られた。ＬＲＧＲＰの一部をコードするｃＤＮＡは、第２図に示す組織及び株細胞に由来するｃＤＮＡライブラリーにおいて見いだされた。ＬＲＧＲＰに対して一義的なｃＤＮＡの一部分は、心臓、胎盤、肺、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、及び脳組織において見いだされた。また、ＰＣＲ解析によって、ＬＲＧＲＰを特異的にコードするｃＤＮＡ群及びレプチンレセプターを特異的にコードするｃＤＮＡ群が、分化の前及び後の双方におけるヒト前脂肪細胞の株細胞、及び６つの造血性細胞の株細胞、及び子宮頚癌細胞の株細胞において見いだされた（第８図及び第９図参照）。ＬＲＧＲＰの自然発生の発現は、それらの細胞及び組織の型に限定される必要はない。本発明はまた、ＬＲＧＲＰ変異体をその範囲に含む。好適なＬＲＧＲＰ変異体は、ＬＲＧＲＰアミノ酸配列（配列番号：１）と、少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有するものであり、より好適なＬＲＧＲＰ変異体は配列番号：１と少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するものであり、最も好適なＬＲＧＲＰ変異体は、配列番号：１、少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するものである。本発明のヒト・レプチンレセプター遺伝子関連タンパク質をコードする核酸は、核酸配列アライメントのコンピュータ検索によってインサイト社クローンＮｏ．４９２７０３のｃＤＮＡ（配列番号：２）として初めに同定された。この配列番号：２の核酸配列は、配列番号：１のＬＲＧＲＰアミノ酸配列をコードしており、ヒト・レプチンレセプターｃＤＮＡの非コーディング領域と共通ないくつかのエクソンを有している（Tartaglia等，前出；第３図）。配列番号：２のＧ₁乃至Ｇ₁₆₂のヌクレオチドは、ヒト・レプチンレセプターｃＤＮＡの非コーディング領域におけるＧ₁₂乃至Ｇ₁₇₃のヌクレオチドと同一である（GI 1139595;Tartag lia等，前出）。ＬＲＧＲＰのコーディング配列は独特のものである。ＬＲＧＲＰにおける推定上のスプライス部位における核酸、ヒト・レプチンレセプターと同一の領域の３'末端は、関連遺伝子線虫ORF C30B5.2（GI 733555;Wilson等，前出；第３図）に対する推定上のスプライス部位でコードされたものと完全に同一のアミノ酸群をコードする。ラットのレプチンレセプターｃＤＮＡ（GI 1335914 ）の非コーディング領域におけるエキソンは、ヒト・レプチンレセプターの非コーディング配列と一致するＬＲＧＲＰコーディング配列の一部と高度の相同性を有する。ＬＲＧＲＰ遺伝子は、レプチンレセプターと同じ部位、ヒト染色体の1p 31にマッピングされる。ＬＲＧＲＰをコードする遺伝子のゲノムの構成、及びエキソン／イントロン接合部の配列は第７図に示されている。本発明の或る実施例では、ＬＲＧＲＰｍＲＮＡの翻訳が、配列番号：２のＡ₇₁ の位置で始まるATGから開始される。別の実施例では、ＬＲＧＲＰのｍＲＮＡの翻訳が、Ａ₁₃₄で始まる後続のフレーム内ATGから開始される。本発明は、ＬＲＧＲＰと、線虫ORF C30B5.2(GI 733555)と、サッカロミセスセレビシエORF YJR044c(GI 1197072;Huang等，前出；第４図)との間の化学的及び構造的相同性に部分的に基礎をおいている。ＬＲＧＲＰは、線虫ORF C30B5.2のアミノ酸配列に対して４５％の同一性及び７７％の類似性を有している。またＬＲＧＲＰは、サッカロミセスセレビシエORF YJR044cのアミノ酸配列に対して３２％の同一性及び６４％の類似性を有している。ＬＲＧＲＰ、線虫OR F C30B5.2の疎水性プロット（第５図及び第６図に示す）は、それらがＬＲＧＲＰの立体配置及び膜局在化を共通に有していることを示唆している。この新規なＬＲＧＲＰは、１３１個のアミノ酸からなる長さを有し、推定上のグリコシル化部位を有していない。ＬＲＧＲＰコーディング配列ＬＲＧＲＰの核酸及び推定アミノ酸配列は第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図に示されている。本発明によれば、ＬＲＧＲＰのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、ＬＲＧＲＰを発現する組換え体分子を作り出すことができる。ここに開示する特定の実施例では、ＬＲＧＲＰの一部分をコードする核酸配列は、hNT2細胞ｃＤＮＡライブラリー（HNT2NOT01）からインサイト社クローンＮｏ．４９２７０３として初めに単離されたものである。遺伝暗号の縮重の結果、既知の又は自然発生の遺伝子のヌクレオチド配列に対して最小限の相同性しか有していないものも含まれる多数のＬＲＧＲＰコード化ヌクレオチド配列が作り出され得る、ということは当業者には明らかであろう。本発明は、特に、可能なコドン選択に基づく組み合わせの選択によりなされ得る全ての可能な核酸配列の変化をその範囲に含んでいる。それらの組み合わせは、自然発生のＬＲＧＲＰのヌクレオチド配列に当てはまる標準的なトリプレット遺伝暗号に基づいて作り出されるものであり、このような全ての変異は、ここに具体的に示されたものと考えられたい。ＬＲＧＲＰ及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は適切に選択された厳格性の条件の下で、自然発生配列のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なものであるのが好ましいが、概ね異なるコドン使用を有するＬＲＧＲＰ又はその変異体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。コドン選択は、特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従って、特定の原核細胞の、或いは真核細胞の発現宿主においてペプチドが発現する速度を高めるように選択され得る。ＬＲＧＲＰ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を、コードされるアミノ酸配列を変更することなく実質的に変更する理由は、例えば天然配列から作り出される転写物よりより長い半減期のようなより望ましい特性を有するＲＮＡ転写物の産生のためである。現在では、ＬＲＧＲＰ又はその誘導体をコードするＤＮＡ配列、若しくはその一部分を、完全に合成ケミストリにより作製して、その後、その合成遺伝子を任意の入手可能なＤＮＡベクター及び株細胞に、この出願時点において周知の試薬を用いて挿入することができる。更に、合成ケミストリを用いてＬＲＧＲＰをコードする配列又はその任意の部分に突然変異を誘発させることができる。また本発明の範囲に含まれるものとして、種々の厳格性の条件の下で、第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なポリヌクレオチド配列がある。ハイブリダイゼーション条件は、Berger及びKimmel(1 987,Guide to Molecular Cloning Technioues.Metods in Enzymology,Vol 152,A cademic Press,San Diego CA)に記載されているように、核酸結合複合体またはプローブの融点（Ｔｍ）に基づいており、定義された「厳格性」で用いられる基準を与える。上記文献は本明細書と一体に引用されたものである。本発明において用いられ得るＬＲＧＲＰをコードする変異核酸配列は、異なるヌクレオチド残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に同一の、または機能的に等価のＬＲＧＲＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとなるものである。そのタンパク質も、サイレント変化を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に機能的に等価なＬＲＧＲＰとなる。慎重なアミノ酸置換は、ＬＲＧＲＰの生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性並びにまた両親媒性についての類似性に基づいてなされ得る。例えば負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、同じ親水値を持つ荷電していない極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン並びにチロシンが含まれる。本発明の範囲に含まれるものとして、ＬＲＧＲＰのアレルがある。ここで用いる「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＬＲＧＲＰの別形態である。アレルは変異、すなわち核酸配列の変化によって生じ、一般に変化したｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生成するが、そのｍＲＮＡ或いはポリペプチドの構造或いは機能は変更される場合もあれば、されない場合もある。遺伝子によっては、アレル形態が存在しないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するものがある。アレルを生じる変異は一般に、アミノ酸の自然な欠失、付加並びに置換に起因する。このタイプの変化はそれぞれ単独で、或いは他の遺伝子の組み合わせて、与えられた配列内の１又は２箇所以上の部位で生じ得る。ＤＮＡ配列決定のための方法は周知であり、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ，Se quenase（商標）のクラノウフラグメント（US Biochemical 社,Cleveland OH）、Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer社,Norwalk CT）、熱安定性Ｔ７ポリメラーゼ（Amersham社,Chicago IL）、或いはGibco BRL（Gaithers burg MD）Methods社から市販されているELONGASE増幅システムのような組換えポリメラーゼとプルーフリーディングエキソヌクレアーゼとの組み合わせのような酵素を使用する。好ましくは、この処理は、Hamilton Micro Lab2200(Hamilton 社,Reno NV）、Peltier Thermal Cycler（PTC200；MJ Reserch社,Watertown MA ）並びにABI377DNAシーケンサ（Perkin Elmer社）のような装置を用いて自動化される。ポリヌクレオチド配列の延長ＬＲＧＲＰをコードするポリヌクレオチド配列は、部分的なヌクレオチド配列と、プロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当業者には周知の様々な方法とを用いて延長することができる。Gobinda等（1993;PCR Me thods Applic 2:318-22）は既知の部位に隣接する未知の配列を検索するために汎用プライマーを用いる直接的な方法として「制限部位」ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を開示している。ここでは、まずゲノムＤＮＡが、既知の領域に対して特異的なプライマー及びリンカー配列に対するプライマーの存在下で増幅される。増幅された配列は、その同じリンカープライマー及び最初のプライマーの内部に含まれる別の特異的プライマーを用いてＰＣＲの２巡目にかけられる。ＰＣＲの各回の生成物は、適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列決定される。逆ＰＣＲ法を用いて、既知領域に基づく多様なプライマーを利用した配列の増幅、または延長を行うことができる(Triglia等(1988)Nucleic Acids Res 16:818 6)。プライマーは、OLIGO(登録商標)4.06(National Biosciences社,Plymouth MN )或いは別の適切なプログラムを用いて設計され、長さが２０〜３０ヌクレオチドで、５０％以上のＧＣ含有率を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールする。この方法ではいくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域の適当なフラグメントを生成する。次いでこのフラグメントは分子内ライゲーションにより環状にされ、ＰＣＲ用の鋳型として使用される。キャプチャＰＣＲ法（Lagerstrom M等（1991）PCR Methods Applic 1:111-19 ）は、ヒト及び酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ内の既知の配列に隣接するＤＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を行うための方法である。またキャプチャＰＣＲでは、多重制限酵素消化及びライゲーションによってＰＣＲ前にＤＮＡ分子の未知の部分に、組換え二本鎖配列を配置する必要がある。未知の配列を検索するために用いることができる別の方法は、Parker JD等の方法（1991;Nucleic Acids Res 19:3055-60）である。また、ＰＣＲ法、入れ子プライマー並びにPromoterFinderのライブラリーを用いて、ゲノムＤＮＡ内を歩行させることができる（PromoterFinder^TMClontech社(Palo Alto CA)）。この過程は、ライブラリーをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エクソン接合部を探し出すのに有用である。完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするための好適なライブラリーは、サイズ選択された、より大きなｃＤＮＡを含むライブラリーである。またランダムプライマーを与えた（rondom primed）ライブラリーは、遺伝子の５’及び上流領域を含むより多くの配列を含むという点で好適である。ランダムプライマーを与えられたライブラリーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを生成しない場合、特に有用である。またゲノムライブラリーは、プロモータ結合領域の５’まで延長するために有用である。サイズを分析したり、或いは配列決定やＰＣＲ処理の産物のヌクレオチド配列を確認するための新しい方法はキャピラリー電気泳動法である。迅速な配列決定のためのシステムは、Perkin elmer社、Beckman Instruments社（Fulle rton CA）並びに他の企業から入手できる。キャピラリー電気泳動法では、電気泳動分離のための流動性ポリマー、レーザで活性化される４つの異なる蛍光色素 (各ヌクレオチドに対して１つ)を使用し、ＣＣＤカメラにより放射線の波長の検出を行う。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えばPerkin elmer社製のGeno typer（登録商標）及びSequence Navigator（登録商標））を用いて電気信号に変換され、サンプルの負荷からコンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコンピュータ制御される。キャピラリー電気泳動法は特定のサンプルの限定された量の中に存在するＤＮＡの小片の配列決定に特に適している。この方法により３０分間でＭ１３ファージＤＮＡの３５０ｂｐを再現可能な形で配列決定できたことが報告されている（Ruiz-Martinez MC等（1993）Anal Chem 65:2851-8 ）。ヌクレオチド配列の発現本発明に従って、ＬＲＧＲＰ、そのポリペプチドの断片、融合タンパク質或いはその機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列を、適切な宿主細胞内でのＬＲＧＲＰの発現を誘導する組換えＤＮＡ分子を生成するために用いることができる。遺伝暗号固有の縮重のために、概ね同一か或いは機能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も、ＬＲＧＲＰのクローニングや発現のために用いることができる。当業者には理解できるように、非自然発生コドンを有するＬＲＧＲＰコード化ヌクレオチド配列を生成することは有益であり得る。特定の原核細胞或いは真核細胞の宿主において好適なコドン（Murray E等（1989）;N ucleic Acids Res 17:477-508）を選択して、例えば、ＬＲＧＲＰ発現率を増大させたり、或いは自然発生配列から生成された転写産物より長い半減期のような望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写産物を生成することができる。本発明のヌクレオチド配列は、様々な目的でＬＲＧＲＰコード配列を変更するために組換えられ得るが、このような変更には、限定はしないが遺伝子生成物のクローニング、プロセシング並びにまた発現を修飾するための変更が含まれる。例えば、特定部位突然変異誘発のような当業者には周知の技術を用いて突然変異を誘発させることによって、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン選好の変化等をもたらすことができる。本発明の別の実施例では、天然ＬＲＧＲＰコーディング配列、修飾ＬＲＧＲＰコーディング配列或いは組換えＬＲＧＲＰコーディング配列を異種の配列に結合して、融合タンパタ質をコードする配列にする。例えば、ＬＲＧＲＰ活性のインヒビターを選別すべくペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体により認識される異種のペプチドを発現するキメラＬＲＧＲＰタンパク質をコード化することが役立ち得る。融合タンパク質はＬＲＧＲＰ配列と異種のタンパク質配列との間の位置に切断部位を包含するように設計することもでき、これによってＬＲＧＲＰを切断して、異種の部分から分けて実質的に精製することが可能となる。本発明の別の実施例では、ＬＲＧＲＰコーディング配列は、当業者によく知られた化学的方法(Caruthers等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223、Crea,H orn（1980）Nuc Acids Res 9:2331、Matteucci，Caruthers（1980）Tetrahedron Lett 21:719、Chow,Kempe（1981）Nuc Acids Res 9:2807-2817参照)を用いて、全体的に、或いは部分的に合成することができる。別法では、ＬＲＧＲＰアミノ酸配列を、全体的に或いは部分的に合成する化学的方法を用いてタンパク質自体を生成することができる。例えば、種々の固相技術（Roberge JY等(1995)Science 269: 202-204）でペプチド合成を行うことができ、合成の自動化は、例えばABI431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を製造者の指示に従って用いることにより達成することができる。この新たに合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィにより精製することができる（例えばCreighton（1983）Proteins,Structure and Molecu lar Principles,WH Freeman and Co,New York参照）。合成されたペプチドの組成は、アミノ酸解析或いは配列決定処理により確認することができる（例えばth e Edman degradation procedure;Creighton，上述）。さらにＬＲＧＲＰのアミノ酸配列、或いはその任意の部分を、その直接の合成の際に改変したり、また他の細胞内メディエータ或いはその任意の部分に由来する配列と化学的方法を用いて結合して、変異体ポリペプチドを生成することができる。発現系生物学的に活性のＬＲＧＲＰを発現するために、ＬＲＧＲＰコーディングヌクレオチド配列或いは機能的等価物は、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコード化配列の転写及び翻訳に必要不可欠な要素を含むベクターに挿入される。ＬＲＧＲＰコーディング配列及び適切な転写や翻訳の制御エレメントを含む発現ベクターを構成するために当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo組換え、即ち遺伝子組換え技術が含まれる。このような技術は、Sambrook等（1989）Molecular Clon ing A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Press,Planview NY及びAusubel FM等Current Protocol in Molecular Biology,John Wilky & Sons,New Yorkに記載されている。種々の発現ベクター／宿主系を、ＬＲＧＲＰコード化配列を保持し、かつ発現するために利用することができる。このようなものには、限定はされないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMV、タバコモザイクウイルスTMV）をトランスフェクトした、或いはバクテリア発現ベクター（例えばTi、或いはpBR3 22プラスミド）で形質転換した植物細胞系、或いは動物細胞系が含まれる。これらの系の「制御エレメント」或いは「調節配列」は、その力及び特異性は様々で、ベクターの非翻訳領域、エンハンサー、プロモータ及び３′非翻訳領域であり、これらは転写及び翻訳を実行するために宿主細胞のタンパク質と相互作用する。利用されるベクター及び宿主に応じて、構成的及び誘導性プロモータを含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントが用いられ得る。例えば、バクテリア系においてクローニングする際には、Bluescript（登録商標）ファージミド（Stratagene社，LaJolla CA）のハイブリッドlacZプロモータ及びptrp-lacハイブリッド並びに同様の誘導性プロモータが用いられる。バキュロウイルスポリヘドリンプロモータは昆虫細胞において用いられる。植物細胞のゲノム（例えば熱ショック,RUBISCO及びストレージタンパク質遺伝子）に由来する、或いは植物ウイルス（例えばウイルス性プロモータ或いはリーダー配列）に由来するプロモータ或いはエンハンサはベクターにクローン化され得る。哺乳動物細胞では、哺乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルス由来のプロモータが最適である。ＬＲＧＲＰの多数の複製を含む株細胞を生成する必要がある場合には、SV40或いはEBVに基づくベクターを、適切な選択マーカーと共に用いる。細菌系では、ＬＲＧＲＰの発現の用途に応じて多数の発現ベクターが選択され得る。例えば抗体を誘発するために大量のＬＲＧＲＰが必要とされる場合は、容易に精製される融合タンパク質を高濃度で発現できるベクターが望まれる。そのようなベクターには、限定はしないが、大腸菌クローニングベクター及び発現ベクターBluescript（Stratagene社）（このベクターでは、ＬＲＧＲＰコード化配列が、アミノ基末端メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列を備えたフレーム内においてベクターに結合されてハイブリッドタンパク質が生成される）や、pINベクター（Van Heeke&Schuster（1989）J Biol Chem 264:550 3-5509）等が含まれる。またpGEXベクター（Promage社、Madison WI）も、グルタチオンS−トランスファーゼ（GST）を有する融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現するため用いられる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへの吸着に続き、遊離グルタチオンの存在下における溶出により溶解した細胞から容易に精製できる。その系において生成されたタンパク質はヘパリン、トロンビン或いはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計され、対象となるクローン化ポリペプチドは随意にGST部分から放出され得る。酵母菌、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因子、アルコールオキシダーゼ及びPGHのような構成的或いは誘導性プロモータを含む多数のベクターが用いられる。再検討する場合には、Ausubel等（前出）及びGrant等（1987）Methods Enzymol 153:516-544を参照されたい。植物発現ベクターを用いる場合には、ＬＲＧＲＰをコードする配列の発現は、多数の任意のプロモータにより促進される。例えばCaMVの35S及び19Sプロモータ（Brisson等（1984）Nature 310:511-514）のようなウイルス性プロモータは、単独で、或いはTMV（Takamatsu等（1987）EMBO J6:307-311）からのオメガーリーダー配列と共に用いられる。別法では、RUBIS CO(Coruzzi等(1984)EMBO J3:1671-1680)、Broglie等（1984）Science 224:838-8 43）の小サブユニット、或いは熱ショックプロモータ(Winter J及びSinibaldi R M(1991)Results Probl Cell Differ 17:85-105)のような植物プロモータが用いられる。これらの構成は直接ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞内に導入される。そのような技術を再検討する場合には、Ho bbs S及びMurry LE、McGraw Hill Yearbook of Sience and Technology（1992） McGraw Hill NY,pp191-196及びWeissbach and Weissbach（1988）Methods for P lant Molecular Biology ,Academic Press NY,pp421-463を参照されたい。ＬＲＧＲＰを発現するために用いることができる別の発現系は昆虫系である。そのような系の一つでは、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV) がベクターとして用いられ、Spodoptera frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの幼虫において外来遺伝子を発現する。ＬＲＧＲＰコード化配列は、ポリヘドリン遺伝子のような、ウイルスの非必須領域にクローニングされ、ポリヘドリンプロモータの制御下に置かれる。ＬＲＧＲＰの挿入が成功した場合には、ポリヘドリン遺伝子が不活性にされ、コートタンパク質膜が欠如した変異体ウイルスが生成される。次いで、この変異体ウイルスは、S.frugiperda細胞或いはTrichoplusia の幼虫への感染させるために用いられ、その中でＬＲＧＲＰが発現される（Smit h等（1983）J Virol 46:584、Engelhard EK等（1994）Proc Nat Acad Sci 91:32 24-7）。哺乳類宿主細胞では、多数のウイルス性発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、ＬＲＧＲＰのコード化配列は、後期プロモータ及び三連リーダ配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳物複合体内に結合される。ウイルス性ゲノムの非必須領域への挿入により、感染した宿主細胞でＬＲＧＲＰを発現することができる生存可能なウイルスになる（Logan及びShenk（1984）Proc Nat Acad Sci 81:3655-3659）。さらにラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサのような転写エンハンサを哺乳類宿主細胞内の発現を増加させるために用いることができる。また、ＬＲＧＲＰ配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要である。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接の配列が含まれる。ＬＲＧＲＰ及びその開始コドン及び上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合には、追加の翻訳制御シグナルは不要である。しかしながらコード化配列、或いはその一部のみが挿入される場合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルが与えられなければならない。さらに、開始コドンは正しい読み枠内にある必要があり、全インサートの転写を確実に行わなければならない。外来転写エレメント及び開始コドンは、自然及び合成両方の様々な起源に由来するものであり得る。発現の効果は、その細胞系に適切なエンハンサを含めることにより強化される(Scharf等(1994)Results Probl Cell Differ 20:125-62、Bitter等（ 1987）Methods Enzymol 153:516-544)。さらに宿主細胞株は、挿入された配列を望ましい形に改変したり、発現したタンパク質のプロセシングを行う能力で選択され得る。このようなポリペプチドの修飾は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）並びにアシル化を含む。またタンパク質の「プレプロ」形態を切り離す、翻訳後プロセシングは、正しい挿入、折り畳み、並びにまた機能の発揮のために重要である。CHO,HeLa,MDCK,293,WI38等のような異なる宿主細胞は、そのような翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特徴的な機構を有しており、導入される外来タンパク質の修飾やプロセシングを確実に実行するべく選択される。長期間にわたって高収率の変異体タンパタ質の生産を確保するためには、安定した発現が望ましい。例えばＬＲＧＲＰを安定的に発現する株細胞は、ウイルス由来の複製物、或いは内在性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて形質転換される。ベクターの導入に続いて、細胞は、選択培地に切り替えられる前に、濃縮培地内で１〜２日間成長させられる。選択マーカーは選択物への耐性を与え、導入された配列をＤＮＡ内に安定的に結合する細胞を同定できるようにする。安定的に形質転換された細胞の耐性凝集塊はその細胞型に適切な組織培養技術を用いて増殖することができる。形質転換された株細胞を回収するために任意の数の選択系を用いることができる。限定はしないが、選択系は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler 等（1977）Cell 11:223-32）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy等（1980）Cell 22:817-23）遺伝子を含み、それぞれtk-及びaprt-細胞において用いられる。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の基礎として用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え（Wigler等(1980)Natl Acad Sci 77:3567）、nptはアミノグリコシッド剤、ネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え（Colberre-Garapin等（1981）J Mol Biol 150:1）、als或いはpatはクロルスルフロン(chlorsulfuron)、フォスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinotricin acetyltransferase ）に対する耐性を与える（上記Murry）。さらに選択可能な遺伝子として、例えば細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるようにするhisDが記載されている（Hartman及びM ulligan（1988）Proc Nalt Acad Sci 85:8047）。最近になって、形質転換体を同定するためばかりではなく、特定ベクター系による一過性の或いは安定なタンパク質発現の量を定量するために広く用いられるβ−グルクロニダーゼ、アントシアニン及びルシフェリンのような標識による可視標識が非常によく用いられるようになった（Rhodes CA等（1995）Methods Mol Biol 55:121-131）。本発明のポリヌクレオチド配列を含む形質転換体の同定マーカー遺伝子発現の存在／不存在は、対象の遺伝子も存在することを示唆するが、その存在及び発現は確認されるべきである。例えばＬＲＧＲＰがマーカー遺伝子配列内に挿入されるなら、ＬＲＧＲＰを含む組換え細胞がマーカー遺伝子の機能の存在により同定できる。別法ではマーカー遺伝子は、単一プロモータの制御下でＬＲＧＲＰ配列と直列に配置することができる。誘導または選択に応じてのマーカー遺伝子の発現は、通常さらにＬＲＧＲＰの発現をも示す。この他、ＬＲＧＲＰのコーディング配列を含み、さらにＬＲＧＲＰを発現する宿主細胞が、当業者には周知の様々な手順により同定できる。これらの手順は、限定はしないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション及び、核酸及びタンパク質の検出並びにまた定量するための膜、溶液或いは破片ベースの技術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイを含む。ＬＲＧＲＰポリヌクレオチド配列の存在は、ＬＲＧＲＰのプローブ、一部、或いはフラグメントを用いるＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション或いは、増幅により検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイでは、ＬＲＧＲＰ配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーを使用し、ＬＲＧＲＰのＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形質転換体を検出する。本明細書において「オリゴヌクレオチド」或いは「オリゴマー」とは、プローブ或いは、ＰＣＲで増幅されるセグメントであるアンプリマーとして用いることができる、少なくとも１０ヌクレオチド、多い場合には６０ヌクレオチド、好適には１５〜３０ヌクレオチド、より好適には２０〜２５ヌタレオチドの核酸配列を指す。目的のタンパク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれかを用いてＬＲＧＲＰポリペプチドの発現を検出し、測定するための種々のプロトコルが当業者には周知である。このようなプロトコルの例としては、酵素結合免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光表示式細胞分取器法（ＦＡＣＳ）を含む。ＬＲＧＲＰポリペプチド上で２つの非干渉なエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナルベースイムノアッセイ（two-site,monoclo nal-based immunoassay）は好適ではあるが、競合的結合アッセイも用いられる。これらアッセイの並びに他のアッセイは、Hampton R等(1990,Serologivcal Me thods,a Laboratory Manual,APS Press,St Paul MN)及びMaddox DE等(1983,IExp Med 158:1211)等に記載されている。さらに多くの標識及び結合技術は当業者には周知であり、種々の核酸及びアミノ酸アッセイにおいて用いることができる。ＬＲＧＲＰに関連する配列を検出するための標識されたハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプローブを生成するための手段には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、末端標識化或いは標識化ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅などがある。別法では、ＬＲＧＲＰ配列、或いはその任意の部分が、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクターにクローニングされる。そのようなベクターは当分野では周知であり、市販されており、Ｔ７，Ｔ３或いはＳＰ６並びに標識されたヌクレオチドのような適切なＲＮＡポリメラーゼの付加により、in vitroでのＲＮＡプローブ合成のために用いることができる。 Pharmacia Biotech社(Piscataway NJ)、Promega社(Madison WI)並びにUS Bioc hemical社（Cleveland OH）のようないくつかの企業がこれらの手順に対する商用のキット及びプロトコルを提供している。適切なリポーター分子、すなわち標識には、放射性核種、酵素、蛍光性剤、化学ルミネセンス剤或いは色素生成剤や、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子或いはそれに類似のものが含まれる。そのような標識の使用について記載している特許には、米国特許第3,817,837 号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,275, 149号並びに第4,336,241号がある。また、組換え免疫グロブリンの製造については米国特許第4,816,567号に記載の方法を用いることができ、本明細書とともに参照されたい。ＬＲＧＲＰの精製ＬＲＧＲＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地からコード化タンパク質を発現及び回収するために適切な条件下で培養される。組換え細胞により生成されるタンパク質は、用いられる配列並びにまたベクターに応じて、細胞内に分泌、つまり含有されるようにすることができる。当業者には理解されるように、ＬＲＧＲＰをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞か、真核細胞の細胞膜を通してのＬＲＧＲＰの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計される。他の組換え体作製物では、ＬＲＧＲＰを、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合することができる（Kroll DJ等（1993）DNACell Biol 1 2:441-53、融合タンパク質を含むベクターに関する上記論議も参照されたい）。またＬＲＧＲＰは、タンパク質精製を容易にするために加えられた１または２以上の付加的なポリペプチドドメインを備えた組換えタンパク質として発現される。そのような精製を容易にするドメインには、限定はしないが、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド（Porath J（1992）Protain Expr Purif 3:263-281）、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、並びにＦＬＡＧＳ延長／アフィニティ精製システムにおいて用いられるドメイン（Immunex社、Seattle WA）が含まれる。精製ドメイン及びＬＲＧＲＰ間に第ＸＡ因子或いはエンテロキナーゼ（Invitrogen,San Diego CA）のような切断可能なリンカー配列を含めるのは精製を促進するのに役立つ。このような発現ベクターの１つは、ＬＲＧＲＰを含む融合タンパク質の発現を提供し、かつ６個のヒシチジン残基、それに続くチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位をコードする核酸を含む。ヒシチジン残基によりＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、Porathら（1992）Protein Expression and Purification 3:263-281に記載）上での精製を促進すると共にエンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質からの目的タンパク質の精製のための手段となる。組換え体の産生に加えて、ＬＲＧＲＰのフラグメントは、固層技術を用いた直接のペプチド合成で形成することもできる。（Stewartら(1969)Solid-Phase Pet ide Synthesis,WH Freeman Co,San Francisco;Merrifield J(1963)J Am Chem So c 85:2149-2154を参照されたい）。in vitroタンパク質合成は手作業で行えるが、自動化することもできる。自動的な合成は、例えば、Applied Biosystem 431A ペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer,Foster City CA）を製造者の指示に従って用いて行うことができる。ＬＲＧＲＰの種々のフラグメントを個別に化学的に合成し、化学的方法を用いて結合して完全長分子を作り出すことができる。ＬＲＧＲＰの使用レクチンレセプター（GI 1139595;Tartaglia等，前出）の非コーディング配列のポリヌクレオチドとＬＲＧＲＰのコーディング領域の一部分との間には、共通のエキソンが存在する。更に、ＬＲＧＲＰと線虫及びサッカロミセスセレビシエのＯＲＦの間には化学的及び構造的相同性が存在し、前記２つの遺伝子は膜に局在化していると考えられる。従って、ＬＲＧＲＰ又はＬＲＧＲＰ誘導体を、癌や、代謝、生殖、結合組織、及び発達障害の診断及び治療のために用いることが可能である。更に、ラットにおけるレプチンの発現の誘導の結果、筋肉において脂肪成分の著しい低下が見られたことから、ＬＲＧＲＰ、ＬＲＧＲＰ誘導体、又はＬＲＧＲＰを発現するベクターを用いて、脂肪分の少ない食用の肉を作り出すことが可能である。ＬＲＧＲＰは、膜タンパク質であり可溶性ではないと思われる。従って、これを必要とする患者に投与できるようにするために、周知の技術によってＬＲＧＲＰに対する可溶性のアゴニストを作り出す必要がある。従って、ある実施例では、ＬＲＧＲＰのアゴニストを患者に投与して、代謝障害を治療する。このような疾患には、限定を意図するものではないが、肥満症、糖尿病、高コレステロール血漿、及び高脂血症が含まれる。別の実施例では、ＬＲＧＲＰのアゴニストを患者に投与して、男性又は女性の生殖障害の治療を行う。このような疾病には、限定を意図しないが、不妊症、性腺機能低下症、及び無月経症が含まれ得る。別の実施例では、ＬＲＧＲＰのアゴニストを患者に投与して、発達障害を治療することができる。このような疾病には、限定を意図しないが、２分脊椎、放射線による造血性症候群、免疫不全疾患、小人症、神経管奇形、多発性関節拘縮症、及び筋骨格欠損が含まれる。ＬＲＧＲＰは、いくつかの癌細胞系、及び腫瘍組織において発現される。従って、ＬＲＧＲＰのアゴニストは、直接又は間接的に腫瘍細胞の増殖に干渉し得る。従って、ある実施例では、ＬＲＧＲＰのアゴニストを患者に投与して癌の治療を行い得る。このような癌には、限定を意図しないが、腺癌、肉腫、白血病、リンパ腫、及び脳や乳房や膀胱の癌が含まれ得る。ＬＲＧＲＰは、関節炎の患者の滑膜組織において発現される。従って、別の実施例では、ＬＲＧＲＰのアンタゴニストを患者に投与して、結合組織の疾患を治療することができる。このような疾患には、限定を意図しないが、慢性関節リウマチやシェーグレン症候群が含まれる。ある実施例では、ＬＲＧＲＰ、又はその断片又は誘導体を発現し得るベクターを、患者に投与して、上述の代謝、生殖、又は発達障害の何れかの治療を行うこともできる。別の実施例では、ＬＲＧＲＰに対して特異的な抗体をＬＲＧＲＰのアンタゴニストとして直接に使用することができる。レプチンレセプター遺伝子関連タンパク質の活性が望ましくないようなこれらの状態では、細胞にＬＲＧＲＰをコードするポリヌクレオチドのアンチセンス配列をトランスフェクトしたり、ＬＲＧＲＰのインヒビターを与えたりすることができる。ＬＲＧＲＰの抗体ＬＲＧＲＰ特異的抗体は、ＬＲＧＲＰの発現、及び代謝、生殖、及び発達障害が関係する疾患及び状態の診断や治療のために役立つ。特に、ＬＲＧＲＰ特異的抗体をＬＲＧＲＰを発現する細胞又は組織へ薬剤を到達させるためのターゲティング又はデリバリー用の手段として用いることができる。このような抗体には、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂフラグメント並びにＦａｂ発現ライブラリにより生成されるフラグメントが含まれる。中和抗体、すなわちＬＲＧＲＰポリペプチドの生物活性を抑制する抗体は、特に診断及び治療に好適である。抗体誘発のためのＬＲＧＲＰは生物学的活性を有している必要はないが、そのタンパク質断片、つまりオリゴペプチドは抗原性でなければならない。特異的抗体を誘発するために用いられるペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。これらの配列は、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一のものであり、小さい自然発生の分子の全アミノ酸配列を含み得る。ＬＲＧＲＰアミノ酸の短いストレッチを、キーホールリンペットヘモシアニン及びキメラ分子に対して産生された抗体のような他のタンパク質の配列に融合することができる。ＬＲＧＲＰに対する抗体の生成のために、当分野においてよく知られる手順が用いられる。抗体を産生するために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む種々の宿主は、免疫学的特性を保持するＬＲＧＲＰ或いはその任意の部分、フラグメント或いはオリゴペプチドを注入することにより免疫することができる。宿主の種に応じて、種々のアジュバントが免疫学的反応を促進するために用いられる。そのようなアジュバントには、限定はしないが、フロイントのアジュバント、水酸化アルミニウムのような無機質ゲルアジュバント、リゾレシチンのような表面活性物質アジュバント、プルロニックポリオルアジュバント、ポリアニオンアジュバント、ペプチドアジュバント、油性乳剤アジュバント、キーホールリンペットヘモシニアンアジュバント並びにジニトロフェノールアジュバントが含まれる。ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウムパルヴム（Corynebacterium parvum）は有用なヒト・アジュバントである。ＬＲＧＲＰに対するモノクローナル抗体は、培地中の連続株細胞による抗体分子の産生を行うための任意の技術を用いて調製される。これらは、限定はしないが、Koehler及びMilstein(1975,Nature 256:495-497)に当初掲載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor等（1983）Immunol Today 4:72、Cote等（1983）Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Cote等（1985）Monoclnal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R Liss Inc,pp77-96）を含む。さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための「キメラ抗体」の生成、即ちヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングのために開発された技術が用いられる（Morrison等（1984）Proc Natl Acad Sci 81: 6851-6855）、Neuberger等（1984）Nature 312:604-608、Takeda等（1985）Natu re 314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のための周知技術（米国特許第 4,946,778号）を、ＬＲＧＲＰ特異的一本鎖抗体を生成するために適用する。また抗体は、リンパ球集団におけるin vivo産生を誘導することにより、或いはOrlandi等（1989,Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837）並びにWinter G及びMil stein C（1991,Nature 349:293-299）に開示されているような組換え免疫グロブリンライブラリー、または高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによっても生成することができる。ＬＲＧＲＰに対する特異結合部位を含む抗体フラグメントも生成することができる。例えばこのようなフラグメントには、限定はしないが、抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）₂フラグメント及びＦ（ａｂ’ ）₂フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるＦａｂフラグメントが含まれる。別法では、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速に、しかも容易に同定できるように、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築する（Huse WD等（1989）S cience 256:1275-1281）。確立された特異性を有するポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射定量測定法のための種々のプロトコルが当分野ではよく知られている。そのようなイムノアッセイでは、一般に、ＬＲＧＲＰとその特異的抗体（或いは類似のＬＲＧＲＰ結合分子）との間の複合体の形成、並びに複合体形成の測定が行われる。特異的ＬＲＧＲＰタンパク質上の２つの非干渉性エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナル用イムノアッセイが好適ではあるが、競合結合アッセイも用いられる。これらの検査法はMaddox DE等（1983,J Exp Med 158:1211）に記載されている。ＬＲＧＲＰ特異的抗体を用いる診断検査法特定のＬＲＧＲＰ抗体は、ＬＲＧＲＰの発現の誘発によって特性化される病気或いは疾病の診断や、ＬＲＧＲＰで治療されている患者のモニタリングのためのアッセイにおいて役立つ。ＬＲＧＲＰについての診断アッセイは、ヒトの体液、細胞或いは組織の抽出物において、ＬＲＧＲＰを検出するための抗体或いは標識を利用する方法を含む。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾の有無に拘わらず用いることができる。多くの場合、ポリペプチド及び抗体は、共有結合、或いは非共有結合かのいずれかでそれらをリポーター分子と結合することにより標識される。種々のリポーター分子が周知となっており、その幾つかについては上記した。それぞれのタンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体を用いて、ＬＲＧＲＰポリペプチドを測定するための種々のプロトコルが当分野では周知である。その例として、酵素結合免疫測定法（ELISA ）、ラジオイムノアッセイ（RIA）並びに蛍光表示式細胞分取器法（FACS）がある。ＬＲＧＲＰポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナル用イムノアッセイは好適ではあるが、競合的結合アッセイも用いられる。これらのアッセイは、他にもあるが、Maddox DE等（1983,I Exp Med 158:1211）に記載されている。疾病の診断の基礎を提供するために、ＬＲＧＲＰ発現についての通常の値、すなわち標準値が確立されなければならない。これは複合体形成のために適切な条件下で、ヒト或いは動物どちらでもよいが、正常の被験者から得られる体液或いは細胞抽出物と、ＬＲＧＲＰに対する抗体とを結合することにより得ることができるが、これは当分野ではよく知られた技術である。標準的な複合体形成量は、一連のポジティブコントロールの希釈系とそれを比較することにより定量され、抗体の既知の量が既知の濃度の精製ＬＲＧＲＰと結合される。その後正常サンプルから得られた標準値を、ＬＲＧＲＰが関係する疾患を潜在的に患う被験者からのサンプルから得られた値と比較する。標準値と対象値との偏差によって疾病の存在を確認できる。薬物スクリーニングＬＲＧＲＰ、その触媒作用性又は免疫原性断片若しくはオリゴペプチドを、種々の薬物スクリーニング技術の何れかにおいて、治療用化合物を選別するために用いることができる。このような試験において用いられる断片は、溶液内に遊離しているもの、固形の支持体に付着しているもの、細胞表面に結合しているもの、又は細胞内に存在するものであり得る。そしてＬＲＧＲＰと試験される薬剤との間の結合複合体の形成量を測定することができる。薬物スクリーニングのための別の方法は、ＬＲＧＲＰポリペプチドへの安定的な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを可能にするものであり、１９８４年９月１３日公告の欧州特許出願第84/03564号（Guysen）に詳細に記載されている。この文献を本明細書に一体に参照されたい。概要としては、多数の別々の小ペプチド試験用化合物をプラスチックピン或いはいくつかの他の表面のような、固体基質上で合成する。ポリペプチド試験化合物をＬＲＧＲＰフラグメントと反応させ、洗浄する。次いで結合ＬＲＧＲＰを当分野で周知の方法により検出する。また精製ＬＲＧＲＰを前述の薬物スクリーニング技術において使用するために、プレート上に直接コーティングすることもできる。別法では、ペプチドを捕捉し、固形支持体上にペプチドを固定するために非中和抗体を用いる。また本発明は、ＬＲＧＲＰに結合し得る中和抗体特性が、ＬＲＧＲＰとの結合について特に試験化合物と競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの使用も意図している。このようにして、抗体を用いて１または２以上の抗原性決定基をＬＲＧＲＰと共通に有する任意のペプチドの存在を検出することができる。ＬＲＧＲＰコーディングポリヌクレオチドの使用ＬＲＧＲＰ又はその任意の部分をコードするポリヌクレオチドを、診断や治療の目的で用いることができる。好適実施例では、診断目的で用いられるポリヌクレオチドは、配列番号：２のＣ₁₆₃乃至Ａ₈₇₄のヌクレオチドである。診断目的の場合、本発明のＬＲＧＲＰは、ＬＲＧＲＰの発現が関与する生検組織における遺伝子発現を検出し、かつ定量するために用いられる。診断試験は、ＬＲＧＲＰが存在、不存在、及び過剰発現の何れの状態にあるかを区別したり、治療的介入の際にＬＲＧＲＰ濃度の調節をモニタリングするのに役立つ。本発明の範囲には、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。本発明の別の側面は、ＬＲＧＲＰまたは近縁な分子をコードするゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出できるハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを提供することである。そして、そのプローブの特異性、すなわち非常に高度な保存領域（例えば５’調節領域における１０個の独特のヌクレオチド）か、低度に保存的な領域（例えば特に３’領域におけるシステイン残基の間の領域）の何れに由来するのかということや、ハイブリダイゼーション或いは増幅の（高度の、中程度の或いは低度の）厳格性によって、そのプローブが自然発生ＬＲＧＲＰのみを同定するものであるか、或いはアレル配列や近縁な配列も同定するものであるかが決まってくる。プローブは近縁なインヒビターをコードする配列を検出するためにも用いることができ、好ましくは、これらのＬＲＧＲＰの任意のものをコードする配列から得られるヌクレオチドを少なくとも５０％含むべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号：２のヌクレオチド配列か、プロモータ、エンハンサエレメント及びＬＲＧＲＰをコードする自然発生配列のイントロンを含むゲノムの配列に由来するものであり得る。ハイブリダイゼーションプローブは種々のリポータ分子により標識することができ、この標識には、³²Ｐや³⁵Ｓのような放射性核種、アビジン／ビオチン結合系によりプローブに結合するアルカリホスファターゼのような酵素標識等が含まれる。ＬＲＧＲＰをコードするＤＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブの生成のための他の手段は、ｍＲＮＡプローブ産生用のベクターにＬＲＧＲＰやＬＲＧＲＰ誘導体をコードする核酸配列をクローン化することである。このようなベクターは周知であって市販されており、Ｔ７やＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのような適切なＲＮＡポリメラーゼや適切な放射性標識ヌクレオチドを付加することにより、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。ＬＲＧＲＰをコードするポリヌクレオチド配列を、ＬＲＧＲＰの発現が関与する病気や疾病の診断のために用いることができる。例えば、ＬＲＧＲＰをコードするポリヌクレオチド配列を、ＬＲＧＲＰ発現を検出するための生検組織や体液の、ハイブリダイゼーションアッセイ或いはＰＣＲアッセイにおいて用いることができる。そのような定性的及び定量的方法の形態には、サザンブロット法或いはノーザンブロット法、ドットブロット法或いは他の膜用技術、ＰＣＲ技術、ディップスティック試験法（試験紙法）、ピン或いはチップ技術及びELISA技術が含まれる。これらの技術は全て、当分野ではよく知られており、実際に市販されている多くの診断キットの基礎となっている。ここに開示したＬＲＧＲＰヌクレオチド配列は、筋肉るいそうに関係する活性化や誘導を検出するアッセイのための基礎を提供する。ＬＲＧＲＰヌクレオチド配列は、既知の方法により標識され得、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した条件の下で、患者の体液や組織のサンプルに加えられる。インキュベーション時間の経過後、このサンプルを、ヌクレオチドが酵素で標識されている場合には所望に応じて色素（または他の展開剤を要する標識）を含む適合性の液体で洗浄する。この適合性の液体をリンスした後、色素を定量して標準値と比較する。生検サンプルや抽出サンプルにおける色素の量が、比較用対照サンプルの色素量を著しく上回っている場合には、このヌクレオチド配列はサンプルのヌクレオチド配列とハイブリッド形成しており、サンプル内に著しく高い濃度のＬＲＧＲＰヌクレオチド配列が存在していることは、関連する炎症及び／または疾患が存在していることを示している。このようなアッセイは、特定の治療行為の有効性を評価するため、動物実験、臨床試験、或いは個々の患者の治療をモニタリングする際に用いることができる。疾患を診断するための基礎を与えるために、ＬＲＧＲＰ発現に対する正常な或いは標準的なプロフィールが確立されなければならない。この標準プロフィールは、正常な被験者、すなわち動物或いはヒトから得られる体液或いは細胞抽出物を、ハイブリダイゼーション或いは増幅に適切な条件下で、ＬＲＧＲＰ或いはその一部と結合することにより確立される。標準的なハイブリッド形成は、正常被験者に対して得られる値と、既知の実質的に精製されたＬＲＧＲＰの量が用いられる同一の実験におけるポジティブコントロール希釈系列で得られる値とを比較することにより定量することができる。正常なサンプルから得られた標準値は、ＬＲＧＲＰ発現に関連する障害或いは疾患を潜在的に患っている被験者からのサンプルから得られる値と比較される。標準値と被験者値との偏差から疾病の存在が確認される。ひとたび疾患が確認されると、現存する治療用薬剤が投与され、治療プロファイルが作成される。このようなアッセイは、その数値が正常すなわち標準パターンに向かって回復しているか否かを評価するために規則的に繰り返される。継続的な治療プロファイルを用いて数日間或いは数ヶ月の期間にわたる治療効果を示すことができる。米国特許第4,683,195号、第4,800,195号並びに第4,965,188号に記載のようなＰＣＲ法により、ＬＲＧＲＰ配列に基づくオリゴヌクレオチドの追加の使用法が提供される。このようなオリゴマーは一般には化学的に合成されるが、酵素を用いて発生させたり、或いは組換えソースから生成することもできる。一般にオリゴマーは、通常特定の遺伝子或いは状態を同定するために最適な条件下で用いられる２つのヌクレオチド配列、即ちセンス方向（５’→３’）のヌクレオチド及びアンチセンス方向（３ ’←５’）のヌクレオチドからなる。同一の２つのオリゴマー、入れ子オリゴマーの組、或いはオリゴマーの縮重プールでさえ、近縁なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出や定量のためのより低い厳格性の条件下であっても用いることができる。さらに特定の分子の発現を定量するための方法には、放射性標識（radiolabel ing）(Melby PC等1993 J Immunol Methods 159:235-44)或いはビオチン標識（Du plaa C等1993 Anal Biochem 229-36）ヌクレオチドの利用、制御核酸の同時増幅（coamplification）の利用、並びに実験結果を補完して書かれた標準的なグラフ曲線の利用が含まれる。多数のサンプルの定量は、ＥＬＩＳＡ形式のアッセイを実行することにより迅速に行うことができ、対象のオリゴマーが様々な希釈溶液中に現れ、分光光度分析或いは比色分析反応により迅速に定量することができる。例えば、生検組織の抽出物においてＬＲＧＲＰが比較的高いレベルで存在することは、筋肉るいそうの発症を示している。このタイプの確定診断により、健康の専門家が患者の積極的治療を開始したり、病状の悪化を防ぐことが可能となる。同様に、当業者に周知のアッセイを用いて、患者の治療の際に、その病状の進行をモニタリングすることができる。また、まだ開発されていない分子生物学的技術でも、その新技術が既知のヌクレオチド配列の性質、例えばトリプレット遺伝暗号、特異的塩基対形成等に基づくものであれば、ここに開示したヌクレオチド配列をそれに利用することができる。治療的利用膜に局在化していると考えられているレプチンレセプター遺伝子関連タンパク質をコードする遺伝子に対するＬＲＧＲＰの相同性、レプチンレセプターの非コーディング領域とのエキソンの共有、及びその発現プロファイルに基づき、ＬＲＧＲＰをコードするポリヌクレオチド配列又はアンチセンスポリヌクレオチドは、リンパ腫、白血病、肺癌、子宮頚癌、及び膀胱癌を含む癌や、エネルギー代謝、発達、結合組織、又は生殖に関する障害に関する疾病状態の診断や治療のための基礎を提供する。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルスに由来する発現ベクター、或いは細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられる。当業者によく知られた方法は、アンチＬＲＧＲＰを発現する組換えベクターを構築するために用いることができる。例えばManiatis等（上記）及びAusubel等（上記）に記載された技術を参照されたい。完全長ｃＤＮＡ配列、並びにまたその調節エレメントを含むポリヌクレオチドにより、研究者は遺伝子機能のセンス調節（Youssoufian H及びHF Lodish 1993 Mol Cell Biol 13:98-104）、或いはアンチセンス調節（Eguchi等（1991）Annu Rev Biochem 60:631-652）の調査用のツールとしてＬＲＧＲＰを用いることができる。このような技術は、現在当分野ではよく知られており、センス或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きなフラグメントを、コーディング領域或いは制御領域に沿った様々な位置から設計することができる。所望のＬＲＧＲＰコーディング断片を高度に発現する発現ベクターを細胞または組織にトランスフェクトすることにより、ＬＲＧＲＰをコードする遺伝子の機能を停止させることができる。このような作製物は、翻訳不可能なセンス或いはアンチセンス配列とともに細胞から溢れ出し得る。ＤＮＡへの組み込みがない場合ですら、このようなベクターは、全ての複製物が内在性ヌクレアーゼにより分解されるまで、ＲＮＡ分子を転写し続ける。このような一過性の発現は、非複製ベクター（Mettler I,personal communication）でも１ヶ月以上、適当な複製エレメントがベクター系の一部である場合には更に長い期間継続し得る。上述のように、ＬＲＧＲＰの制御領域、例えばプロモータ、エンハンサ或いはイントロンに対するアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを設計することにより遺伝子発現を修飾することができる。転写開始部位、例えばリーダー配列の＋１０〜−１０領域の間に由来するオリゴヌクレオチドが好適である。またアンチセンス分子は、転写産物がリボソームへの結合するのを防止することにより、ｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計される。同様に、抑制は、「三重らせん」塩基対合法を用いて達成することができる。三重らせん対合は、二重らせんが、ポリメラーゼ、転写因子、或いは調節分子を結合するべく十分に開かないようにする。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療法は、Gee JEら（Huber BE a nd BI Carr(1994)Moleular and Immunologic Approaches,Futura Publishing Co ,Mt Kisco NY）により記載されている。リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用の仕組みでは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションが行われ、その後エンドヌクレアーゼによる切断（endonucleolytic cleavage）がなされる。発明の範囲内には、ＬＲＧＲＰのエンドヌクレアーゼによる切断を、特異的に及び効果的に触媒し得る、人工合成のハンマーヘッド型リボザイム分子も含まれている。任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位の最初の同定は、配列ＧＵＡ、ＧＵＵ並びにＧＵＣが後続するリボザイム切断部位に対する標的分子を走査することにより行われる。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列は、そのオリゴヌクレオチドの機能を停止させる２次構造の特徴について評価される。また候補の標的の適切性の評価は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に対する接触性を試験することにより行われる。本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、ＲＮＡ分子を合成するのための当分野で周知の方法により調製することができる。これらの技術には、固相ホスホラミダイト（phosphoramidite）化学合成のような化学合成オリゴヌクレオチドの技術が含まれる。別法では、ＲＮＡ分子を、ＬＲＧＲＰをコードするＤＮＡ配列のin vivo及びin vitro転写により生成することができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを有する多種のベクターに組み込まれる。別法では、構造的に或いは誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構成物が、株細胞、細胞或いは組織内に導入される。ＲＮＡ分子は細胞内安定性を高め及び半減期を長くするために修飾することができる。実行可能な修飾には、限定はしないが、その分子の５’並びにまた３’ 末端のフランキング配列の付加、或いは分子のバックボーン内にホスホジエステラーゼ連鎖ではなくホスホロチオネート（phosphorothioate）或いは２’Ｏ−メチルを使用することを含む。このコンセプトは、ＰＮＡの産生において固有のものであり、内在性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデニン、グアニン、シチジン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び類似の修飾形態とともに、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（Wybutosine）のような従来あまり用いられなかった塩基を含めることによって、これら全ての分子に拡張することができる。細胞或いは組織内にベクターを導入するための方法には、以下に議論される方法が含まれ、これらの方法は、in vivo、in vitro、及びex vivo治療法に対しても適切なものである。ex vivo治療法の場合には、患者から採取された幹細胞にベクターを導入し、自家移植のためにクローンとして増殖して同じ患者に戻す方法が、ここで引用されている米国特許第5,399,493号及び第5,437,994号に記載されている。トランスフェクションによる送達、リポソームによる送達は、当分野でよく知られているものである。更に、ここに開示するＬＲＧＲＰのヌクレオチド配列は、新技術、即ち、限定はしないが、それがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対合相互作用のような特性を含む、現在周知のヌクレオチド配列の特性に依存する技術であれば、まだ開発されていない分子生物学的技術においても用いることができる。医薬品組成物本発明は、ヌクレオチド、タンパク質、抗体、アンタゴニスト、またはインヒビターを、単独で、或いは安定化化合物のような少なくとも１つの他の薬剤とともに含んでいる医薬品組成物を、その範囲に含む。この医薬品組成物は、任意の無菌の生体適合性製薬用担体に含めて投与されるが、このような担体には、限定はしないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水が含まれる。これらの分子は、患者に対して、単体で、或いは他の薬品やホルモンと結合して、賦形剤或いは製薬学的に許容される担体と混合される他の薬品組成物に入れて投与され得る。本発明の一実施例では、製薬学的に許容される担体とは、製薬学的に不活性なものである。医薬品組成物の投与医薬品組成物は経口投与、或いは非経口投与される。非経口投与の方法には、局所的投与、動脈内（腫瘍への直接の）投与、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与、くも膜下内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与或いは鼻腔内投与が含まれる。活性成分に加えて、これらの薬品組成物は、薬学的に用いられ得る調合物内への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び補助剤を含む適切な製薬学的に許容される担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、 “Remington's Pharmaceutical Sciences”(Mack Publishing Co,Easton PA）の最新版において見出すことができる。経口投与用の医薬品組成物は、当分野でよく知られる製薬学的に許容される担体を用いて適切な剤形に製剤される。このような担体により、薬品組成物は、治療を受ける患者による経口及び鼻腔摂取のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、液体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤或いは類似の剤形として処方される。経口投与するための医薬品調製物は、活性化合物と固形の賦形剤とを結合することによって得ることができるが、所望に応じて、必要なら適切な補助剤を添加した後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、錠剤或いは糖衣剤核を得ることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、サクロース、マンニトール或いはソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク質充填剤、とうもろこし、小麦、米、じゃがいも等からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントのようなゴム、並びにゼラチン或いはコラーゲンのようなタンパク質である。必要ならば、架橋結合したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸或いはアルギン酸ナトリウムのようなその塩のような、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられる。糖衣剤核は、濃縮砂糖溶液のような適切な錠皮を与えられるが、溶液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混合物が含み得る。錠剤の識別のため、すなわち活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために染料或いは色素が錠剤或いは糖衣錠皮に加えられてもよい。経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル及びゼラチンからなる柔らかい、密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビトールのような錠皮を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはでんぷんのような充填剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、並びに付加的には安定剤と混合された活性処方組成物を含み得る。柔らかいカプセルでは、活性化合物は、安定剤があるなしにかかわらず、脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或いは懸濁される。非経口投与用の剤形は、水溶性の活性化合物の水溶液を含む。注射用として、本発明の薬品組成物を水溶液、好適にはハンクの溶液、リンガー溶液或いは生理緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液に入れて製剤することができる。水性の注入懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を増加する物質が含み得る。更に、活性成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁剤として調製される。適切な親油性の溶媒或いは媒介物は、胡麻油のような脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。また懸濁剤は、所望に応じて、それにより溶解度を増加し、非常に濃縮された溶液の調製ができるようになる適切な安定剤或いは薬剤を含んでもよい。局所的投与または経鼻投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸透剤を用いて調合が行われる。このような浸透剤は、一般的に周知である。製造と保管本発明の薬品組成物は周知の方法、例えば従来の混合処理、溶解処理、顆粒化処理、糖衣形成処理、研和処理、乳化処理、封入処理(entrapping)処理或いは凍結乾燥処理により製造される。この医薬品組成物は塩類として提供されることもあり、限定はしないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む、多くの酸とともに形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性或いはプロトニック溶剤において、より可溶性が高くなる傾向がある。他の場合には、好適な製剤は、１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のショ糖、使用前に緩衝剤と結合させたｐＨ範囲４．５〜５．５にある２％〜７％のマンニトールにおける凍結乾燥粉末である。製薬学的に許容される担体内に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調製された後、適切な容器内に入れられて、さらに提示した疾病状態の治療のためにラベル付けされる。ＬＲＧＲＰの投与のため、このようなラベルには、投与の量、頻度、方法が表示される。治療上効果的な投与量本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、活性成分を所望の目的を達成するに効果的な量だけ含む組成物である。効果的な投与量の決定は、当業者の能力の範囲内で行うことができる。任意の化合物の場合、治療的に有効な投与量は、初めに、新生物細胞、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のアッセイから推定される。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおいて効果的な投与量や投与経路を決定することができる。治療的に有効な投与量とは、疾病状態を寛解するタンパク質、その抗体、アンタゴニスト、またはインヒビターの量である。そのような化合物の毒性及び治療有効性は、例えばＬＤ５０（個体群の５０％の致死投与量）及びＥＤ５０（個体群の５０％において治療的に有効な投与量、５０％有効量）を決定するための、細胞培地或いは実験動物における標準的な製薬学的手順により決定することができる。毒性と治療有効性との間の投与量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい。これらの細胞培地のアッセイ及び付加的な動物研究から得られるデータは、ヒトへの使用に対する投与量の範囲を決める際に用いることができる。そのような化合物の投与量は、毒性がほとんど或いは全くなく、ＥＤ５０を達成する循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並びに投与経路に応じてこの範囲内で変化する。正確な投与量は治療されるべき患者を考慮して個々の医師により選択される。投与量及び投薬量は、十分なレベルの活性部分を与え、かつ所定の効果を維持するために調整される。考慮すべき付加的な要因は、疾患状態の重症度、または患者の年齢、体重並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、並びに治療への耐性／反応を含む。長期的に作用する薬品組成物は３〜４日毎に、１週間毎に、或いは半減期及び特定の処方のクリアランス速度に応じて２週間に１度投与してもよい。通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲にあって、全投与量は最大約１ｇであり、投与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは供給の方法に関するガイダンスは、文献において見出すことができる。米国特許第4,657,760号、第5,206,344号或いは第5,225,212号を参照されたい。当業者は、ヌクレオチドに対しては、タンパク質やインヒビター用の剤形とは異なる剤形を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状態、位置等によって決まってくる。以下に本発明の実施例を示す。但し、以下の実施例は単なる例示であって、本発明をこの実施例に限定しようとするものではない。産業上の応用１ｃＤＮＡライブラリーの作製 hNT2細胞系は、まだ発達の初期段階にある関係する（committed）ニューロン前駆体細胞の特性を示す。未処理のhNT2細胞系に対するｃＤＮＡライブラリー（ HNT2NOT01,Cat.No.937230）はStratagene社（Stratagene,La Jolla CA）から市販されている。このライブラリーは、基本的に以下に説明するように作製された。Stratagene はｍＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡライブラリーを調製した。ｃＤＮＡはオリゴｄ（Ｔ）を用いてプライミングされ、サイズ分画化されて、５００ｂｐ以上の大きさの断片が単離された。合成アダプターオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡ分子にリゲートし、このｃＤＮＡ分子がUni-ZAP（商標）ベクターシステム（Stratagene）に挿入できるようにした。これによって、高い効率の一方向性（センス方向）のラムダライブラリーの作製が可能となり、ｃＤＮＡインサートを有するクローンを検出するための青／白色選択を有するプラスミド系の利便性を利用することが可能となる。ｃＤＮＡライブラリーの質について、ＤＮＡプローブを用いてスクリーニングを行い、次にpBluescriptファージミド（Stratagene）を切除した。このファージミドにより、インサートの特性化、配列決定、部位特異的突然変異誘発、一方向性欠失の作製、及び融合ポリペプチドの発現を容易に行うためのプラスミド系を利用できるようになる。次に、カスタムメイドで作製されたライブラリーファージ粒子を大腸菌宿主株XL1-Blue（Stratage ne）に感染させた。この細菌株の高い形質転換効率により、このｃＤＮＡライブラリーが希な少数のクローンを含む可能性を高めることができる。この他の一方向性ベクターには、限定はしないが、pcDNA1（Invitrogen）や、pSH1ox-1（Nova gen）がある。２ｃＤＮＡクローンの単離ファージミド形態の個々のｃＤＮＡクローンは、Advanced Genetic Technolog ies Corp.,Gaithersburg MDから市販されているミニプレップキット（Catalog N o.77468）を用いて得られた。このキットは、９６穴フォーマットのもので、９６０回の精製に十分な量の試薬が付いている。各キットには推奨プロトコルが備えられているが、以下の変更点を除いてこのプロトコルを採用した。第１に、９６個のウエルはそれぞれ、２５ｍｇ／Ｌのカルベニシン及び０．４％のグリセロールを含む滅菌テリフィックブロスの１ｍｌのみで満たした。ウエルに接種した後、細菌を２４時間培養し、６０μｌの溶解バッファに溶解した。遠心分離処理（２９００ｒｐｍで５分間）を行った後に、ブロックの内容物を一次濾板に添加した。トリスバッファにイソプロパノールを添加するオプションのステップは定例的には実施しなかった。プロトコルの最終ステップの後、サンプルを保管のためにBeckman９６穴ブロックに移送した。この他、ファージミドの精製のため、ライブラリーファージとf1ヘルパーファージの双方を宿主細胞株に同時感染させるin vivo切除プロセスが用いられる。ライブラリーの挿入されたファージとヘルパーファージの双方に由来するポリペプチド又は酵素がＤＮＡにニックを入れて、標的ＤＮＡ上の決まった配列からの新たなＤＮＡ合成を開始させ、pBluescriptファージミドの全てのＤＮＡ配列及びｃＤＮＡインサートを有する小形の一本鎖の環状ファージミドＤＮＡ分子が生成される。このファージミドＤＮＡは、細胞から遊離して精製され、新たな宿主細胞（SOLR,Stratagen e）に再度感染させるのに用いられ、そこで二本鎖のファージミドＤＮＡが作り出される。このファージミドはβラクタマーゼの遺伝子を有しているため、新たに形質転換された細菌をアンピシリン含有媒地上で選択することができる。ファージミドＤＮＡの精製は、QIAGEN DNA Purification System（QIAGEN Inc ,Chatsworth CA）製のQIAWELL-8 Plasmid Purification Systemを用いて行うこともできる。この製品は、細菌細胞を溶解し、QIAGEN陰イオン交換樹脂粒子を、 3MのEMPORETMメンブランテクノロジーと共にマルチウエルフォーマットで使用して高度に精製されたファージミドＤＮＡを単離するための便利で、高速で、高信頼性かつ高スループットの方法を提供する。このＤＮＡは、精製レジンから溶出されて、ＤＮＡシークエンシングや他の解析操作のために調製された。３ｃＤＮＡクローン及びそれらの推定タンパク質の相同性検索 Applied Biosystems社で開発された検索アルゴリズムを、INHERIT（商標）670 Sequence Analysis Systemに組み込んで用いて、各ｃＤＮＡの配列をGenBankの配列と比較した。このアルゴリズムでは、Pattern Specification Language（TR W社、LosAngeles CA）を用いて相同な領域を決定した。配列の比較をどのように行うかを決定する３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセット、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの組を用いて、対象の配列に対して相同な領域を含む配列をＤＮＡデータベースから検索し、適切な配列には、初期値とともにスコアが付けられた。これによって、これらの相同な領域をドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、相同な領域と偶然の一致とを区別した。相同性検索の結果は、Smith-Watermanアライメントを用いて表示した。ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、INHERIT（商標）670配列解析システムをＤＮＡ配列の相同性検索で用いたのと同様に用いて確かめた。Pattern Spec ification Language及びパラメータウィンドウを用いて、タンパク質データベースから相同性領域を含む配列を検索し、その結果には初期値とともにスコアを付けられた。ドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、有意な相同性を有する領域と偶然の一致とを区別した。 BLASTは、Basic Local Alignment Search Tool(Altschul SF(1993)JMol Evol3 6:290-300;Altschul,SF等(1990)J Mol Blil215:403-10)の略称であり、これを用いて局部的な配列アライメントを検索した。BLASTはヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを生成して配列類似性を求める。そのアライメントの局所性のために、BLASTは厳密な一致、すなわちホモログを求める際に特に有効である。BLASTは間隙を含まない一致を求めるのに役立つ。BLASTアルゴリズム出力の基本的な単位は、High-scoring Segment Pair（HSP）である。 HSPは２つの配列フラグメントからなり、両フラグメントは任意ではあるが、そのアライメントが局所的に最大となっている等しい長さものであり、そのアライメントスコアはユーザにより設定された閾値すなわちカットオフスコアを満足、即ち、カットオフスコアを超えている。BLASTアプローチは問い合わせ配列とデータベース配列との間のHSPを見つけ出すものであり、見出された任意の一致の統計的有意性を評価し、そのユーザが設定した有意性の閾値を満足する一致のみを報告するものである。パラメータＥはデータベース配列一致を知らせるための統計的に有意な閾値を確定するパラメータである。Ｅは全データベース検索の情況においてHSP（或いはHSPの組）の発生の機会の期待される頻度の上側の境界として解釈される。その一致がＥを満足する任意のデータベース配列がプログラム出力において報告される。４ノーザン法による解析ノーザン解析は、標識されたヌクレオチド配列と特定の細胞型または組織に由来するＲＮＡが結合したメンブランとのハイブリッド形成を伴う、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術である（Sambrookら、上述）。類似の電子的ノーザン分析ではBLAST（Altschul SF 1993 and 1990，上述）を用いて、GenBankまたはLIFESEQ(商標)データベース(Incyte，Palo Alto CA)のようなデータベースにおける同一のまたは近縁な分子を検索した。この解析は、多数の膜式ハイブリダイゼーションより非常に短時間で行うことができる。更に、コンピュータ検索の感度を変更して、ある一致が正確な一致か、相同的であるかの分類を決定することができる。検索の基準値は、プロダクトスコアであり、これは以下の式で定義されるものである。（配列の一致（％）×最大BLASTスコア（％））／１００このプロダクトスコアは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致の双方を考慮している。例えば、プロダクトスコアが４０の場合は、一致は誤差が１〜２％の範囲で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相同な分子は、通常プロダクトスコアとして１５〜４０を示すものを選択することにより同定されるが、スコアの低いものは近縁関係にある分子として同定される。発現情報は逆転写ＰＣＲ法を用いても得られた。転写処理は、５０μｌの反応物におけるランダム六量体を用いて、Superscript逆転写酵素（Gibco,BRL）を含む１μｇの全細胞ＲＮＡ上で行った。プライマーＰ１〜Ｐ４は、それぞれ、5'-AAGGCCGCAGGCTCCCCATT-3'、5'-AGCAGCCGCGGCCCCAGTTC-3'、5' -TGACAAGTTAAACGCAGTTATCACAT-3'、及び5'-TCTCTGCCTTCGGTCGAGTTG-3'（第８図）である。４つのプライマーの濃度は、P1-500nM、P2-250nM、P3-500nM、及びP4 -100nMである。５０μｌのＰＣＲ反応物は、１０μｌの一本鎖ｃＤＮＡ、２００ μの各dNTP、及び０．３ＵのTaqポリメラーゼ（Promega）を含む。この反応条件は以下の通りである。即ち、９４℃で３分間、９４℃で２０秒間、６２℃で３０秒間、７２℃で３０秒間、これを３４サイクル繰り返し、７２℃で４分間処理する。この反応産物は、臭化エチジウム染色アガロース上で可視化した（第９図）。５完全長まで、又は調節エレメントを回復するまでのＬＲＧＲＰの延長完全長ＬＲＧＲＰの核酸配列（配列番号：２）は、部分的ヌクレオチド配列を完全長まで延長するため、或いはゲノムライブラリから５’配列を得るためのオリゴヌタレオチドプライマーを設計するために用いることができる。一方のプライマーはアンチセンス方向（ＸＬＲ）の延長を開始するために合成され、他方のプライマーはセンス方向（ＸＬＦ）に配列を延長するために合成される。これらのプライマーにより、周知のＬＲＧＲＰ配列を「外側に」延長し、対象の制御領域の新しい未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成できるようになった。初期プライマーは、Oligo（登録商標）4.06（National Biosciences社、Ply mouth MN）、或いは他の適切なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチドで５０％以上のＧＣ含有率を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計することができる。結果的にヘアピン構造及びプライマー−プライマー二量体化を生じる任意のヌクレオチドのストレッチの延長はが回避される。元の選択されたｃＤＮＡライブラリーか、ヒトゲノムライブラリーを用いて、配列を延長する。後者のライブラリーは、５’上流配列を得るために最も役立つ。必要なら、既知領域をさらに延長するために追加のプライマーの組が設計される。 XL-PCRキット（Perkin Elmer社）のための指示に従って、酵素と反応混合物とを完全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られる。４０pmolの各プライマーと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始する場合、ＰＣＲはPeltier Thermal Cycler（PTC200；MJ Reserch社、Watertown MA）を用いて、以下のパラメータで実行される。ステップ１９４℃で１分間（初期変性）ステップ２６５℃で１分間ステップ３６８℃で６分間ステップ４９４℃で１５秒間ステップ５６５℃で１分間ステップ６６８℃で７分間ステップ７ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復ステップ８９４℃で１５秒間ステップ９６５℃で１分間ステップ１０６８℃で７分１５秒間ステップ１１ステップ８〜１０を１２サイクル反復ステップ１２７２℃で８分間ステップ１３４℃（その温度を保持）反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）アガロースミニゲルにおける電気泳動で解析して、反応物が配列を延長することに成功したか否かを決定する。最も大きな生成物或いはバンドを選択して、ゲルから切り出した。さらなる精製には、QIAQuick（登録商標）（QIAGEN社）のような市販のゲル抽出法を用いる。ＤＮＡ回収の後、クレノウ酵素を用いて一本鎖ヌクレオチドの延び出しを切り取り、再結合及びクローニングを容易にする平滑末端を作った。エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌのリゲーション緩衝液内に再溶解し、１μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加えて、その混合物を、室温で２〜３時間、或いは１６℃で一昼夜インキュベートする。コンピテントな大腸菌細胞（４０μｌの適切な溶媒内にある）を、３μｌのリゲーション混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培地（Sembrook J等、上記）で培養する。３７℃で１時間のインキュベーションの後、全ての形質転換混合物を、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertani（ＬＢ）寒天上にのせる。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択し、適切な市販の無菌の９６穴マイクロタイタープレートの個々のウェル内に入れられた１５０μｌの液状ＬＢ／２ｘＣａｒｂ培地で培養する。さらに後日、５μｌの各オーバーナイト培養物を非無菌９６穴プレート内に移し、水で１：１０に希釈した後、各５μｌのサンプルをＰＣＲアレイ内に移す。ＰＣＲ増幅の場合、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの４単位を含む１８μｌの濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用いられる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以下の条件に従って行う。ステップ１９４℃で６０秒間ステップ２９４℃で２０秒間ステップ３５５℃で３０秒間ステップ４７２℃で９０秒間ステップ５ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復ステップ６７２℃で１８０秒間ステップ７４℃（そのまま保持）ＰＣＲ反応物のアリコットを、分予量マーカーと共にアガロースゲル上で移動させる。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクローンを選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行う。６ハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用配列番号：２の配列に基づくハイブリダイゼーションプローブは、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングするために用いられる。好適実施例では、ハイブリダイゼーションプローブは、配列番号：２のヌクレオチドＣ１６３とＡ８７４との間の配列に由来する。約２０の塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０ｍＣｉの[γ‐³²Ｐ]アデノシン三リン酸（Amersham社,Chicago IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuPont NEN（商標）、Boston MA）とを組み合わせて用いて標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、SephadexG-25超精細樹脂カラム（Pharmacia社）を用いて精製する。それぞれ毎分１０⁷カウントを含む各部分を、以下のエンドヌクレアーゼ（AseI,Bgl II,EcoRI,Pst I,Xba1或いはPv uII；DuPont NEN（商標））の１つを用いて消化されるヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ハイブリダイゼーション解析において用いる。各切断ＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画化して、ナイロン膜（Nytr an Plus,Schleicher&Schuell,Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くために、ブロットは、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまで段階的に厳格性が増す条件下で、室温にて順次洗浄される。 XOMATAR（登録商標）フィルム（Kodak,Rochester NY）を、数時間かけてPhospho imager cassette（Molecular Dynamics,Sunnyvale CA）においてブロットに露光された後、ハイブリダイゼーションパターンが視覚的に比較される。７アンチセンス分子ＬＲＧＲＰ配列或いはその任意の一部は、天然ＬＲＧＲＰのin vivoまたはin vitro発現を抑制するために用られ得るアンチセンス分子の設計のための基礎となる。約２０塩基対からなるアンチセンスオリゴマーの使用について特に記すが、大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いることができる。第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図に示すようなＬＲＧＲＰのコード化配列に基づく相補的なオリゴヌクレオチド用いて、自然発生ＬＲＧＲＰの発現を抑制することができる。この相補的なオリゴヌクレオチドを第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図に示す最も一義的な５’配列から設計し、これを用いてプロモーターが結合するのを阻害することにより転写を抑制したり、リボソームが転写物に結合するのを阻害することによりＬＲＧＲＰ転写物の翻訳を抑制することができる。配列番号：２のリーダー配列及び５’配列の適切な部分を用いることにより、効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図に示すヌクレオチドのなかの、ポリペプチドのシグナル配列または初めの方のコーディング配列に翻訳される領域全体にわたる１５〜２０個のヌクレオチドを含むようになる。８ＬＲＧＲＰの発現ＬＲＧＲＰの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクター内にサブクローニングし、そのベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって行われる。クローニング用のpBluescriptベクターを、大腸菌株であるXLI-BlueMRF（商標）（Stratagene）においてＬＲＧＲＰを発現するのに用いる。クローニング部位の上流には、β−ガラクトシダーゼに対するプロモータが存在し、その後ろにはアミノ基末端メチオニン及びβ−ガラクトシダーゼの７残基が存在する。直後に続くこれら８つの残基は、転写に役立つバクテリオファージプロモーターであり、多くの一義的な切断部位を含むリンカーである。単離されたＩＰＴＧトランスフェクト菌株を標準的な方法を用いて誘導することにより、初めのβガラクトシダーゼの７残基、約５〜１５残基のリンカー、及び完全長ＬＲＧＲＰからなる融合タンパク質を作り出す。このシグナル配列は、後の行う活性のアッセイにおいて直接用いることができる菌増殖培地へのＬＲＧＲＰの分泌を誘導する。ＬＲＧＲＰ融合タンパク質は哺乳類細胞において発現された。エプトープ標識されたヒトＬＲＧＲＰタンパク質を用いて、ＬＲＧＲＰをコードするｃＤＮＡが、タンパク質に翻訳される傾向を示した。c-mycタンパク質の抗原部分をコードするポリヌクレオチドを、全ＬＲＧＲＰタンパク質をコードするポリヌクレオチドの３'末端に融合し、pcDNA3/CMV真核生物発現ベクターに挿入した。組換え体発現ベクターを、COS-1細胞に導入し、抗c-myc抗体を用いて免疫染色して、推定ＬＲＧＲＰ融合タンパク質の発現を調べた。ＬＲＧＲＰ融合タンパク質は細菌細胞において発現された。グルタチオンS-トランスフラーゼ（GST）をコードするポリヌクレオチドを、全ＬＲＧＲＰタンパク質をコードするポリヌクレオチドの３'末端に融合し、発現ベクターに挿入した。組換え体発現ベクターを大腸菌に導入し、抗ＬＲＧＲＰ抗体を用いた免疫プロットにより、推定ＬＲＧＲＰ融合タンパク質の発現を調べた。融合タンパク質は、グルタチオンアガロースビーズに吸収させた後、遊離グルタチオンの存在の下で溶出させることによって溶解細胞から精製することができる。９ＬＲＧＲＰ活性ＬＲＧＲＰ活性はレプチンレセプター活性に対するその影響を測定することによりアッセイすることができる。レプチンレセプターは、ＪＡＫチロシンキナーゼ結合部位を特徴として有する（Lee GH等，前出;Fukunaga R等(1991)EMBO J 10 :2855-2865）。ＪＡＫチロシンキナーゼと相互作用するレセプターの活性は、適切なリガンドによる刺激の後に³²Ｐをタンパク質に組み込み、それを評価することにより測定することができる（例えばWang Y等(1995)Mol Endocrinol 9:303-3 11）。レプチンレセプター活性へのＬＲＧＲＰの影響は、レプチンレセプター発現生成物を、ＬＲＧＲＰ発現作製物を同時感染させて、或いはさせないでトランスフェクトした細胞系にレプチンを添加した後組み込まれた³²Ｐを測定することにより確かめることができる。Ｐチロシンに対する抗体を用いた免疫沈降を行った後、ゲル電気泳動を行ってブロットする。タンパク質のリン酸化は、ＬＲＧＲＰ発現作製物の同時感染を行った、或いは行わなかった分離されたタンパタ質のサイズにおける放射線を測定することにより定量する。１０ＬＲＧＲＰ特異的抗体の産生標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化及び抗体の産生には、ＰＡＧＥ電気泳動法（Sambrook前出）を用いて実質的に精製されたＬＲＧＲＰを用いる。ＬＲＧＲＰから翻訳されたアミノ酸配列をDNAStarソフトウエア（DNASTAR社）を用いて解析して免疫抗原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを当業者には周知の手段により合成して、当業者に周知の方法で抗体をを産生するために用いる。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープのような、適切なエピトープを選択するための解析法は、Ausubel FM等（上記）の論文に記載されており、第４図及び第５図に示されている。通常、約１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、Applied BiosystemsのペプチドシンセサイザーModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法ケミストリにより合成し、Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ： Ausubel FM等、上記）を用いた反応によりキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ、Sigma）に結合する。フロイントの完全アジュバントにおけるオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫する。得られた抗血清の抗ペプチド活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、１％BSAを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧに反応させる。ＬＲＧＲＰに対する抗血清が作り出された。以下の２つのペプチドを化学的に合成した。即ちＬＲＧＲＰ内の５１番目から６２番目のアミノ酸残基であるFIAK RVTYDSDAC、及びＬＲＧＲＰ１２０番目から１３１番目のアミノ酸残基を表すKFG RGDDFSWEQW。これらのペプチドのそれぞれは、ウサギに注射され、その後確立された手順を用いて抗ＬＲＧＲＰ抗血清を回収した。１１特異的抗体を用いる自然発生ＬＲＧＲＰの精製自然発生ＬＲＧＲＰ或いは組換え体ＬＲＧＲＰは、ＬＲＧＲＰに対する特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより精製することができる。イムノアフィニティーカラムは、CnBr活性化Sepharose（Pharmacia Biote ch社）のような活性化クロマトグラフレジンとＬＲＧＲＰ抗体とを共有結合させることにより構成される。結合後、そのレジンを製造者の指示に従って、ブロックし洗浄する。ＬＲＧＲＰを含む培養液をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをＬＲＧＲＰを優先的に吸着できる条件下で（例えば界面活性剤の存在下において高イオン強度緩衝剤で）洗浄する。このカラムを、抗体／ＬＲＧＲＰ結合を切るような条件下（例えばｐＨ２〜３の緩衝剤、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオン）で溶出させ、ＬＲＧＲＰを回収する。１２ＬＲＧＲＰと相互作用する分子の同定ＬＲＧＲＰ、或いはその生物学的に活性なフラグメントを、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬を用いて標識する（Bolton,AE及びHunter,WM（1973）Biochem J 13 3:529）。９６穴プレートのウェル内に前に入れておいた候補分子を、標識したＬＲＧＲＰとともに培養し、洗浄し、標識したＬＲＧＲＰ複合体を有する任意のウェルをアッセイする。異なる濃度のＬＲＧＲＰを用いて得られるデータを用いて、候補分子とＬＲＧＲＰの数、アフィニティー並びに会合度の数値を計算する。ＬＲＧＲＰに結合する分子を、ＬＲＧＲＰに特異的な抗血清を用いて免疫沈降させることにより、同定することができる。ＬＲＧＲＰの免疫沈降は、非変性条件の下で、標準的な方法を用いてポリアクリルアミドゲル上で行うことができる。ＬＲＧＲＰより高い推定分子量を有するゲル上のタンパク質は、ＬＲＧＲＰのヘテロマー及びＬＲＧＲＰと相互作用するタンパク質である。これらのＬＲＧＲＰと相互作用するタンパク質を、精製し更に特性化することができる。更に、OB -Rとの相互作用は、OB-R抗血清を含む細胞抽出物を免疫沈降させた後、ＬＲＧＲＰ血清でウェスタンブロット解析を行うことにより直接検定することができる。上記のすべての刊行物及び特許明細書は、本明細書と一体に参照されたい。本発明の記載した方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は、本発明の範囲及び精神から逸脱しないことは当業者には明らかであろう。本発明は特に好適な実施例に関連して記載されているが、本発明の請求の範囲は、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際には、本発明を実施するために記載された方法の種々の変更例は、分子生物学或いは関連する分野の当業者には明らかなように、以下の請求項の範囲内に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 43/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ０７Ｋ 14/705 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/21 1/19 Ｃ１２Ｑ 1/68 1/21 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 5/10 5/00 ＡＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ，ＵＳ

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：１のアミノ酸配列、又はその断片を含む実質的に精製されたヒト・レプチンレセプター遺伝子関連タンパク質。２．配列番号：１の２２番目のＭｅｔから１３１番目のＴｒｐまでの請求項１に記載の実質的に精製された断片。３．請求項１のポリペプチドをコードする単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。４．配列番号：２の１６３番目のＣから８７４番目のＡまでの配列を含む請求項３に記載の単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。５．配列番号：２の配列、又はその縮重変異体からなることを特徴とする請求項３に記載の単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。６．厳格な条件の下で、請求項４のポリヌクレオチド配列とハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列。７．配列番号：２の配列、又はその縮重変異体に対して完全に相補的なポリヌクレオチド配列。８．厳格なハイブリダイゼーション条件の下で、配列番号：２の配列とハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列からなることを特徴とする請求項４に記載の単離され、精製されたポリヌクレオチド配列。９．請求項５のポリヌクレオチド配列を含む組換え体発現ベクター。１０．請求項５のポリヌクレオチド配列を含む組換え体宿主細胞。１１．配列番号：１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドの精製方法であって、（ａ）ポリペプチドの発現に適切な条件の下で、請求項１０の宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特徴とするポリペプチドの精製方法。１２．請求項１のポリペプチドに対して特異的に結合する精製された抗体。１３．請求項１のポリペプチドに特異的に結合し、その活性を変調する精製されたアゴニスト。１４．請求項１のポリペプチドに特異的に結合し、その活性を変調する精製されたアンタゴニスト。１５．実質的に精製された請求項１のポリペプチドを適切な製薬用担体と共に含む医薬品組成物。１６．請求項１３のアゴニストを効果的な量だけ治療が必要な患者に投与する過程を含むことを特徴とする代謝障害の治療方法。１７．請求項１３のアゴニストを効果的な量だけ治療が必要な患者に投与する過程を含むことを特徴とする生殖障害の治療方法。１８．請求項１３のアゴニストを効果的な量だけ治療が必要な患者に投与する過程を含むことを特徴とする発達障害の治療方法。１９．請求項１４のアンタゴニストを効果的な量だけ治療が必要な患者に投与する過程を含むことを特徴とする癌の治療方法。２０．請求項１４のアンタゴニストを効果的な量だけ治療が必要な患者に投与する過程を含むことを特徴とする結合組織疾患の治療方法。２１．生物学的サンプルにおいて、ヒト・レプチンレセプター遺伝子関連タンパク質をコードするポリペプチドを検出する方法であって、（ａ）生物学的サンプルの核酸材料と請求項６のポリペプチドをハイブリッド形成させ、ハイブリダイゼーション複合体を形成させる過程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを含むことを特徴とし、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプルにおけるヒト・レプチンレセプター遺伝子関連タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在と相関を有することを特徴とするポリヌクレオチドの検出方法。