【発明の詳細な説明】
ヒト・ホスホリパーゼインヒビター技術分野
本発明は、新規なヒト・ホスホリパーゼインヒビターの核酸配列及びアミノ酸
配列、及び疾病の診断、研究、予防、及び治療のためのこれらの配列の利用に関
するものである。背景技術
ホスホリパーゼ酵素はホスホグリセリド類からの脂肪酸残基の遊離を触媒する
。詳述すると、ホスホリパーゼA2(PLA2)や、リン脂質膜のグリセロール
部分の2位におけるエステル結合を切断し、等モルのアラキドン酸とリゾリン脂
質を遊離させる。PLA2はリン脂質からアラキドン酸を優先的に遊離させるが
、アラキドン酸はS1、ホスホリパーゼC−及びホスホリパーゼD−活性化経路
の中間体から二次的に発生される。
既知のPLA2群は、起源の生物体(以下の説明でカッコ内に記載)に、及び
それらの一次アミノ酸配列によって数種の型に分けられたが、現在では作成中の
他の属性のリストによって特性化されている。I型は、80〜90kDのPLA
2(哺乳類)であって、pH6〜8で活性でカルシウムイオン(Ca++)の存在
にその活性が従属している。II型は約14kDの分泌されたPLA2(ヘビ)
の混合物であり、ペパリンに結合し、又デキサメサゾン、ジチオスレイトール、
及びデオキシコール酸塩により阻害される。III型は、サイトゾルの100k
DのPLA2(ミツバチ毒液)である。PLA2の原核細胞を起源とするものは
、Streptomyces violaceoruberのような細菌によって産生される。
いくつかの最近の科学的研究により、PLA2及びそれらの脂肪分解
活性を特性化するに適切な事実が分かった。Van den Berg B等(1995;EMBO J 14
:4123-31)は、PLA2がモノマーの分解より高分子量の凝集体の分解において
より活性が高いということを報告した。Carvalho MG等(1995;J Biol Chem 270:
20439-46)によるIn vitroの実験により、二重層基質を用いると、PLA2は初
めにsn−2アシル基の脱アシル化を行い、次いでsn−1アシル基の脱アシル
化を行うことが分かった。Ross等(1995;J Neutrochem 64:2213-21)は、ヒトの
脳の側頭皮質において、PLA2活性はサイトゾル画分より膜画分において高い
ことを報告した。
PLA活性の生成物であるアラキドン酸は、リゾ血小板活性化因子(リゾPA
F)のような生活性脂質メディエータになるか、或いはエイコサノイドの合成の
ための経路にシャトルされる。実際、リン脂質膜からのアラキドン酸の遊離は、
痛み、熱、及び炎症に関与するエイコサノイドの4つの主なクラス(プロスタグ
ランジン、プロスタサイクリン、トロンボサン、及びロイコトリエン)の生合成
における律速段階である。更に、ロイコトリエンB4(LKB4)は、PLA2
の活性を更に高めるフィードバックループにおいて機能していることが知られて
いる。
PLA2は多くの他の既知の活性化物質を有しており、このような活性化物質
には腫瘍壊死因子(Jaattela M et al.(1995)Oncogene10:2297-305);プロテ
インホスファターゼ阻害薬のオカダ酸(Gewert K and R Sundler(1995)Biochem
J 307:499-504);神経遮断薬のフルフェナジン及びチオリダジン(Trzeciak HI
et al(1995)Eur Arch Psychiatry Clin Neurosci 245:179-182);哺乳類ホ
スホリパーゼA2活性化タンパク質(PLAP;Yamada H and Bitar KN(1995)Bioc
hem Biophys Res Commun 217:203-10);及びエイコサノイドのLKB4、5オ
キソエイコサテトラエン酸又は5ヒドロキシエイコサテトラエン酸
(Wijkander J et al(1995)J Biol Chem 270:26543-9)が含まれる。上皮細胞成
長因子は、特にサイトゾルのPLA2のセリンリン酸化依存性及びカルシウム依
存性の活性化を誘導する(Schalkwijk CG et al.(1995)Eur J Biochem 231:593-
601)。
PLA2のインヒビターはPLA2活性から生ずる、又はその活性に相関性を
有するシグナル伝達カスケードの調節において役立つ。このシグナル伝達の明確
な例の1つは、PLA2の増加が通常の12,000倍以上になりPLA2が補
体成分C3由来アナフィラトキシンに会合した敗血症の場合において見られる。
PLA2インヒビターには、パラブロモフェナシルブロミドのような化学的分子
や心筋により産生される特異的インヒビターのチエロシンA1ベータのような生
物学的分子(Tanaka et al.(1995)Eur J Pharmacol 279:143-8)及び糖質コルチ
コイドのような非特異的インヒビターが含まれる。
Fortes-Dias CL等(1994;J Biol Chem 269:15646-51)は、南アメリカガラガ
ラヘビCrotalus durissus terrificusの血漿からPLA2インヒビターを単離し
特性化した。ガラガラヘビ中和因子(CNF)と称されるこの20〜24kDの
タンパク質は、6〜8個のオリゴマーの凝集塊として自己会合しているようであ
る。CNFが中和するクロトキシン分子は、二量体としてのみ活性であり、PL
A2の2つの塩基性アイソフォーム(CB1及びCB2)の1つと会合する酸性分
子(CA)からなる。実際、CNFはCAを置換してCB分子の1つと安定な会
合を形成する。この置換によりプロトキシンの神経毒性、心毒性、筋毒性、抗凝
集血清活性及び血小板活性化活性を失活させる。
840bpの長さのCNFの完全長cDNAは、ガラガラヘビの肝臓の組織か
らクローン化された。このヌクレオチド配列は19残基のシグナルペプチド及び
16個のシステインを含み、pIが5.45でN157
に潜在性グリコシル化部位を有する181残基の成熟タンパク質をコードする。
Fortes-Diasは、このcDNAは非コーディング配列を含み、推定ポリアデニル
化部位を欠いていると記述している。抑制性試験において、酸性CNF分子は又
、ハチの毒液の活性を阻害し、且つブタの脾臓のPLA2の血漿において100
倍の過剰量が存在している。発明の開示
本発明は、THP−1細胞ライブラリーに由来する部分的なcDNAの中から
初めに同定された新規なホスホリパーゼインヒビター、及び疾病の研究、診断、
予防、及び治療におけるこの核酸及びアミノ酸配列の使用に関するものである。
本発明のホスホリパーゼインヒビターは、アミノ酸配列アライメントのコンピ
ュータ検索によりインサイト社クローンNo.156817の中から初めに同定
された。本明細書において小文字のgiplで表記される配列番号:1のこの核
酸配列は、本明細書において大文字のGIPLで表記される配列番号:2のアミ
ノ酸配列をコードする。本発明は、GIPLとガラガラヘビホスホリパーゼA2
インヒビタCNF(GenBank GI 501050;Fortes-Dias CL et al.1994;J Biol Ch
em 269:15646-51)との化学的、及び構造的相同性に部分的に基づくものである
。
GIPLは成熟CNF分子と23%の同一性を有し、GenBankにおける他のヌ
クレオチド又はタンパク質配列とは相同ではない。GIPLは204アミノ酸の
長さを有し潜在性N連結グリコシル化部位を欠いている。GIPLは19個のシ
ステイン残基を有し、この中の16個は成熟CNFのシステイン残基と一致して
いる。この核酸配列、オリゴヌクレオチド、フラグメント、部分又はそのアンチ
センス分子を体液やバイ
オプシー用に採取された組織の診断試験において使用して、giplの発現濃度
を検出することができる。例えば、患者におけるmRNA転写物の存在を検出し
たり、治療中の転写物の経過をモニタリングするのに、インサイト社クローンN
o.8491、 10033、10644、10774、72861、7445
2、75814、155045、156817、619856、683480、
及び1291208において見いだされた近接配列又はコンセンサス配列から設
計されたgipl配列を(それぞれ配列番号:4〜15)用いることができる。
この核酸配列は、ホスホリパーゼ活性を通常レベルにしたり、或いは高めるこ
とで病状が改善されるような病気の患者におけるゲノムのヌクレオチド配列の発
現を低下、又は完全に抑制する場合に役立つアンチセンス分子の設計も提供する
。本発明は又、宿主細胞や生物体の形質転換に使用され得る発現ベクターへのポ
リヌクレオチドの導入にも部分的に関連している。このような遺伝子組換え宿主
はGIPLの産生のために役立つ。
本発明は更に、天然GIPLの検出のための診断用キットも提供する。このキ
ットはGIPLを誘発させるアゴニストや、GIPLに結合するアンタゴニスト
又はインヒビタの同定において使用するための、若しくは抗体を産生するための
精製GIPLの使用を提供する。このようなアゴニスト、アンタゴニスト、又は
インヒビターは、血管系、リンパ液又は脳脊髄液に送達させてGIPLと相互作
用させることにより、ホスホリパーゼ活性を調節することができる。抗GIPL
抗体は、GIPLの阻害や、GIPLが発現されるバイオプシー用に採取された
組織におけるGIPL活性のモニタリングにおいて役立つ。
本発明は天然遺伝子の発現を中断させ得るタンパク質アンチセンス分子、及び
ここに開示したタンパク質のアゴニスト、抗体、アンタゴニス
ト、又はインヒビタを含む医薬品組成物をその範囲に含む。これらの医薬品組成
物は、敗血症、及びトキシックショック及び壊疽を含むウイルス感染、バクテリ
ア感染又は心筋の感染症のような病気や、これらに限定されないが貧血症、喘息
、全身性エリテマトーデス、及び重症筋無力症を含む自己免疫反応、アルツハイ
マー病、乳癌、糖尿病、骨粗鬆症、及び分裂病のような遺伝病又は癌性疾患、腎
炎、妊娠、リウマチ及び変形性関節炎、強皮症、及び昆虫に刺されたりヘビに噛
まれたりしてホスホリパーゼを一成分として含む毒液を注入された状態のような
病気の予防や治療に役立つ。図面の簡単な説明
第1A図、第1B図、及び第1C図は、初めにTHP−1ライブラリ(THP1PLB02
)に由来する部分的cDNAの中から同定されたホスホリパーゼインヒビターG
IPLの核酸配列(配列番号:1)及び予測アミノ酸配列(配列番号:2)を示
した図である。核酸及びアミノ酸配列のアライメントは、McDNAsisソフトウエア
(Hitachi Software Engineering Co Ltd)を用いて作成された。
第2A図〜第2I図は、コンセンサス配列(配列番号:1)と、インサイト社
クローンNo.8491、10033、10644、10774、72861、
74452、75814、155045、156817、619856、683
480、及び1291208の部分的cDNA(配列番号:4〜15)との核酸
配列アライメントを示した図である。配列のアライメントはDNAStarソフトウエ
ア(DNAStar Inc,Madison WI)のマルチシーケンスアライメントプログラムを用
いて作成された。
第3図はGIPLのコンセンサス翻訳物の配列(配列番号:2)と、ガラガラ
ヘビ中和因子CNF(GI 501050;Fortes-Dias CL et al.(1994)
JBiol Chem 269:15646-51)との間のアミノ酸配列アライメントを示した図であ
る。この配列アライメントはDNAStarソフトウエア(DNAStar Inc,Madisom WI)
のマルチシーケンスアライメントプログラムを用いて作成された。
第4図は、GIPLの疎水性プロットを示した図である。この疎水性プロット
はMacDNAsisソフトウエアを用いて作成されたもので、X軸がアミノ酸の位置、
Y軸の負の方向が疎水性度を表す。
第5図はCNFの疎水性プロットを示した図である。
第6図はGIPLに対する等電点プロットを示した図である(MacDNAsisソフ
トウエアにて作成)。
第7図はCNFに対する等電点プロットを示した図である。発明の実施の形態
本発明は、ホルボール及びリポ多糖刺激THP−1細胞から調製されたcDN
Aライブラリ(THP1PLB02)に由来するインサイト社クローンNo.15681
7においてその部分的配列が初めに同定された新規なホスホリパーゼインヒビタ
に関するものであり、又疾病の研究、診断、予防、及び治療における第1図に示
すポリヌクレオチド(gipl;配列番号:1)及びポリペプチド(GIPL;
配列番号:2)の利用に関するものである。本発明はGIPLの成熟タンパク質
とガラガラヘビホスホリパーゼA2インヒビタCNF(GenBank GI 501050;Fort
es-DiasCL et al.1994;J Biol Chem 269:15646-51)との化学的、及び構造的相
同性に部分的に基づくものである。
GIPLは既知の成熟CNF分子と23%の同一性を有し、GenBankにおける
他のヌクレオチド又タンパク質配列と統計的に有意な相同性は有していない。G
IPLは204個のアミノ酸からなる長さで潜在性N
連結グリコシル化部位を欠いている。しかし、GIPLは19個のシステイン残
基を含み、その内の16個がCNFのシステイン残基と一致している。
giplの発現濃度を検出するための体液又はバイオプシー用に採取された組
織の診断試験においてこの核酸配列、オリゴヌクレオチド、フラグメント、部分
、又はそのアンチセンス分子を用いることができる。例えば、コンセンサス配列
(配列番号:1)又はインサイト社クローンNo.8491において見いだされ
た近縁な配列(配列番号:4、cDNAライブラリHMC1NOT01に由来)、インサ
イト社クローンNo.10033において見いだされた近縁な配列(配列番号:
5、cDNAライブラリTHP1PLB01に由来)、インサイト社クローンNo.10
644において見いだされた近縁な配列(配列番号:6、cDNAライブラリTH
P1PLB01に由来)、インサイト社クローンNo.10774において見いだされ
た近縁な配列(配列番号:7、cDNAライブラリTHP1PLB01に由来)、インサ
イト社クローンNo.72861において見いだされた近縁な配列(配列番号:
8、cDNAライブラリTHP1PLB01に由来)、インサイト社クローンNo.74
452において見いだされた近縁な配列(配列番号:9、cDNAライブラリTH
P1PEB01に由来)、インサイト社クローンNo.75814において見いだされ
た近縁な配列(配列番号:10、cDNAライブラリTHP1PEB01に由来)、イン
サイト社クローンNo.155045において見いだされた近縁な配列(配列番
号:11、cDNAライブラリ、THP1PIB02に由来)、インサイト社クローンN
o.156187において見いだされた近縁な配列(配列番号:12、cDNA
ライブラリTHP1PIB02に由来)、インサイト社クローンNo.619856にお
いて見いだされた近縁な配列(配列番号:13、cDNAライブラリー
PGANNOT01に由来)、インサイト社クローンNo.683480において見いだ
された近縁な配列(配列番号:14、cDNAライブラリUTRSNOT02に由来)、
及びインサイト社クローンNo.1291208において見いだされた近縁な配
列(配列番号:15、cDNAライブラリBRAINOT11に由来)から設計されたg
ipl配列を用いて、治療中の患者の細胞又は組織における転写物の数の変化を
モニタリングしたりmRNA転写物の存在を検出したりすることができる。
この核酸配列は、阻害性のゲノムのヌクレオチド配列の発現を減らしたり無く
したりするのに役立つアンチセンス分子の設計も提供する。アルツハイマー病の
患者において、通常のホスホリパーセ活性の維持により、疾病の進行を遅くする
ことができる。本発明が又、宿主細胞又は生物体の形質転換に使用することがで
きる発現ベクタへのこのポリヌクレオチドの導入にも部分的に関連する。このよ
うな遺伝子組換え宿主はGIPLの産生のために役立つ。
本発明は更に天然GIPLの検出のための診断用キットを提供する。このキッ
トにより抗体の産生のために精製GIPLを用いたりGIPLに結合するアンタ
ゴニストやインヒビタ、若しくはGIPLを誘発するアゴニストの同定において
精製GIPLを使用することができるようになる。このようなアゴニスト、アン
タゴニスト、又はインヒビタは、血管系、リンパ液、又は脳脊髄液に送達されて
、GIPLに結合し、ホスホリパーゼの活性に影響を与えることができる。抗G
IPL抗体は、GIPLの阻害や、GIPLが発現されるバイオプシー用に採取
された組織におけるGIPLの活性をモニタリングするのに役立つ。
本発明は天然遺伝子の発現を中断させ得るタンパク質アンチセンス分子、及び
ここに開示したタンパク質のアゴニスト、抗体、アンタゴニスト、又はインヒビ
タを含む医薬品組成物をその範囲に含む。これらの医
薬品組成物は、敗血症、及びトキシックショック及び壊疽を含むウイルス感染、
バクテリア感染又は心筋の感染症のような病気や、これらに限定されないが貧血
症、喘息、全身性エリテマトーデス、及び重症筋無力症を含む自己免疫反応、ア
ルツハイマー病、乳癌、糖尿病、骨粗鬆症、及び分裂病のような遺伝病又は癌性
疾患、腎炎、妊娠、リウマチ及び変形性関節炎、強皮症、及び昆虫に刺されたり
ヘビに噛まれたりしてホスホリパーゼを一成分として含む毒液を注入された状態
のような病気の予防や治療に役立つ。
GIPLをコードするヌクレオチド配列(又はその相補配列)は、分子生物学
の専門家に周知の様々な技術に適用できる。このような技術には、ハイブリダイ
ゼーションプローブとしての使用、PCR用のオリゴマーとしての使用、染色体
、又は遺伝子マッピングのための使用、GIPLの組換え体の産生における使用
、アンチセンスDNA又はRNAの作成における使用、化学的類似体等が含まれ
る。更に、まだ開発されてはいない分子生物学上の技術であっても、その新規な
技術が例えばトリプレット遺伝暗号や特異的塩基対相互作用等の既知のヌクレオ
チド配列の特性に基づくものであれば、本明細書に開示するヌクレオチド配列を
、そのような技術においても用いることができる。
遺伝暗号の縮重の結果、既知の又は天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して最
小限の相同性しか有していないものも含まれる多数のGIPLコード化ヌクレオ
チド配列が作り出され得る、ということは当業者には明らかであろう。本発明は
、特に、可能なコドン選択に基づく組み合わせの選択により成され得る全ての可
能な核酸配列の変化をその範囲に含んでいる。それらの組み合わせは、天然GI
PLのヌクレオチド配列に適応されるような標準的なトリプレット遺伝暗号に基
づいて成されるものであり、このような全ての変異は、ここに具体的に示された
ものと考
えられたい。
GIPL及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は適切に選択された厳
密性の条件の下で、天然giplのヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能な
ものであるのが好ましいが、概ね異なるコドン使用を有するGIPL又はその変
異体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。コドン選
択は、特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従って、特定の原核細胞の
、或いは真核細胞の発現宿主においてペプチドが発現する速度を高めるように選
択され得る。GIPL及びその誘導体を、コードされるアミノ酸配列を変更する
ことなく実質的に変更する理由は、例えば天然配列から作り出される転写物より
より長い半減期のようなより望ましい特性を有するRNA転写物の産生のためで
ある。
GIPLをコードするヌクレオチド配列はよく確立された組換えDNA技術(
Sambrook J et al.(1989)Molecular Cloning;A Laboratory Manual,Cold Spring
Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY参照)により、他の様々なヌクレオ
チド配列に結合され得る。giplに結合するのに有益なヌクレオチド配列には
、周知の種類のクローニングベクター、例えばプラスミド、コスミド、ラムダフ
ァージ誘導体、ファージミド等が含まれる。興味の対象であるベクタには、発現
ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及びシークエンシングベクタ
ーが含まれる。一般に、興味の対象であるベクターは少なくとも1種類の生物体
において機能的な複製起点、便利な制限エンドヌクレアーゼ感受性部位、及び主
細胞に対する選択マーカーを含んでいる。
本発明の別の側面によれば、GIPLをコードする天然ヌクレオチド配列とハ
イブリッド形成可能なgipl特異的核酸ハイブリダイゼーションプローブが提
供される。このようなプローブは、近縁なインヒビタ
ーをコードする配列の検出にも用いることができ、好ましくはこれらのGIPL
コーディング配列の任意のものに由来するヌクレオチドを少なくとも50%含ん
でいるべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号:1
、及び配列番号:5〜12のヌクレオチド配列、若しくは天然giplのプロモ
ータ、エンハンサエレメント、及びイントロンを含むゲノムの配列に由来するも
のであり得る。ハイブリダイゼーションプローブは様々なリポータ基により標識
され得るが、このようなリポータ分子には例えば32Pや35Sのような放射性核種
や、アビジン/ビオチン結合系を介してプローブに結合されるアルカリホスファ
ターゼのような酵素標識等が含まれる。
米国特許第4,683,195号及び第4,965,188号に記載されてい
るPCR法により、GIPLをコードするヌクレオチド配列に基づくオリゴヌク
レオチドの他の使用法が提供される。PCRにおいて用いられるこのようなプロ
ーブは、組換体を起源とするもの、化学的に合成されたもの、或いは両者の混合
物であり得る。このプローブは、同一の配列を検出するための分散したヌクレオ
チド配列、若しくは近縁なゲノムの配列の同定のための可能な配列の縮重プール
を含む。
giplのDNAに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブを生成する
ための他の手段には、GIPL又はGIPL誘導体をコードする核酸配列の、m
RNAプローブの産生のためのベクターへのクローニングがある。このようなベ
クターは周知のもので、市販されているが、T7又はSP6 RNAポリメラー
ゼのような適当なRNAポリメラーゼや、適切な放射標識ヌクレオチドを加える
ことによりin vitroでRNAプローブを合成するために用いられ得る。
このようにして、完全に化学的合成によりGIPL又はその誘導体をコードす
るDNA配列、若しくはその一部分を作成することが可能であ
るが、その後合成遺伝子を任意の入手可能なDNAベクター及び細胞系にこの出
願時点において周知の試薬を用いて挿入することができる。更に、合成化学を用
いてgipl配列又はその任意の部分に突然変異を誘発させることができる。
このヌクレオチド配列を用いて炎症又は疾病に起因するgiplの活性化又は
誘発を検出するためのアッセイを構築することができる。このヌクレオチド配列
は周知の方法により標識され得、ハイブリッド形成条件の下で患者から採取され
た体液又は組織のサンプルに加えることができる。インキュベーション時間の経
過後、このサンプルを、ヌクレオチドが酵素で標識されている場合には染料(又
は他の顕色剤を必要とする標識)を所望に応じて含む生体適合性の液体で洗浄さ
れる。この生体適合性の液体がリンスされた後、染料が定量され標準値と比較さ
れる。バイオプシー用又は抽出されたサンプルにおける染料の量が比較可能な対
照サンプルの値よりも著しく大きい場合には、そのヌクレオチド配列はサンプル
とハイブリッド形成したことになり、このアッセイにより炎症及び/又は疾病の
誘発が存在していることが示されることになる。
giplに対するヌクレオチド配列を用いて、その各ゲノム配列にマッピング
するためのハイブリダイゼーションプローブを構築することができる。ここで開
示されたヌクレオチド配列は、周知の遺伝子及び/又は染色体マッピング技術を
用いて染色体又は染色体上の特定の領域にマッピングされ得る。このような技術
には、in situハイブリダイゼーション、既知の染色体マーカーに対する連関分
析、既知の染色体に対して特異的なフローソートされた染色体調整物かライブラ
リを用いたハイブリダイゼーションスクリーニング等が含まれる。染色体副産物
の蛍光in situハイブリダイゼーション技術については他の論文、即ちVerma et
al(1988)Human Chromosomes:A Manual of Basic Techniques,
Pergamon Press,New York NYに記載されている。
染色体調整物の蛍光in situハイブリダイゼーション又は他の物理的染色体マ
ッピング技術は、追加の遺伝子地図データと相関性を有し得る。遺伝子地図デー
タの例には、1994 Gemone Issue of Science(265:1981f)がある。物理的遺伝子
地図上のgiplの位置と特定の疾病(又は特定の疾病の素因)との間の相関関
係が、特定の遺伝病が関係するDNAにおいて特定する助けとなり得る。本発明
のヌクレオチド配列を用いて健常者、キャリア若しくは患者の間の遺伝子配列の
違いを検出することも可能である。
周知の組換えDNA技術を用いた精製GIPLの生成のためにこのGIPLを
コードするヌクレオチド配列を用いることができる。多くの出版物において、遺
伝子の単離の後その遺伝子を発現させる方法について記載されており、このよう
な文献の例にはGoeddel(1990)Gene Expression Technology,Methods and Enzy
mology,Vol 185,Academic Press.SanuDiegoがある。GIPLは原核細胞、真核
細胞の何れかの種々の宿主細胞において発現され得る。宿主細胞は特定のgip
lヌクレオチド配列がそこから単離された同じ種に由来するものであるか、或い
は異なる種に由来するものであり得る。組換えDNA技術によりGIPLを生成
する利点には、精製のために充分な量のタンパク質が得られる点と簡単な精製手
順が利用できる点がある。
GIPLをコードするDNAで形質転換された細胞は、GIPLの発現及びタ
ンパク質の回収に適した条件の下で培養され得る。組換え細胞により産生された
GIPLは、使用された特定の遺伝子構築物に応じて分泌されるか、細胞内に含
められるか、或いは膜の中に入れられ得る。一般に、組換えタンパク質を分泌さ
れた形態で準備するのがより便利である。精製工程は産生の過程、宿主の生物体
、及び生成される特定のタ
ンパク質によって変化する。
組換体の産生に加えて、GIPLのフラグメントを固相技術(Stewart et al(
1969)Solid-Phase Peptide Synthesis,WH Freeman Co,SanFrancisco;Merrifiel
d J(1963)J Am Chem Soc 85:2149-2154参照)を用いる直接のペプチド合成によ
り取り出すことができる。In vitroタンパク質合成は、手で行っても自動化して
も良い。自動化合成は、例えばApplied Biosystems 431A Peptide Synthesizer(
Perkin Elmer,Foster City,California)を、製造者の指示に従って用いることに
より達成され得る。GIPLの種々のフラグメントを個別に化学的に合成し、化
学的方法を用いて結合することにより完全長分子を作り出すことができる。
抗体誘発用のGIPLは生物学的活性を有している必要はないが、このタンパ
ク質フラグメント、又はオリゴペプチドは免疫原性でなければならない。特異的
抗体の誘発に用いられるペプチドは、少なくとも5個、好ましくは少なくとも1
0個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有し得る。このような配列は天然タンパ
ク質のアミノ酸配列の一部を擬したものであるべきであり、小型の天然分子の全
アミノ酸配列を含んでいても良い。GIPLアミノ酸の短いストレッチは、キー
ホールリンペットヘモシアニンやキメラ分子に対して産生された抗体のような他
のタンパク質のストレッチと融合され得る。
GIPLに対して特異的な抗体は、ポリペプチド又は抗原性のフラグメントを
適切な動物に接種することにより産生され得る。抗体は対ポリペプチドの抗原決
定基に対して産生された場合は特定のGIPLに対して特異的であり、天然又は
組換えタンパク質の少なくとも一部分に結合する。抗体産生の方法は、動物への
注射により免疫反応を刺激することだけでなく、組換え免疫グロブリンライブラ
リのスクリーニング
(Orlandi R et al(1989)PNAS 86:3833-3837,or Huse WD et al(1989)Science 2
56:1275-1281参照)のような合成抗体や他の特異的結合分子の産生における類似
の過程や、リンパ球集団のin vitroでの刺激を含み得る。現在の技術(Winter G
and Milstein C(1991)Nature 349:293-299)は、抗体形成の原理に基づく複
数の高度に特異的な結合試薬を提供している。これらの技術はGIPLに特異的
に結合する分子の生成に適応することができる。
本発明の別の実施例では、過剰なホスホリパーゼ活性が関与する病気の治療の
ための生理活性薬剤として、GIPL特異的抗体を使用する。
GIPLのアゴニスト又はアンタゴニストを含む生理活性組成物は、適切な使
用的投与量で投与され得る。この適切な投与量は、最大限の許容される投与量を
決定するための動物臨床実験及び安全投与量を決定するための健常なヒト被験者
への実験を含むいくつかの方法によって決定される。更に、生理活性薬剤は良く
確立された種々の化合物や例えば半減期のような薬理学的特性や安定性を強化す
る組成物と複合体を形成し得る。治療用の生理活性組成物の静脈内注入による血
液への送達や治療のために使用され得る他の効果的な手段による到達は本発明の
範囲に含まれている。
本明細書において、「核酸配列」とは、一本鎖若しくは二本鎖の、センス鎖、
又はアンチセンス鎖であるゲノムの若しくは合成起源のDNA若しくはRNA、
及びオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びそのフラ
グメント又は一部分を意味する。同様に、本明細書におけるアミノ酸配列とは、
オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質配列を意味する。
本明細書において「ペプチド核酸」とは、リジンのようなアミノ酸残基及びア
ミノ基を加えられたオリゴマーを含む分子を意味する。これら
の小分子は、抗遺伝子剤とも称され、核酸のこれらの相補的な(鋳型の)鎖に結
合することにより転写物の伸張を停止させる(Nielsen PE et al(1993)Anticanc
er Drug Des 8:53-63)。
本明細書において、GIPLとは、任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウ
ス、ウマ、そして好ましくはヒトを含む哺乳類に由来する、天然の形態のGIP
L、若しくは天然、合成、半合成、若しくは組換体のいずれかの起源に由来する
GIPLのアミノ酸配列を意味する。本明細書において、「天然(又は自然発生
)」とは、天然に見いだされるアミノ酸配列を意味する。
本発明は、GIPL変異体をその範囲に含む。好適なGIPL変異体は、GI
PLアミノ酸配列(配列番号:2)に対して少なくとも80%のアミノ酸配列の
類似性を有するものであり、より好適なGIPL変異体は少なくとも90%のア
ミノ酸配列の類似性を有し、最も好適なGIPL変異体は少なくとも95%のア
ミノ酸配列の類似性を有するものである。GIPLの「変異体」が、1又は2箇
所以上のアミノ酸の「置換」により異なるものとなったアミノ酸配列を有し得る
。この変異体は「保存的」変化を有し得、この保存的変化においては例えばロイ
シンをイソロイシンで置き換える場合のように置換されるアミノ酸が類似な構造
的及び化学的特性を有する。稀に、変異体が「非保存的」変化をする場合もあり
、この非保存的変化では例えばグリシンナトリプトファンで置換される。類似し
た小変化には、アミノ酸の欠失、挿入、若しくはその両方も含まれ得る。例えば
DNAStarソフトウエアのような従来より周知のコンピュータプログラムを用いて
、生物学的或いは免疫学的活性を損なわずに、置換、挿入、又は除去できるアミ
ノ酸及びそのアミノ酸の数を決定することができる。
用語「生物学的活性」は、天然GIPLの構造的、調節の、又は生化
学的機能を有するGIPLを意味する。同様に「免疫学的活性」とは、天然、組
換え、又は合成のGIPL、若しくはその任意のオリゴペプチドが適当な動物や
細胞における特定の免疫反応を誘発し、特定の抗体に結合する能力として定義さ
れる。
本明細書において「、誘導体」なる用語は、gipl、又はコードされたGI
PLの化学的修飾物を意味する。このような修飾の例には、水素からアルキル基
、アシル基、又はアミノ基への置換がある。GIPL誘導体は、天然GIPLの
必要不可欠な生物学的特性を維持するポリぺプチドをコードしている。
本明細書において、「精製」なる用語は、この天然の環境から取り除かれ、天
然にはそれが結合して存在する少なくとも1つの他の成分から単離又は分離され
た核酸配列又はアミノ酸配列を有する分子を意味する。
GIPLコーディング配列
GIPLの核酸配列及び予測アミノ酸配列を第1図に示す。本発明によれば、
GIPLのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、GIPLを発現
する組換え分子を生成することができる。ここに開示する特定の実施例では、g
iplの配列が、THP−1 cDNAライブラリー(THP1PBL02)に由来するク
ローンの中から初めに単離された。前記ライブラリーについては、1995年5
月10日に出願された、Delegeane Aらによる“Polynucleotides Derived from
THP-1 Cells”なる名称の米国特許出願第08/438,571号に記載されて
おり、本明細書と一体に参照されたい。
DNA配列決定のための方法は周知であり、例えばDNAポリメラーゼI,S
equenase(商標)のクラノウフラグメント(USBiochemical社,Clevel
and OH)、Taqポリメラーゼ(Perkin Elmer
社,Norwalk CT)、熱安定性T7ポリメラーゼ(Amersham社,Chicago IL)、或い
はGibco BRL(Gaithersburg MD)Methods社から市販されているELONGAS
E増幅システムのような組換えポリメラーゼとプルーフリーディングエキソヌク
レアーゼとの組み合わせのような酵素を使用する。
対象となるDNAテンプレートにアニールされたオリゴヌクレオチドプライマ
からDNAを延長する方法は、一本鎖テンプレート及び二本鎖テンプレートの両
方に対して開発されている。連鎖終了反応の生成物は電気泳動を用いて分離され
、それに組み込まれた標識された前駆体を介して検出される。最近の機械化反応
調製、配列決定並びに解析における改善によって、1日当たりに決定できる配列
数が増えた。好適には、この処理は、Hamilton Micro Lab2
200(Hamilton社,Reno NV)、Peltier Thermal Cycle
r(PTC200;MJ Reserch社,Watertown MA)並びにABI377DNAシ
ーケンサ(Perkin Elmer社)のような装置を用いて自動化される。
特定のcDNAライブラリの品質は、cDNAのパイロットスケール分析を実
行することにより、さらにはクローン含有ベクター、λ或いはE.coli D
NA、ミトコンドリア或いは反復DNA、並びに公的データベースに厳密に一致
、或いは相同的に一致するクローンのパーセンテージを検査することにより決定
される。
ポリヌクレオチド配列の延長
ポリヌクレオチド配列giplは、部分的なヌクレオチド配列と、プロモータ
及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当業者には周知の様々な
方法とを用いて延長することができる。Gobinda等
(1993;PCR Methods Applic 2:318-22)は既知の部位に隣接する未知の配列を検
索するために汎用プライマーを用いる直接的な方法として「制限部位」ポリメラ
ーゼ連鎖反応(PCR)を開示している。ここでは、まずゲノムDNAが、既知
の領域に対して特異的なプライマー及びリンカー配列に対するプライマーの存在
下で増幅される。増幅された配列は、その同じリンカープライマー及び最初のプ
ライマーの内部に含まれる別の特異的プライマーを用いてPCRの2巡目にかけ
られる。PCRの各回の生成物は、適切なRNAポリメラーゼを用いて転写され
、逆転写酵素を用いて配列決定される。
逆PCR法を用いて、既知領域に基づく多様なプライマーを利用した配列の増
幅、または延長を行うことができる(Triglia等(1988)Nucleic Acids Res 16:81
86)。プライマーは、Oligo4.0(National Biosciences社,Plymouth M
N)或いは別の適切なプログラムを用いて設計され、長さが22−30ヌクレオ
チドで、50%以上のGC含有率を有し、かつ約68〜72℃の温度で標的配列
にアニールする。この方法ではいくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域
における適切なフラグメントを生成する。次いでこのフラグメントは分子内ライ
ゲーションにより環状にされ、PCR鋳型として使用される。
キャプチャPCR法(Lagerstrom M等(1991)PCR Methods Applic 1:111-19
)は、ヒト及び酵母菌人工染色体(YAC)DNA内の既知の配列に隣接するD
NAフラグメントのPCR増幅を行うための方法である。またキャプチャPCR
では、多数の制限酵素の消化及びライゲーションによってPCR前にDNA分子
の未知の部分に、組換え二本鎖配列を配置する必要がある。
Parker JD等(1991;Nucleic Acids Res 19:3055-60)は、歩行PCR法、すな
わち未知の配列の検索ができる標的遺伝子歩行のための方法
を教示している。PromoterFinder(登録商標)なる、Clontech社
(Palo Alto CA)から入手できる新しいキットでは、PCR、入れ子状(nested
)プライマー並びにプロモータファインダライブラリーを用いて、ゲノムDNA
内を歩行させる。この過程は、ライブラリーをスクリーニングする必要がなく、
イントロン/エクソン接合部を探し出すのに有用である。
別のPCR方法としては、Guebler等による1995年6月7日出願の米国特
許第08/487,112号“Improved Method for Obtaining Full Length cD
NA Sequences”に開示されたものがあり、この明細書を本明細書と一体に参照さ
れたい。この方法では、XL−PCR(登録商標)(Perkin elmer社,Foster Ci
ty CA)を用いて、ヌクレオチド配列を増幅、並びにまた延長する。
完全長cDNAをスクリーニングするための好適なライブラリーは、サイズ選
択された、より大きなcDNAを含むライブラリーである。またランダムに初回
刺激を与えられた(primed)ライブラリーは、遺伝子の5’及び上流領域を含む
より多くの配列を含むという点で好適である。ランダムに初回刺激を与えられた
ライブラリーは、オリゴd(T)ライブラリーが完全長cDNAを生成しない場
合、特に有用である。またゲノムライブラリーは、プロモータ結合領域の5’ま
で延長するために有用である。
サイズがどのくらいかを分析したり、或いは配列決定やPCR処理の産物のヌ
クレオチド配列を確認するための新しい方法はキャピラリー電気泳動法である。
迅速な配列決定のためのシステムは、Perkin elmer社、Beckman Instruments社
(Fullerton CA)並びに他の企業から入手できる。キャピラリー電気泳動法では
、電気泳動分離のための流動性ポリマー、レーザで活性化される4つの異なる蛍
光色素(各ヌクレオチ
ドに対して1つ)を使用し、CCDカメラにより放射線の波長の検出を行う。出
力/光強度は適切なソフトウエア(例えばPerkin elmer社製のGenotyper(登録
商標)及びSequence Navigator(登録商標))を用いて電気信号に変換され、サ
ンプルの負荷からコンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコンピュ
ータ制御される。キャピラリー電気泳動法は特定のサンプルの限定された量の中
に存在するDNAの小片の配列決定に特に適している。この方法により30分間
でM13ファージDNAの350bpを再現可能な形で配列決定できたことが報
告されている(Ruiz-Martinez MC等(1993)Anal Chem 65:2851-8)。
ヌクレオチド配列の発現
本発明に従って、GIPL、そのポリペプチドのフラグメント、融合タンパク
質或いはその機能的等価物をコードするgiplポリヌクレオチド配列を、適切
な宿主細胞内でのgiplの発現を誘導する組換えDNA分子を生成するために
用いることができる。遺伝暗号固有の縮重のために、概ね同一か或いは機能的に
等価なアミノ酸配列をコードする他のDNA配列も、GIPLのクローニングや
発現のために用いることができる。当業者には理解できるように、非自然発生コ
ドンを有するGIPLコード化ヌクレオチド配列を生成することは有益であり得
る。特定の原核宿主或いは真核宿主において好適なコドン(Murray E等(1989)
;Nucleic Acids Res 17:)を、例えば、GIPL発現率を増大させたり、或いは
自然発生配列から生成された転写産物より長い半減期のような望ましい特性を有
する組換えRNA転写産物を生成したりするように選択することができる。
また本発明の範囲に含まれるものとして、中程度から最高度の厳密性の条件の
下で、第1図のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なポ
リヌクレオチド配列がある。ハイブリダイゼーション条件は、Berger及びKimmel
(1987,Guide to Molecular Cloning Techniques,Methods in Enzymology,Vol 15
2,Academic Press,San Diego CA)により教示され、ここで引用して組み込んで
いるように、核酸結合複合体の融点(Tm)に基づいており、以下に説明するよ
うに、定義された「厳密性」を与える。
「最高度の厳密性」は典型的に約Tm−5℃(プローブのTmより5℃下)で発
生し、「高度の厳密性」はTmの約5〜10℃下で発生し、「中程度の現密性」
はTmの約10〜20℃下で発生し、「低度の現密性」はTmの約20〜25℃
下で発生する。当業者には理解できるように、厳密性が最高度のハイブリダイゼ
ーションは、同一のポリヌクレオチド配列を同定、すなわち検出するために用い
ることができるが、一方厳密性が中程度(或いは低度)のハイブリダイゼーショ
ンは類似の、すなわち近縁なポリヌクレオチド配列を同定、すなわち検出するた
めに用いられる。
本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション」は「核酸の鎖が塩基対合
を介して相補鎖と結合する過程」(Coombe J(1994)Dictionary of Biotechnology,
Stockton Press社,New York)を含む概念である。従って定義により、ハイブリダ
イゼーションは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術で実行されるような増幅
のプロセスを含むものである。このPCR技術についてはDieffenbach CW and G
S Dveksler(1995,PCR Primer,a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press
社,New york)の論文に記載されており、本明細書と一体に参照されたい。
本明細書において「欠失」とは、1または2以上のヌクレオチド若しくはアミ
ノ酸残基が欠ける、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化として定
義される。
本明細書において「挿入」或いは「付加」とは、天然giplに比べて、結果
的に1または2以上のヌクレオチド或いはアミノ酸残基の加わるようなヌクレオ
チド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。
本明細書において「置換」とは、1または2以上のヌクレオチド或いはアミノ
酸を異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置換することによって生ずる変化を指
す。
本発明において用いられ得る変異gipl核酸配列は、異なるヌクレオチド残
基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に同一の、または機能的に等価のGI
PLポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとなるものである。そのタンパ
ク質も、サイレント変化を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに置換を含み、
結果的に機能的に等価なGIPLとなる。慎重なアミノ酸置換は、GIPLの生
物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親
水性並びにまた両親媒性についての類似性に基づいてなされ得る。例えば負に荷
電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したア
ミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、同じ親水値を持つ帯電していない極
性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、ア
ラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン並
びにチロシンが含まれる。
本発明の範囲に含まれるものとして、giplのアレルがある。ここで用いる
「アレル」或いは「アレル配列」とは、giplの別の形態である。アレルは変
異、すなわち核酸配列の変化に起因し、一般に変化したmRNA或いはポリペプ
チドを生成し、そのmRNA或いはポリペプチドの構造或いは機能は変更される
場合もあれば、されない場合もある。遺伝子によっては、アレル形態がないもの
、1つあるもの、或いは多数存在するものがある。アレルを生じる変異は一般に
、アミノ酸の自然な
欠失、付加並びに置換に起因する。このタイプの変化はそれぞれ単独で、或いは
他の遺伝子の組み合わせで、与えられた配列内一回またはそれ以上の回数生じ得
る。
本発明のヌクレオチド配列は、様々な理由によりGIPLコード配列を変更す
るために組換えられ得、限定はしないが遺伝子生成物のクローニング、プロセッ
シング並びにまた発現を変更する別形態を含む。例えば、変異は、当業者には周
知の技術、例えば特定部位突然変異誘発を用いて導入され、新しい制限部位の挿
入、グリコシル化パターンの変更、コドン選好の変化等をもたらすことができる
。
本発明の別の実施例では、天然gipl、変更gipl或いは組換えgipl
が、異種の配列に結合され、融合タンパク質をコードする配列となる。例えば、
GIPL活性のインヒビターを選び出すべくペプチドライブラリをスクリーニン
グするために、市販の抗体により認識される異種のペプチドを発現するキメラG
IPLタンパク質をコード化することが役立つことがある。融合タンパク質はG
IPL配列と異種のタンパク質配列との間の位置に切断部位を包含するように設
計することもでき、これによってGIPLを切断して、異種の部分から分けて精
製することが可能となる。
本発明の別の実施例では、giplコード化配列は、当業者によく知られた化
学的方法を用いて、(Caruthers等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223、C
rea,Horn(1980)Nuc Acids Res 9:2331、Matteucci,Caruthers(1980)Tetrahe
dron Lett 21:719、Chow,Kempe(1981)Nuc Acids Res 9:2807-2817参照)全体
的に、或いは部分的に合成することができる。別法では、GIPLアミノ酸配列
を、全体的に或いは部分的に合成する化学的方法を用いてタンパク質自体を生成
することができる。例えばペプチドを固相技術で合成して、樹脂から切り離し、
さら
に分離用高速液体クロマトグラフィにより精製することができる(例えばCreigh
ton(1983)Proteins Structure And Molecular Principles,WH Freeman and Co,N
ew york参照)。合成されたペプチドの構成は、アミノ酸解析或いは配列決定処
理により確認することができる(例えばthe Edman degradation procedure;Crei
ghton,上述)。さらにGIPLのアミノ酸配列、或いはその任意の部分を、そ
の直接の合成の際に変更したり、また他の細胞内メディエータ或いはその任意の
部分に由来する配列と化学的方法を用いて結合して、変異体ポリペプチドを生成
することができる。
発現系
生物学的に活性のGIPLを発現するために、GIPLをコード化したヌクレ
オチド配列或いは機能的等価物は、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコ
ード化配列の転写及び翻訳に必要不可欠な要素を含むベクターに挿入される。
GIPLコード化配列及び適切な転写や翻訳の制御要素を含む発現ベクターを
構成するために当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、in vitro
組換えDNA技術、合成技術、並びにin vivo組換え即ち遺伝子組換え技術が含
まれる。このような技術は、Maniatis等(1989)Molecular Cloning,A Laborat
ory Manual,Cold Spring Harbor Press,Planview NY及びAusubel FM等Current P
rotocol in Molecular Biology,John Wilky & Sons,New JohnWilky & Sons,New
Yorkに記載されている。
種々の発現ベクター/宿主系が、GIPLコード化配列を保持し発現するため
に利用される。このようなものには、限定はされないが、組換えバクテリオファ
ージ、プラスミド或いはコスミドDNA発現ベクター
で形質転換したバクテリア、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌、ウイル
ス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系、ウイルス
発現ベクター(例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMV、タバコモザイク
ウイルスTMV)をトランスフェクトした、或いはバクテリア発現ベクター(例
えばTi或いはpBR322プラスミド)で形質転換した植物細胞系、或いは動
物細胞系を含む。
これらの系の「制御エレメント」或いは「調節配列」は、その力及び特異性は
様々で、ベクターの非翻訳領域、エンハンサ、プロモータ及び3’非翻訳領域で
あり、これらは転写及び翻訳を実行するために宿主細胞のタンパク質と相互作用
する。利用されるベクター及び宿主に応じて、構成的及び誘導性プロモータを含
む、任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントが用いられ得る。例えば、バクテ
リア系においてクローニングする際には、Bluescript(商標)phagemid(Stratag
ene社,LaJolla CA)のhybrid lacZプロモータ及びptrp−lac
hybrid並びに同様の誘導性プロモータが用いられる。バキュロウイルス
ポリヘドリンプロモータは昆虫細胞において用いられる。植物細胞のゲノム(例
えば熱ショック,RUBISCO及びストレージタンパク質遺伝子)に由来する、或い
は植物ウイルス(例えばウイルス性プロモータ或いはリーダ配列)に由来するプ
ロモータ或いはエンハンサはベクターにクローン化され得る。哺乳動物細胞では
、哺乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルス由来のプロモータが最適である。gi
plの多数の複製を含む株細胞を生成する必要がある場合には、SV40或いはEBV
に基づくベクターを、適切な選択マーカーと共に用いる。
細菌系では、GIPLの発現の用途に応じて多数の発現ベクターが選択され得
る。例えば抗体を誘発するために大量のGIPLが必要とされる場合は、容易に
精製される融合タンパク質を高濃度で発現できるベク
ターが望まれる。そのようなベクターには、限定はしないが、大腸菌クローニン
グベクター及び発現ベクターBluescript(商標)(このベクターにおいて、gi
plコード化配列が、アミノ基末端メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼ
の7残基の配列を備えたフレーム内においてベクターに結合されてハイブリッド
タンパク質が生成される)や、pINベクター(Van Heeke&Schuster(1989)J Biol
Chem 264:5503-5509)等が含まれる。またpGEXベクター(Promage社、Madison WI
)もグルタチオンS−トランスファーゼ(GST)を有する融合タンパク質として
異種ポリペプチドを発現するため用いられる。一般に、そのような融合タンパク
質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへの吸着に続き、遊離グルタ
チオンの存在下における溶出により溶解した細胞から容易に精製できる。その系
において生成されたタンパク質はヘパリン、トロンビン或いはXA因子プロテア
ーゼ切断部位を含むように設計され、対象となるクローン化ポリペプチドは随意
にGST部分から放出され得る。
酵母菌、サッカロミセスセレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)では、α因
子、アルコールオキシダーゼ及びPGHのような構成的或いは誘導性プロモータを
含む多数のベクターが用いられる。再検討する場合には、Ausubel等(前出)及
びGrant等(1987)Methods Enzymol153:516-544を参照されたい。
植物発現ベクターを用いる場合には、GIPLをコードする配列の発現は、多
数の任意のプロモータにより促進される。例えばCaMVの35S及び19Sプロモータ(
Brisson等(1984)Nature 310:511-514)のようなウイルス性プロモータは、単
独で、或いはTMV(Takamatsu等(1987)EMBO J 6:307-311)からのオメガ−リー
ダー配列と共に用いられる。別法では、RUBISCO(Coruzzi等(1984)EMBO J 3:1671
-1680)、
Broglie等(1984)Science 224:838-843)の小サブユニット、或いは熱ショック
プロモータ(Winter J及びSinibaldi RM(1991)Results Probl Cell Differ
17:85-105)のような植物プロモータが用いられる。これらの構成は直接DNA形
質転換或いは病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞内に導入される。
そのような技術を再検討する場合には、Hobbs S及びMurry LE、McGraw Yearbook
of Science and Technology(1992)McGraw Hill NY,pp191-196及びWeissbach
and Weissbach(1988)Methods for Plant MolecularBiology,Academic Press N
Y,pp421-463を参照されたい。
giplを発現するために用いることができる別の発現系は昆虫系である。そ
のような系の一つでは、Autographa californica核多角体病ウイルス(AcNPV)
がベクターとして用いられ、Spodoptera frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの
幼虫において外来遺伝子を発現する。giplコード化配列は、ポリヘドリン遺
伝子にような、ウイルスの非必須領域にクローニングされ、ポリヘドリンプロモ
ータの制御下に置かれる。
giplの挿入が成功した場合には、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、コート
タンパク質膜が欠如した変異体ウイルスを生成する。変異体ウイルスはそれから
S.frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの幼虫への感染させるために用いられ、そ
の中でGIPLが発現される(Smith等(1983)J Virol 46:584、Engelhard EK
等(1994)Proc Nat Acad Sci 91:3224-7)。
哺乳類宿主細胞では、多数のウイルス性発現系を利用することができる。発現
ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、GIPLコード化配列は
、後期プロモータ及び三連リーダ配列からなるアデノウイルス転写物/翻訳物複
合体内に結合される。ウイルス性ゲノムの非必須E1或いはE3領域における挿入に
より、結果的に感染した宿主細
胞におけるGIPLを発現することができる生存可能なウイルスになる(Logan
及びShenk(1984)Proc Nat Acad Sci 81:3655-3659)。さらにラウス肉腫ウイ
ルス(RSV)エンハンサのような転写エンハンサを哺乳類宿主細胞内の発現を増
加させるために用いることができる。
また、挿入されるGIPLコード化配列の有効な翻訳のためには、特定の開始
信号も必要である。これらの信号には、ATG開始コドン及び隣接の配列が含まれ
る。gipl及びその開始コドン及び上流配列が適切な発現ベクター内に挿入さ
れる場合には、追加の翻訳制御信号は不要である。しかしながらコード化配列、
或いはその一部のみが挿入される場合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制
御信号が与えられなければならない。さらに、開始コドンは正しい読み枠内にあ
る必要があり、全インサートの転写を確実に行わなければならない。外来転写素
子及び開始コドンは、自然及び合成両方の様々な起源に由来するものであり得る
。発現の効果は、その細胞系に適切なエンハンサを含めることにより強められる
(Scharf等(1994)Results Probl Cell Differ 20:125-62、Bitter等(1987)M
ethods Enzymol 153:516-544)。
さらに宿主細胞株は、望ましい形に、挿入された配列を変更したり、発現した
タンパク質のプロセシングを行う能力を求めて選択される。このようなポリペプ
チドの修飾は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、
リン酸化、脂質化(リピデーション)並びにアシル化を含む。またタンパク質の
プレプロ形態を切り離す翻訳後プロセッシングは、正確な挿入、折り畳み、並び
にまた機能を正しく発揮するために重要である。CHO,HeLa,MDCK,293,WI38等のよ
うな異なる宿主細胞は、そのような翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特徴
的な機構を有しており、導入される外来タンパク質の修飾やプロセシングを確実
に実行するべく選択される。
長期にわたる高収率の変異体タンパク質の生産を確保するためには、安定した
発現が望ましい。例えばGIPLを安定的に発現する株細胞は、ウイルス由来の
複製物、或いは内在性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を含む発現ベクタ
ーを用いて形質転換される。ベクターの導入に続いて、細胞は、選択培地に切り
替えられる前に、濃縮培地内で1〜2日間成長させられる。選択マーカーは選択
物への耐性を与え、導入された配列をDNA内に安定的に結合する細胞を同定で
きるようにする。細胞の耐性凝集塊はその細胞型に適切な組織培養技術を用いて
増殖することができる。
形質転換された細胞株を回収するために任意の数の選択系を用いることができ
る。限定はしないが、選択系は単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(Wigler
等(1977)Cell 11:223)及びアデニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ
(Lowy等(1980)Cell 22:817)遺伝子を含み、それぞれtk-及びaprt-細胞にお
いて用いられる。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の基
礎として用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性
を与え(Wigler等(1980)Natl Acad Sci 77:3567)、nptはアミノグリコシッ
ド剤、ネオマイシン及びG−418に対する耐性を与え(Colberre-Garapin等(
1981)J Mol Biol 150:1)、als或いはpatはクロルスルフロン(chlorsul
furon)、フォスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ(phosphinotricin
acetyltransferase)に対する耐性を与える(上記Murry)。さらに選択可能な
遺伝子として、例えば細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できる
ようにするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール(histinol)を
利用できるようにするhisDが記載されている(Hartman及びMulligan(1988)Pr
oc Nalt Acad Sci 85:8047)。最近になって、形質転換体を同定するためばかり
ではなく、特定ベクター系が要因となる一過性の或いは安定なタンパク質発現の
量を定量するために広く用いられるβ−グルクロニダーゼ、アントシアニン及び
ルシフェリンのような標識を用いる、可視標識が非常によく用いられるようにな
った(Rhodes CA等(1995)Methods Mol Biol 55:121-31)。
本発明のポリヌクレオチド配列を含む形質転換体の同定
マーカー遺伝子発現の存在/不在は、対象の遺伝子も存在することを示唆する
が、その存在及び発現は確認されるべきである。例えばgiplがマーカー遺伝
子配列内に挿入されるなら、giplを含む組換え細胞がマーカー遺伝子の機能
の存在により同定できる。別法ではマーカー遺伝子は、単一プロモータの制御下
でgipl配列と直列に配置することができる。誘導または選択に応じてのマー
カー遺伝子の発現は、通常さらにgiplの発現をも示す。
この他、giplのコーディング配列を含み、さらにGIPLを発現する宿主
細胞が、当業者には周知の様々な手順により同定できる。これらの手順は、限定
はしないが、DNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーション及び
、核酸及びタンパク質の検出並びにまた定量するための膜、溶液或いは破片ベー
ス技術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイを含む。
giplポリヌクレオチド配列の存在は、giplのプローブ、一部、或いは
フラグメントを用いるDNA−DNA或いはDNA−RNAハイブリダイゼーシ
ョン或いは、増幅により検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイでは
、gipl配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーを使用し、gip
lのDNA或いはRNAを含む形質転換体を検出する。本明細書において「オリ
ゴヌクレオチド」或いは「オ
リゴマー」とは、プローブ或いはアンプリマー(amplimer)として用いることが
できる、少なくとも10ヌクレオチド、多い場合には60ヌクレオチド、好適に
は15〜30ヌクレオチド、より好適には20〜25ヌクレオチドの核酸配列を
指す。
タンパク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれか
を用いて、GIPLポリペプチドの発現を検出し、測定するための種々のプロト
コルが当業者には周知である。このようなプロトコルの例としては、酵素結合免
疫検定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)及び蛍光表示式細胞
分取器法(FACS)を含む。GIPLポリペプチド上で2つの非干渉なエピト
ープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナル用イ
ムノアッセイ(two-site,monoclonal-based immunoassay)は好適ではあるが、
競合的結合アッセイも用いられる。これらアッセイの並びに他のアッセイは、Ha
mpton R等(1990,Serologivcal Methods,a Laboratory Manual,APS Press,St Pau
l MN)及びMaddox DE等(1983,I Exp Med 158:1211)等に記載されている。
さらに多くの標識及び結合技術は当業者には周知であり、種々の核酸及びアミ
ノ酸検査法において用いることができる。giplに関連する配列を検出するた
めの標識されたハイブリダイゼーション或いはPCRプローブを生成するための
手段には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、末端標識化或いは標識
されたヌクレオチドを用いるPCR増幅などがある。別法では、gipl配列、
或いはその任意の部分が、mRNAプローブの生成のためにベクターにクローニ
ングされる。そのようなベクターは当分野では周知であり、市販されており、T
7,T3或いはSP6並びに標識されたヌクレオチドのような適切なRNAポリ
メラーゼの付加により、in vitroでのRNAプローブ合成のために用い
ることができる。
Pharmacia Biotech社(Piscataway NJ)、Promega社(Madison WI)並びにUS Bioc
hemical社(Cleveland OH)のようないくつかの企業がこれらの手順に対する商
用のキット及びプロトコルを提供している。適切なリポーター分子、すなわち標
識には、放射性核種、酵素、蛍光性、化学ルミネセンス或いは色素生成剤や、基
質、補助因子、インヒビター、磁気粒子或いはそれに類似のものが含まれる。そ
のような標識の使用について記載している特許には、米国特許第3,817,8
37号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,3
45号、第4,277,437号、第4,275,149号並びに第4,336
,241号がある。また、組換え免疫グロブリンの製造については米国特許第4
,816,567号に記載の方法を用いることができ、本明細書とともに参照さ
れたい。
GIPLの精製
giplヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞培地からコード
化タンパク質を発現及び回収するために適切な条件下で培養される。組換え細胞
により生成されるタンパク質は、用いられる配列並びにまたベクターに応じて、
細胞内に分泌、つまり含有されるようにすることができる。当業者には理解され
るように、giplを含む発現ベクターは、原核細胞か、真核細胞の細胞膜を通
してのGIPLを分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計される。他の組
換え体作製物では、giplを、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプ
チドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合することができる(Kroll DJ
等(1993)DNA Cell Biol 12:441-53、融合タンパク質を含むベクターに関する
上記論議も参照されたい)。
またGIPLは、タンパク質精製を容易にするために加えられた1または2以
上の付加的なポリペプチドドメインを備えた組換えタンパク質として発現される
。そのような精製を容易にするドメインには、限定はしないが、固定化金属上で
の精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュールのような金属キレート
ペプチド(Porath J(1992)Protain Expr Purif 3:263-281)、固定化免疫グロブ
リン上での精製を可能にするプロテインAドメイン、並びにFLAGS延長/ア
フィニティ精製システムにおいて用いられるドメイン(Immunex社、Seattle WA
)が含まれる。精製ドメイン及びGIPL間の第XA因子或いはエンテロキナー
ゼのような切断可能なリンカー配列を含めるのは精製を促進するのに役立つ。
GIPLの使用
ここに開示したヌクレオチド及びベプチド配列の診断及び治療における使用の
原理は、開示された核酸及びアミノ酸配列や、第3図〜第7図に示すようなGI
PLとCNFとの間の配列の比較により得られた情報や、マスト細胞cDNAラ
イブラリー(HMC1NOT1)、THP−1cDNAライブラリー、神経細胞
cDNAライブラリー(PGANNOT01)、及び子宮cDNAライブラリー
(UTRSNOT01)におけるgipl転写物の存在に基づいている。これら
のライブラリが事故死の被害者や病気の患者から採取された活性化された細胞、
細胞、又は組織から作られたものであることに注意しなければならない。
核酸配列(配列番号:1)、その相補配列、フラグメント、又はオリゴマー、
及び抗GIPL抗体を、giplの発現のための生物学的サンプルの抽出物又は
体液をアッセイするための診断用組成物として使用することができる。精製ポリ
ヌクレオチド及びポリペプチドは、特定の病
気又は疾病に対する治療の進行中、又は予備的な診断の際の何れかにおいて、g
iplの発現の確認及び定量を行うための各核酸又はタンパク質を用いるアッセ
イにおけるポジティブコントロールとして使用することができる。gipl又は
GIPL(発現vs発現の存在)が僅かに存在することが疾病の存在を意味する
場合もあれば、gipl又はGIPL濃度が予め定められた通常の濃度から乖離
していることから、giplの発現の異常が確認できる場合もある。
中程度のホスホリパーゼ発現が、重要であり得るような病気の中には、敗血症
及びトキシックショック及び壊疽を含むウイルス、バクテリア又は真菌感染症;
限定はされないが貧血症、喘息、全身性エリトマトーデス、及び重症筋無力症等
を含む自己免疫反応;アルツハイマー病、乳癌、糖尿病、骨粗鬆症、及び分裂病
のような遺伝病又は癌性疾患;腎炎;妊娠;リウマチ及び変形性関節炎;強皮症
;及び昆虫に刺されたりヘビに噛まれたりしてホスホリパーゼがその一成分であ
る毒液を注入された状態が含まれる。
GIPL、及びそれをコードする核酸配列の使用は、GIPLとCNFとの間
のシステイン分布に基づくアミノ酸配列の相同性及び構造的相同性に基づいてい
る。ホスホリパーゼ及びGIPLの発現の量及びタイミングは、以前に説明した
条件に関係している。次の3つの状況のそれぞれでは、ホスホリパーゼ発現の濃
度が、GIPL発現より少ないか多いかの何れかである。
ホスホリパーゼは、癌組織と同様通常の組織においても膜の代謝回転において
ある役割を果たす。癌組織に精製GIPLを与えることにより、新生物細胞の転
移及び増殖が干渉される。同様に、腫瘍が発生した患者に精製GIPLを与える
と、腫瘍の増殖を促進する腫瘍における血管形成、血管新生が干渉される。
生殖の研究において、Reponen P等(1995;Dev Dyn 202:388-96)は、胎児の着
床の際の再構築(remodeling)において活性な酵素について述べている。ホスホ
リパーゼは、このプロセスの間の膜の再構築に関与している。従って、組換えG
IPLを、性交の後女性に与えることによりこれらのホスホリパーゼがタイムリ
ーに阻害され、膜の再構築プロセスが阻害されて、効果的に着床や妊娠を防止す
ることができる。
変形性関節炎、慢性関節リウマチ、肺気種、歯周病、全身性エリテマトーデス
、及び骨粗鬆症のような病気や、敗血症やトクシックショックや壊疽のような感
染症のような病気では、アラキドン酸又はジアシルグリセロールの生成や、エイ
コサノイドの形成に寄与するホスホリパーゼの過剰な活性が、炎症、組織破壊、
不能障害、又は死亡をもたらす。GIPLの適切な投与により、ホスホリパーゼ
活性、及びエイコサノイド(例えばLKB4)によりこの継続的な誘発が阻害さ
れて、炎症や損傷を著しく少なくすることができる。同様に、GIPL特異的ア
ゴニストの投与によりGIPLの効果を長時間維持することができる。
精製GIPLは、ホスホリパーゼが活性成分の1つであるような毒液をもつヘ
ビに噛まれたり虫に刺されたりした場合の抗毒素としても投与することができる
。GIPLを含有する医薬品組成物を与えると、毒液の神経毒性、心毒性、筋毒
性、抗凝集血清活性及び血小板活性化活性が失活させられる。
GIPLの抗体
GIPLに対する抗体の生成のために、当分野においてよく知られる手順が用
いられる。このような抗体には、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モノク
ローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fabフラグメント並びにFab発現ライ
ブラリにより生成されるフラグメントが含ま
れる。中和抗体、すなわちGIPLポリペプチドの生物活性を抑制する抗体は、
、特に診断及び治療に好適である。
抗体を産生するために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む種々の宿主は
、免疫学的特性を保持するGIPL或いはその任意の部分、フラグメント或いは
オリゴペプチドを注入することにより免疫することができる。宿主の種に応じて
、種々のアジュバントが免疫学的反応を促進するために用いられる。そのような
アジュバントには、限定はしないが、フロイントのアジュバント、水酸化アルミ
ニウムのような無機質ゲルアジュバント、リゾレシチンのような表面活性物質ア
ジュバント、プルロニックポリオルアジュバント、ポリアニオンアジュバント、
ペプチドアジュバント、油性乳剤アジュバント、キーホールリンペットヘモシニ
アンアジュバント並びにジニトロフェノールアジュバントが含まれる。BCG(
カルメット-ゲラン杆菌)及びコリネバクテリウムパルヴムは役立ち得るヒトア
ジュバントである。
GIPLに対するモノクローナル抗体は、培地中の連続株細胞による抗体分子
の産生を行うための任意の技術を用いて調製される。これらは、限定はしないが
、Koehler及びMilstein(1975,Nature 256:495-497)に当初掲載されたハイブリ
ドーマ技術、ヒトB−細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor等(1983)Immunol Today
4:72、Cote等(1983)Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030)及びEBV−ハイブリ
ドーマ技術(Cote等(1985)Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Alan R
Liss Inc,pp77-96)を含む。
さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための「キメラ
抗体」の生成、即ちヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングのた
めに開発された技術が用いられる(Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci 81:
6851-6855)、Neuberger等(1984)
Nature 312:604-608、Takeda等(1985)Nature 314:452-454)。別法では、一本
鎖抗体の生成のために記載された技術(米国特許第4,946,778号)が、
GIPL特異的一本鎖抗体を生成するために適用される。
また抗体は、リンパ球集団におけるin vivo生成を誘導することにより、或い
はOrlandi等(1989,Proc Natl Acad Sc 186:3833-3837)並びにWinter G及びMil
stein C(1991,Nature 349:293-299)に開示されているような組換え免疫グロブ
リンライブラリー或いは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングする
ことによっても生成することができる。
GIPLに対する特異結合部位を含む抗体フラグメントも生成することができ
る。例えばこのようなフラグメントには、限定はしないが、抗体分子のペプシン
消化により生成することができるF(ab’)2フラグメント及びF(ab’)2
フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるFa
bフラグメントが含まれる。別法では、所望の特異性を有するモノクローナルF
abフラグメントを迅速に、しかも容易に同定できるように、Fab発現ライブ
ラリーが構築される(Huse WD等(1989)Science 256:1275-1281)。
GIPL特異的抗体は、GIPLポリペプチドの発現が関連する状態及び疾患
の診断のために有用である。確立された特異性を有するポリクローナル抗体或い
はモノクローナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射定
量測定法のための種々のプロトコルが当分野ではよく知られている。そのような
イムノアッセイでは、一般に、GIPLとその特異的抗体(或いは類似のGIP
L結合分子)との間の複合体の形成、並びに複合体形成の測定が行われる。特異
的GIPLタンパク質上の2つの非干渉性エピトープに対して反応するモノクロ
ーナル抗
体を利用する二部位モノクローナル用イムノアッセイが好適ではあるが、競合結
合アッセイも用いられる。これらの検査法はMaddox DE等(1983,J Exp Med 158:1
211)に記載されている。
GIPL特異的抗体を用いる診断アッセイ
特定のGIPL抗体は、GIPLの発現の誘発により特性化される病気或いは
疾病の診断や、GIPLで治療された患者のモニタのためのアッセイに役立つ。
GIPLに対する診断アッセイは、ヒトの体液、細胞、組織或いはそのような組
織の切片または抽出物において、GIPLを検出するための抗体或いは標識を利
用する方法を含む。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾がある、なしに拘わ
らず用いることができる。多くの場合、ポリペプチド及び抗体は、共有結合、或
いは非共有結合かのいずれかでそれらをリポーター分子と結合することにより標
識される。種々のリポーター分子が周知となっており、その幾つかについては上
記した。
それぞれのタンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体或いはモノクロー
ナル抗体を用いて、GIPLポリペプチドを測定するための種々のプロトコルが
当分野では周知である。その例として、酵素結合免疫測定法(ELISA)、ラ
ジオイムノアッセイ(RIA)並びに蛍光表示式細胞分取器法(FACS)があ
る。GIPLポリペプチド上の2つの非干渉性エピトープに対して反応するモノ
クローナル抗体を利用する二部位モノクローナル用イムノアッセイは好適ではあ
るが、競合的結合アッセイも用いられる。これらのアッセイは、他にもあるが、
Maddox DE等(1983,I Exp Med 158:1211)に記載されている。
疾病の診断の基礎を提供するために、GIPL発現についての通常値、すなわ
ち標準値が確立されなければならない。これは複合体形成のため
に適切な条件下で、ヒト或いは動物どちらでもよいが、正常の被験者から得られ
る体液或いは細胞抽出物と、GIPLに対する抗体とを結合することにより得る
ことができるが、これは当分野ではよく知られた技術である。標準的な複合体形
成量は、一連のポジティブコントロールの希釈系とそれを比較することにより定
量され、抗体の既知の量が既知の濃度の精製GIPLと結合される。その後正常
サンプルから得られた標準値を、GIPLが関係する障害或いは疾患により潜在
的に影響を受けた被験者からのサンプルから得られた値と比較する。標準値と対
象値との偏差によって疾患状態の存在を確認できる。
薬物スクリーニング
GIPL、その触媒作用性または免疫原性フラグメント或いはオリゴペプチド
は、種々の任意の薬物スクリーニング技術において治療用化合物のスクリーニン
グのために用いることができる。そのような試験において用いられるフラグメン
トは、溶液、固体支持体への付着、細胞表面への付着、或いは細胞内への定着に
おいて制限はない。GIPLと試験される薬剤との間の触媒活性、すなわち結合
複合体形成の低下が測定される。
薬物スクリーニングのための別の方法は、GIPLポリペプチドへの安定的な
結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを可能にするもので
あり、1984年9月13日公告の欧州特許出願第84/03564号(Guysen
)に詳細に記載されている。この文献を本明細書に一体に参照されたい。概要と
しては、多数の別々の小ペプチド試験用化合物をプラスチックピン或いはいくつ
かの他の表面のような、固体基質上で合成する。ポリペプチド試験化合物をGI
PLフラグメントと反応させ、洗浄する。次いで結合GIPLを当分野で周知の
方法に
より検出する。また精製GIPLを前述の薬物スクリーニング技術において使用
するために、プレート上に直接コーティングすることもできる。別法では、ペプ
チドを捕捉し、固形支持体上にペプチドを固定するために非中和抗体を用いる。
また本発明は、GIPLに結合し得る中和抗体特性が、GIPLとの結合につ
いて特に試験化合物と競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの使用も意図
している。このようにして、抗体を用いて1または2以上の抗原性決定基をGI
PLと共通に有する任意のペプチドの存在を検出することができる。
GIPLコード化ポリヌクレオチドの使用
giplポリヌクレオチド、或いはその一部が診断並びにまた治療目的で用い
られる。診断目的の場合、本発明のgiplは、GIPLの発現が関与するバイ
オプシー用に採取された組織における遺伝子発現を検出し、かつ定量するために
用いられる。診断試験は、giplの欠如、存在、及び過剰発現の何れの状態に
あるかを区別したり、治療的介入の際にgipl濃度の調節をモニタリングする
のに役立つ。本発明の範囲には、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスRNA
及びDNA分子、及びPNAが含まれる。
本発明の別の側面は、GIPLまたは近縁な分子をコードする、ゲノム配列を
含むポリヌクレオチド配列を検出できるハイブリダイゼーションプローブ或いは
PCRプローブを提供することである。そして、そのプローブの特異性、すなわ
ち非常に高い保存領域(例えば5’調節領域における10個の独特のヌクレオチ
ド)に由来するのか、或いは低度に保存的な領域(例えば特に3’領域における
システイン残基の間の領域)に由来するのかということや、ハイブリダイゼーシ
ョン或いは増幅の(高
度の、中程度の或いは低度の)厳密性によって、そのプローブが天然giplの
みを同定するものであるか、或いは近縁な配列も同定するものであるかが決まっ
てくる。
診断
GIPLコード化ポリヌクレオチド配列を、GIPLの発現が関与する病気や
疾病の診断や、治療のモニタリング用として使用することができる。例えば、G
IPLをコードするポリヌクレオチド配列を、gipl発現を検出するための生
検から得られた組織や体液の、ハイブリダイゼーションアッセイ或いはPCRア
ッセイにおいて用いることができる。そのような定性的及び定量的方法の形態は
、サザンブロット法或いはノーザンブロット法、ドットブロット法或いは他の膜
用技術、PCR技術、ディップスティック試験法(試験紙法)、ピン或いはチッ
プ技術及びELISA技術を含む。これらの技術は全て、当分野ではよく知られ
ており、実際に市販されている多くの診断キットの基礎となっている。
そのようなアッセイは、特定の治療行為の有効性を評価するために修正され、
動物実験、臨床試験、或いは個々の患者の治療をモニタリングする際に用いるこ
とができる。疾患を診断するための基礎を与えるために、gipl発現に対する
正常な或いは標準的なプロフィールが確立されなければならない。これは、正常
な被験者、すなわち動物或いはヒトから得られる体液或いは細胞抽出物を、ハイ
ブリダイゼーション或いは増幅に適切な条件下で、gipl或いはその一部と結
合することにより達成される。標準的なハイブリダイゼーションの定量は、正常
被験者に対して得られる値と、既知の精製gipl量が用いられる同一の実験に
おけるポジティブコントロール希釈系列で得られる値とを比較することにより定
量することができる。正常なサンプルから得られた標準値は、
gipl発現に関連する障害或いは疾患により潜在的に影響を受けている被験者
からのサンプルから得られる値と比較される。標準値と被験者値との偏差から疾
病の存在が確立される。
疾患が確立された場合は、現存する治療用薬剤が投与され、治療プロファイル
が作成される。最終的にアッセイは、その数値が正常、すなわち標準パターンに
進む、つまり回復しているかを評価するために規則的に繰り返される。継続的な
治療プロファイルを用いて数日間或いは数ヶ月の期間にわたる治療の有効性が示
される。
米国特許第4,683,195、4,800,195並びに4,965,18
8号に記載のあるようなPCR法により、gipl配列に基づくオリゴヌクレオ
チドの追加の使用法が提供される。このようなオリゴマーは一般には化学的に合
成されるが、酵素を用いて発生させたり、或いは組換えソースから生成すること
もできる。一般にオリゴマーは、通常特定の遺伝子或いは状態を同定するために
最適な条件下で用いられる2つのヌクレオチド配列、即ちセンス方向(5’→3
’)のヌクレオチド及びアンチセンス方向(3’←5’)のヌクレオチドからな
る。同一の2つのオリゴマー、入れ子状のオリゴマーの組、或いはオリゴマーの
縮重プールでさえ、近縁なDNAまたはRNA配列の検出や定量のためのより低
い厳密性の条件下であっても用いることができる。
さらに特定の分子の発現を定量するための方法には、放射性標識(radiolabel
ing)(Melby PC等1993 J Immunol Methods 159:235-44)或いはビオチン標識(Du
plaa C等1993 Anal Biochem 229-36)ヌクレオチドの利用、制御核酸の同時増幅
(coamplification)の利用、並びに実験結果を補完して書かれた標準的なグラ
フ曲線の利用が含まれる。多数のサンプルの定量は、ELISA形式のアッセイ
を実行することにより迅速に行うことができ、対象のオリゴマーが様々な希釈溶
液中に現
れ、分光光度分析或いは比色分析反応により迅速に定量することができる。例え
ば、バイオプシー用に採取された組織の抽出物におけるgiplの存在は、癌の
発生を示している。このタイプの確定的診断により、健康の専門家が患者の積極
的治療を開始したり、病状の悪化を防ぐことが可能となる。同様に、当業者に周
知のアッセイを用いて、患者の治療の際に、その病状の進行をモニタリングする
ことができる。
治療
ここに開示するポリヌクレオチドは、自己免疫疾患、遺伝病、及び癌のような
種々の遺伝病や、妊娠や、感染症や、ショックやアナフィラキシーをもたらす蛇
や虫の毒液注入の治療に役立ち得る。例えば、giplを含み、それを発現する
ベクターを与えることにより、分裂病における急激な膜の再構成をもたらすホス
ホリパーゼ活性を緩和する手段を提供する。アンチセンス分子(アンチgipl
)を、脳脊髄液に導入することにより、GIPLの発現を介した遺伝子治療を用
いて、ホスホリパーゼ活性を低下させたり、なくしたりすることができる。
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルスに由来
する発現ベクター、或いは細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の
器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられる。当
業者によく知られた方法は、アンチgiplを発現する組換えベクターを構築す
るために用いることができる。例えばManiatis等(上記)及びAusubel等(上記
)に記載された技術を参照されたい。
完全長cDNA配列、並びにまたその調節エレメントを含むポリヌクレオチド
により、研究者は遺伝子機能のセンス調節(Youssoufian H及びHF Lodish 1993
Mol Cell Biol 13:98-104)、或いはアンチセンス調
節(Eguchi等(1991)Annu Rev Biochem 60:631-652)の調査用のツールとして
giplを用いることができる。このような技術は、現在当分野ではよく知られ
ており、センス或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きなフラ
グメントを、コーディング領域或いは制御領域に沿った様々な位置から設計する
ことができる。
所望の断片を高濃度で発現する発現ベクターを細胞または組織にトランスフェ
クトすることにより、GIPLをコードする遺伝子の機能を停止させることがで
きる。このような作製物は、翻訳不可能なセンス或いはアンチセンス配列ととも
に細胞から溢れ出し得る。DNAへの組み込みがない場合ですら、このようなベ
クターは、全ての複製物が内在性ヌクレアーゼにより分解されるまで、RNA分
子を転写し続ける。このような一過性の発現は、非複製ベクター(Mettler I,p
ersonal communication)でも1ヶ月以上、適当な複製エレメントがベクター系
の一部である場合には更に長い期間継続し得る。
上述のように、giplの制御領域、例えばプロモータ、エンハンサ或いはイ
ントロンに対するアンチセンス分子、DNA、RNAまたはPNAを設計するこ
とにより遺伝子発現を修飾することができる。転写開始部位、例えばリーダー配
列の+10〜−10領域の間に由来するオリゴヌクレオチドが好適である。また
アンチセンス分子は、転写産物がリボソームへの結合するのを防止することによ
り、mRNAの翻訳を阻止するように設計される。同様に、抑制は、「三重らせ
ん」塩基対合法を用いて達成することができる。三重らせん対合は、二重らせん
が、ポリメラーゼ、転写因子、或いは調節分子を結合するべく十分に開かないよ
うにする。三重らせんDNAを用いた最近の治療法は、Gee JEら(Huber BE and
BI Carr(1994) Molecular and Immunologic Approaches,Futura Publishing Co,
Mt Kisco NY)により論評されている。
リボザイムはRNAの特異的切断を触媒することができる酵素性RNA分子で
ある。リボザイムの作用の仕組みでは、相補的標的RNAへのリボザイム分子の
配列特異的ハイブリダイゼーションが行われ、その後エンドヌクレアーゼによる
切断(endonucleolytic cleavage)がなされる。発明の範囲内には、giplの
エンドヌクレアーゼによる切断を、特異的に及び効果的に触媒し得る組換えられ
たハンマーヘッド状モチーフ(hammerhead motif)リボザイム分子も含まれてい
る。
任意の潜在的なRNA標的内の特異的なリボザイム切断部位の最初の同定は、
配列GUA、GUU並びにGUCが後続するリボザイム切断部位に対する標的分
子を走査することにより行われる。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝
子の領域に対応する15〜20個のリボヌクレオチドの間の短いRNA配列は、
そのオリゴヌクレオチドの機能を停止させる2次構造の特徴について評価される
。また候補の標的の適切性の評価は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相
補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に対する接触性を試験すること
により行われる。
本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、RNA分子を合成するのための
当分野で周知の方法により調製することができる。これらの技術には、固相ホス
ホラミダイト(phosphoramidite)化学合成のような化学的合成オリゴヌクレオ
チドの技術が含まれる。別法では、RNA分子を、GIPLをコードするDNA
配列のin vivo及びin vitro転写により生成することができる。このようなDN
A配列は、T7或いはSP6のような適切なRNAポリメラーゼプロモータを有
する多種のベクターに組み込まれる。別法では、構造的に或いは誘導的にアンチ
センスRNAを合成するアンチセンスcDNA構成物が、株細胞、細胞或いは組
織内に導入される。
RNA分子は細胞内安定性を高め及び半減期を長くするために修飾することが
できる。実行可能な修飾には、限定はしないが、その分子の5’並びにまた3’
末端のフランキング配列の付加、或いは分子のバックボーン内にホスホジエステ
ラーゼ連鎖ではなくホスホロチオネート(phosphorothioate)或いは2’O−メ
チルを使用することを含む。このコンセプトは、PNAの産生において固有のも
のであり、内在性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデニン、グア
ニン、シチジン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び
類似の修飾形態とともに、イノシン、クエオシン(queosine)、及びワイブトシ
ン(Wybutosine)のような従来あまり用いられなかった塩基を含めることによっ
て、これら全ての分子に拡張することができる。
細胞或いは組織内にベクターを導入するための方法には、以下に議論される方
法が含まれ、これらの方法は、in vivo、in vitro、及びex vivo治療法に対して
も適切なものである。ex vivo治療法の場合には、患者から採取された幹細胞に
ベクターを導入し、自家移植のためにクローンとして増殖して同じ患者に戻す方
法が、ここで引用されている米国特許第5,399,493号及び第5,437,994号に記載さ
れている。トランスフェクションによる送達、リポソームによる送達は、当分野
でよく知られているものである。
更に、ここに開示するgiplのヌクレオチド配列は、新技術、即ち、限定は
しないが、それがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対合相互作用のような特
性を含む、現在周知のヌクレオチド配列の特性に依存する技術であれば、まだ開
発されていない分子生物学的技術においても用いることができる。
近縁なポリヌクレオチド配列の検出及びマッピング
giplの核酸配列は、天然ゲノム配列のマッピングのためのハイブリダイゼ
ーションプローブを生成するために用いることができる。この配列は、よく知ら
れる技術を用いて、特定の染色体或いはその染色体の特定領域に対してマッピン
グすることができる。このような技術には、拡散させた染色体(chromosomal sp
reads)に対するin situハイブリダイゼーション(Verma等(1988)Human Chrom
osomes:A Manual of Basic Technique,Pergamon Press,New York)、フローソ
ート(flow-sorted)染色体調製法、或いは酵母菌人工染色体(YACs)、細
菌性人工染色体(BACs)、細菌性P1構造体或いはPrice CM(1993;Blood R
ev 7:127-34)及びTrask BJ(1991;Trends Ganet 7:149-54)に概要が示されて
いる単染色体cDNAライブラリのような人工染色体構造が含まれる。
染色体調製物のin situハイブリダイゼーション及び確定された染色体マーカ
ーを用いる連鎖解析のような物理的地図作成技術は、遺伝子地図を延長する際に
大変重要である。ヒトゲノムのSTSに基づく地図の最近の例は、Whitehead-MI
T Center for genomic Reserch(Hudson TJら(1995)Science 270:1945-1954)か
ら最近出版されている。多くの場合、特定のヒト染色体の数或いは腕が知られて
いなくても、マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配置から、関
連する標識を明らかにすることができる。新しい配列は、染色体の腕、或いはそ
の一部への物理的マッピングにより割当てることができる。これは位置クローニ
ング或いは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を調査する研究者に貴重な情
報を提供する。ひとたび毛細血管拡張性運動失調(AT)のような疾患或いは症
候群が、特定のゲノム領域、例えばAT〜11q22−23への遺伝子連鎖によ
り粗く局所化されれば、その領域にマッピングされる任意の配列は、さらなる研
究のための関連する遺伝子、或い
は調節遺伝子を表すことができる(Gatti等(1988)Nature 336:577-580)。本
発明のヌクレオチド配列は、正常者、保菌者或いは感染した個体間の転座、逆位
等による染色体位置の違いを検出するために用いることもできる。
医薬品組成物
本発明は、ヌクレオチド、タンパク質、抗体、アンタゴニスト、またはインヒ
ビターを、単独で、或いは安定化化合物のような少なくとも1つの他の薬剤とと
もに含んでいる医薬品組成物を、その範囲に含む。この医薬品組成物は、任意の
無菌の生体適合性担体に含めて投与されるが、このような担体には、限定はしな
いが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水が含まれる。これらの分子は
、患者に対して、単体で、或いは他の薬品やホルモンと結合して、賦形剤或いは
製薬学的に許容される担体と混合される他の薬品組成物に入れて投与され得る。
本発明の一実施例では、製薬学的に許容される担体とは、製薬学的に不活性なも
のである。
医薬品組成物の投与
医薬品組成物は経口投与、或いは非経口投与される。非経口投与の方法には、
局所的投与、動脈内(腫瘍への直接の)投与、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与
、くも膜下内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与或いは鼻腔内投与が含
まれる。活性成分に加えて、これらの薬品組成物は、薬学的に用いられ得る調合
物内への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び補助剤を含む適切な製薬学的
に許容される担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、“Reming
ton's Pharmaceutical Sciences”(Mack Publishing Co,Easton PA)の最
新版において見出すことができる。
経口投与用の医薬品組成物は、当分野でよく知られる製薬学的に許容される担
体を用いて適切な剤形に製剤される。このような担体により、薬品組成物は、治
療を受ける患者による経口及び鼻腔摂取のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、液
体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤或いは類似の剤形として処方さ
れる。
経口投与するための製薬調製は、活性化合物と固形の賦形剤とを結合すること
によって得ることができるが、所望に応じて、必要なら適切な補助剤を添加した
後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、錠剤或いは糖衣剤核を
得ることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、サクロース、マンニトール或
いはソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク質充填剤、とうもろこ
し、小麦、米、じゃがいも等からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキシプ
ロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのよう
なセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントのようなゴム、並びにゼラチン
或いはコラーゲンのようなタンパク質である。必要ならば、架橋結合したポリビ
ニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸或いはアルギ
ン酸ナトリウムのようなその塩のような、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられる。
糖衣剤核は、濃縮砂糖溶液のような適切な錠皮を与えられるが、溶液はアラビ
アゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤、ポリエチレングリ
コール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混
合物が含み得る。錠剤の識別のため、すなわち活性化合物の量、すなわち投与量
を特徴付けるために染料或いは色素が錠剤或いは糖衣錠皮に加えられてもよい。
経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル
及びゼラチンからなる柔らかい、密封されたカプセル、並びにグリセロール或い
はソルビトールのような錠皮を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース
或いはでんぷんのような充填剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネ
シウムのような潤滑剤、並びに付加的には安定剤と混合された活性処方組成物を
含み得る。柔らかいカプセルでは、活性化合物は、安定剤があるなしにかかわら
ず、脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体
に溶解或いは懸濁される。
非経口投与用の剤形は、水溶性の活性化合物の水溶液を含む。注射用として、
本発明の薬品組成物を水溶液、好適にはハンクの溶液、リンガ一溶液或いは生理
緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液に入れて製剤することができる。
水性の注入懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール
或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を増加する物質が含み得る。更に、活
性成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁剤として調製される。適切な親油性の溶
媒或いは媒介物は、胡麻油のような脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリ
ド或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。また懸濁剤は、所望に
応じて、それにより溶解度を増加し、非常に濃縮された溶液の調製ができるよう
になる適切な安定剤或いは薬剤を含んでもよい。
局所的投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸透剤を用いて調合
が行われる。このような浸透剤は、従来より周知である。
製造と保管
本発明の薬品組成物は周知の方法、例えば従来の混合処理、溶解処理、顆粒化
処理、糖衣形成処理、研和処理、乳化処理、封入処理(entrapping)処理或いは凍
結乾燥処理により製造される。
この医薬品組成物は塩類として提供されることもあり、限定はしないが、塩酸
、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む、多くの酸とともに
形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性或いはプロトニ
ック溶剤において、より可溶性が高くなる傾向がある。他の場合には、好適な製
剤は、1mM〜50mMのヒスチジン、0.1%〜2%のショ糖、使用前に緩衝
剤と結合させたpH範囲4.5〜5.5にある2%〜7%のマンニトールにおけ
る凍結乾燥粉末である。
製薬学的に許容される担体内に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調
製された後、適切な容器内に入れられて、さらに提示した疾病状態の治療のため
にラベル付けされる。GIPLの投与の場合、このようなラベルには、投与の量
、頻度、方法が表示される。
治療上効果的な投与量
本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、活性成分を所望の目的
を達成するに効果的な量だけ含む組成物である。効果的な投与量の決定は、当業
者の能力の範囲内で行うことができる。
任意の化合物の場合、治療的に有効な投与量は、初めに、新生物細胞、或いは
通常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のアッ
セイから推定される。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおいて効果的な
投与量や投与経路を決定することができる。
治療的に有効な投与量とは、疾病状態を寛解するタンパク質、その抗体、アン
タゴニスト、またはインヒビターの量である。そのような化合物の毒性及び治療
有効性は、例えばLD50(個体群の50%の致死投与量)及びED50(個体
群の50%において治療的に有効な投与量、50%有効量)を決定するための、
細胞培地或いは実験動物における標
準的な製薬学的手順により決定することができる。毒性と治療有効性との間の投
与量比は治療指数であり、LD50/ED50の比として表すことができる。大
きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい。これらの細胞培地のアッセイ及び
付加的な動物研究から得られるデータは、ヒトへの使用に対する投与量の範囲を
決める際に用いることができる。そのような化合物の投与量は、毒性がほとんど
或いは全くなく、ED50を達成する循環濃度の範囲内にあることが望ましい。
投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並びに投与経路に応じてこの範囲内で
変化する。
正確な投与量は治療されるべき患者を考慮して個々の医師により選択される。
投与量及び投薬量は、十分なレベルの活性部分を与え、かつ所定の効果を維持す
るために調整される。考慮すべき付加的な要因は、疾患状態の重症度、または患
者の年齢、体重並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感
受性、並びに治療への耐性/反応を含む。長期的に作用する薬品組成物は3〜4
日毎に、1週間毎に、或いは半減期及び特定の処方のクリアランス速度に応じて
2週間に1度、投与してもよい。
通常の投与量は0.1〜100,000μgの範囲にあって、全投与量は最大
約1gであり、投与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは供給の方法に関
するガイダンスは、文献において見出すことができる。米国特許第4,657,
760、5,206,344或いは5,225,212号を参照されたい。当業
者は、ヌクレオチドに対しては、タンパク質やインヒビター用の剤形とは異なる
剤形を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達
は、特定の細胞、状態、位置等によって決まってくる。
例えば、分裂病におけるホスホリパーゼ活性に関係する膜の代謝回転の加速(
Gattaz WFら(1995)Schizophr Res 16:1-6)を止めるため、G
IPLを適切な剤形で送達することができる、ということも企図されている。臨
床的設定では、アラキドン酸、ジアシルグリセロール、またはエイコサノイド濃
度とともに、患者の精神的、情緒的状態を監視することにより、担当外科医が、
医薬品組成物の投与量を調節することができる。同様に、同定されたアゴニスト
の投与により、天然GIPL活性が促進されて、疾病状態からの回復を達成でき
る。
以下に本発明の実施例を示す。但し、以下の実施例は単なる例示であって、本
発明をこの実施例に限定しようとするものではない。
産業上の応用
1 THP1PLB02 cDNAライブラリーの構築
THP−1は明確な単球特性を備えたヒト白血病性株細胞である。この株細胞
は急性単球性白血病(Tsuchiya S et al(1980)Int J Cancer 26:171-176)を
患う一歳の子供の血液に由来するものであった。細胞をDMSOの中で100n
mのホルボールと共に48時間培養し、1μg/mlのLPSと共に4時間培養
した。PMA+LPS刺激細胞は、活性化マクロファージである。このcDNA
ライブラリーはStratagene社(La Jolla CA)によりカスタムメードで構築され
たものであったがその概要を以下に説明する。
Stratagene社はオリゴd(T)をプライマーとして用いてcDNAライブラリ
ーを作成した。cDNA分子に合成アダプタオリゴヌクレオチドをリゲートし、
cDNAがUni-ZAP(商標)ベクターシステム(Stratagene)に挿入され得るよ
うにした。cDNAライブラリの品質は、DNAプローブを用いて選別し、その
後pBluescript(登録商標)ファージミド(Stratagene)を切除した。ライブラ
リファージ粒子を、大腸菌宿主株XL1-Blue(登録商標)(Stratagene)に感染さ
せた。こ
の他の一方向性ベクターには、限定されないがpcDNAI(Invitrogen,San Di
ego CA)やpSHIox-1(Novagen,Madison WI)が含まれる。
2 cDNAクローンの単離
ファージミドに組み込まれた個々のcDNAクローンは、in vivo切除プロセ
スにより得たが、その過程の中で宿主菌株にライブラリファージとf1ヘルパー
ファージの双方を共感染させた。ライブラリ含有ファージと、ヘルパーファージ
の双方に由来するポリペプチド又は酵素はDNAにニックを入れ、標的DNA上
の規定された配列から新たなDNA合成を開始させ、pBluescriptファージミド
及びcDNAインサートの全てのDNA配列を含んだ小型の一本鎖の環状ファー
ジミドDNA分子を作り出した。このファージミドDNAは細胞から放出され、
精製され、新たなSOLR(商標)宿主細胞(Stratagene)に再感染させるのに用い
られた。新たに形質転換された細菌が、アンピシリン含有媒地上で選択され、二
本鎖ファージミドDNAが作り出された。
ファージミドを精製するための別の方法では、ミニプレップキット(Catalog
No.77468,vailable from Advanced Genetic Technologies Corporation,Gaithe
rsburg MD)を用いる。このキットは96穴フォーマットを有し、960回の精
製のための試薬を提供するものである。各キットには推奨プロトコルが含まれて
おり、以下の変更点を除いてその推奨プロトコルを採用した。第1に、96個の
ウェルのそれぞれには、25mg/Lのカルベニンシン及び0.4%のグリセロ
ールと共に滅菌terrific brothの1mlのみを充填する。ウェルへの接種の後、
細菌を24時間培養し、60mlの溶解バッファと共に溶解する。遠心分離過程
(2900rpmで5分間)を実行した後、ブロックの内容物を一次フィルタプ
レートに加える。イソプロパノールをトリスバッファに加え
るオプションのステップは定例的には行わない。プロトコルの最終ステップの後
、サンプルを保管のためBeckman96穴ブロックに移送した。
ファージミドDNAの精製はQIAGEN社(Chatsworth CA)のQUAWELL-8ファスミ
ド精製システムを用いて行っても良い。この高スループットの方法では、細菌細
胞を溶解し、多数のウェル内において、QIAGEN(登録商標)陰イオン交換樹脂粒
子を、EMPORE(商標)メンブランテクノロジー(3M,Minneapolis MN)と共に用
いて高度に精製したファージミドDNAを単離する。このDNAを精製用樹脂か
ら溶出させ、DNAシークエンシングや他の分析的操作のために調整した。
cDNAは、4つのPeltier Thermal Cycler(PTC200;MJ Research社,Watert
own MA)及びApplied Biosystems377或いは373DNA Sequencing Systems(Perkin
Elmer社)と組み合わせて、Applied Biosystems Catalyst 800またはHamilton
Micro Lab 2200(Hamilton社,Reno NV)を用いる、Sanger F及びAR Coulson(19
75;J Mol Biol 94:441f)の方法により配列決定し、読み枠を決定した。
3 cDNAクローン及びそれらの推定タンパク質の相同性検索
Applied Biosystems社で開発された検索アルゴリズムを、INHERIT(商標)670
Sequence Analysis Systemに組み込んで用いて、各cDNAの配列をGenBankの
配列と比較した。このアルゴリズムでは、Pattern Specification Language(TR
W社、LosAngeles CA)を用いて相同な領域を決定した。配列の比較をどのように
行うかを決定する3つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセッ
ト、及び誤差許容度であった。これら3つのパラメータの組を用いて、対象の配
列に対して相同な領域を含む配列をDNAデータベースから検索し、適切な配列
には、初期値とともにスコアが付けられた。これによって、これ
らの相同な領域をドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、相同
な領域と偶然の一致とを区別した。相同性検索の結果は、Smith-Watermanアラ
イメントを用いて表示した。
ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、INHERIT(商標)670配列解析システ
ムをDNA配列の相同性検索で用いたのと同様に用いて確かめた。Pattern Spec
ification Language及びパラメータウインドウを用いて、タンパク質データベー
スから相同性領域を含む配列を検索し、その結果には初期値とともにスコアを付
けられた。ドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、有意な相同
性を有する領域と偶然の一致とを区別した。
BLASTは、Basic Local Alignment Search Tool(Altschul SF(1993)J Mo
l Evol36:290-300;Altschul,SF等(1990)J Mol Biol215:403-10)を表しており、
これを用いて局部的な配列アライメントを検索した。BLASTはヌクレオチド
及びアミノ酸配列の両方のアライメントを生成して配列類似性を求める。そのア
ライメントの局所性のために、BLASTは厳密な一致、すなわちホモログを求
める際に特に有効である。BLASTは間隙を含まない一致を求めるのに役立つ
。BLASTアルゴリズム出力の基本的な単位は、High-scoring Segment Pair
(HSP)である。
HSPは2つの配列フラグメントからなり、両フラグメントは任意ではあるが
、そのアライメントが局所的に最大となっている等しい長さものであり、そのア
ライメントスコアはユーザにより設定された閾値すなわちカットオフスコアを満
足、即ち、カットオフスコアを超えている。BLASTアプローチは問い合わせ
配列とデータベース配列との間のHSPを見つけ出すものであり、見出された任
意の一致の統計的有意性を評価し、そのユーザが設定した有意性の閾値を満足す
る一致のみを報告
するものである。パラメータEはデータベース配列一致を知らせるための統計的
に有意な閾値を確定するパラメータである。Eは全データベース検索の情況にお
いてHSP(或いはHSPの組)の発生の機会の期待される頻度の上側の境界と
して解釈される。その一致がEを満足する任意のデータベース配列がプログラム
出力において報告される。
4 完全長まで、又は調節エレメントを回復するまでのgiplの延長
完全長GIPLの核酸配列(配列番号:1)は、ゲノムライブラリから5’配
列を得るためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いることがで
きる。一方のプライマーはアンチセンス方向(XLR)の延長を開始するために合
成され、他方のプライマーはセンス方向(XLF)に配列を延長するために合成
される。これらのプライマーにより、周知のgipl配列を「外側に」延長し、
対象の制御領域の新しい未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成でき
るようになった。初期プライマーは、Oligo4.0(National Biosciences
社、Plymouth MN)、或いは他の適切なプログラムを用いて、長さが22〜30
ヌクレオチドで50%以上のGC含有率を有し、かつ約68〜72℃の温度で標
的配列にアニールするように設計することができる。結果的にヘアピン構造及び
プライマー−プライマー二量体化を生じる任意のヌクレオチドのストレッチの延
長は避けられる。
5’上流配列を延長し、増幅するためにヒトゲノムライブラリを用いる。必要
なら、既知領域をさらに延長するためにプライマーの第2の組が設計される。
XL−PCRキット(Perkin Elmer社)のための指示に従って、酵素と反応混
合物とを完全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られる。40pmo
lの各プライマと、推奨された濃度のキットの他の
全ての成分とから増幅を開始する場合、PCRはPeltier Therma
l Cycler(PTC200;MJ Reserch社、Watertown MA)を用いて、以
下のパラメータで実行される。
ステップ1 94℃で1分間(初期変性)
ステップ2 65℃で1分間
ステップ3 68℃で6分間
ステップ4 94℃で15秒間
ステップ5 65℃で1分間
ステップ6 68℃で7分間
ステップ7 ステップ4〜6をさらに15サイクル反復
ステップ8 94℃で15秒間
ステップ9 65℃で1分間
ステップ10 68℃で7分15秒間
ステップ11 ステップ8〜10を12サイクル反復
ステップ12 72℃で8分間
ステップ13 4℃(その温度を保持)
反応混合物の5〜10μlのアリコットを、低濃度(約0.6〜0.8%)アガ
ロースミニゲルにおける電気泳動で解析して、反応物が配列を延長することに成
功したか否かを決定する。最も大きな生成物或いはバンドを選択して、ゲルから
切り出した。さらなる精製には、QIAQuick(登録商標)(QIAGEN社)の
ような市販のゲル抽出法を用いる。DNA回収の後、クレノウ酵素を用いて一本
鎖ヌクレオチドの延び出しを切り取り、再結合及びクローニングを容易にする平
滑末端を作った。
エタノール沈殿の後、生成物を13μlのリゲーション緩衝液内に再溶解し、
1μlのT4−DNAリガーゼ(15単位)及び1μlのT4
ポリヌクレオチドキナーゼを加えて、その混合物を、室温で2〜3時間、或いは
16℃で一昼夜インキュベートする。コンピテントなE.coli細胞(40μ
lの適切な溶媒内にある)を、3μlのリゲーション混合物を用いて形質転換し
、80μlのSOC培地(Sembrook J等、上記)で培養する。37℃で1時間の
インキュベーションの後、全ての形質転換混合物を、2xCarbを含むLur
ia Bertani(LB)寒天上にのせる。後日、いくつかのコロニーを各
プレートから無作為に選択し、適切な市販の無菌の96穴マイクロタイタープレ
ートの個々のウェル内に入れられた150μlの液状LB/2xCarb培地で
培養する。さらに後日、5μlの各オーバーナイト培養物を非無菌96穴プレー
ト内に移し、水で1:10に希釈した後、各5μlのサンプルをPCRアレイ内
に移す。
PCR増幅の場合、rTthDNAポリメラーゼの4単位を含む18μlの濃
縮PCR反応混合物(3.3x)、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い
られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以
下の条件に従って行う。
ステップ1 94℃で60秒間
ステップ2 94℃で20秒間
ステップ3 55℃で30秒間
ステップ4 72℃で90秒間
ステップ5 ステップ2〜4をさらに29サイクル反復
ステップ6 72℃で180秒間
ステップ7 4℃(そのまま保持)
PCR反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動
させる。PCR生成物のサイズを元の部分的なcDNAと比較して、適切なクロ
ーンを選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行
う。
5 ハイブリダイゼーションプローブの標識
配列番号:1の配列に由来するハイブリダイゼーションプローブは、cDNA
、mRNA並びにゲノムDNAをスクリーニングするために用いられる。約20
の塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、大きなcDN
Aフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、50
pmolの各オリゴマと、250mCiの[γ-32P]アデノシン三リン酸(Amers
ham社,Chicago IL)及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN(商標)
、Boston MA)とを組み合わせて用いてラベルする。標識されたオリゴヌクレオ
チドを、SephadexG−25超精細樹脂カラム(Pharmacia社)を用いて
精製する。それぞれ毎分107カウントを含む各部分を、以下のエンドヌクレア
ーゼ(AseI,BgIII,EcoRI,PstI,Xba1或いはPvuI
I;DuPont NEN(商標))の1つを用いて消化されるヒトゲノムDNAの典型的
な膜ハイブリダイゼーション解析において用いる。
各消化物からのDNAを、0.7%アガロースゲル上で分画化して、ナイロン
膜(Nytran Plus,Schleicher&Schuell,Durham NH)に移す。ハイブリダイゼーシ
ョンは40℃で16時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くために、ブロ
ットは、0.1xクエン酸ナトリウム食塩水及び0.5%ドデシル硫酸ナトリウ
ムまで段階的に厳密性が増す条件下で、室温にて順次洗浄される。XOMAT
AR(登録商標)フィルム(Kodak,Rochester NY)を、数時間かけてPhosphoima
ger cassette(Molecular Dynamics,Sunnyvale CA)においてブロットに露光さ
れた後、ハイブリダイゼーションパターンが視覚的に比較される。
6 アンチセンス分子
gipl配列或いはその任意の一部は、天然giplのin vivo発現を抑制す
るために用られ得るアンチセンス分子の設計のための基礎となる。約20塩基対
からなるアンチセンスオリゴマーの使用について特に記すが、大きなcDNAフ
ラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いることができる。giplのコード化
配列または非翻訳リーダー配列に基づく相補的なオリゴヌクレオチドを用いて、
天然giplの発現を抑制することができる。この相補的なオリゴヌクレオチド
は、プロモーターか結合するのを防ぐことにより転写を抑制したり、リボソーム
が転写物に結合するのを防ぐことによりgipl転写物の翻訳を抑制するように
設計される。
7 GIPLの発現
GIPLの発現は、cDNAを適切なベクター内にサブクローニングし、その
ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって行われる。クローニン
グ用のpBluescriptベクターを、E.coli株であるXL1-BlueMRF(商標)(St
ratagene)においてGIPLを発現するのに用いる。クローニング部位の上流に
は、β−ガラクトシダーゼに対するプロモータが存在し、その後ろにはアミノ基
末端メチオニン及びβ−ガラクトシダーゼの7残基が存在する。直後に続くこれ
ら8つの残基は、転写に役立つバクテリオファージプロモーターであり、多くの
一義的な切断部位を含むリンカーである。
標準的な方法を用いた、IPTGによる単離されたトランスフェクト菌株の誘
導により、初めのβガラクトシダーゼの7残基、約5〜15残基のリンカー、及
び完全長GIPLからなる融合タンパク質を産生する。
このシグナル配列は、後の行う活性のアッセイにおいて直接用いることができる
菌培地へのGIPLの分泌を誘導する。
8 GIPL活性
GIPL活性の定量に、赤血球膜アッセイを用いることができる。赤血球と種
々のホスホリパーゼを、リン脂質膜の消化に適切な条件の下で、適切な培養液に
入れてエッペンドルフ型管に入れる。約1時間経過後、サンプルを取出して、高
速液体クロマトグラフィー(HPLC)を用いてアラキドン酸及びジアシルグリ
セロールの存在を解析する。HPLCの結果対照標準の組が得られ、これに対し
てGIPL含有実験用セットが比較される。実験用セットでは、赤血球をホスホ
リパーゼ及びGIPLとともにインキュベートする。ここに開示するGIPLに
よるホスホリパーゼの効果的な阻害は、実験用の管の培養液におけるアラキドン
酸やジアシルグリセロールの濃度の低下(または欠如)として現れる。
9 GIPL特異的抗体の産生
標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化には、PAGE電気泳動法(Mani
atis前出)を用いて精製されたGIPLを用いるが、モノクローナル法の方が一
般的に利用される。GIPLから翻訳されたアミノ酸配列をDNAStarソフ
トウエア(DNASTAR社)を用いて解析して免疫抗原性の高い領域を決定し、対応
するオリゴペプチドを当業者には周知の手段により合成して、当業者に周知の方
法で抗体をを産生するために用いる。C末端付近の、或いは隣接する親水性領域
内のエピトープのような、適切なエピトープを選択するための解析法は、Ausube
l FM等(上記)の論文に記載されている。
通常、約15残基の長さを有するオリゴペプチドを、fmoc−ch
emistryを用いるApplied Biosystemsのペプチドシン
セサイザーModel 431Aを用いて合成し、M−マレイミドベンゾイル−
N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS:Ausubel FM等、上記)を用い
た反応によりキーホールリンペットヘモシニアン(KLH、Sigma)に結合する
。フロイントの完全アジュバントにおけるオリゴペプチド−KLH複合体を用い
てウサギを免疫する。得られた抗血清の抗ペプチド活性を検査するには、例えば
ペプチドをプラスチックに結合し、1%BSAを用いてブロックし、ウサギ抗血
清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギIgGに反
応させる。
10 特異的抗体を用いる天然GIPLの精製
天然GIPL或いは組換えGIPLは、GIPLに対する特異的な抗体を用い
るイムノアフィニティークロマトグラフィにより精製することができる。イムノ
アフィニティーカラムは、CnBr活性化Sepharose(Pharmacia Biot
ech社)のような活性化クロマトグラフ樹脂とGIPL抗体とを共有結合させる
ことにより構成される。結合後、その樹脂を製造者の指示に従って、ブロックし
洗浄する。
GIPLを含む培地をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをGI
PLを優先的に吸収できる条件下で(例えば界面活性剤の存在下において高イオ
ン強度緩衝剤で)洗浄する。このカラムを、抗体/GIPL結合を切るような条
件下(例えばpH2〜3の緩衝剤、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イ
オンのようなカオトロピックイオン)で溶離させ、GIPLを回収する。
11 GIPLと相互作用する分子の同定
GIPL、或いはその生物学的に活性なフラグメントを、125I ボルトンハ
ンター試薬を用いて標識する(Bolton,AE及びHunter,WM(1973)Biochem J 133:
529)。96穴プレートのウェル内に前に入れておいた候補分子を、標識したG
IPLとともに培養し、洗浄し、標識したGIPL複合体を有する任意のウェル
をアッセイする。異なる濃度のGIPLを用いて得られるデータを用いて、候補
分子とGIPLとの会合の数、アフィニティー並びに会合度の値を計算する。
上記のすべての刊行物及び特許明細書は、本明細書と一体に参照されたい。本
発明の記載した方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は、本発明の範囲及
び精神から逸脱しないことは当業者には明らかであろう。本発明は特に好適な実
施例に関連して記載されているが、本発明の請求の範囲は、そのような特定の実
施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際には、本発明を
実施するために記載された方法の種々の変更例は、分子生物学或いは関連する分
野の当業者には明らかなように、以下の請求項の範囲内に含まれるものである。
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(51)Int.Cl.7 識別記号 FI テーマコート゛(参考)
A61P 25/28 C12N 1/15
C07K 16/18 1/19
C12N 1/15 1/21
1/19 9/99
1/21 C12Q 1/68 A
5/10 G01N 33/53 D
9/99 C12N 15/00 ZNAA
C12Q 1/68 5/00 A
G01N 33/53 A61K 37/02
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,DE,
DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,IT,L
U,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ,CF
,CG,CI,CM,GA,GN,ML,MR,NE,
SN,TD,TG),AP(GH,KE,LS,MW,S
D,SZ,UG),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ
,MD,RU,TJ,TM),AT,AU,BR,CA
,CH,CN,DE,DK,ES,FI,GB,IL,
JP,KZ,MX,NO,NZ,RU,SE,SG,U
S