JP2001501823A - 疾病関連プロテインチロシンホスファターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト・プロテインチロシンホスファターゼ（ＨＰＴＰ）、及びＨＰＴＰを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明は、ＨＰＴＰをコードする核酸配列を含む遺伝子組換え発現ベクター及び宿主細胞、及びＨＰＴＰの生成方法を提供する。本発明はまた、ＨＰＴＰを含む医薬品組成物又はＨＰＴＰのアンタゴニスト、及びＨＰＴＰに特異的に結合する抗体も提供する。更に、本発明は、ＨＰＴＰの異常発現が関係する疾病の治療又は予防のための、ＨＰＴＰのアンチセンス分子を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 疾病関連プロテインチロシンホスファターゼ技術分野 本発明は、２つの新規な疾病関連プロテインチロシンホスファターゼの核酸及 びアミノ酸配列、及び疾病の診断、研究、予防、及び治療におけるこれらの配列 の使用に関すものである。背景技術 ホスファターゼは、キナーゼにより活性化済みの分子からリン酸基を取り除き 、細胞の増殖及び分化、細胞間接触、細胞周期及び発癌を調節する多くの細胞シ グナル伝達を制御する。タンパク質のリン酸化は、真核細胞の活性を調節するた めに用いられる広く存在するストラテジーである。典型的な哺乳類細胞において 活性な１００００のタンパク質のうち１０００以上がリン酸化されると推定され ている。活性化を与える高エネルギーリン酸塩は、プロテインキナーゼによりア デノシン酸リン酸分子からタンパク質に移り、次にプロテインホスファターゼに よってタンパク質から取り除かれる。 ３つの進化的に区別できるプロテインホスファターゼ遺伝子ファミリーが存在 するようである（Carbonneau H及びTonks NK(1992),Annu Rev Cell Biol 8:463- 93）。それは、プロテインホスファターゼ（ＰＰ）、プロテインチロシンホスフ ァターゼ（ＰＴＰ）、及び酸性／アルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ）である。Ａ Ｐ群はin vitroで基質を脱リン酸化するが、in vivoでのその役割はよく分かっ ていない。 ＰＴＰ群は、特定の型のタンパク質上の選択されたホスホチロシンのみからリ ン酸基を取り除く。これを行う際、ＰＴＰ群はプロテインチロシンキナーゼ（Ｐ ＴＫ）の効果を逆転させ、従って細胞周期及び細胞シグナル伝達プロセスにおい て重要な役割を果たしている。ＰＴＰ群はそ れらのＰＴＫ対応物と比較して高い特異的酵素活性を有しており、従ってチロシ ンリン酸化が非常に短時間しか持続せず、休止細胞において殆ど見られなくなる ことを確実にする。多くのＰＴＫは、オンコジーンによってコードされ、発癌は チロシンリン酸化が高まることによって生ずることが多いということがよく知ら れている。従って、ＰＴＰが、細胞におけるチロシンリン酸化のレベルを制御す ることによって細胞形質転換及び種々の癌の増殖を防止又は逆転させる役目を果 たし得るということが言える。このことは、ＰＴＰの過剰発現が細胞における形 質転換を抑制し得、逆にＰＴＰの特異的阻害によって細胞形質転換を高進し得る ということを示す研究によっても支持されている。 ＰＴＰには、膜貫通形態、受容体様非膜貫通形態、非受容体形態が見られ、多 様なサイズ（２０ｋＤａから１００ｋＤａ以上）及び多様な構造を有している。 全てのＰＴＰは触媒作用性ドメインを表し、カルボキシ末端の近傍に共通の配列 VHCXAGXXRを含む２４０個の残基の領域内における相同性を共有している。多様 な構造的モチーフと触媒作用性ドメインの組み合わせが、これらの酵素の多様性 及び特異性の原因である。非受容体アイソフォームでは、非触媒作用性配列も、 異なる調節機序及び標的ＰＴＰを、種々の細胞内区画に与え得る。 受容体様ＰＴＰ群（Ｒ−ＰＴＰ群）は、一般に大形で（１００ｋＤａ以上）、 原形質の尾部内部の１つの膜貫通セグメント及び２つの直列ＰＴＰドメインに基 づいて分類される。これらの分子の内部細胞質ドメイン内の類似性とは対照的に 、細胞外セグメントの中には著しい多様性が見られる。このタイプのＰＴＰの重 要な例はＣＤ４５であり、このＣＤ４５は白血球の表面上で見いだされ、細胞外 抗体及びＬＡＲによって活性化されたときＴ細胞及びＢ細胞を活性化する助けと なり、かつその細胞外ドメイン上の細胞接着分子のＮ−ＣＡＭファミリーに近縁 な構造的 特徴を有し、細胞接着プロセスに関与し得るＰＴＰである。 非受容体ＰＴＰ（ＮＲ−ＰＴＰ）は、Ｒ−ＰＴＰより一般に小形（約５０ｋＤ ａ）で、Ｎ末端又はＣ末端の何れかに可変長の非触媒作用性配列及び１個の触媒 作用性ドメインを有する。ＮＲ−ＰＴＰは、細胞内にあり、その非触媒性配列を 用いてそれらを特定の細胞下の区画に誘導するか、若しくはそれらの酵素調節活 性を決定し得る。ＮＲ−ＰＴＰの中にはそれらの非触媒性ドメインにおける類似 性に基づいてサブファミリーに分けられ得るものもある。例えば、ヒトＰＴＰＨ １及びＭＥＧ０１は、相同な触媒作用性ドメイン及びバンド４．１、タリン及び エズリンと相同なＮ末端セグメントを有する。更に、それらはアクチンストレス ファイバーと原形質膜との間に局在化し、そこで細胞骨格の動態を調節している と考えられる。Ｔ細胞のＰＴＰ及びＰＴＰ１βは、それらの触媒作用性ドメイン において高度な類似性を示し、また、酵素活性を調節する場である膜にそれらを 誘導する助けとなり得るそのＣ末端非触媒性ドメインにおいて構造的類似性を示 す。 最近、１つの触媒作用性ドメインを有する、小形の（約２０ｋＤａ）のＮＲ− ＰＴＰの新たなクラスが発見された。そのなかでラットの肝臓及び肝臓癌細胞の 再生において見出されたものはＰＲＬ−１と表記され、ヒト卵巣組織において見 いだされたものは、ＯＶ−１と表記される（Diamond RH,等（1994）Mol Cell Bi ol 14:3752-62;Montagna M等(1995)Hum Genet 96:532-538）。これらのＰＴＰ群 は、その触媒作用性部位の領域内においてのみ他のＮＲ−ＰＴＰと相同性を有す る。ＰＲＬ−１を過剰発現する、安定的にトランスフェクトされた細胞は、細胞 増殖及び形態及び質転換された表現形の変化を示す。更に、正常な細胞増殖の調 節及び腫瘍形成能の発達においてＰＲＬ−１が重要であることが推定される。 ＰＴＰが細胞増殖の正の制御因子又は負の制御因子の何れかとしての役目を果 たし得ること、またシグナル伝達経路におけるホスファターゼの相互作用のより 詳細な理解によって、癌の進行、炎症性疾患の進行、又は発癌における臨床的診 断又は治療的介入のための手段となる多くの潜在する仕組みが明らかになること は明白である。新たなＰＴＰの発見によって、ＨＰＴＰ−１関連疾患の予防又は 治療に役立つ薬剤が提供され当技術分野での必要性を満たし得ることになる。発明の開示 本発明は、２つの新規な疾病関連プロテインチロシンホスファターゼ（以下Ｈ ＰＴＰ−１及びＨＰＴＰ−２と表記し、集合的にＨＰＴＰと表記する）を開示す る。これら２つのタンパク質は、細胞増殖の調節に関与する２つの非膜貫通ＰＴ Ｐと共通の特徴を有している。従って、本発明は、配列番号：１及び配列番号： ３のアミノ酸配列に示すような、実質的に精製されたＨＰＴＰを提供する。本発 明はまた、ＨＰＴＰの生成方法も提供する。 本発明のある対応は、ＨＰＴＰをコードする単離され、実質的に精製されたポ リヌクレオチドを提供する。特定の対応では、このポリヌクレオチドは、配列番 号：２及び配列番号：４のヌクレオチド配列である。更に、本発明は配列番号： ２及び４の配列と厳密な条件の下でハイブリッド形成するポリヌクレオチド配列 を提供する。 本発明は更にＨＰＴＰをコードする核酸配列、オリゴヌクレオチド、ペプチド 核酸、その断片、一部分、又はアンチセンス分子にも関連する。本発明はまた、 ＨＰＴＰをコードする核酸配列を含む発現ベクターにも関連し、これは宿主細胞 又は生物体を形質転換するのに用いることができる。本発明はまた、癌細胞又は 組織の増殖を防止するための、治療的な細胞の形質転換のための類似なベクター の使用も提供する。 本発明はまた、ＨＰＴＰに特異的に結合する抗体にも関連する。図面の簡単な説明 第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図は、MacDNAsisソフトウエア（Hitachi Sof tware Engineering Co Ltd,San Bruno CA)を用いて作製した、本発明の新規なＨ ＰＴＰ−１のアミノ酸配列（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）を示 す図である。 第２Ａ図、第２Ｂ図、及び第２Ｃ図は、同様に、本発明の新規なＨＰＴＰ−２ のアミノ酸配列（配列番号：３）及び核酸配列（配列番号：４）を示す図である 。 第３Ａ図、第３Ｂ図、及び第３Ｃ図は、LIFESEQ^TMデータベース（Incyte Phar maceuticals,Palo Alto CA）を用いて電子的に作製したコンセンサスヌクレオチ ド配列（配列番号：２）のノーザン解析の結果を示す図である。 第４図は、同様に、コンセンサスヌクレオチド配列（配列番号：４）のノーザ ン解析の結果を示す図である。 第５図は、ＨＰＴＰ−１（配列番号：１）、ＨＰＴＰ−２（配列番号：３）、 GI 894159ヒトＰＴＰ、ＯＶ−１（配列番号：５）及びGI 530162ラットのＰＴＰ 、ＰＲＬ−１（配列番号：６）（Diamond等，前出；Montagna等，前出）の間の アミノ酸配列アライメントを示した図である。配列のアライメントは、DNAStar^{T M} ソフトウエア（DNAStar Inc，Madison WI）のマルチシーケンスアライメントプ ログラムを用いて作製した。発明の実施の形態 定義 本明細書において「核酸配列」とは、一本鎖か二本鎖の、センス鎖又はアンチ センス鎖である、ゲノムの又は合成起源のＤＮＡ、ＲＮＡや、 オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びその断片又は 一部分を意味する。同様に、本明細書において「アミノ酸配列」とは、ペプチド 若しくはタンパク質配列を意味する。 本明細書において「コンセンサス」とは、（１）再度シークエンシングされて 不要な塩基が分離された核酸配列か、（２）XL-PCR（Perkin Elmer）を用いて５ ’方向または３’方向に延長されて、再度シークエンシングされた核酸配列か、 （３）GCGフラグメントアセンブリシステム（GCG,Madison WI）を用いて２以上 のインサイト社クローンの重複した配列を元に組み合わせて構成された核酸配列 か、若しくは（４）延長と組み合わせの双方によって形成された核酸配列の何れ かを意味する。 本明細書において「ペプチド核酸」とは、リジンのようなアミノ酸残基及びア ミノ基が加えられたオリゴマーを含む分子を意味する。これらの小分子は、抗遺 伝子剤とも称され、それらに対して相補的な核酸の（鋳型の）鎖に結合すること により転写物の伸長を停止させる（Nielsen PE等(1993)Anticancer Drug Des 8: 53-63）。 本明細書において「欠失」とは、１または２以上のヌクレオチド若しくはアミ ノ酸残基が欠ける、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化として定 義される。 本明細書において「挿入」或いは「付加」とは、自然発生のＨＰＴＰと比較し て、それぞれ１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ酸残基が加わるような 、ヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。 本明細書において「置換」とは、それぞれ１または２以上のヌクレオチド或い はアミノ酸を、異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置換することによって生ず る変化を指す。 本明細書で用いられるとき、ＨＰＴＰとは、任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブ タ、マウス、ウマ、及び好ましくはヒトを含む哺乳類に由来す る、天然の、合成の、半合成の、又は組換え体を起源とする実質的に精製された ＨＰＴＰのアミノ酸配列を童味する。 ＨＰＴＰの「変異体」は、１又は２箇所以上のアミノ酸が異なっているアミノ 酸配列として定義される。この変異体は「保存的」変化を含むものであり得、こ の保存的変化においては例えばロイシンをイソロイシンで置き換える場合のよう に置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性を有する。稀に、変異体が 「非保存的」に変化する場合もあり、この非保存的変化では例えばグリシンがト リプトファンで置換される。類似した小変化には、アミノ酸の欠失か挿入、若し くはその両方も含まれ得る。例えばDNAStarソフトウエアのような良く知られた コンピュータプログラム、を用いて、生物学的或いは免疫学的活性を損なわずに 置換、挿入、又は除去できるアミノ酸が何れかということ、及びそのようなアミ ノ酸がいくつかということを決定することができる。 用語「生物学的に活性」とは、自然発生のＨＰＴＰの構造的機能、調節機能、 又は生化学的機能を有するＨＰＴＰを意味する。同様に「免疫学的に活性」とは 、天然の、組換え体の、又は合成のＨＰＴＰ、若しくはその任意のオリゴペプチ ドが適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体に結合する 能力として定義される。 本明細書において、「誘導体」なる用語は、化学的に修飾されたＨＰＴＰをコ ードする核酸、又はそのコードされたＨＰＴＰを意味する。このような修飾の例 には、水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換がある。核酸誘導 体は、未修飾ＨＰＴＰの必須の生物学的特性を保持しているポリペプチドをコー ドする。 本明細書において、「実質的に精製」なる用語は、この天然の環境から取り除 かれ、天然にはそれが結合して存在する他の成分から単離又は分離されて、その 成分が少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、 最も好ましくは少なくとも９０％取り除かれた核酸配列又はアミノ酸配列を有す る分子を意味する。 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション(ハイブリッド形成)」は「核 酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する過程」(Coombs J（1994）Dictionary of Biotechnology ,Stockton Press社,New York)を含む概念である。増幅とは、 核酸配列の複製を作り出すこととして定義され、通常周知のポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）法により実行される（Dieffenbach CW及びGS Dveksler(1995),PCR Primer.a Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Press社,New york）。 「厳密性」とは、典型的には、約Ｔｍ−５℃（プローブのＴｍより５℃下）か らＴｍの約２０〜２５℃下の範囲で発生する。当業者には理解できるように、厳 密なハイブリダイゼーションでは、同一のポリヌクレオチド配列を同定、つまり 検出するため、或いは類似の、即ち近縁なポリヌクレオチド配列を同定、つまり 検出するために用いることができる。好適実施例 本発明は、骨格筋組織から作製されたライブラリー（ＨＰＴＰ−１の場合）及 び胃腫瘍組織から作製されたライブラリー（ＨＰＴＰ−２の場合）からのｃＤＮ Ａの中から同定された新規なヒト・プロテインチロシンホスファターゼ（ＨＰＴ Ｐ）、及び疾病の研究、診断、予防、及び治療におけるこの核酸及びアミノ酸配 列の使用に関するものである。 ここに開示するコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号：２）は、以下のイ ンサイト社クローンを伸長し構築したものであった。そのインサイト社クローン は、Ｎｏ．121894（MUSCNOTO 1）、352438（LVENNOT01）、383710（HYPONOB01） 、459667（KERANOT01）、479994(LIVRBCT01)、646834(BRSTTUT02)、716720(PROS TUT01)、900738（BRSTTUT03）、911770（STOMNOT02）、1373206 （BSTMNONO02）、及び1443250（THYRNOT03）である。 ここに開示するコンセンサスヌクレオチド配列（配列番号：４）は、以下のイ ンサイト社クローンを伸長し構築したものであった。そのインサイト社クローン は、Ｎｏ．490222（HNT2AGT01）、504976（TMLR3DT02）、534687（LVENNOT02） 、540462（LNODNOT02）、646402(BRSTTUT02)、889096(STOMTUT01)、945318(RATR NOT02)、1261554（SYNORAT05）、及び1263105（SYNORAT05）である。 第３Ａ図、第３Ｂ図、及び第３Ｃ図に示すように、ＨＰＴＰ−１の一部をコー ドするｃＤＮＡは、卵巣、心臓、小腸、前立腺、膀胱、脳、及び甲状腺の腫瘍を 含む種々の腫瘍組織において見いだされた。そのｃＤＮＡはまた、マクロファー ジ、リンパ球、及び顆粒球を含む免疫系又は体防衛に関与する種々の細胞及び組 織においても見いだされた。同様に、第４図に示すのは、ＨＰＴＰ−２の一部を コードするｃＤＮＡが、脳、胃、乳房、及び前立腺の腫瘍を含む種々の腫瘍組織 、リウマチ様組織、及びリンパ球においても見いだされたということである。Ｈ ＰＴＰの自然発生の発現は、これらの細胞及び組織に限定されるものではないと いうことに注意しなければならない。 本発明は、ＦＩＰＴＰの変異体もその範囲に含む。好適なＨＰＴＰ変異体は、 アミノ酸配列（配列番号：１）と少なくとも８０％のアミノ酸配列類似性を有す るものであり、より好適なＨＰＴＰ変異体は配列番号：１及び配列番号：３の配 列と少なくとも９０％のアミノ酸配列類似性を有するものであり、最も好適なＨ ＰＴＰ変異体は配列番号：１及び配列番号：３の配列と少なくとも９５％のアミ ノ酸配列類似性を有するものである。 本発明のＨＰＴＰ−１の一部をコードする核酸は、アミノ酸配列アライメント のコンピュータ検索によって、ｃＤＮＡ、インサイト社クロー ンＮｏ．121894（配列番号：２）において初めに同定された。同様に、ＨＰＴＰ −２の一部をコードする核酸は、インサイト社クローンＮｏ．889096において初 めに同定された。配列番号：２の核酸配列は、１７０個のアミノ酸からなる配列 番号：１のアミノ酸配列をコードし、配列番号：４の核酸配列は、１７３個のア ミノ酸からなる配列番号：３のアミノ酸配列をコードする。本発明は、ＨＰＴＰ −１、ＨＰＴＰ−２及び既知のＰＴＰであるラットのＰＲＬ−１（GI 530162； 配列番号：６）及びヒトのＯＶ−１（GI 889096；配列番号：５）の間の化学的 及び構造的相同性に部分的に基づく。第５図に示すのは、この４分子の中の近縁 な配列の同一性である。特に、ＰＴＰの全てのクラスに共通なモチーフVHCVAGLG Rは、ＨＰＴＰ−１の残基Ｖ(99)から始まっていることが分かっており、その後 の１１個の残基と共に全ての４つの分子において同一である。また、これら４つ のＰＴＰの全てのカルボキシ末端は、他のＰＴＰと共通な残基Ｒ(131)、Ｑ(142) 、及びＬ(143)を含んでいる（Diamond等，前出参照）。 ＨＰＴＰコーディング配列 ＨＰＴＰの伸長し構築された核酸配列及び推定アミノ酸配列は第１Ａ図、第１ Ｂ図、及び第１Ｃ図、及び第２Ａ図、第２Ｂ図、及び第２Ｃ図に示されている。 本発明によれば、ＨＰＴＰをコードする任意の核酸配列を用いて、ＨＰＴＰを発 現する組換え体分子をつくり出すことができる。ここに開示する特定の実施例で は、ＨＰＴＰ−１をコードする部分的配列は、骨格筋ｃＤＮＡライブラリー（MU SCNOTO １）等のインサイト社クローンＮｏ．121894として初めに単離され、Ｈ ＰＴＰ−２の場合は、胃腫瘍ライブラリー（STOMTUTO1）からのインサイト社ク ローンＮＯ．889096として初めに単離された。 遺伝暗号の縮重の結果、既知の又は自然発生の遺伝子のヌクレオチド 配列に対して最小限の相同性しか有していないものも含む、多種のＨＰＴＰコー ディングヌクレオチド配列が作り出され得る、ということは当業者には明らかで あろう。本発明は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することにより なされ得る、全ての可能な核酸配列の変化をその範囲に含んでいる。それらの組 み合わせは、自然発生のＨＰＴＰのヌクレオチド配列に当てはまる標準的なトリ プレット遺伝暗号に基づいて作り出されるものであり、このような全ての変異は 、ここに具体的に示されたものと考えられたい。 ＨＰＴＰ及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は適切に選択された厳 密性の条件の下で、自然発生配列のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能な ものであるのが好ましいが、実質的に異なるコドン使用を有するＨＰＴＰ又はそ の変異体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。コド ン選択は、特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従って、特定の原核細 胞の、或いは真核細胞の発現宿主においてペプチドが発現する速度を高めるよう に選択することができる。ＨＰＴＰ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配 列を、コードされるアミノ酸配列を変えることなく実質的に変更する理由は、例 えば自然発生配列から作り出される転写物より長い半減期のような、より望まし い特性を有するＲＮＡ転写物を作り出すためである。 ＨＰＴＰ又はその誘導体をコードするＤＮＡ配列、若しくはその一部分を、完 全に合成ケミストリにより作製して、その後その合成遺伝子を、任意の入手可能 なＤＮＡベクター及び細胞系に、この出願時点において周知の試薬を用いて挿入 することができる。更に、合成ケミストリを用いてＨＰＴＰをコードする配列又 はその任意の一部分に突然変異を誘発させることができる。 また本発明の範囲に含まれるものとして、種々の厳密性の条件の下で 配列番号：２又は配列番号：４のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なポ リヌクレオチド配列がある。ハイブリダイゼーション条件は、本明細書と一体に 引用されているBerger及びKimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Technique s,Methods in Enzymology ,Vol 152,Academic Press,San Diego CA)に記載されて いるように、核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）と、プロセスが 行われる環境の塩濃度とに基づいている。 本発明において用いられ得るＨＰＴＰをコードする変異核酸配列は、異なるヌ クレオチド残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に同一の、または機能的 に等価のＨＰＴＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとなるものである 。そのタンパク質も、サイレント変化を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに 置換を含み、結果的に機能的に等価なＨＰＴＰとなる。慎重な（deliberate）ア ミノ酸置換は、ＨＰＴＰの生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性 、電荷、溶解度、疎水性、親水性並びにまた両親媒性についての類似性に基づい てなされ得る。例えば負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン 酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、近い親 水性値を持つ荷電していない極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロ イシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、ス レオニン、フエニルアラニン並びにチロシンが含まれる。 本発明の範囲に含まれるものとして、ＨＰＴＰのアレルがある。ここで用いる 「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＨＰＴＰの別形態である。アレルは変異 、すなわち核酸配列の変化によって生じ、一般に変化したｍＲＮＡ或いはポリペ プチドを生成するが、そのｍＲＮＡ或いはポリペプチドの構造或いは機能は変わ る場合もあれば、変わらない場合も ある。遺伝子によっては、アレル形態が存在しないもの、１つ存在するもの、或 いは多数存在するものがある。一般にアレルを生じる変異はアミノ酸の自然な欠 失、付加並びに置換に起因する。このタイプの変化はそれぞれ単独で、或いは他 の変化と同時に、与えられた配列内の１又は２箇所以上の位置で生じ得る。 ＤＮＡ配列決定のための方法は周知であり、例えばＤＮＡポリメラーゼI,Sequ enase(商標)のクレノウ断片(US Biochemical社,Cleveland OH)、Taqポリメラー ゼ（Perkin Elmer社,Norwalk CT）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham社,Chic ago IL）、或いはGibco BRL(Gaithersburg MD)Methods社から市販されているELO NGASE増幅システムのような組換えポリメラーゼとプルーフリーディングエキソ ヌクレアーゼとの組み合わせのような酵素を使用する。この処理は、Hamilton M icro Lab2200（Hamilton社,Reno NV）、Peltier Thermal Cycler(PTC200；MJ Re serch社,Watertown MA）並びにABI377DNAシーケンサ（Perkin Elmer社）のよう な装置を用いて自動化するのが好ましい。 ポリヌクレオチド配列の伸長 ＨＰＴＰをコードするポリヌクレオチド配列は、部分的なヌクレオチド配列と 、プロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当業者には 周知の様々な方法とを用いて伸長させることができる。Gobinda等（1993;PCR Me thods Applic 2:318-22）は既知の部位に隣接する未知の配列を検索するための 、汎用プライマーを用いる直接的な方法として「制限部位」ポリメラーゼ連鎖反 応（ＰＣＲ）法を開示している。ここでは、まずゲノムＤＮＡを、既知の領域に 対して特異的なプライマー及びリンカー配列に対するプライマーの存在下で増幅 する。増幅された配列を、その同じリンカープライマー及び最初のプライマーの 内部に含まれる別の特異的プライマーを用いてＰＣＲの２巡目にかける。ＰＣＲ の各回の生成物は、適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を 用いて配列決定される。 逆ＰＣＲ法を用いて、既知領域に基づく多様なプライマーを利用した配列の増 幅、または伸長を行うことができる(Triglia等(1988)Nucleic Acids Res 16:818 6)。プライマーは、OLIGO(登録商標)4.06(National Biosciences社,Plymouth MN )或いは別の適切なプログラムを用いて設計され、長さが２０〜３０ヌクレオチ ドで、５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にア ニールする。この方法ではいくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知領域の適 当なフラグメントを生成する。次いでこのフラグメントは分子内ライゲーション により環状にされ、ＰＣＲ用の鋳型として使用される。 キャプチャＰＣＲ法（Lagerstrom M等（1991）PCR Methods Applic 1:111-19 ）は、ヒト及び酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ内の既知の配列に隣接するＤ ＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を行う方法である。またキャプチャＰＣＲでは、 ＰＣＲ処理の前に、制限酵素による多重消化及びライゲーションによって、ＤＮ Ａ分子の未知の部分に組換え二本鎖配列を配置しでおく必要がある。 未知の配列を検索するために用いることができる別の方法は、標的遺伝子歩行 を行う歩行ＰＣＲ法（Parker JD等(1991)Nucleic Acids Res 19:3055-60）であ る。更に、ＰＣＲ、ネスト化プライマー、PromoterFinder^TM(Clontech社(Palo A lto CA)並びにPromoterFinderのライブラリーを用いて、ゲノムＤＮＡ内歩行を 行うことができる。このプロセスは、ライブラリーをスクリーニングする必要が なく、イントロン／エクソン接合部を探し出すのに有用である。 完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするための好適なライブラリーは、 サイズ選択された、より大きなｃＤＮＡを含むライブラリーである。またランダ ムプライミングした（rondom primed）ライブラリーは、遺伝子の５’及び上流 領域を含むより多くの配列を含むという点で好適である。ランダムプライミング したライブラリーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを生成しな い場合、特に有用である。またゲノムライブラリーは、プロモータ結合領域の５ ’まで伸長させるために有用である。 サイズを分析したり、或いは配列決定やＰＣＲ処理の産物のヌクレオチド配列 を確認するための新しい方法はキャピラリー電気泳動法である。迅速な配列決定 のためのシステムは、Perkin Elmer社、Beckman Instruments社（Fullerton CA ）並びに他の企業から入手できる。キャピラリーシークエンシングでは、電気泳 動による分離のための流動性ポリマー、レーザで活性化される４つの異なる蛍光 色素（各ヌクレオチドに対して１つ）を使用し、ＣＣＤカメラにより放射線の波 長の検出を行う。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えばPerkin elmer社製 のGenotyper^TM及びSequence Navigator^TM）を用いて電気信号に変換され、サン プルの負荷からコンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコンピュー タ制御される。キャピラリー電気泳動法は特定のサンプルの限定された量の中に 存在するＤＮＡの小片の配列決定に特に適している。この方法により３０分間で Ｍ１３ファージＤＮＡの３５０ｂｐを再現可能な形で配列決定できたことが報告 されている（Ruiz-Martinez MC等（1993）Anal Chem 65:2851-8）。 ヌクレオチド配列の発現 本発明により、ＨＰＴＰ、そのポリペプチドの断片、融合タンパク質或いはそ の機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列を、適切な宿主細胞内でのＨ ＰＴＰの発現を誘導する組換えＤＮＡ分子を生成する ために用いることができる。遺伝暗号固有の縮重のために、概ね同一か或いは機 能的に等価なアミノ酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も、ＨＰＴＰのクローニ ングや発現のために用いることができる。当業者には理解できるように、非自然 発生コドンを有するＨＰＴＰコードディングヌクレオチド配列を生成することは 有益であり得る。特定の原核細胞或いは真核細胞の宿主において好適なコドン(M urray E等(1989);Nucleic Acids Res 17:477-508）を選択して、例えば、ＨＰＴ Ｐ発現率を増大させたり、或いは自然発生配列から生成された転写物より長い半 減期のような望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写物を生成することができる 。 本発明のヌクレオチド配列は、様々な目的でＨＰＴＰをコードする配列を変え るために組換えることができるが、このような改変には、限定はしないが遺伝子 生成物のクローニング、プロセシング並びにまた発現を修飾する改変が含まれる 。例えば、特定部位突然変異誘発のような当業者には周知の技術を用いて突然変 異を誘発させることによって、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの 変更、コドン選好の変化等をもたらすことができる。 本発明の別の実施例では、未改変ＨＰＴＰコーディング配列、修飾したＨＰＴ Ｐコーディング配列或いは組換えＨＰＴＰコーディング配列をヘテロの配列に結 合して、融合タンパク質をコードする配列にする。例えば、ＨＰＴＰ活性のイン ヒビターを選別すべくペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販 の抗体により認識される異なるペプチドを発現するキメラＨＰＴＰタンパク質を コードすることが役立ち得る。融合タンパク質はＨＰＴＰ配列とヘテロのタンパ ク質配列との間の位置に切断部位を包含するように設計することもでき、これに よってＨＰＴＰを切断して、ヘテロの部分から分けて実質的に精製することが可 能となる。 本発明の別の実施例では、ＨＰＴＰコーディング配列は、当業者によく知られ た化学的方法（Caruthers等（1980）Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223、Crea ，Horn（1980）Nuc Acids Res 9:2331、Matteucci，Caruthers（1980）Tetrahed ron Lett 21:719、Chow,Kempe（1981）Nuc Acids Res 9:2807-2817参照）を用い て、その全体を、或いは部分的に合成することができる。別法では、ＨＰＴＰア ミノ酸配列を、全体的に或いは部分的に合成する化学的方法を用いてタンパク質 自体を生成することができる。例えば、種々の固相技術（Roberge JY等(1995)Sc ience 269:202-204）でペプチド合成を行うことができ、合成の自動化は、例え ばABI431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）をその使用説明書に従って用 いることにより達成することができる。 この新たに合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィにより精 製することができる（例えばCreighton（1983）Proteins Structure And Molecu lar Principles ,WH Freeman and Co,New York参照）。合成されたペプチドの組 成は、アミノ酸解析或いはシークエンシングにより確認することができる（例え ばthe Edman degradation procedure;Creighton，上述）。さらにＨＰＴＰのア ミノ酸配列、或いはその任意の部分を、その直接の合成の際に改変したり、また 他の細胞内メディエータ或いはその任意の部分に由来する配列と化学的方法を用 いて結合して、変異体ポリペプチドを生成することができる。 発現系 生物学的に活性のＨＰＴＰを発現するために、ＨＰＴＰコーディングヌクレオ チド配列或いは機能的等価物は、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコー ディング配列の転写及び翻訳に必要なエレメントを含むベクターに挿入される。 ＨＰＴＰコーディング配列及び適切な転写や翻訳の制御エレメントを 含む発現ベクターを構成するために当業者に周知の方法が用いられる。これらの 方法には、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo組換え技術、 つまり遺伝子組換え技術が含まれる。このような技術は、Sambrook等（1989）Mo lecular Cloning,A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Press,Planview NY 及びAusubel FM等Current Protocol in Ｍlecular Biology,John Wilky &Sons,N ew Yorkに記載されている。 種々の発現ベクター／宿主系を、ＨＰＴＰコーディング配列を保持し、かつ発 現するために利用することができる。このようなものには、以下のものに限定は されないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現 ベクターで形質転換した細菌や、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌や、 ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系や、 ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMV、タバコモザ イクウイルスTMV）をトランスフェクトしたものか、或いはバクテリア発現ベク ター（例えばTi、或いはpBR322プラスミド）で形質転換した植物細胞系や、或い は動物細胞系が含まれる。 これらの系の「制御エレメント」或いは「調節配列」は、その力及び特異性は 様々で、ベクターの非翻訳領域、エンハンサー、プロモータ及び３’非翻訳領域 であり、これらは転写及び翻訳を実行するために宿主細胞のタンパク質と相互作 用する。利用されるベクター及び宿主に応じて、構成的及び誘導性プロモータを 含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントが用いられ得る。例えば、細菌系 にクローニングする際には、Bluescript（登録商標）ファージミド（Stratagene 社，LaJolla CA）のハイブリッドlacZプロモータ及びptrp-lacハイブリッド並び に同様の誘導性プロモータが用いられる。バキュロウイルスポリヘドリンプロモ ータは昆虫細胞において用いられる。植物細胞のゲノム（例えば熱ショック,RUB ISCO及びストレージタンパク質遺伝子）に由来する、或いは植物ウイルス（例え ばウイルス性プロモータ或いはリーダー配列）に由来するプロモータ或いはエン ハンサを、ベクターにクローン化してもよい。哺乳動物細胞では、哺乳類遺伝子 或いは哺乳類ウイルス由来のプロモータが最適である。ＨＰＴＰの多数の複製を 含む株細胞を生成する必要がある場合には、SV40或いはEBVに基づくベクターを 、適切な選択マーカーと共に用いる。 細菌系では、ＨＰＴＰの用途に応じて多数の発現ベクターが選択され得る。例 えば抗体を誘発するために大量のＨＰＴＰが必要とされる場合は、容易に精製さ れる融合タンパク質を高レベルで発現できるベクターが望ましい。そのようなベ クターには、以下のものに限定はしないが、大腸菌クローニングベクター及び発 現ベクターBluescript（Stratagene社）(このベクターでは、ＨＰＴＰをコード する配列が、アミノ基末端メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基 の配列を備えたフレーム内においてベクターに結合されてハイブリッドタンパク 質が生成される)や、pINベクター(Van Heeke及びSchuster(1989)J Biol Chem 26 4:5503-5509)等が含まれる。またpGEXベクター（Promage社、Madison WI）も、 グルタチオンＳ−トランスファーゼ（GST）を有する融合タンパク質として異種 ポリペプチドを発現するため用いられる。一般に、そのような融合タンパク質は 可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへ吸着させた後、遊離グルタチオ ンの存在下で溶出させることにより溶解した細胞から容易に精製できる。その系 において生成されたタンパク質はヘパリン、トロンビン或いはＸＡ因子プロテア ーゼ切断部位を含むように設計され、目的のクローン化ポリペプチドは随意にGS T部分から放出させることができる。 酵母菌、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因 子、アルコールオキシダーゼ及びPGHのような構成的或いは誘導性プロモーター を含む多数のベクターが用いられる。再検討する場合には、Ausubel等（前出） 及びGrant等（1987）Methods Enzymol 153:516-544を参照されたい。 植物発現ベクターを用いる場合には、ＨＰＴＰをコードする配列の発現は、多 数のプロモーターの何れかにより促進される。例えばCaMVの35Ｓ及び19Ｓプロモ ーター（Brisson等（1984）Nature 310:511-514）のようなウイルスのプロモー ターを、単独で用いるか、或いはTMV（Takamatsu等（1987）EMBO J 6:307-311） からのオメガ−リーダー配列と共に用いることができる。別法では、RUBISCO(Co ruzzi等(1984)EMBO J 3:1671-1680)、Broglie等(1984)Science 224:838-843)の 小サブユニット、或いは熱ショックプロモーター(Winter J及びSinibaldi RM（1 991）Results Probl Cell Differ 17:85-105）のような植物プロモーターが用い られる。これらの構成物は直接のＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介トランスフェ クションにより植物細胞内に導入される。このような技術を再検討する場合には 、Hobbs S及びMurry LE、McGraw Hill Yearbook of Science and Technlogy(199 2)McGraw Hill NY,pp191-196及びWeissbach及びWeissbach（1988）Methods for Plant Molecular Biology ,Academic Press NY,pp421-463を参照されたい。 ＨＰＴＰを発現させるために用いることができる別の発現系は昆虫系である。 そのような系の一つでは、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV ）がベクターとして用いられ、Spodoptera frugiperda細胞或いはTrichoplusia の幼虫において外来遺伝子を発現する。ＨＰＴＰをコードする配列は、ポリヘド リン遺伝子のような、ウイルスの非必 須領域にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれる。Ｈ ＰＴＰの挿入が成功した場合には、ポリヘドリン遺伝子が不活性にされ、コート タンパク質膜が欠如した変異体ウイルスが生成される。次いで、この変異体ウイ ルスを用いて、S.frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの幼虫へ感染させ、その中 でＨＰＴＰが発現される(Smith等(1983)J Virol 46:584、Engelhard EK等（1994 ）Proc Nat Acad Sci 91:3224-7)。 哺乳類宿主細胞では、多数のウイルス性発現系を利用することができる。発現 ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、ＨＰＴＰをコードする配 列は、後期プロモータ及び三連リーダ配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳 物複合体内に結合される。ウイルス性ゲノムの非必須領域への挿入により、感染 した宿主細胞でＨＰＴＰを発現することができる生存可能なウイルスになる（Lo gan及びShenk（1984）Proc Nat Acad Sci 81:3655-3659）。さらに哺乳類宿主細 胞内の発現を増加させるために、ラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサのよう な転写エンハンサを用いることができる。 また、ＨＰＴＰ配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要で ある。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接の配列が含まれる。ＨＰ ＴＰ及びその開始コドン及び上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合 には、追加の翻訳制御シグナルは不要である。しかしながらコーディング配列、 或いはその一部のみが挿入される場合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制 御シグナルが与えられなければならない。さらに、全インサートの転写を確実に 行うために、開始コドンは正しい読み枠内にある必要がある。外来転写エレメン ト及び開始コドンは、自然及び合成両方の様々な起源に由来するものであり得る 。発現の効率は、その細胞系に適切なエンハンサを含めることにより高め られる（Scharf等（1994）Results Probl Cell Differ 20:125-62、Bitter等（1 987）Methods Enzymol 153:516-544）。 さらに宿主細胞株は、挿入された配列を望ましい形に改変したり、発現したタ ンパク質のプロセシングを行う能力で選択される。このようなポリペプチドの修 飾は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化 、脂質化（lipidation）並びにアシル化を含む。またタンパク質の「プレプロ」 形態を切り離す、翻訳後プロセシングは、正しい挿入、折り畳み、並びにまた機 能の発揮のために重要である。CHO,HeLa,MDCK，293,WI38等のような異なる宿主 細胞は、そのような翻訳後活性のための特定の細胞装置及び特徴的な機構を有し ており、導入される外来タンパク質の修飾やプロセシングを確実に実行するよう に選択され得る。 長期間にわたって高収量の変異体タンパク質の生産を確保するためには、安定 した発現が望ましい。例えばＨＰＴＰを安定的に発現する株細胞を、ウイルス由 来の複製物、或いは内在性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を含む発現ベ クターを用いて形質転換する。ベクターの導入に続いて、細胞を、選択培地に切 り替える前に濃縮培地内で１〜２日間増殖させる。選択マーカーの目的は、選択 のための耐性を与え、その存在によって導入された配列をうまく発現する細胞を 増殖、回収できるようにすることである。安定的に形質転換された細胞の耐性凝 集塊は、その細胞の型に適切な組織培養技術を用いて増殖することができる。 形質転換された株細胞を回収するために任意の数の選択系を用いることができ る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジン キナーゼ（Wigler M等（1977）Cell 11:223-32）及びアデニン ホスホリボシル トランスフェラーゼ（Lowy I等（1980）Cell 22:817-23）遺伝子が含まれ、それ ぞれtk-及びaprt-細胞において用い られる。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の基礎として 用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え（Wigl er M等(1980)Natl Acad Sci 77:3567）、nptはアミノ配糖体のネオマイシン及び G-418に対する耐性を与え（Colberre-Garapin F等（1981）J Mol Biol 150:1） 、als或いはpatはクロルスルフロン（chlorsulfuron）、フォスフィノトリシン アセチルトランスフェラーゼ(phosphinotricin acetyltransferase)に対する耐 性を与える（上記Murry）。さらに選択に用いることができる遺伝子として、例 えば細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするtrpB、 細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるようにする hisDが記載されている(Hartman SC及びRC Mulligan（1988）Proc Nalt Acad Sci 85:8047)。最近になって、形質転換体を特定するためばかりではなく、特定ベ クター系による一過性の或いは安定なタンパク質発現の量を定量するために広く 用いられるβ−グルクロニダーゼ、アントシアニン及びルシフェリンのような標 識による可視標識が非常によく用いられるようになった(Rhodes CA等(1995)Meth ods Mol Biol 55:121-131)。 本発明のポリヌクレオチド配列を含む形質転換体の同定 マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって、目的の遺伝子の存在も示唆され るが、その存在及び発現は確認するべきである。例えばＨＰＴＰをコードする配 列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合は、ＨＰＴＰをコードする配列を含 む組換え体細胞をマーカー遺伝子の機能の存在により確認できる。別法では、マ ーカー遺伝子を、単一プロモータの制御下となるように、ＨＰＴＰをコードする 配列と直列に配置することができる。誘導または選択に応じてのマーカー遺伝子 の発現は、通常、直列に配置された配列の発現をも同時に示す。 この他、ＨＰＴＰのコーディング配列を含み、ＨＰＴＰを発現する宿主細胞を 、当業者には周知の様々な手順により同定できる。これらの手順には、以下のも のに限定はしないが、ＤＮＡ-ＤＮＡ或いはＤＮＡ-ＲＮＡハイブリダイゼーショ ン及び、核酸及びタンパク質の検出及び／又は定量を行うための膜ベース、溶液 ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノ アッセイが含まれる。 ＨＰＴＰポリヌクレオチド配列の存在は、ＨＰＴＰのプローブ、一部、或いは フラグメントを用いるＤＮＡ-ＤＮＡ或いはＤＮＡ-ＲＮＡハイブリダイゼーショ ン或いは、増幅により検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイでは、 ＨＰＴＰ配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーを用いて、ＨＰＴＰ をコードするＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形質転換体を検出する。本明細書におい て「オリゴヌクレオチド」或いは「オリゴマー」とは、プローブ或いは、ＰＣＲ で増幅されるセグメントであるアンプリマーとして用いることができる、少なく とも１０ヌクレオチド、多い場合には６０ヌクレオチド、好適には１５〜３０ヌ クレオチド、より好適には２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列を指す。このタン パク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれかを用い てＨＰＴＰポリペプチドの発現を検出し、測定するための種々のプロトコルが当 業者には周知である。このようなプロトコルの例としては、酵素結合免疫検定法 （ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）及び蛍光表示式細胞分取器法（FACS） を含む。ＨＰＴＰポリペプチド上で２つの非干渉なエピトープに対して反応する モノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナルベースイムノアッセイ（tw o-site,monoclonal-based immunoassay）は好適ではあるが、競合的結合アッセ イも用いられる。これらアッセイの並びに他のアッセイは、Hampton R等（1990, Serologivcal Methods,a Laboratory Manual,APS Press,St Paul MN） 及びMaddox DE等（1983,I Exp Med 158:1211）等に記載されている。 さらに多くの標識及び結合技術は当業者には周知であり、種々の核酸及びアミ ノ酸アッセイにおいて用いることができる。ＨＰＴＰに関連する配列を検出する ための標識されたハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプローブを生成するため の手段には、オリゴ標識、ニックトランスレーション法、末端標識或いは標識ヌ クレオチドを用いるＰＣＲ増幅などがある。別法としては、ＨＰＴＰ配列、或い はその任意の部分を、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクターにクローニング する。そのようなベクターは当分野では周知で市販されており、Ｔ7、Ｔ3、或い はSP6並びに標識されたヌクレオチドのような適切なＲＮＡポリメラーゼを加え ることにより、in vitroでのＲＮＡプローブ合成のために用いることができる。 Pharmacia Biotech社(Piscataway NJ)、Promega社(Madison WI)並びにUS Bioc hemical社（Cleveland OH）のようないくつかの企業がこれらの手順のための市 販のキット及びプロトコルを提供している。適切なリポーター分子、すなわち標 識には、放射性核種、酵素、蛍光性剤、化学ルミネセンス剤或いは色素生成剤や 、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子或いはそれに類似のものが含まれる 。そのような標識の使用について記載している特許には、米国特許第3,817,837 号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,275, 149号並びに第4,336,241号がある。また、組換え体免疫グロブリンの製造につい ては米国特許第4,816,567号に記載の方法を用いることができ、本明細書ととも に参照されたい。 ＨＰＴＰの精製 ＨＰＴＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、細胞培 地からコードされたタンパク質を発現及び回収するために適切な 条件下で培養することができる。組換え体細胞により生成されるタンパク質は、 用いられる配列及び／またはベクターに応じて、細胞内に分泌、つまり細胞内に 含まれるようにすることができる。当業者には理解されるように、ＨＰＴＰをコ ードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、原核細胞か、真核細胞の細胞 膜を通してのＨＰＴＰの分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計すること ができる。他の組換え体作成物では、ＨＰＴＰをコードする配列を、可溶性タン パク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列 に結合することができる(Kroll DJ等（1993）DNA Cell Biol 12:441-53；本文献 における融合タンパク質を含むベクターに関する考察を参照されたい)。 またＨＰＴＰは、タンパク質精製を容易にするために加えられた１または２以 上の付加的なポリペプチドドメインを備えた組換え体タンパク質としても発現さ れ得る。そのような精製を容易にするドメインには、以下のものに限定はしない が、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュールの ような金属キレートペプチド（Porath J（1992）Protain Expr Purif 3:263-281 ）、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、並び にＦＬＡＧＳ延長／アフィニティ精製システムにおいて用いられるドメイン（Im munex社、Seattle WA）が含まれる。精製ドメイン及びＨＰＴＰ間にＸＡ因子或 いはエンテロキナーゼ（Invitrogen，San Diego CA）のような切断可能なリンカ ー配列を含めるのは精製を促進するのに役立つ。このような発現ベクターの１つ は、ＨＰＴＰをコードする配列とともに、６個のヒスチジン残基、それに続くチ オレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位をコードする核酸配列を含む、融合 タンパク質の発現をなす。ヒスチジン残基が精製を促進し、エンテロキナーゼ切 断部位は融合タンパク質からのＨＰＴＰの精製のための手段となる。 組換え体の産生に加えて、ＨＰＴＰのフラグメントは、固層技術を用いた直接 のペプチド合成で形成することもできる。（Stewartら（1969）Solid-Phase Pet ide Synthesis,WH Freeman Co，San Francisco;Merrifield J(1963)J Am Chem S oc85:2149-2154を参照されたい）。in vitroタンパク質合成は手作業で行えるが 、自動化することもできる。自動的な合成は、例えば、Applied Biosystem 431A ペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer，Foster City CA）を使用説明書に従って 用いて行うことができる。ＨＰＴＰの種々のフラグメントを個別に化学的に合成 し、化学的方法を用いて結合して完全長分子を作り出してもよい。 ＨＰＴＰの使用 ここに開示するヌクレオチド配列及びポリペプチド配列の使用の原理は、ＨＰ ＴＰと既知のＰＴＰ群の間の化学的及び構造的相同性に部分的に基づく。種々の 細胞及び組織における細胞増殖及び調節プロセスにおけるＰＴＫ及びそれらの各 ＰＴＰの幅広い役割のため、ＨＰＴＰ発現の変化は種々の疾患及び疾病に関係し 得る。 ＨＰＴＰ−１は炎症細胞及び種々の癌と関連を有していると考えられ、従って 慢性関節リウマチや骨関節炎、及び腸、膀胱、前立腺、乳房、及び脳の癌のよう な疾病の病因においてある役割を有し得る。ＨＰＴＰ−２も同様に炎症や脳、胃 、乳房、及び前立腺の癌に関連している。 ＨＰＴＰ−１又はＨＰＴＰ−２は、遺伝子治療での利用により、又はＨＰＴＰ やＨＰＴＰのアゴニストの投与によってＨＰＴＰ活性を高めることにより癌や炎 症性疾患の治療若しくは予防のためにも用いることができる。この他、ＨＰＴＰ の過剰発現が疾病状態に関連し得る場合には、ＰＲＬ−１の場合のように、ＨＰ ＴＰのアンチセンス分子、ＨＰＴＰに対する抗体、又はＨＰＴＰのアンタゴニス トを用いることによってＨＰＴＰの活性を低下させることができる。更に、ＨＰ ＴＰの配列は、ＨＰ ＴＰの活性又は産生を調節するアゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビター のスクリーニングのための基礎となる。 ＨＰＴＰ抗体 ＨＰＴＰ特異的抗体は、ＨＰＴＰの発現が関係する状態、及び疾病の診断及び 治療に役立つ。このような抗体には、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モ ノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Fabフラグメント、及びFab発現ライブ ラリーにより生成されるフラグメントが含まれる。中和抗体、すなわち二量体形 成を抑制する抗体は、診断及び治療のために特に好適である。 抗体誘発のためのＨＰＴＰの一部分は生物学的活性を有している必要はないが 、そのタンパク質断片、又はオリゴペプチドが抗原性でなければならない。特異 的抗体を誘発するために用いられるペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸、好 ましくは少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有し得る。これら の配列は、自然タンパク質のアミノ酸配列の一部を模倣したものであるべきであ り、小形の自然発生の分子の全アミノ酸配列を含んでいてもよい。ＨＰＴＰアミ ノ酸の短いストレッチを、キーホールリンペットヘモシアニン及びキメラ分子に 対して産生された抗体のような他のタンパク質の配列に融合してもよい。ＨＰＴ Ｐに対する抗体の生成のためには、当分野においてよく知られる手順を用いるこ とができる。 抗体を産生するために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む種々の宿主は 、ＨＰＴＰ或いは免疫学的特性を保持するその任意の部分、フラグメント或いは オリゴペプチドを注射することにより免疫することができる。宿主の種に応じて 、種々のアジュバントを免疫学的反応を増強するために用いることができる。そ のようなアジュバントには、限定はしないが、フロイントのアジュバント、水酸 化アルミニウムのような無 機質ゲルアジュバント、リゾレシチンのような界面活性物質アジュバント、プル ロニックポリオールアジュバント、ポリアニオンアジュバント、ペプチドアジュ バント、油性乳剤アジュバント、キーホールリンペットヘモシニアンアジュバン ト並びにジニトロフェノールアジュバントが含まれる。ＢＣＧ（カルメット‐ゲ ラン杆菌）及びコリネバクテリウム−パルヴム（Corynebacterium parvum）は有 用なヒトアジュバントである。 ＨＰＴＰに対するモノクローナル抗体は、培地中の連続株細胞によって抗体分 子を産生する任意の技術を用いて調製できる。このような技術には、限定はしな いが、Koehler及びMilstein（1975,Nature 256:495-497）に当初掲載されたハイ ブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor等(1983)Immunol Today 4:72、Cote等(1983)Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030)、及びＥＢＶ−ハイブ リドーマ技術（Cote等（1985）Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Ala n R Liss Inc,pp77-96）が含まれる。 さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための「キメラ 抗体」の生成、即ちヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子の結合のために開発さ れた技術が用いられる(Morrison等(1984)Proc Natl Acad Sci 81:6851-6855)、N euberger等（1984）Nature 312:604-608、Takeda等（1985）Nature 314:452-454 )。別法では、ＨＰＴＰ特異的一本鎖抗体を生成するために、一本鎖抗体の生成 のための周知技術（米国特許第4,946,778号）を適用することができる。 また抗体は、リンパ球集団でのin vivo産生を誘導することにより、或いはOrl andi等（1989,Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837）並びにWinter G及びMilstein C（1991,Nature 349:293-299）に開示されているような高度に特異的な結合試 薬のパネル、または組換え体免疫グロ ブリンライブラリーをスクリーニングすることによっても生成することができる 。 ＨＰＴＰに対する特異結合部位を含む抗体フラグメントも生成することができ る。このようなフラグメントには例えば、限定はしないが、抗体分子のペプシン による消化で生成することができるＦ（ａｂ’）₂フラグメントや、Ｆ（ａｂ’ ）₂フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができる Ｆａｂフラグメントが含まれる。別法として、所望の特異性を有するモノクロー ナルＦａｂフラグメントを迅速かつ容易に同定できるように、Ｆａｂ発現ライブ ラリーを作製してもよい（Huse WD等（1989）Science 256:1275-1281）。 確立された特異性を有するモノクローナル抗体或いはポリクローナル抗体のい ずれかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射線測定法のための種々のプロ トコルが当分野ではよく知られている。そのようなイムノアッセイでは、ＨＰＴ Ｐとその特異的抗体との複合体の形成、並びに複合体形成の測定が行われる。特 定のＨＰＴＰタンパク質上の２つの非干渉性エピトープに対して反応するモノク ローナル抗体を用いる二部位モノクローナル式イムノアッセイが好適ではあるが 、競合的結合アッセイも用いられる。これらのアッセイはMaddox DE等（1983,J Exp Med 158:1211）に記載されている。 ＨＰＴＰ特異的抗体を用いる診断的測定 特定のＨＰＴＰ抗体は、ＨＰＴＰの発現によって特性化される状態や疾病の診 断や、ＨＰＴＰで処置を受けている患者のモニタリングのためのアッセイにおい て役立つ。ＨＰＴＰについての診断測定法には、ヒトの体液、細胞或いは組織の 抽出物においてＨＰＴＰを検出するために抗体或いは標識を利用する方法が含ま れる。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾したものでも、修飾なしでも用い ることができる。多くの場 合、ポリペプチド及び抗体は、共有結合、或いは非共有結合かのいずれかでリポ ーター分子と結合することにより標識される。種々のリポーター分子が周知とな っており、その幾つかについては上記した。 それぞれのタンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体或いはモノクロー ナル抗体の何れかを用いる、ＨＰＴＰポリペプチドを測定するための種々のプロ トコルが当分野では周知である。その例として、酵素結合免疫測定法（ELISA） 、ラジオイムノアッセイ（RIA）並びに蛍光表示式細胞分取器法（FACS）がある 。ＨＰＴＰポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応するモノク ローナル抗体を利用する二部位モノクローナル式イムノアッセイは好適ではある が、競合的結合アッセイも用いられる。これらのアッセイは、Maddox DE等（198 3,I Exp Med 158:1211）その他に記載されている。 疾病の診断の基礎を得るために、ＨＰＴＰ発現についての正常な値、すなわち 標準値が確立されなければならない。これは複合体形成に適切な条件の下で、ヒ ト或いは動物どちらでもよいが、正常の被験者から得られる体液或いは細胞抽出 物とＨＰＴＰに対する抗体とを結合することにより得ることができ、このことは 当分野ではよく知られた技術である。標準の複合体形成量は、既知の量のＨＰＴ Ｐを含む種々の人工膜を、対照標準及び生検組織からの患部組織サンプルの双方 と比較することにより定量され得る。その後は、正常サンプルから得られた標準 値を、疾病の可能性がある被験者のサンプルから得られた値と比較できる。標準 値と対象値との偏差によって疾病の存在を確認できる。 薬物スクリーニング ＨＰＴＰや、その触媒作用性または免疫原性フラグメント或いはオリゴペプチ ドは、種々の薬物スクリーニング技術において治療用化合物のスクリーニングの ために用いることができる。そのような試験において 用いられるフラグメントは、溶液に遊離した形態か、固体支持体へ付着したもの か、細胞表面へ付着したものか、或いは細胞内に存在するものであり得る。ＨＰ ＴＰと試験される薬剤との結合複合体形成を測定できる。 ＨＰＴＰポリペプチドへの適切な結合親和性を有する化合物の高スループット スクリーニングのために用いられ得る別の薬物スクリーニング方法は、1984年９ 月13日公告の「アミノ酸配列の抗原性の決定（Determination of Amino Acid Se quence Antigenicity）」なる名称のWO84/03564（Guysen HN）に詳細に記載され ている。この文献を本明細書と一体に参照されたい。概要を述べると、多数の異 なる小ペプチド試験用化合物を、プラスチックピン或いは他の表面のような固体 基質上で合成する。ポリペプチド試験用化合物をＨＰＴＰフラグメントと反応さ せ、洗浄する。次いで結合ＨＰＴＰを当分野で周知の方法により検出する。また 、前述の薬物スクリーニング技術において使用するために、精製ＨＰＴＰをプレ ート上に直接コーティングすることもできる。この他、ペプチドを捕捉し、固形 支持体上にペプチドを固定するために非中和抗体を用いることができる。 本発明はまた、ＨＰＴＰに結合し得る中和抗体特性が、ＨＰＴＰとの結合につ いて試験化合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの使用も 企図している。このようにして、抗体を用いて１または２以上のＨＰＴＰと共通 の抗原決定基を有する任意のペプチドの存在を検出することができる。 ＨＰＴＰをコードするポリヌクレオチドの使用 ＨＰＴＰをコードするポリヌクレオチド、またはその一部を、診断目的または 治療目的、或いはその両方の目的で用いることができる。診断目的の場合、本発 明のＨＰＴＰは、ＨＰＴＰの発現が関与する生検組織 における遺伝子発現を検出し、定量するために用いられる。診断的測定は、ＨＰ ＴＰが存在、不存在、及び過剰発現の何れの状態にあるかを区別したり、治療的 介入の際にＨＰＴＰ濃度の調節をモニタリングするのに役立つ。本発明の範囲に は、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びペプチ ド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。 本発明の別の側面は、ＨＰＴＰまたは近縁な分子をコードする、ゲノム配列を 含むポリヌクレオチド配列を検出できるハイブリダイゼーションプローブ或いは ＰＣＲプローブを提供することである。そして、そのプローブの特異性、すなわ ち非常に高度な保存領域（例えば５’調節領域における１０個の独特のヌクレオ チド）か、保存的である度合いの低い領域（例えば特に３’領域におけるシステ イン残基の間の領域）の何れに由来するのかということや、ハイブリダイゼーシ ョン或いは増幅の（高度の、中程度の或いは低度の）厳密性とによって、そのプ ローブが自然発生ＨＰＴＰのみを同定するものであるか、或いはアレル配列や近 縁な配列も同定するものであるかということが決まってくる。 プローブは、近縁なインヒビターをコードする配列を検出するためにも用いる ことができ、好ましくは、これらのＨＰＴＰをコードする任意の配列から得られ るヌクレオチドを少なくとも５０％含むべきである。本発明のハイブリダイゼー ションプローブは、配列番号：２又は配列番号：４のヌクレオチド配列か、自然 発生ＨＰＴＰのイントロン、プロモータ、及びエンハンサーエレメントを含むゲ ノムの配列に由来するものであり得る。ハイブリダイゼーションプローブは種々 のリポータ分子により標識することができ、この標識には、³²Ｐや³⁵Ｓのような 放射性核種、アビジン／ビオチン結合系によりプローブに結合するアルカリホス ファターゼのような酵素標識等が含まれる。 ＤＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブの作製のため の他の手段には、ＨＰＴＰやＨＰＴＰ誘導体をコードする核酸配列を、ｍＲＮＡ プローブ生成のためのベクターにクローン化する方法がある。このようなベクタ ーは周知で市販されており、Ｔ７やＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼのような適切な ＲＮＡポリメラーゼや適切な放射性標識ヌクレオチドを付加することにより、in vitroでのＲＮＡプローブを合成のために用いることができる。診断的使用 ＨＰＴＰをコードするポリヌクレオチド配列を、ＨＰＴＰの発現が関係する状 態や疾病の診断のために用いることができる。例えば、ＨＰＴＰをコードするポ リヌクレオチド配列を、ＨＰＴＰ発現を検出するための組織や体液の、ハイブリ ダイゼーションアッセイ或いはＰＣＲアッセイにおいて用いることができる。こ のような形態の定性的及び定量的方法には、サザンブロット法或いはノーザンブ ロット法、ドットブロット法或いは他の膜ベース技術、ＰＣＲ技術、ディップス ティック試験法（試験紙法）、ピン或いはチップ技術及びELISA技術が含まれる 。これらの技術は全て、当分野ではよく知られており、実際に市販されている多 くの診断キットの基礎となっている。 ここに開示したＨＰＴＰをコードするヌクレオチド配列は、炎症または疾病に 関係する活性化や誘導を検出するアッセイのための基礎となる。ＨＰＴＰヌクレ オチド配列を、既知の方法により標識して、ハイブリダイゼーション複合体の形 成に適した条件の下で、患者の体液や組織のサンプルに加えることができる。イ ンキュベーション時間の経過後、このサンプルを、ヌクレオチドが酵素で標識さ れている場合には所望に応じて色素（または他の展開剤を要する標識）を含む適 合性の液体で洗浄する。この適合性の液体をリンスした後、色素を定量して標準 値と比較する。生検サンプルや抽出サンプルにおける色素の量が、比較用対照サ ン プルの色素量を著しく上回っている場合には、このヌクレオチド配列はサンプル のヌクレオチド配列とハイブリッド形成しており、サンプル内に著しく高濃度の ＨＰＴＰをコードするヌクレオチド配列が存在しているということは、炎症か疾 病、若しくはその両方が存在していることを示している。 このようなアッセイは、特定の治療行為の有効性を評価するために、動物実験 、臨床試験、或いは個々の患者の治療をモニタリングする際に用いることができ る。疾患を診断するための基礎を得るためには、ＨＰＴＰ発現についての正常な 、つまり標準のプロフィールが確立されなければならない。この標準プロフィー ルは、正常な被験者、すなわち動物或いはヒトから得られる体液或いは細胞抽出 物を、ハイブリダイゼーション或いは増幅に適切な条件下で、ＨＰＴＰ或いはそ の一部と結合することにより確立される。標準的なハイブリッド形成は、既知の 量の実質的に精製されたＨＰＴＰが用いられる同一の実験におけるポジティブコ ントロール希釈系列で得られる値と正常被験者に対して得られる値とを比較する ことにより定量することができる。正常なサンプルから得られた標準値は、ＨＰ ＴＰ発現に関連する障害或いは疾患を患っている被験者からのサンプルから得ら れる値と比較することができる。標準値と被験者値との偏差から疾病の存在が確 認される。 ひとたび疾患が確認されると、治療用の薬剤が投与され、治療プロフィールが 作成される。このようなアッセイは、その数値が正常すなわち標準パターンに向 かって回復しているか否かを評価するために定期的に繰り返される。継続的な治 療プロフィールを用いて数日間或いは数ヶ月の期間にわたる治療効果を示すこと ができる。 米国特許第4,683,195号、並びに第4,965,188号に記載のようなＰＣＲ法では、 ＨＰＴＰ配列に基づくオリゴヌクレオチドの別の使用法が提 供される。このようなオリゴマーは一般には化学的に合成するが、酵素を用いて 生成したり、或いは組換え体を起源として生成することもできる。一般にオリゴ マーは、特定の遺伝子或いは状態を同定するために最適な条件下で用いられる２ つのヌクレオチド配列、即ちセンス方向(５’→３’)のヌクレオチド及びアンチ センス方向（３’←５’）のヌクレオチドからなる。同一の２つのオリゴマー、 入れ子オリゴマーの組、或いはオリゴマーの縮重プールでさえ、近縁なＤＮＡま たはＲＮＡ配列の検出や定量のためのより厳密性の低い条件の下であっても用い ることができる。 さらに特定の分子の発現を定量するための方法には、放射性標識（radiolabel ing）（Melby PC等1993 J Immunol Methods 159:235-44）或いはビオチン標識（ Duplaa C等1993 Anal Biochem 229-36）ヌクレオチドの利用、コントロールの核 酸の同時増幅（coamplification）の利用、並びに実験結果を補完して引かれた 標準的なグラフ曲線の利用が含まれる。多数のサンプルの定量は、ELISA形式の アッセイを実行することにより迅速に行うことができる。このアッセイでは目的 のオリゴマーが様々な希釈溶液中に存在し、分光光度計を用いる分析或いは比色 分析反応により迅速に定量することができる。このタイプの確定診断によって、 健康の専門家が患者の積極的治療を開始したり、病状の悪化を防ぐことができる ようになる。同様に、当業者に周知のアッセイを用いて、治療中の患者の状態の 進行をモニタリングすることができる。また、まだ開発されていない分子生物学 的技術でも、その新技術が既知のヌクレオチド配列の性質、例えばトリプレット 遺伝暗号、特異的塩基対形成等に基づくものであれば、ここに開示したヌクレオ チド配列をそこで利用することができる。治療的使用 前に述べたように、ＰＴＰの過小発現又は過剰発現は、様々な例の腫瘍形成を もたらし得る。従ってＨＰＴＰをコードするヌクレオチド配列を用いる遺伝子治 療は、ＨＰＴＰ活性の上昇が必要な場合に役立ち得、逆に、ＨＰＴＰをコードす る配列のアンチセンス分子は、ＨＰＴＰの発現の低下が必要な場合に投与され得 る。 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルスに由来 する発現ベクター、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、 標的の器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられ る。当業者によく知られた方法を用いて、ＨＰＴＰをコードする配列のアンチセ ンスを発現する組換え体ベクターを作り出すことができる。例えばManiatis等（ 上記）及びAusubel等（上記）に記載された技術を参照されたい。 完全長ｃＤＮＡ配列や調節エレメント、若しくはその両方を含むポリヌクレオ チドにより、研究者が、ＨＰＴＰを遺伝子機能のセンス調節（Youssoufian.H及 びHF Lodish 1993 Mol Cell Biol 13:98-104）、或いはアンチセンス調節（Eguc hi等（1991）Annu Rev Biochem 60:631-652）の研究用ツールとして用いること ができるようになる。このような技術は、現在当分野ではよく知られており、セ ンス或いはアンチセンスオリゴヌクレオチド、或いはより大きなフラグメントを 、コーディング領域或いは制御領域に沿った様々な位置から設計することができ る。 所望のＨＰＴＰ断片を高度に発現する発現ベクターを細胞または組織にトラン スフェクトすることにより、ＨＰＴＰをコードする遺伝子の機能を停止させるこ とができる。このような作製物は、翻訳不可能なセンス或いはアンチセンス配列 で細胞を満たし得る。ＤＮＡへの組み込みがない場合ですら、このようなベクタ ーは、全ての複製物が内在性ヌクレ アーゼにより分解されるまで、ＲＮＡ分子を転写し続ける。このような一過性の 発現は、非複製ベクター(Mettler I,personal communication)でも１ヶ月以上、 適当な複製エレメントがベクター系の一部である場合には更に長い期間継続し得 る。 上述のように、ＨＰＴＰをコードする配列の制御領域、即ちプロモータ、エン ハンザ或いはイントロンに対するアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮ Ａを設計することにより遺伝子発現を修飾することができる。転写開始部位、例 えばリーダー配列の＋１０〜−１０領域の間に由来するオリゴヌクレオチドが好 適である。またアンチセンス分子は、転写産物がリボソームへの結合するのを防 止することによりｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計される。同様に、阻害は 、「三重らせん」塩基対合法を用いて達成することができる。三重らせん対合は 、二重らせんが十分にほどけないことでポリメラーゼ、転写因子、或いは調節分 子が結合できないようにする。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療法は、Gee JEらの論文（Huber BE及びBI Carr(1994)Molecular and Immunologic Approache s ,Futura Publishing Co,Mt Kisco NYの中に記載）に記載されている。 リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子で ある。リボザイムの作用機序では、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列 特異的ハイブリダイゼーションが行われ、その後エンドヌクレアーゼによる切断 （endonucleolytic cleavage）がなされる。発明の範囲内には、ＨＰＴＰのエン ドヌクレアーゼによる切断を、特異的に及び効果的に触媒し得る人工合成のハン マーヘッド型リボザイム分子も含まれている。 任意の潜在性ＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位の最初の同定は、配 列GUA、GUU並びにGUCが後続するリボザイム切断部位に 対する標的分子を走査することにより行われる。一度同定されると、切断部位を 含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの間の短いＲ ＮＡ配列を、そのオリゴヌクレオチドの機能を停止させる２次構造の特徴につい て評価することができる。また候補の標的の適切性も、リボヌクレアーゼ保護ア ッセイを用いて相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に対する接触 性を試験することにより評価することができる。 本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、ＲＮＡ分子を合成するのための 当分野で周知の方法により調製することができる。これらの技術には、固相ホス ホラミダイト（phosphoramidite）化学合成のようなオリゴヌクレオチドの化学 的合成技術が含まれる。この他、ＲＮＡ分子を、ＨＰＴＰをコードするＤＮＡ配 列のin vivo及びin vitro転写により生成することができる。このようなＤＮＡ 配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有 する多種のベクターに組み込むことができる。更に別の方法として、構成的に或 いは誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチ七ンスｃＤＮＡ作成物を、株 細胞、細胞或いは組織内に導入することができる。 ＲＮＡ分子は細胞内安定性を高め及び半減期を長くするために修飾することが できる。実行可能な修飾には、限定はしないが、その分子の５’末端か３’末端 、或いはその両方へのフランキング配列の付加や、分子のバックボーン内におい てホスホジエステラーゼ連鎖ではなくホスホロチオネート（phosphorothioate） 或いは２’Ｏ−メチルを使用することが含まれる。このコンセプトは、ＰＮＡ生 成固有のものであり、内在性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデ ニン、グアニン、シチジン、チミン、及びウリジンの、アセチル−、メチル−、 チオ−形態、及び類似の修飾形態とともに、イノシン、キュエオシン（queosine ）、 及びワイブトシン（Wybutosine）のような従来あまり用いられなかった塩基を含 めることによって、これら全ての分子に拡張することができる。 細胞或いは組織内にベクターを導入するための方法には、以下に議論される方 法が含まれ、これらの方法は、in vivo、in vitro、及びex vivo治療法に対して も同様に適切なものである。exvivo治療法の場合には、患者から採取された幹細 胞にベクターを導入し、自家移植用のクローンとして増殖して同じ患者に戻す方 法が、ここで引用されている米国特許第5,399,493号及び第5,437,994号に記載さ れている。トランスフェクションによる送達、リポソームによる送達は、当分野 でよく知られているものである。 更に、ここに開示するＨＰＴＰをコードするヌクレオチド配列は、限定はしな いがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対合相互作用のような特性を含む、現 在周知のヌクレオチド配列の特性に基づく技術であれば、新技術において、即ち まだ開発されていない分子生物学的技術においても用いることができる。 近縁なポリヌクレオチド配列の検出及びマッピング ＨＰＴＰをコードする核酸配列を用いて、自然発生のゲノム配列マッピングの ためのハイブリダイゼーションプローブを生成することができる。この配列を、 よく知られた技術を用いて特定の染色体或いはその染色体の特定領域に対してマ ッピングすることができる。このような技術には、染色体展着物（chromosomal spreads）のin situハイブリダイゼーション、フローソーティング（flow-sorte d）染色体調製法、或いは酵母菌人工染色体（ＹＡＣｓ）、細菌性人工染色体（ ＢＡＣｓ）、細菌性Ｐ１作成物、或いはPrice CM(1993;Blood Rev 7:127-34)及 びTrask BJ（1991;Trends Ganet 7:149-54）に概要が示されている単染色体ｃＤ ＮＡライブラリーのような人工染色体作製物が含まれる。 染色体展着物の蛍光in situハイブリダイゼーションの技術は、“Verma等（19 88）Human Chromosomes:A Manual of Basic Technioue,Pergamon Press，New Yo rk”に記載されている。染色体調製物の蛍光in situハイブリダイゼーション及 び他の染色体マッピング技術は、追加の遺伝子地図データと関係を有し得る。遺 伝子地図データの例は、1994 Genome Issue of Science(265:1981f)に見ること ができる。物理的染色体地図上でのＨＰＴＰをコードする配列の位置と、特定の 疾病（または特定の疾病の素因）との相関関係を助けとして、ある遺伝病が関係 するＤＮＡの領域の限界決定ができる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正 常者とキャリアまたは患者との遺伝子配列の違いを検出することができる。 染色体調製物のin situハイブリダイゼーション及び確定された染色体マーカ ーを用いる連鎖解析のような物理的地図作成技術は、遺伝子地図を延長する際に 大変重要である。ヒトゲノムのＳＴＳに基づく地図の最近の例は、Whitehead-MI T Center for Genome Research(Hudson TJら(1995)Science 270:1945-1954)から 最近出版されている。多くの場合、特定のヒト染色体の数或いは腕が未知であっ ても、マウスのような別の哺乳類種の染色体上の遺伝子配置（Whitehead Instit ute/MIT Center for Genome Research,Genetic Map of the Mouse,Database Rel ease 10,April 28,1995）から、関連するマーカーがわかる。新しい配列は、物 理的マッピングにより染色体の腕、或いはその一部へ割当てることができる。こ れは位置クローニング或いは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を調査する 研究者に貴重な情報を提供する。ひとたび毛細血管拡張性運動失調（AT）のよう な疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域、例えばATから11q22-23(Gatti等（19 88）Nature 336:577-580)への遺伝子連鎖によって粗い局所化がなされれば、そ の領域にマッピングさ れる任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは調節遺伝子を 表すことになる。本発明のヌクレオチド配列は、正常者とキャリアまたは患者と の間の、転座、逆位等による染色体位置の違いを検出するために用いることもで きる。 医薬品組成物 本発明は、ヌクレオチド、タンパク質、抗体、アンタゴニスト、またはインヒ ビターを単独で含んでいる、或いは安定化化合物のような少なくとも１つの他の 薬剤とともに含んでいる医薬品組成物を、その範囲に含む。この医薬品組成物は 、任意の無菌の生体適合性製薬用担体に含めて投与されるが、このような担体に は、限定はしないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水が含まれる。 これらの分子は、患者に対して、単体で、或いは他の薬品やホルモンと結合して 、賦形剤或いは製薬学的に許容される担体と混合される他の医薬品組成物に含め て投与され得る。本発明の或る実施例では、製薬学的に許容される担体とは、製 薬学的に不活性なものである。医薬品組成物の投与 医薬品組成物は経口投与、或いは非経口投与される。非経口投与の方法には、 局所的投与、動脈内（腫瘍への直接の）投与、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与 、くも膜下内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与或いは鼻腔内投与が含 まれる。活性成分に加えて、これらの薬品組成物は、薬学的に用いられ得る調合 物内への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び補助剤を含む適切な製薬学的 に許容される担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、“Reming ton's Pharmaceutical Sciences”（Maack Publishing Co,Easton PA）の最新版 において見ることができる。 経口投与用の医薬品組成物は、当分野でよく知られる製薬学的に許容 される担体を用いて適切な剤形に製剤される。このような担体により、薬品組成 物は、治療を受ける患者による経口及び鼻腔摂取のための、錠剤、丸剤、カプセ ル剤、液体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁剤或いは類似の製剤とし て処方される。 経口投与するための医薬品調製物は、活性化合物と固形の賦形剤とを結合する ことによって得ることができるが、所望に応じて、必要なら適切な補助剤を添加 した後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、錠剤或いは糖衣剤 核を得ることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトー ル或いはソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク質充填剤、とうも ろこし、小麦、米、じゃがいも等からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキ シプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムの ようなセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントのようなゴム、並びにゼラ チン或いはコラーゲンのようなタンパク質である。必要ならば、架橋結合したポ リビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸或いはア ルギン酸ナトリウムや、その塩のような、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられる。 糖衣剤核は、濃縮砂糖溶液のような適切な錠皮を与えられるが、溶液はアラビ アゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤、ポリエチレングリ コール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混 合物が含み得る。錠剤の識別のため、すなわち活性化合物の量、すなわち投与量 を特徴付けるために染料或いは色素が錠剤或いは糖衣錠皮に加えられてもよい。 経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル及びゼラ チンからなる柔らかい、密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビ トールのような錠皮を含む。プッシュフィットカプセ ルは、ラクトース或いはでんぷんのような充填剤或いは結合剤、タルク或いはス テアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、並びに付加的には安定剤と混合された 活性処方組成物を含み得る。柔らかいカプセルでは、活性化合物は、安定剤があ るなしにかかわらず、脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールの ような適切な液体に溶解或いは懸濁される。 非経口投与用の製剤は、水溶性の活性化合物の水溶液を含む。注射用として、 本発明の薬品組成物を水溶液、好適にはハンクの溶液、リンガー溶液或いは生理 緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液に入れて製剤することができる。 水性の注入懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール 或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性 成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁剤として調製される。適切な親油性の溶媒 或いは媒介物は、胡麻油のような脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド 或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。また懸濁剤は、所望に応 じて、それにより溶解度を増加し、非常に濃縮された溶液の調製ができるように なる適切な安定剤或いは薬剤を含んでもよい。 局所的投与または経鼻投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸透 剤を用いて調合が行われる。このような浸透剤は、一般的に周知である。製造と保管 本発明の薬品組成物は周知の方法、例えば従来の混合処理、溶解処理、顆粒化 処理、糖衣形成処理、研和処理、乳化処理、封入処理(entrapping)処理或いは凍 結乾燥処理により製造される。 この医薬品組成物は塩類として提供されることもあり、限定はしないが、塩酸 、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む、 多くの酸とともに形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水 性或いはプロトニック溶剤において、より可溶性が高くなる傾向がある。他の場 合には、好適な製剤は、１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のショ 糖、使用前に緩衝剤と結合させたｐＨ範囲４．５〜５．５にある２％〜７％のマ ンニトールにおける凍結乾燥粉末である。 製薬学的に許容される担体内に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調 製された後、適切な容器内に入れられて、さらに提示した疾病状態の治療のため にラベル付けされる。ＨＰＴＰの投与の場合、このようなラベルには、投与の量 、頻度、方法が表示される。治療上効果的な投与量 本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、活性成分を所望の目的 を達成するに効果的な量だけ含む組成物である。効果的な投与量の決定は、当業 者の能力の範囲内で行うことができる。 任意の化合物について、治療的に有効な投与量は、初めに、新生物細胞、或い は通常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のア ッセイから推定される。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおいて効果的 な投与量や投与経路を決定することができる。 治療的に有効な投与量とは、症状や疾病を寛解するタンパク質、その抗体、ア ンタゴニスト、またはインヒビターの量である。そのような化合物の毒性及び治 療有効性は、例えばＬＤ５０（個体群の５０％の致死投与量）及びＥＤ５０（個 体群の５０％において治療的に有効な投与量、５０％有効量）を決定するための 、細胞培地或いは実験動物における標準的な製薬学的手順により決定することが できる。毒性と治療有効性との間の投与量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好まし い。これら の細胞培地のアッセイ及び付加的な動物研究から得られるデータは、ヒトへの使 用に対する投与量の範囲を決める際に用いることができる。そのような化合物の 投与量は、毒性がほとんど或いは全くなく、ＥＤ５０を達成する循環濃度の範囲 内にあることが望ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並びに投与 経路に応じてこの範囲内で変化する。 正確な投与量は治療されるべき患者を考慮して個々の医師により選択される。 投与量及び投薬量は、十分なレベルの活性部分を与え、かつ所定の効果を維持す るために調整される。考慮すべき付加的な要因は、疾患状態の重症度、または患 者の年齢、体重並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感 受性、並びに治療への耐性／反応を含む。長期的に作用する薬品組成物は３〜４ 日毎に、１週間毎に、或いは半減期及び特定の処方のクリアランス速度に応じて ２週間に１度投与してもよい。 通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲にあって、全投与量は最大 約１ｇであり、投与経路に応じて変わってくる。特定の投与量或いは送達の方法 に関する手引きは、文献において見出すことができる。米国特許第4,657,760号 、第5,206,344号或いは第5,225,212号を参照されたい。当業者は、ヌクレオチド に対しては、タンパク質やインヒビター用の剤形とは異なる剤形を採用するであ ろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状 態、位置等によって決まってくる。 例えば、ＨＰＴＰを、自己免疫疾患における炎症性細胞の悪影響を小さくする 治療用分子の選別のために用いることができる。 以下に本発明の実施例を示す。但し、以下の実施例は単なる例示であって、本 発明をこの実施例に限定しようとするものではない。 産業上の応用 １ ＨＰＴＰ−１のＭＵＳＣＮＯＴＯ１ ｃＤＮＡライブラリーの作製及び単離 このライブラリーのために用いられた正常な骨格筋は、the Keystone Skin Ba nk,International Institute for the Advancement of Medicine（Exton,PA）か ら得た。４７歳の成人男性から採取された正常な骨格筋組織の５ｇをフラッシュ 冷凍し、乳棒と乳鉢ですり潰し、グアニジウムイソチオシアネートを含むバッフ ァに即座に溶解した。溶解の後、数回のフェノールクロロフォルム抽出及びエタ ノール沈殿を行った。ポリＡ⁺ＲＮＡは、ビオチン標識したオリゴｄ(Ｔ)プライ マー及び常磁性粒子（Promega Corp,Madison WI）に結合したストレプトアビジ ンを用いて単離し、Stratagene社（La Jolla,CA）に送った。Stratagene社は、 オリゴｄ(Ｔ)プライミングを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。合成アダ プターオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡ分子にリゲートし、これによって、そのｃ ＤＮＡ分子をUni-ZAP^TMベクターシステム(Stratagene)に挿入できるようにした 。 ＤＮＡプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーの質を選別し、次にpBluescrip t（登録商標）ファージミド（Stratagene）を切除した。その後、カスタムメイ ドで作製されたライブラリーファージの粒子を、大腸菌宿主菌株XL1-Blue（登録 商標）（Stratagene）に感染させた。 ファージミドに組み込んだ個々のｃＤＮＡクローンは、in vivo切除プロセス によって得た。このプロセスでは宿主菌株にライブラリーファージとｆ１ヘルパ ーファージの双方を同時感染させた。ライブラリーを含むファージとヘルパーフ ァージの双方に由来するポリペプチド、つまり酵素がＤＮＡにニックを入れ、標 的ＤＮＡ上の決まった配列からの新たなＤＮＡ合成を開始させ、pBluescriptフ ァージミドとｃＤＮＡインサートの全てのＤＮＡ配列を含んでいる小形で一本鎖 の環状ファージミドＤＮＡ分子をつくり出した。このファージミドＤＮＡは細胞 から放出さ れ、精製されて、新たな宿主細胞（SOLR,Stratagene）に再感染させるのに用い られ、その宿主細胞で二本鎖のファージミドＤＮＡが生成された。このファージ ミドはβラクタマーゼの遺伝子を有しているため、新たに形質転換された細菌は 、アンピシリンを含む媒地で選択された。 ファージミドＤＮＡはQIAWELL-8プラスミド精製システム （QIAGEN Inc，Chatsworth，ＣＡ）を用いて精製した。このＤＮＡは精製用レジ ンから溶出させ、ＤＮＡ配列決定及び他の解析操作のために調製した。 ２ ＨＰＴＰ−２のSTOMTUTO1 ｃＤＮＡライブラリーの作製及び単離 ＳＴＯＭＴＵＴ01 ｃＤＮＡライブラリーは、胃の腺癌から作製された。ドナ ーは、腹痛と異常な体重減の症状がみられ、胃食道接合部に及ぶ浸潤性グレード ４腺癌の診断を受けた後に、胃全切除術を受けた５２歳の白人男性であった（sp ecimen #0092B;Mayo Clinic,Rochester MN）。病理報告によれば腫瘍細胞は筋層 において見いだされ、胃周囲の脂肪組織に浸潤していた。更に、１８個の生検腹 壁リンパ節の中の６個に転移が見られた。外科的切除は、十二指腸及び食道及び 脾臓の一部まで行われた。外科手術の前に、この患者は胃酸分泌を抑止するため Priloseq（登録商標）（Omeprazole）で処置を受けた。 この冷凍組織を、グアニジウムイソチオシアネート溶液内で、Brinkmann Homo genizer Polytron PT-3000(Brinkmann Instruments,Westbury NJ)を用いてホモ ジナイズし溶解した。このライセートを、Beckman L8-70M Ultracentrifuge（Be ckman Instruments）においてBeckman SW28ロータを用いて、５．７Ｍの塩化セ シウムクッションを通して周囲温度で１８時間、２５０００ｒｐｍで遠心分離し た。ＲＮＡをｐＨ４．０の酸性フェノールで抽出し、０．３Ｍの酢酸ナトリウム 及び２．５倍量のエタノールで沈殿させ、ＲＮアーゼのない水に再懸濁し、 ３７℃でＤＮアーゼ処理した。ｐＨ８．０の酸フェノールクロロフォルムを用い てＲＮＡの抽出を繰り返し、前回と同様に酢酸ナトリウム及びエタノールで沈殿 させた。次にこのｍＲＮＡをQiagen Oligotex kit（QIAGEN Inc;Chatsworth CA ）を用いて単離し、ｃＤＮＡライブラリーの作製のために用いた。 このｍＲＮＡは、SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plas mid Cloning（Cat.#18248-013;Gibco/BRL）の推奨プロトコルに従って取り扱い 、ｃＤＮＡをSepharose CL4Bカラム（Cat.#275105-01;Pharmacia）上で分画化し 、これらのｃＤＮＡで４００ｂｐを超えるものをpSportＩにリゲートした。次に このプラスミドpSport ＩをDH5a^TMコンピテント細胞（Cat.#18258-012;Gibco/BR L）に移入して形質転換させた。 プラスミドＤＮＡは細胞から放出され、REAL Prep 96 Plasmid Kit for Rapid Extraction Alkaline Lysis Plasmid Minipreps（Catalog#26173;QIAGEN,Inc） を用いて精製した。このキットでは、マルチチャネル試薬ディスペンサを用いて ９６穴ブロックにおける９６サンプルの同時精製が可能である。以下の変更点を 除いて推奨プロトコルを採用した。（１）細菌を２５ｍｇ／Ｌのカルベニシン及 び０．４％のグリセロールと共に１ｍｌの滅菌Terrific Broth（Catalog #22711 ,LIFE TECHNOLOGIES^TM）において培養した。（２）植菌の後、培地を１９時間イ ンキュベートし、インキュベーションの後この細胞を０．３ｍｌの溶解バッファ に溶解した。（３）イソプロパノール沈殿の後、プラスミドＤＮＡペレットを０ ．１ｍｌの蒸留水に再懸濁した。プロトコルの最終ステップの後、サンプルを９ ６穴ブロックに移し４℃で保管した。 ３ ｃＤＮＡクローンの配列決定 MUSCNOTO１及びSTOMTUTO１の双方について、ｃＤＮＡの配列 決定は、Hamilton Micro Lab 2200（Hamilton,Reno NV）をPeltier Thermal Cyc lers（PTC200 from M3 Research,Watertown MA）及びApplied Biosystems 377 D NA Sequencing Systemsと共に用いてSanger F及びAR Coulsonの方法（1975;J Mo l Biol 94:441f）により行い、読み枠を決定した、 ４ ｃＤＮＡクローン及びそれらの類推されるタンパク質の相同性検索 Applied Biosystems社で開発された検索アルゴリズムを、INHERIT（商標）670 Sequence Analysis Systemに組み込んで用いて、各ｃＤＮＡの配列をGenBankの 配列と比較した。このアルゴリズムでは、Pattern Specification Language（TR W社、LosAngeles CA）を用いて相同な領域を決定した。配列の比較をどのように 行うかを決定する３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセッ ト、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの組を用いて、対象の配 列に対して相同な領域を含む配列をＤＮＡデータベースから検索し、適切な配列 には、初期値とともにスコアが付けられた。これによって、これらの相同な領域 をドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、相同な領域と偶然の 一致とを区別した。相同性検索の結果は、Smith-Watermanアライメントを用いて 表示した。 ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、INHERIT^TM 670配列解析システムを ＤＮＡ配列の相同性検索で用いたのと同様に用いて確かめた。Pattern Specifil cation Language及びパラメータウィンドウを用いて、タンパク質データベース から相同性領域を含む配列を検索し、その結果には初期値とともにスコアを付け られた。ドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、有意な相同性 を有する領域と偶然の一致とを区別した。 BLASTは、Basic Local Alignment Search Tool(Altschul SF(1993)J Mol Evol36:290-300;Altschul,SF等(1990)J Mol Biol215:403-10)の略称であり 、これを用いて局部的な配列アライメントを検索した。BLASTはヌクレオチド及 びアミノ酸配列の両方のアライメントを生成して配列類似性を求める。そのアラ イメントの局所性のために、BLASTは厳密な一致、すなわちホモログを求める際 に特に有効である。BLASTは間隙を含まない一致を求めるのに役立つ。BLASTアル ゴリズム出力の基本的な単位は、High-scoring Segment Pair（HSP）である。 HSPは２つの配列フラグメントからなり、両フラグメントは任意ではあるが、 そのアライメントが局所的に最大となっている等しい長さものであり、そのアラ イメントスコアはユーザにより設定された閾値すなわちカットオフスコアを満足 、即ち、カットオフスコアを超えている。BLASTアプローチは問い合わせ配列と データベース配列との間のHSPを見つけ出すものであり、見出された任意の一致 の統計的有意性を評価し、そのユーザが設定した有意性の閾値を満足する一致の みを報告するものである。パラメータＥはデータベース配列一致を知らせるため の統計的に有意な閾値を確定するパラメータである。Ｅは全データベース検索の 情況においてHSP（或いはHSPの組）の発生の機会の期待される頻度の上側の境界 として解釈される。その一致がＥを満足する任意のデータベース配列がプログラ ム出力において報告される。 ５ ノーザン法による解析 ノーザン解析は、標識されたヌクレオチド配列と特定の細胞型または組織に由 来するＲＮＡが結合したメンブランとのハイブリッド形成を伴う、遺伝子の転写 物の存在を検出するために用いられる実験技術である（Sambrookら、上述）。 類似のコンピュータ技術で、BLAST(Altschul SF 1993 and 1990，上述)を用い てGenBankまたはLIFESEQ（商標）データベース（Incyte， Palo Alto CA）のようなデータベースにおける同一のまたは近縁な分子を検索し た。この解析は、多くの膜ベースのハイブリダイゼーションより非常に短時間で 行うことができる。更に、コンピュータ検索の感度を変更して、ある一致が正確 な一致か、相同的であるかの分類を決定することができる。 検索の基準値は、積スコアであり、これは以下の式で定義されるものである。 （配列の一致（％）×最大BLASTスコア（％））／１００ この積スコアでは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致の双方 が考慮されている。例えば、積スコアが４０の場合は、一致は誤差が１〜２％の 範囲で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相同な分子は、 通常積スコアとして１５〜４０を示すものを選択することにより同定されるが、 スコアの低いものは近縁関係にある分子として同定される。 検索の結果は、完全長配列、又はその部分が存在するライブラリー、配列の存 在量（abundance）、及びパーセント存在量（percent abundance）のリストとし て報告される。存在量は、特定の転写物の検出回数を直接反映し、パーセント存 在量は、存在量をライブラリー内で検出された配列の総数で除したものである。 ６ ＨＰＴＰをコードする配列の伸長 配列番号：２及び配列番号：４の核酸配列を用いて、部分的ヌクレオチド配列 を完全長まで伸長させるための、或いはゲノムライブラリから５’配列を得るた めのオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。一方のプライマー はアンチセンス方向（ＸＬＲ）の延長を開始するために合成され、他方のプライ マーはセンス方向（ＸＬＦ）に配列を延長するために合成される。これらのプラ イマーにより、周知のＨＰ ＴＰ配列を「外側に」延長し、対象の制御領域の新しい未知のヌクレオチド配列 を含むアンプリコンを生成できるようになった（1995年６月７日出願の米国特許 出願第08/487,112号を本明細書と一体に参照されたい）。初期プライマーは、Ol igo（登録商標）4.06(National Biosciences社、Plymouth MN)、或いは他の適切 なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチドで５０％以上のＧＣ含有 率を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計する ことができる。アピン構造及びプライマー−プライマー二量体化を生じるような 任意のヌクレオチドのストレッチの延長は回避される。 元の選択されたｃＤＮＡライブラリーか、ヒトゲノムライブラリーを用いて配 列を延長する。後者のライブラリーは、５’上流配列を得るために最も役立つ。 必要なら、既知領域をさらに延長するために追加のプライマーの組が設計される 。 XL-PCRキット（Perkin Elmer社）の説明書の指示に従って、酵素と反応混合物 とを完全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られる。４０pmolの各プ ライマーと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始する場 合、ＰＣＲはPeltier Thermal Cycler（PTC200；MJ Reserch社、Watertown MA） を用いて、以下のパラメータで実行される。 ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（その温度を保持） 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）ア ガロースミニゲル上での電気泳動で解析して、反応物が配列を延長することに成 功したか否かを決定する。最も大きな生成物或いはバンドを選択して、ゲルから 切り出した。さらなる精製には、QIAQuick^TM（QIAGEN社）のような市販のゲル抽 出法を用いる。ＤＮＡ回収の後、クレノウ酵素を用いて一本鎖ヌクレオチドの延 び出しを切り取り、再結合及びクローニングを容易にする平滑末端を作った。 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌのリゲーション緩衝液内に再溶解し、 １μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチド キナーゼを加えて、その混合物を室温で２〜３時間、或いは１６℃で一昼夜イン キュベートする。コンピテントな大腸菌細胞（４０μｌの適切な溶媒内にある） を、３μｌのリゲーション混台物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培地（ Sembrook J等、上記）で培養する。３７℃で１時間のインキュベーションの後、 全ての形質転換混合物を、２ｘＣａｒｂを含むLuria Bertani（ＬＢ）寒天（Sem brook J等、上記）上にのせる。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無 作為に選択し、適切な市販の無菌の９６穴マイクロタイタープレートの個々のウ ェル内に入れられた１５０μｌの液状ＬＢ／２ｘＣａｒｂ培地で培養する。さら に後日、５μｌの各一昼夜の培養物を非無菌９６穴プレート内に移し、水で１： １０に希釈した後、各５μｌのサンプルを ＰＣＲアレイ内に移す。 ＰＣＲ増幅のため、４単位のｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを含む１８μｌの濃 縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以 下の条件に従って行う。 ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動 させる。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクロ ーンを選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行う。 ７ ハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 配列番号：２及び配列番号：４の配列に基づくハイブリダイゼーションプロー ブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約 ２０の塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、大きなｃ ＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドを、 ５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０ｍＣｉの[γ‐³²Ｐ]アデノシン三リン酸 （Amersham社,Chicago IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ(DuPont NEN(商 標)、Boston MA)とを組み合わせて用いて標識する。標識されたオリゴヌクレオ チドを、SephadexG-25超精細樹脂カラム（Pharmacia社）を用いて精製 する。毎分１０⁷カウントのセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれ ぞれを含む部分を、以下のエンドヌクレアーゼ（AseI，BglII，EcoRI，Pst I，X ba1或いはPvuII；DuPont NEN（商標））の１つを用いて消化されるヒトゲノムＤ ＮＡの典型的な膜ハイブリダイゼーション解析において用いる。 各消化物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画化して、ナイロン 膜（Nytran Plus,Schleicher&Schuell,Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーシ ョンは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くために、ブロ ットは、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウ ムまで段階的に厳密性が増す条件下で、室温にて順次洗浄される。XOMATAR(登録 商標)フィルム(Kodak，Rochester NY）を、数時間かけてPhosphoimager cassett e(Molecular Dynamics,Sunnyvale CA)においてブロットに露光された後、ハイブ リダイゼーションパターンが視覚的に比較される。 ８ アンチセンス分子 ＨＰＴＰをコードする配列或いはその任意の一部は、自然発生の配列のin viv oまたはin vitro発現を阻害するために用られる。約２０塩基対からなるアンチ センスオリゴヌクレオチドの使用について特に記すが、より大きなｃＤＮＡフラ グメントの場合でも概ね同じ手順を用いることができる。配列番号：２及び配列 番号：４に示すようなＨＰＴＰをコードする配列に基づく相補的なオリゴヌクレ オチド用いて、自然発生ＨＰＴＰの発現を阻害することができる。この相補的な オリゴヌクレオチドを最も独特な５’配列から設計し、これを用いてプロモータ ーが結合するのを阻害することにより転写を抑制したり、リボソームが転写物に 結合するのを阻害してＨＰＴＰ転写物の翻訳を抑制することができる。配列番号 ：２及び配列番号：４のリーダー配列及び５’配列の適切な部分 を用いることにより、効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが、第１Ａ図、 第１Ｂ図、第１Ｃ図、第２Ａ図、第２Ｂ図、又は第２Ｃ図に示すポリペプチドの シグナル配列または初めの方のコーディング配列に翻訳される領域全体にわたる １５〜２０個のヌクレオチドを含むようになる。 ９ ＨＰＴＰの発現 ＨＰＴＰの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクター内にサブクローニングし、その ベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって行われる。クローニン グ用のpBluescriptベクターを、大腸菌株であるXL1-BlueMRF（商標）（Stratage ne）においてＨＰＴＰを発現するのに用いる。クローニング部位の上流には、β −ガラクトシダーゼに対するプロモータが存在し、その後ろにはアミノ基末端メ チオニン及びβ−ガラクトシダーゼの７残基が存在する。直後に続くこれら８つ の残基は、転写に役立つバクテリオフアージプロモータ一であり、多くの独特の 切断部位を含むリンカーである。 単離されたトランスフェクト菌種を、IPTGとともに標準的な方法を用いて誘導 することにより、初めのβガラクトシダーゼの７残基、約５〜１５残基のリンカ ー、及び完全長ＨＰＴＰからなる融合タンパク質を作り出す。このシグナル配列 は菌培地へのＨＰＴＰの分泌を誘導し、この培地は後に行う活性のアッセイにお いて直接用いることができる。 １０ ＨＰＴＰ活性の測定 ＨＰＴＰの活性をＰ−ニトロフェニールリン酸（ＰＮＰＰ）の加水分解によっ て測定する。ＨＰＴＰを、０．１％のｂ−メルカプトエタノールの存在の下で、 ｐＨ７．５のＨＥＰＥＳバッファにおいてＰＮＰＰと共に３７℃で６０分間イン キュベートする。この反応を、６ｍｌの１０Ｎ ＮａＯＨを加えて停止させ、加 水分解されたＰＮＰＰの４１０ｎｍ での光吸収の上昇を、分光光度計を用いて測定する(Diamond等，前出)。 １１ ＨＰＴＰ特異的抗体の産生 標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化及び抗体の産生には、ＰＡＧＥ電 気泳動法（Sambrook前出）を用いて実質的に精製されたＨＰＴＰを用いる。ＨＰ ＴＰから翻訳されたアミノ酸配列をDNAStarソフトウエア（DNASTAR社）を用いて 解析して免疫抗原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを当業者には 周知の手段により合成して、当業者に周知の方法で抗体をを産生するために用い る。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープ（第３図に示す） のような、適切なエピトープを選択するための解析法は、Ausubel FM等（上記） の論文に記載されている。 通常、約１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペ プチドシンセサイザーModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し 、Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ ：Ausubel FM等、上記）を用いた反応によりキーホールリンペットヘモシニアン （ＫＬＨ、Sigma）に結合する。フロイントの完全アジュバントにおけるオリゴ ペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫する。得られた抗血清の抗ペプチ ド活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、１％BSAを用 いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識さ れたヤギ抗ウサギＩｇＧに反応させる。 １２ 特異的抗体を用いる自然発生ＨＰＴＰの精製 自然発生ＨＰＴＰ或いは組換え体ＨＰＴＰは、ＨＰＴＰに特異的な抗体を用い るイムノアフィニティークロマトグラフィにより精製することができる。イムノ アフィニティーカラムは、CnBr活性化Sepharose（Pharmacia Biotech社）のよう な活性化クロマトグラフレジンとＨＰ ＴＰ抗体とを共有結合させることにより構築される。結合後、そのレジンを使用 説明書の指示に従って、ブロックし洗浄する。 ＨＰＴＰを含む培地をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをＨＰ ＴＰを優先的に吸着できる条件下で（例えば界面活性剤の存在下において高イオ ン強度緩衝剤で）洗浄する。このカラムを、抗体／ＨＰＴＰ結合を切るような条 件下（例えばｐＨ２〜３の緩衝剤、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イ オンのようなカオトロピックイオン）で溶出させ、ＨＰＴＰを回収する。 上記のすべての刊行物及び特許明細書は、本明細書と一体に参照されたい。本 発明の記載した方法及びシステムの種々の改変は、本発明の範囲及び精神から逸 脱しないことは当業者には明らかであろう。本発明は特に好適な実施例に関連し て記載されているが、本発明の請求の範囲は、そのような特定の実施例に不当に 制限されるべきではないことを理解されたい。実際には、本発明を実施するため に記載された方法の種々の改変は、分子生物学或いは関連する分野の当業者には 明らかなように、後述の請求の範囲内に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ａ６１Ｐ 11/00 Ａ６１Ｐ 11/00 13/08 13/08 13/10 13/10 15/08 15/08 19/02 19/02 25/00 25/00 29/00 29/00 １０１ １０１ 35/00 35/00 43/00 １０５ 43/00 １０５ Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ０７Ｋ 16/40 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 9/16 Ｂ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 9/16 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/54 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＲ ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＩＬ， ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ，Ｕ Ｓ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：１のアミノ酸配列又はその断片を含む実質的に精製されたヒト・ プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド。 ２．請求項１のポリペプチドをコードする単離され精製されたポリヌクレオチド 配列。 ３．配列番号：２の配列又はその変異体を含む請求項２の単離され精製されたポ リヌクレオチド配列。 ４．配列番号：２の配列又はその変異体に対して相補的なポリヌクレオチド配列 。 ５．請求項２のポリヌクレオチド配列を含む組換え体発現ベクター。 ６．請求項５の発現ベクターを含む組換え体宿主細胞。 ７．配列番号：１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドの生成方法であって、 （ａ）該ポリペプチドの発現に適した条件の下で請求項６の宿主細胞を培養す る過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から該ポリペプチドを回収する過程とを含むことを 特徴とする配列番号：１に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドの生成方法。 ８．配列番号：１のアミノ酸配列又はその断片を有する実質的に精製されたヒト ・プロテインチロシンホスファターゼポリペプチドを、適切な製薬学的担体と共 に含む医薬品組成物。 ９．請求項１のポリペプチドに特異的に結合する精製された抗体。 １０．請求項１のポリペプチドの活性を特異的に調節又は変調する精製されたア ンタゴニスト。 １１．配列番号：３のアミノ酸配列又はその断片を含む実質的に精製されたヒト ・プロテインチロシンホスファターゼポリペプチド。 １２．請求項１１のポリペプチドをコードする単離され精製されたポリヌクレオ チド配列。 １３．配列番号：４の配列又はその変異体を含む請求項１２に記載の単離され精 製されたポリヌクレオチド配列。 １４．配列番号：４の配列又はその変異体に対して相補的なポリヌクレオチド配 列。 １５．請求項１２のポリヌクレオチド配列を含む組換え体発現ベクター。 １６．請求項１５の発現ベクターを含む組換え体宿主細胞。 １７．請求項３に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドの生成方法であって、 （ａ）該ポリペプチドの発現に適した条件の下で請求項１６の宿主細胞を培養 する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から該ポリペプチドを回収する過程とを含むことを 特徴とする配列番号：３に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドの生成方法。 １８．配列番号：３のアミノ酸配列又はその断片を有する実質的に精製されたヒ ト・プロテインチロシンホスファターゼポリペプチドを、適切な製薬用担体と共 に含む医薬品組成物。 １９．請求項１１のポリペプチドに特異的に結合する精製された抗体。 ２０．請求項１１のポリペプチドの活性を特異的に調節又は変調する精製された アンタゴニスト。