JP2002512527A - ヒト・プレプロタキキニンｂ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、ヒト・プレプロタキキニンＢ（ＰＰＴ−Ｂ）及びＰＰＴ−Ｂを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、発現ベクター、宿主細胞、アゴニスト、抗体、及びアンタゴニストを提供する。また本発明は、ＰＰＴ−Ｂの発現に関係する疾病の治療方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒト・プレプロタキキニンＢ技術分野 本発明は、ヒト・プレプロタキキニンＢ（preprotachykinin B）の核酸及びア ミノ酸配列、及び神経性疾患及び腫瘍性疾患の診断、予防、及び治療におけるこ れらの配列の使用に関するものである。発明の背景 生物活性ペプチドは、ホルモン、パラクリン調節因子、又は化学的神経伝達物 質として機能する。これらのペプチドは、通常より大形で多くの場合不活性の前 駆体分子のタンパク分解により放出される。神経ペプチドは、中枢神経系（ＣＮ Ｓ）において、神経伝達物質として、神経調節物質として、及び神経栄養性因子 として様々な機能を果たす(Stewart,J.M.及びHall.M.E.(1993)Agents Actions S uppl.42:211-226)。神経ペプチドは、アミン神経伝達物質放出の重要な調節因子 でもあり、幾つかの生理学的状態において重要な役割を果たすものとして同定さ れ得る（Stewart and Hall(1993)前出）。 タキキニンは、多くの生物学的プロセスの調節に関与する極めて近縁なペプチ ドのファミリーを含む。タキキニンは、そのＣ末端におけるアミノ酸配列Phe-X- Gly-Leu-Met-NH₂によって特性化される。ここでＸは芳香族アミノ酸（Phe,Tyr） 又は分岐脂肪族アミノ酸（Val,Ile）を表す。このタキキニンペプチドであるサ ブスタンスＰ（ＳＰ）、ニューロキニンＡ（ＮＫＡ）、ＮＫＡ（３−１０）、神 経ペプチドＫ、及び神経ペプチドγは、一個のプレプロタキキニン遺伝子、プレ プロタキキニンＡ（ＰＰＴ−Ａ）から産生される。ＰＰＴ−ＡのｍＲＮＡの異な ったスプライシングによって、αＰＰＴ−Ａ、βＰＰＴ−Ａ、γＰＰＴ−Ａ、及 びδＰＰＴ−Ａ ｍＲＮＡ種が作り出される。プレプロタンパク質の 翻訳後プロセシングにより、一個の細胞内において、及びその遺伝子を発現する 異なる細胞において複数種の活性産物が生ずる（Helke,C.J.(1990)FASEB J.4:16 06-1615;Nakanishi,S.(1987)Physiol.Rev.67:1117-1参照）。ヒト脳脊髄液（Ｃ ＳＦ）において、成熟ペプチドではないがＮ末端が延長されたＳＰ及びＮＫＡが 、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて測定可能な量検出された。 この事は、ＣＳＦにおけるそれらの濃度を、中枢のＳＰ及びＮＫＡニューロンに おける活性のマーカーとして利用できるということを示唆している(Toresson,G. 等(1993)Regul.Pept.46:357-359）。哺乳動物では、ＳＰ及びＮＫＡによって、 循環系における血管拡張が生じ、またＳＰ及びＮＫＡは、炎症及び免疫プロセス に関与し、且つアレルギー疾患の発病において一定の役割を果たす（0tsuka M． 及びYoshioka,K.(1993)Physiol.Rev.73:229-308）。 第２のプレプロタキキニン遺伝子、ＰＰＴ−Ｂは、プロニューロキニンＢをコ ードする（Kotani,H.等(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:7074-7078）。ラット のプロニューロキニンＢのタンパク分解酵素による切断によって、ニューロキニ ンＢ（NKB）及び３０個の残基からなるペプチドが生ずる（Lang,S汲びSperk,G.( 1995)Regul.Pept.57:183-192）。ＰＰＴ−ＢのｍＲＮＡ及びペプチド産物は、Ｃ ＮＳ(特に視床下部)及び末梢組織全体にわたって異なって分布している(Helke,C .J.(1990)前出)。ＰＰＴ−ＢのｍＲＮＡは、ウシ及びラットの脳から単離され、 これらのタンパク質は、７５％のアミノ酸残基同一性を共有している（Kotani,H .等（1986）前出:Bonner,T.I.等(1987)Brain Res．388:243-249）。 ＮＫＢは、幅広く様々な生物学的機能に関与していることが分かった。例えば 、合成したラットＮＫＢでラットに急性的な処置を行うことによ り、Ｎ−メチル−Ｄアスパラギン酸の大形細胞基底核への注射に伴う皮質コリン アセチルトランスフェラーゼ活性の低下が防止できた。またＮＫＢは、嗅内皮質 の障害によって生じた行動能力の障害を軽減させた（Wenk,G.L.等(1997)Behav.B rain Res．83:129-133）。ラットの海馬の顆粒細胞におけるラットＮＫＢ ｍＲ ＮＡの濃度及びＮＫＢの免疫反応性は、辺縁てんかん発生の後に強くなった。こ れらの変化は、シナプス伝達に明らかな影響を及ぼし、且つ海馬興奮性の調節に 影響を与え得ることが示唆されてきた（Schwarzer,C.等(1996)Brain Res.Rev.22 :27-50）。末梢神経系の腫瘍においては、ＳＰやＮＫＡではなく大量のＮＫＢが 認められた。またＰＰＴ−Ｂ遺伝子発現がＰＰＴ−Ａの発現を上回っており、Ｐ ＰＴ−Ｂ遺伝子の発現が神経組織の腫瘍マーカーとして使用可能であることが示 唆された(McGregor,G.P.等(1990)FEBS Lett.277:83-87)。ラットにおいて気道粘 液分泌によって誘導されるＮＫＢ、及びＮＫＢアゴニストである[ＭｅＰｈｅ７] −ＮＫＢは、in vitroでモルモットの肺の実質性組織片の収縮を引き起こした（ Wagner,U.等(1995)Life Sci.57:283-289:Killingsworth,C.R.及びShore,S.A.(19 95)Regul.Pept.57:149-161）。ＮＫＢは、ＮＫ−３、受容体に結合したＧタンパ ク質と相互作用し、Ｃａ²⁺、イノシトール三リン酸、及びジアシルグリセロール によって活性化されたセカンドメッセンジャー経路を誘導することにより細胞の 生化学を調節する（Helke,C.J.等（1995）前出）。この３０残基のペプチド（プ レプロタキキニンＢ（５０−７９））の特性は未知である。 新規なヒト・プレプロタキキニンＢ及びそれをコードするポリヌクレオチドの 発見は、神経性及び腫瘍性疾患の診断、予防、及び治療において役立つ新たな物 質を提供することにより、当分野における必要性を満たす。発明の要約 本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する実質的に精製されたポリ ペプチドであるヒト・プレプロタキキニンＢ（ＰＰＴ−Ｂ）、又はその断片を提 供する。 更に本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする 単離され実質的に精製されたポリヌクレオチド配列、又はその断片、及び前記ポ リヌクレオチド配列を含む組成物を提供する。また本発明は、配列番号：１のア ミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配列に厳密な条件の下でハイブリダイ ズするポリヌクレオチド配列、又は前記ポリヌクレオチド配列の断片を提供する 。更に本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド配 列の相補配列を含むポリヌクレオチド配列、又は前記ポリヌクレオチド配列の断 片若しくは変異配列を提供する。 また本発明は、配列番号：２の配列を含む単離され精製された配列又はその変 異配列を提供する。更に本発明は、配列番号：２のポリヌクレオチド配列と厳密 な条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を提供する。 別の実施態様では、本発明は、配列番号：２の相補配列を含む単離され精製さ れたポリヌクレオチド配列、又はその断片若しくは変異配列を含む組成物を提供 する。また本発明は、配列番号：２の相補配列を含むポリヌクレオチド配列を提 供する。 更に本発明は、クレームされたポリヌクレオチド配列の何れかの少なくとも断 片を含む発現ベクターを提供する。更に別の実施態様では、前記ポリヌクレオチ ド配列を含む発現ベクターは、宿主細胞に含められる。 また本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチド又はその断片 の製造方法であって、（ａ）前記ポリペプチドの発現に適した 条件の下でＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチド配列の少なくとも断片を含 む発現ベクターを含む宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）前記宿主細胞の培地か ら前記ポリペプチドを回収する過程とを含む、配列番号：１のアミノ酸配列を含 むポリペプチド又はその断片の製造方法を提供する。 また本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたＰＰ Ｔ−Ｂを、適切な医薬用担体と共に含む医薬品組成物を提供する。 また本発明は、配列番号：１のポリペプチドの精製されたアンタゴニストを提 供する。或る実施態様では、本発明は、配列番号：１のアミノ酸配列の少なくと も断片を含むポリペプチドに結合する精製された抗体を提供する。 更に本発明は、配列番号：１のポリペプチドの活性を変調する精製されたアゴ ニストを提供する。 また本発明は、神経性疾患の治療又は予防方法であって、そのような治療が必 要な患者に、ＰＰＴ−Ｂを含む医薬品組成物を有効な量投与する過程を含む、神 経性疾患の治療又は予防方法を提供する。 また本発明は、腫瘍性疾患の治療又は予防方法であって、そのような治療が必 要な患者に、ＰＰＴ−Ｂに対するアンタゴニストを有効な量投与する過程を含む 、腫瘍性疾患の治療又は予防方法を提供する。 また本発明は、生物学的サンプルにおけるＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレ オチドの検出方法であって、（ａ）ＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチド配 列の相補配列と、生物学的サンプルの核酸材料とをハイブリダイズさせ、ハイブ リダイゼーション複合体を形成する過程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション 複合体を検出する過程であって、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプルに おけるＰＰＴ−Ｂをコード するポリヌクレオチドの存在と相関性を有する、該過程とを含む、生物学的サン プルにおけるＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチドの検出方法を提供する。 或る実施態様では、ハイブリダイゼーションの前に、前記生物学的サンプルの核 酸材料を、ＰＣＲ法により増幅する。図面の簡単な説明 第１Ａ図及び第１Ｂ図は、ヒトＰＰＴ−Ｂのアミノ酸配列(配列番号：１)及び 核酸配列（配列番号：２）を示す。配列アライメントは、MacDNASIS PRO^TMソフ トウェア（Hitachi Software Engineering Co.,Ltd.,San Bruno,CA）を用いて作 成した。 第２図は、ヒトＰＰＴ−Ｂ（配列番号：１）、ウシＰＰＴ−Ｂ（GI 163590； 配列番号：３）、ラットＰＰＴ−Ｂ（GI 205724；配列番号：４）、の間のアミ ノ酸配列アライメントを示す。この配列アライメントは、DNASTAR^TMソフトウェ ア（DNASTAR Inc,Madison WI）のマルチシーケンスアライメントプログラムを用 いて作成した。 第３Ａ図及び第３Ｂ図は、それぞれヒトＰＰＴ−Ｂ（配列番号：１）及びウシ ＰＰＴ−Ｂ（GI 163590；配列番号：３）の疎水性プロットを示す。Ｘ軸は正の 方向にアミノ酸の位置を表し、Ｙ軸は負の方向に疎水性を表す（MacDNASIS PRO ソフトウェアを用いて作成）。発明の実施の形態 本発明のタンパク質、核酸配列、及び方法について説明する前に、本発明は、 ここに開示した特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター、及び試薬に限定 されず、その実施形態を変えて実施できることを理解されたい。また、ここで用 いられる用語法は、特定の実施例のみを説明する目的で用いられたものであり、 請求の範囲のみによって限定される本発明の範囲を限定することを意図したもの ではないということも理解されたい。 本明細書及び請求の範囲において、単数を表す「或る」及び「その（この）」 と形容されたものは、前後関係でそうでないことが明らかである場合以外は、複 数の意味も含んでいることに注意しなければならない。従って、例えば「或る宿 主細胞」なる表記が表すものには、複数のそのような宿主細胞が含まれ、この「 抗体」なる表記は、１種またはそれ以上の種類の抗体及び当業者に周知のその等 価物等も表している。 本明細書における全ての科学技術専門用語は、特別に定義されていない限り、 本発明の属する技術分野において通常の知識を有する者に一般に理解されるのと 同じ意味を有する。ここに説明したものと類似のまたは等価な方法や材料を本発 明の実施や試験において用いることができるが、好適な方法、装置、及び材料は ここに説明する。本明細書に記載された全ての文献は、本発明の関連において用 いられ得る文献で報告された細胞系、ベクター、及び方法論を説明し開示する目 的で引用されたものであり、この引用により本明細書の一部とする。この引用の 記載は、本発明がその権利を有していない、従来発明によって先行開示されたそ のような開示内容に対して本発明が優先することを本発明に許容するためのもの と解釈してはならない。 定義 本明細書において、ＰＰＴ−Ｂは、任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウ ス、ウマ、及び好ましくはヒトを含む哺乳動物から得られる、天然の、合成の、 半合成の、又は組換え体を起源とする実質的に精製されたＰＰＴ−Ｂのアミノ酸 配列である。 本明細書において、用語「アゴニスト」は、ＰＰＴ−Ｂに結合したとき、ＰＰ Ｔ−Ｂの効果を強めたり、その効果の持続時間を長くさせる分子である。アゴニ ストには、ＰＰＴ−Ｂに結合し、その効果を変調する タンパク質、核酸、糖質や、任意の他の分子が含まれ得る。 本明細書において「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＰＰＴ−Ｂの対立形 である。アレルは、核酸配列の少なくとも一箇所の変異によって生じ、変異ｍＲ ＮＡ或いはポリペプチドを生ずるが、そのｍＲＮＡ或いはポリペプチドの構造或 いは機能は、変わる場合もあれば変わらない場合もある。遺伝子によっては、ア レル形が存在しないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するものがある。 一般にアレルを生じる変異はアミノ酸の自然な欠失、付加並びに置換に因るもの である。このタイプの変化はそれぞれ単独で、或いは他の変化と同時に、所定の 配列内で１又は２箇所以上生じ得る。 本明細書において、ＰＰＴ−Ｂをコードする「変異」核酸配列とは、異なるヌ クレオチド残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に同一の、または機能的 に等価なＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチドとなるものである。この定義 には、ＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチド配列の正常な染色体上の遺伝子 座以外の位置における、アレルとの不適切又は予期しないハイブリダイゼーショ ン、及びＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチドの特定のオリゴヌクレオチド プローブを用いて容易に検出可能な、或いは検出が困難な多形性が含まれている 。コードされたタンパク質も同様に「変異」したものであり得、サイレント変化 を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に機能的に等価な ＰＰＴ−Ｂとなるものであり得る。意図的なアミノ酸置換は、ＰＰＴ−Ｂの生物 学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水 性並びにまた両親媒性についての類似性に基づいてなされ得る。例えば負に荷電 したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミ ノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、近い親水性値を持つ荷電していない極 性頭基を有するア ミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラ ギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン並びにチロシンが含 まれる。 本明細書において「アミノ酸配列」は、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプ チド、又はタンパク質の配列及びその断片であり、自然発生又は合成の分子であ る。ＰＰＴ−Ｂの断片は、好ましくは約５〜約１５個のアミノ酸からなる長さを 有し、ＰＰＴ−Ｂの生物学的活性又は免疫学的活性を保持しているものである。 ここでは「アミノ酸配列」が、自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を指すも のとして用いられているが、「アミノ酸配列」や類似の用語は、アミノ酸配列を 、列挙されているタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限 定する意味で用いられるわけではない。 本明細書において「増幅」は、核酸配列の更なる複製物を生成することであり 、通常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて行われる（D ieffenbach,C.W.及びG.S.Dveksler(1995)PCR Primer.a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,NY）。 本明細書において、用語「アンタゴニスト」は、ＰＰＴ−Ｂに結合したとき、 ＰＰＴ−Ｂの生物学的又は免疫学的効果の大きさを低下させたり、持続時間を短 縮させる分子である。アンタゴニストは、ＰＰＴ−Ｂの作用を低下させるタンパ ク質、核酸、糖質や、任意の他の分子を含んでいることがある。 本明細書において、用語「抗体」は、完全な抗体分子及び例えばFa、F(ab')₂ 、及びFvのようなその断片であって、抗原決定基と結合し得るものである。ＰＰ Ｔ−Ｂポリペプチドに結合する抗体は、完全なポリペプチド、或いは免疫化する 抗原としての目的の小型のペプチドを含むそ の断片を用いて調製することができる。動物を免疫化するのに用いられるポリペ プチドまたはペプチドは、翻訳されたｃＤＮＡまたは化学的合成物を起源とする ものであり得、必要ならば担体タンパク質と結合することができる。ペプチドに 化学的に結合する、通常用いられる担体には、ウシ血清アルブミン及びサイログ ロブリンが含まれる。次にこの結合したペプチドを用いて動物（例えばマウス、 ラット、またはウサギ）を免疫化する。 本明細書において、用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の一部 分（即ちエピトープ）である。タンパク質またはタンパク質の断片を用いてホス トの動物を免疫化すると、このタンパク質の種々の領域が、該タンパク質上の所 定の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生が誘発され得る。この ような領域または構造を抗原決定基と称する。抗原決定基は、抗体への結合につ いて、元の抗原（即ち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得 る。 本明細書において用語「アンチセンス」は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に 対して相補的なヌクレオチド配列である。「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖 に対して相補的な核酸鎖の意味で用いられる。アンチセンス分子はペプチド核酸 を含み、合成や転写を含む任意の方法で作ることができる。この相補的ヌクレオ チドは、一度細胞内に導入されると、細胞によって作られた天然の配列と結合し て二重鎖を形成し、この二重鎖は更なる転写や翻訳を阻害する。「ネガティブ（ −）」なる表現はアンチセンス鎖の意味で時折用いられ、「ポジティブ（＋）」 はセンス鎖の意味で用いられることがある。 本明細書において、用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造的機能 、調節機能、又は生化学的機能を有するタンパク質を表す。同様に「免疫学的に 活性」は、天然の、組換え体の、又は合成のＰＰＴ− Ｂ、若しくはその任意のオリゴペプチドの、適当な動物や細胞における特定の免 疫応答を誘発し、特定の抗体に結合する能力を指す。 本明細書において、用語「相補的」または「相補性」は、許容的な塩及び温度 条件の下での塩基対によるポリヌクレオチド同士の自然の結合である。例えば、 配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの二本鎖分子 間の相補性は、幾つかの核酸のみが結合している「部分的」なものであるか、若 しくは一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合は完全に相補的なものであり 得る。核酸鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブリダイゼーションの効 率及び強度に有意な影響を与える。このことは、核酸鎖同士の結合によって左右 される増幅反応や、ＰＮＡ分子の設計及び使用において特に重要である。 本明細書において「所定のポリヌクレオチド配列を含む組成物」とは、広く所 定のポリヌクレオチド配列を含む任意の物質をさす。この組成物は、乾燥した製 剤又は水溶液を含み得る。ＰＰＴ−Ｂ（配列番号：１）をコードするポリヌクレ オチド配列又はその断片（例えば配列番号：２又はその断片）を含む組成物は、 ハイブリダイゼーションプローブとして利用することができる。このプローブは 凍結乾燥した形態で保存することができ、糖質のような安定化剤と結合させるこ とができる。ハイブリダイゼーションにおいて、このプローブは、塩（例えばＮ ａＣｌ）、界面活性剤（例えばＳＤＳ）及び他の物質（例えばデンハート液、乾 燥ミルク、サケ精子ＤＮＡ等）に展開することができる。 本明細書において「コンセンサス」は、再度シークエンシングされて不要な塩 基が分離された核酸配列か、XL-PCR^TM（Perkin Elmer,Norwalk,CT）を用いて５ ’方向及び／または３’方向に延長されて、再度シークエンシングされた核酸配 列か、フラグメントの組み合わせのためのコンピュータプログラム（例えばGELV IEW^TM Fragment Assembly system,GCG,Madison WI）を用いて２種以上のインサイト社クローンの 重複した配列を組み合わせて作られた核酸配列である。延長と組み合わせの双方 によってコンセンサス配列が作られることもある。 本明細書において、「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」なる表現は 、ノーザン解析により配列番号：２に類似なリボ核酸の存在が検出されることが 、サンプル内のＰＰＴ−ＢをコードするｍＲＮＡの存在を表しており、従って該 タンパク質をコードする遺伝子からの転写物の発現と相関性を有しているという ことを表している。 本明細書において「欠失」は、１個以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基 が欠けることになる、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化である 。 本明細書において、用語「誘導体」は、ＰＰＴ−Ｂをコードする核酸或いはそ れに相補的な核酸又はコードされたＰＰＴ−Ｂを化学的に修飾したものを意味す る。このような修飾の例には、水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基へ の置換がある。核酸誘導体は、未修飾のＰＰＴ−Ｂの生物学的又は免疫学的機能 を保持しているポリペプチドをコードする。誘導体ポリペプチドは、元のポリペ プチドの生物学的又は免疫学的機能を保持しており、グリコシル化、ポリエチレ ングリコール化（PEGylation）、又は他の任意のプロセスで修飾されたものであ る。 本明細書において、用語「相同性」は、或る程度の相補性を意味する。部分的 な相同と、完全な相同（即ち同一）の場合があり得る。部分的に相補的な配列は 、同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害す るものであり、このことを機能的な表現「実質的に相同な」で表す。完全に相補 的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、低い厳密性条件の下 で、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロット法またはノーザンブロッ ト法、溶液ハイブリ ダイゼーション等）を用いて検定することができる。実質的に相同な配列または プローブは、低い厳密性条件の下で標的の配列と、完全に相同な配列またはプロ ーブとの結合（即ちハイブリッド形成）について競合し、それを阻害する。この ことは、低い厳密性の条件が、非特異的な結合を許容するようなものであるとい うことを意味するわけではない。低い厳密性条件では、２つの配列の相互の結合 が特異的（即ち選択的）相互作用であることが必要である。非特異的結合が存在 しないことは、部分的な程度の相補性（即ち約３０％未満の同一性）も有してい ない第２の標的配列を用いることにより調べることができる。非特異的結合が存 在しない場合、プローブは第２の非相補的標的配列とハイブリダイズしない。 ヒト人工染色体（ＨＡＣ）は１０Ｋ〜１０ＭのサイズのＤＮＡ配列を含んでお り、安定した分裂染色体の分離及び維持に必要な全ての要素を含む直鎖状の小染 色体である（Harrington,J.J.等(1997)Nat Genet.15:345-355）。 本明細書において、用語「ヒト化抗体」は、元の結合能力をそのまま保持しつ つ、ヒトの抗体により近づけるために非抗体結合領域においてアミノ酸を置換し た抗体分子である。 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）」は 、核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する過程である。 本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なＧ塩 基とＣ塩基の間及び相補的なＡ塩基とＴ塩基の間での水素結合の形成によって、 ２つの核酸配列で形成された複合体である。これらの水素結合は、塩基スタッキ ング相互作用（base stacking interaction）により更に安定化し得る。この２ つの相補的核酸配列は水素結合して、逆平行構造をなす。ハイブリダイゼーショ ン複合体は、溶液中で形成さ れるか（例えばＣ₀ｔ又はＲ₀ｔ解析）、或いは核酸は溶液中に存在する一方の核 酸と、固体支持体（例えば細胞やその核酸が固定される紙、メンブラン、フィル ター、ピン、またはスライドガラスまたは他の適切な基板）に固定されたもう一 方の核酸との間で形成され得る。 本明細書において「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子と比較して、１ 個または２個以上のヌクレオチド、アミノ酸残基がそれぞれ加わるような、ヌク レオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。 「マイクロアレイ」とは、基板上に、合成された個々のポリヌクレオチド又は オリゴヌクレオチドを高密度で配列したものである。基板には例えば紙、ナイロ ン又は他のタイプのメンブラン、濾紙、チップ、スライドガラス、又は他の任意 の適切な固体支持体が用いられる。 本明細書において、用語「変調」は、ＰＰＴ−Ｂの活性の変化である。例えば 、変調によって、タンパク質活性の上昇や低下、結合特性の変化、又はＰＰＴ− Ｂの生物学的、機能的、免疫学的特性の他の変化がもたらされる。 本明細書において「核酸配列」は、一本鎖か二本鎖の、センス鎖又はアンチセ ンス鎖である、ゲノム起源又は合成起源のＤＮＡ、ＲＮＡや、オリゴヌクレオチ ド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びその断片又は一部分である。「 断片（フラグメント）」は、長さが６０ヌクレオチド以上の核酸配列であり、最 も好ましくは、長さが１００ヌクレオチド以上又は１０００ヌクレオチド以上、 及び１００００ヌクレオチド以上の断片を含む。 本明細書において「オリゴヌクレオチド」は、ＰＣＲ増幅又はハイブリダイゼ ーションアッセイ、若しくはマイクロアレイで用いることができる核酸配列であ って、長さが約６ヌクレオチド以上、最大６０ヌクレオチド程度、好適には１５ 〜３０ヌクレオチド、より好適には２０〜２ ５ヌクレオチドであるものを指す。本明細書において、オリゴヌクレオチドは、 当分野において一般に定義されている用語「アンブリマー」、「プライマー」、 「オリゴマー」、及び「プローブ」と実質的に同義である。 本明細書において「ペプチド核酸」ＰＮＡは、末端がリジンであるアミノ酸残 基のペプチドバックボーンに結合した５ヌクレオチド以上の長さのオリゴヌクレ オチドを含むアンチセンス分子又は抗遺伝子剤を意味する。末端のリジンがこの 物質に安定性を賦与している。ＰＮＡをポリエチレングリコール化して細胞にお けるＰＮＡの寿命を延ばすことができる。このような細胞では、ＰＮＡが相補的 な一本鎖ＤＮＡやＲＮＡに優先的に結合して、転写物の伸長を止める。（Nlelse n,P.E.等(1993)Anticancer Drug Des.8:53-63）。 本明細書において、（「所定のタンパク質の一部分」と用いられるような）タ ンパク質に関連する用語「一部分」は、そのタンパク質の断片である。この断片 のサイズは５個のアミノ酸残基から、（全アミノ酸配列−１）個のアミノ酸の範 囲に亘る。従って、「配列番号：１のアミノ酸配列の少なくとも一部分を含む」 タンパク質は、完全長ヒトＰＰＴ−Ｂとその断片を含む。 本明細書において、用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられている 。ＰＰＴ−Ｂをコードする核酸またはその断片またはＰＰＴ−Ｂ自体を含む疑い のある生物学的サンプルは、体液や、細胞から単離された染色体、細胞小器官、 又は細胞膜からの抽出物や、細胞や、（溶液中の、または例えばサザンブロット 解析用に固体支持体に結合した）ゲノムのＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡや、 組織や、組織プリントその他を含み得る。 本明細書において、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」 は、抗体及びタンパク質またはペプチドの相互作用が、タンパク質上の特定の構 造（即ち抗原決定基、つまりエピトープ）の存在に左右されることを意味してい る。つまり、この抗体はタンパク質全体ではなく、特定のタンパク質構造を認識 して結合する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識 した「Ａ」及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり結合してい ない、無標識のＡ）を含むタンパク質が存在すると、抗体に結合した標識Ａの量 が低下する。 本明細書において、用語「厳密な条件」又は「厳密性」は、核酸、塩、及び温 度によって定義されるようなハイブリダイゼーションの条件をさす。これらの条 件は当分野でよく知られており、同一のポリヌクレオチド配列の同定や検出のた めであるか、或いは近縁なポリヌクレオチド配列の同定や検出のためであるかに よって変えることができる。低い厳密性条件か高い厳密性条件の何れかを含む名 目上の等価な条件は、例えば配列の長さ及び性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成） 、標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基組成）、環境（溶液中に存在するか或いは 固定されているか等）、塩や他の成分の濃度（例えばホルムアミド、デキストラ ン硫酸、及び／またはポリエチレングリコールの有無）、及び反応の温度（プロ ーブの融解温度（Ｔｍ）より５℃下からＴｍの約２０〜２５℃下までの範囲内） のような要素によって決まる。１又は２以上の因子を変更することによって、上 に列挙した条件とは異なるが等価である低い厳密性または高い厳密性の何れかの 条件を作り出すことができる。 本明細書において、用語「実質的に精製」は、天然の環境から取り除かれ、天 然にはそれが結合して存在する他の構成要素から単離又は分離されて、その構成 要素が６０％以上、好ましくは７５％以上、最も好ましくは９０％以上除去され た核酸配列又はアミノ酸配列である。 本明細書において「置換」は、それぞれ１個または２個以上のヌクレ オチド或いはアミノ酸を、異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置換することに よって生ずる変化である。 本明細書の定義では、「形質転換」は、外来ＤＮＡが入り込みレシピエント細 胞を変化させるプロセスを意味する。このプロ七スは、よく知られた種々の方法 を用いた天然または人工の条件の下で生じ得る。形質転換は、外来核酸配列を原 核細胞または真核細胞の宿主細胞に導入するための何らかの既知の方法に基づい ている。この方法は形質転換される宿主細胞によって選択され、以下のものに限 定されないが、ウイルス感染による方法、電気穿孔法（エレクトロポレーション ）、リポフェクション、及び微粒子銃を用いる方法が含まれ得る。このような「 形質転換された」細胞は、そのなかで挿入されたＤＮＡが、自律的に複製するプ ラスミドとして、または宿主の染色体の一部として複製が可能な安定的に形質転 換された細胞を含む。またこのような細胞は、限られた時間の導入ＤＮＡやＲＮ Ａの一過性の発現をする細胞も含む。 本明細書においてＰＰＴ−Ｂの「変異体」は、１又は２箇所以上のアミノ酸が 変異したアミノ酸配列である。この変異体は「保存的」変化を含むものであり得 、この保存的変化の場合は、例えばロイシンをイソロイシンで置き換える場合の ように置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性を有する。稀に、変異 体が「非保存的」に変化する場合もあり、この非保存的変化の場合は、例えばグ リシンがトリプトファンで置換される。類似した小変化には、アミノ酸の欠失か 挿入、若しくはその両方も含まれる。例えばDNASTARソフトウエアのような良く 知られたコンピュータプログラムを用いて、何れのアミノ酸が生物学的或いは免 疫学的活性を損なわずに置換、挿入、又は除去できるものであるかということ、 及びそのようなアミノ酸がいくつかということを決定することができる。 発明 本発明は、新規なヒト・プレプロタキキニンＢ（以下「ＰＰＴ−Ｂ」と称する ）、ＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチド、及び神経性疾患及び腫瘍性疾患 の診断、予防、又は治療のためのこれらの物質の使用法の発見に基づくものであ る。 本発明のＰＰＴ−Ｂををコードする核酸は、脳腫瘍組織ｃＤＮＡライブラリー （BRAITUT03）を起源とするインサイト社クローンＮｏ．2109906において、アミ ノ酸配列アライメントのコンピュータ検索によって初めに同定された。コンセン サス配列の配列番号：２は、以下の重複及び／又は延長された核酸配列、即ちイ ンサイト社クローンNo.866703、866445、2109906、2106440（BRAITUT03を起源） 、489306（HNT2AGT01を起源）、2256223（OVARTUT01を起源）、2207643（SINTFE T03を起源）、1500257、1498317（SINTBST01を起源）、1384531、及び1380957（ BRAITUT08を起源）から構成されたものである。 或る実施例では、本発明は、第１Ａ図及び第１Ｂ図に示すような配列番号：１ のアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。ヒトＰＰＴ−Ｂは１２２個のア ミノ酸からなる長さを有し、M(90番)のアミド化可能部位、S(37番)、S(55番)、T (75番)、及びS(99番)における４箇所のカゼインキナーゼ１１リン酸化可能部位 、S(37番)における１箇所のプロテインキナーゼＣリン酸化可能部位、Y(36番)に おけるチロシンプロテインキナーゼリン酸化可能部位、及びL(43番)とL(64番)と の間の１箇所のロイシンジッパーパターン部位を有する。ヒトＰＰＴ−ＢのM(1 番)〜G(20番)の疎水性アミノ酸残基は、分泌される分子のシグナルペプチドにお いて典型的なものである。ヒトＰＰＴ−Ｂは、K(38番)〜R(39番)、 K(79番)〜R(80番)、及びK(92番)〜R(93番)において３箇所のタンパク質分解酵素 による切断可能部位を有する。このタンパク分解による切断によってラットのプ レプロタキキニンＢ（５０−７９）に相同な３８残基のペプチドと、ＮＫＢと１ ００％の配列同一性を有するペプチドが作り出される（Helke,C.J.(1990)前出） 。第２図に示すように、ヒトＰＰＴ−Ｂは、ウシＰＰＴ−Ｂ（GI 163590；配列 番号：３）、及びラットＰＰＴ−Ｂ（GI 205724；配列番号：４）と化学的及び 構造的相同性を有する。詳述すると、ヒトＰＰＴ−ＢとウシＰＰＴ−Ｂは６６％ の配列同一性を共有し、ヒトＰＰＴ−ＢとラットＰＰＴ−Ｂは６８％の配列同一 性を共有している。第３Ａ図及び第３Ｂ図に示すように、ヒトＰＰＴ−Ｂとウシ ＰＰＴ−Ｂはかなり類似した疎水性プロットを示す。ノーザン解析の結果から、 種々のライブラリーにおけるこの配列の発現が分かる。この配列を発現するライ ブラリーの５０％以上は不死化つまり癌性組織のもの、具体的には、卵巣、脳、 及び副腎の腫瘍のライブラリーであり、この配列を発現するライブラリーの２５ ％以上は交感神経系関連のものである。 また本発明は、ＰＰＴ−Ｂ変異体を包含する。好適なＰＰＴ−Ｂ変異体は、Ｐ ＰＴ−Ｂアミノ酸配列（配列番号：１）と８０％以上、より好適には９０％以上 のアミノ酸配列同一性を有するものである。最も好適なＰＰＴ−Ｂ変異体は、配 列番号：１の配列と９５％以上のアミノ酸配列同一性を有するものである。 また本発明は、ＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチドを包含する。従って 、ＰＰＴ−Ｂのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、ＰＰＴ−Ｂ を発現する組換え分子を作り出すことができる。特定の実施例では、本発明は、 第１Ａ図及び第１Ｂ図に示すような配列番号：２の核酸配列を含むポリヌクレオ チドを包含する。 当業者には理解されるように、遺伝暗号の縮重の結果、任意の既知の自然発生 遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の相同性しか有していないものも含めて、多 種のＰＰＴ−Ｂコーディングヌクレオチド配列が作り出され得る。従って本発明 は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することにより作り出され得る 、全ての可能な核酸配列の変異をその範囲に含んでいる。それらの組み合わせは 、自然発生のＰＰＴ−Ｂのヌクレオチド配列に適用されるような標準的なトリプ レット遺伝暗号に基づいて作り出されるものであり、このような全ての変異は、 ここに具体的に示されたものと考えられたい。 ＰＰＴ−Ｂ及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は、適切に選択され た厳密性条件の下で自然発生配列のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能な ものであるのが好ましいが、実質的に異なるコドンを使用しているＰＰＴ−Ｂ又 はその変異体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。 コドン選択では、特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従って、特定の 原核細胞又は真核細胞の発現宿主におけるペプチド発現の発生率を高めるように 選択することができる。ＰＰＴ−Ｂ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配 列を、コードされるアミノ酸配列を変えないように実質的に変更する理由は、例 えば自然発生配列から作り出される転写物より長い半減期のような、より望まし い特性を有するＲＮＡ転写物を作り出すためである。 本発明の範囲には、ＰＰＴ−Ｂ又はその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はそ の一部の、完全な合成ケミストリによる作製も含まれる。作製したこの合成遺伝 子を、この出願時点において周知の試薬を用いて任意の入手可能なＤＮＡベクタ ー及び細胞系に挿入することができる。更に、合成ケミストリを用いてＰＰＴ− Ｂをコードする配列又はその任意の一部分に突然変異を誘発させることができる 。 また本発明の範囲に含まれるものとして、種々の厳密性条件の下で請求項に記 載のヌクレオチド配列、特に配列番号：２のヌクレオチド配列とハイブリダイズ し得るポリヌクレオチド配列がある。ハイブリダイゼーション条件については、 Wahl,G.M.及びS.L.Berger(1987;Methods Enzymol.152:399-407)及びKimmel,A.R. (1987;Methods in Enzymol.152:507-511)に記載されている。 当業者が一般に利用可能な周知のＤＮＡ配列決定のための方法を、本発明の実 施において用いることができる。この方法では酵素、例えばＤ Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱安定性T7ポリメラーゼ （Amersham,Chicago IL）、或いはGibco BRL(Gaithersburg MD)Methods社から市 販されているELONGASE増幅システムのような校正エキソヌクレアーゼと組換え体 ポリメラーゼとの組み合わせのような酵素を使用する。このプロセスは、Hamilt on Micro Lab2200（Hamilton,Reno,NV）、Peltier Thermal Cycler（PTC200;MJ Reserch,Watertown MA）並びにABI377 DNAシーケンサ（Perkin Elmer）のような 装置を用いて自動化するのが好ましい。 ＰＰＴ−Ｂをコードする核酸配列は、部分的なヌクレオチド配列と、プロモー ター及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当業者には周知の様 々な方法とを用いて伸長させることができる。例えば、使用可能の方法の一つで ある「制限部位」ＰＣＲ法では、汎用プライマーを用いて既知の位置に隣接する 未知の配列を得る（Sarkar,G.(1993)PCR Methods Applic 2:318-322)。詳述する と、まずゲノムＤＮＡを、既知の領域に対して特異的なプライマー及びリンカー 配列に対するプライマーの存在下で増幅する。増幅された配列を、その同じリン カープライマー及び最初のプライマーの内部に含まれる別の特異的プライマーを 用いてＰＣＲの２巡目にかける。ＰＣＲの各回の生成物を、適切なＲＮＡポリメ ラーゼを用いて転写させ、逆転写酵素を用いて配列決定する。 逆ＰＣＲ法を用いて、既知領域に基づく多様なプライマーを利用した配列の増 幅、または伸長を行うことができる（Triglia,T.等（1988）Nucleic Acids Res 16:8186）。プライマーは、OLIGO 4.06（National Biosciences社,Plymouth MN ）や他の適切なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチドで、５０％ 以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするよ うに設計する。この方法ではいくつかの制限酵素を用いて遺伝子の既知領域の適 当な断片を作り出す。次にこの断片を分子内ライゲーションにより環状にし、Ｐ ＣＲ用の鋳型として使用する。 使用できる別の方法にはキャプチャＰＣＲ法があり、この方法ではヒト及び酵 母菌人工染色体ＤＮＡ内の既知の配列に隣接するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する（ Lagerstrom,M.等（1991）PCR Methods Applic 1:111-119）。この方法では、Ｐ ＣＲ処理の前に、ＤＮＡ分子の未知の部分に、複数の制限酵素による消化及びラ イゲーションによって組換え二本鎖配列を配置しておくこともできる。 未知の配列を得るために用いることができる別の方法は、Parker,J.D.等の方 法（1991;Nucleic Acids Res 19:3055-3060）である。更に、ＰＣＲ、ネスト化 プライマー、PromoterFinder^TMライブラリーを用いて、ゲノムＤＮＡ内歩行を行 うことができる（Clontech,Palo Alto CA）。このプロセスは、ライブラリーを スクリーニングする必要がなく、イントロン／エクソン接合部を探し出すのに有 用である。 完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするときに好適なライブラリーは、サイズ選 択された、より大きなｃＤＮＡを含むライブラリーである。またランダムプライ ミングした（random primed）ライブラリーは、遺伝 子の５’及び上流領域を含む配列をより多く含むという点で好適である。ランダ ムプライミングしたライブラリーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーで完全長ｃＤ ＮＡが得られない場合に特に有用である。またゲノムライブラリーは、５’及び ３’非翻訳領域への配列の伸長のために役立つことがある。 配列決定やＰＣＲの産物のヌクレオチド配列をサイズ分析したり確認するため には、市販のキャピラリー電気泳動システムを用いることができる。特に、キャ ピラリーシークエンシングでは、電気泳動による分離のための流動性ポリマー、 レーザーで活性化される４つの異なる蛍光色素（各ヌクレオチドに対して１つ） を使用し、ＣＣＤカメラにより放射線の波長の検出を行う。出力／光強度は適切 なソフトウエア（例えばPerkin elmer製のGenotyper^TM及びSequence Navigator^{T M} ）を用いて電気信号に変換され、サンプルの負荷からコンピュータ解析及び電 子データ表示までの全過程がコンピュータ制御される。キャピラリー電気泳動法 は、特定のサンプル内に限られた量だけ存在するＤＮＡ小片の配列決定に特に適 している。 本発明の別の実施例では、ＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチド配列また はその断片を組換えＤＮＡ分子において用いて、ＰＰＴ−Ｂ、融合タンパク質或 いはその機能的等価物の適切な宿主細胞内での発現を誘導することができる。遺 伝暗号固有の縮重のために、実質的に同一であるか機能的に等価なアミノ酸配列 をコードする他のＤＮＡ配列も作り出され得、これらの配列をＰＰＴ−Ｂのクロ ーニングや発現のために用いることができる。 当業者には理解できるように、非自然発生コドンを有するＰＰＴ−Ｂコードデ ィングヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。特定の原核細胞或い は真核細胞の宿主において選好されるコドンを選択し て、例えば、ＰＰＴ−Ｂ発現率を増大させたり、或いは自然発生配列から生成さ れた転写物より長い半減期のような望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写物を 生成することができる。 本発明のヌクレオチド配列は、ＰＰＴ−Ｂをコードする配列を改変する目的で 既知の方法を用いて組換えることができる。組換えの目的には、例えば、限定は しないが遺伝子産物のクローニング、プロセシング及び／又は発現を改変するこ とが含まれる。無作為断片によるＤＮＡ再編成や遺伝子断片及び合成オリゴヌク レオチドのＰＣＲ再会合によって、ヌクレオチド配列を組換えることができる。 例えば、特定部位突然変異誘発のような当業者には周知の技術を用いて突然変異 を誘発させることによって、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変 更、コドン選好の変化、スプライスバリアントの生成等をもたらすことができる 。 本発明の別の実施例では、未改変ＰＰＴ−Ｂコーディング配列、変異ＰＰＴ− Ｂコーディング配列、又は組換えＰＰＴ−Ｂコーディング配列を異種の配列に結 合して、融合タンパク質をコードする配列にすることができる。例えば、ＰＰＴ −Ｂ活性のインヒビターをペプチドライブラリーからスクリーニングする場合、 市販の抗体により認識される異なるペプチドを発現するキメラＰＰＴ−Ｂタンパ ク質をコードすることが有用である。融合タンパク質はＰＰＴ−Ｂ配列と異種の タンパク質配列との間の位置に切断部位を有するように設計することもでき、こ れによってＰＰＴ−Ｂを切断して、ヘテロの部分から分けて精製することが可能 となる。 本発明の別の実施例では、当業者によく知られた化学的方法（Caruthers.M.H. 等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223;Horn,T.等（1980）Nucl.Acids Res Symp.Ser.225-232参照）を用いて、ＰＰＴ−Ｂコーディング配列の全体、或い はその一部を合成することがで きる。或いは、化学的方法を用いてタンパク質自体を作り出して、ＰＰＴ−Ｂア ミノ酸配列の全体或いはその一部を合成することができる。例えば、種々の固相 技術（Roberge,J.Y.等(1995)Science 269:202-204）でペプチド合成を行うこと ができ、合成の自動化は、例えばABI 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer ）を用いることにより達成することができる。 この新たに合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィにより実 質的に精製することができる（例えばCreighton T.（1983）Proteins Structure And Molecular Principles ,WH Freeman and Co.,NY参照）。合成されたペプチ ドの組成は、アミノ酸解析或いはシークエンシングにより確認することができる （例えばエドマン分解法；Creighton,前出）。さらにＰＰＴ−Ｂのアミノ酸配列 或いはその任意の部分を、その直接の合成の際の改変することにより、及び／又 は化学的方法を用いて他のタンパク質或いはその任意の部分に由来する配列との 結合することにより、変異体ポリペプチドを作り出すことができる。 生物学的に活性なＰＰＴ−Ｂを発現させるためには、ＰＰＴ−Ｂをコードする ヌクレオチド配列或いはその機能的等価物を、適切な発現ベクター、すなわち挿 入されたコーディング配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入す る。 ＰＰＴ−Ｂをコードする配列及び適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベク ターを作製するために当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo組換え技術、又は遺伝子組 換え技術が含まれる。このような技術は、Sambrook,J.等(1989)Molecular Cloni ng,A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Press,Planview NY及びAusubel,F .M.等Current Protocol in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York,NY に記 載されている。 種々の発現ベクター／宿主系を、ＰＰＴ−Ｂコーディング配列を保持し、かつ 発現するために利用することができる。このようなものには、以下に限定するも のではないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発 現ベクターで形質転換した細菌のような微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転 換した酵母菌や、ウイルス発現ベクター（例えばバキュロウイルス）を感染させ た昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルス CaMV、タバコモザイクウイルスTMV）をトランスフェクトした、或いは細菌の発 現ベクター（例えばTi、或いはpBR322プラスミド）で形質転換した植物細胞系や 、或いは動物細胞系が含まれる。 これらの系の「調節領域」或いは「制御配列」は、転写及び翻訳を実行するた めに宿主細胞のタンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域、即ちエンハン サー、プロモーター及び３’非翻訳領域である。このようなエレメントの、作用 の強さ及び特異性は様々であり得る。利用されるベクター及び宿主に応じて、構 成的及び誘導的プロモーターを含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントを 用いることができる。例え （Stratagene,LaJolla CA）またはpSportI^TMプラスミド（Gibco BRL）等のハイ ブリッドlacZプロモーターのような誘導的プロモーターを用いることができる。 バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターは、昆虫細胞において用いることが できる。植物細胞のゲノムに由来するプロモーター或いはエンハンサ（例えば熱 ショック,RUBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子）、若しくは植物ウイルスに由来す るプロモーター或いはエンハンサ（例えばウイルス性プロモータ或いはリーダー 配列）を、ベクターにクローン化してもよい。哺乳動物細胞では、哺乳動物の遺 伝 子或いは哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが最適である。ＰＰＴ−Ｂをコー ドする配列の多数の複製を含む細胞系を作る必要がある場合には、SV40或いはEB Vに基づくベクターを適切な選択マーカーと共に用いる。 細菌系では、ＰＰＴ−Ｂの用途に応じて多数の発現ベクターを選択することが できる。例えば抗体誘発のために大量のＰＰＴ−Ｂが必要とされる場合は、容易 に精製される融合タンパク質を高レベルで発現できるベクターが望ましい。その ようなベクターには、以下のものに限定はしないが、多機能の大腸菌クローニン グ、発現ベクター、例えば する配列を、アミノ末端メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基の 配列を備えたフレーム内においてベクターに結合してハイブリッドタンパク質を 生成できる）や、pINベクター（Van Heeke,G.及びS.M.Schuster（1989）J.Biol. Chem.264:5503-5509）等が含まれる。またpGEXベクター（Promage、Madison WI ）も、グルタチオンS−トランスファーゼ（GST）を有する融合タンパク質として 異種ポリペプチドを発現するため用いることができる。一般に、そのような融合 タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへ吸着させた後、遊 離グルタチオンの存在下で溶出させることにより溶解した細胞から容易に精製で きる。そのような系において生成されるタンパク質は、ヘパリン、トロンビン或 いはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含めて、目的のクローン化ポリペプチドを GST部分から随意に放出させることができるように設計することができる。 酵母菌、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因 子、アルコールオキシダーゼ及びPGHのような構成的或いは誘導的プロモーター を含む多数のベクターを用いることができる。その 概要を知るには、Ausubel等（前出）及びGrant等（1987）Methods Enzymol 153: 516-544を参照されたい。 植物発現ベクターを用いる場合には、ＰＰＴ−Ｂをコードする配列の発現は、 多数のプロモーターの何れかで促進される。例えばCaMVの35S及び19Sプロモータ ーのようなウイルスのプロモーターを、単独で、或いはTMV（Takamatsu,N.等（1 987）EMBO J6:307-311）由来のオメガリーダー配列と共に用いることができる。 或いは、RUBISCOの小サブユニット、熱ショックプロモーターのような植物プロ モーターを用いてもよい（Coruzzi,G.等（1984）EMBO J 3:1671-1680)；Broglie ,R.等(1984)Science 224:838-843;及びWinter,J.等(1991)Results Probl.Cell D iffer.17:85-105）。これらの作製物は、直接のＤＮＡ形質転換或いは病原体に よるトランスフェクションにより植物細胞内に導入できる。このような技術の種 々の一般に入手可能な文献に記載されている（例えばHobbs,S.又はMurry,L.E.Mc Graw Hill Yearbook of Science and Technology（1992）McGraw Hill NY,pp191 -196を参照されたい）。 昆虫系もＰＰＴ−Ｂの発現のために用いることができる。例えば、そのような 系の一つでは、Spodoptera frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの幼虫において 外来遺伝子を発現するためのベクターとして、Autographa californica核多角体 病ウイルス（AcNPV）を用いる。ＰＰＴ−Ｂをコードする配列は、ポリヘドリン 遺伝子のようなウイルスの非必須領域にクローン化して、ポリヘドリンプロモー ターの制御下に置くことができる。ＰＰＴ−Ｂコーディング配列の挿入が成功す ると、ポリヘドリン遺伝子が不活性になり、コートタンパク質膜が欠如した変異 体ウイルスが生成される。次に、この変異体ウイルスを用いて、S.frugiperda細 胞或いはTrichoplusiaの幼虫へ感染させ、その中でＰＰＴ−Ｂを発現させる（En gelhard,E.K.等（1994）Proc.Natl.Acad.Sci. 91:3224-3227）。 哺乳動物の宿主細胞では、多数のウイルス性発現系を利用することができる。 発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、ＰＰＴ−Ｂをコード する配列は、後期プロモータ及び三連リーダー配列からなるアデノウイルス転写 物／翻訳物複合体内に結合され得る。ウイルスのゲノムの非必須E1又はE3領域へ 挿入することにより、感染した宿主細胞でＰＰＴ−Ｂを発現できる生ウイルスが 得られる（Logan,J.及びShenk,T.（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.81:3655-3659） 。さらに、哺乳類宿主細胞内の発現を増加させるためにラウス肉腫ウイルス（RS V）エンハンサのような転写エンハンサを用いることができる。 また、ヒト人工染色体（ＨＡＣ）を用いることにより、プラスミドに含められ て発現され得るものより大きいＤＮＡの断片を供給することもできる。６〜１０ ＭのＨＡＣを構築し、治療の目的で、従来のデリバリー方法（リポソーム、ポリ カチオンのアミノポリマー、又は小胞）を利用して供給することができる。 また、ＰＰＴ−Ｂをコードする配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シ グナルも必要である。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接する配列 が含まれる。ＰＰＴ−Ｂ及びその開始コドン及び上流配列が適切な発現ベクター 内に挿入された場合には、別の転写または翻訳の制御シグナルは不要である。し かしながらコーディング配列又はその一部のみが挿入される場合には、ATG開始 コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを与えなければならない。さらに、全イン サートの転写が確実に行われるようにするために、開始コドンは正しい読み枠に 存在しなければならない。外来転写エレメント及び開始コドンは、自然及び合成 両方の様々な起源に由来するものであり得る。例えば文献（Scharf,D.等（1994 ）Results Probl.Cell Differ.20:125-162）に記載されている もののような、特定の細胞系に適切なエンハンサーを含めることにより、発現の 効率を高めることができる。 さらに宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節したり、発現したタンパク 質を望ましい形にプロセシングする能力で選択される。このようなポリペプチド の修飾には、以下のものに限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリ コシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）並びにアシル化が含まれる。またタ ンパク質の「プレプロ」部分を切り離す翻訳後プロセシングも、正しい挿入、折 り畳み、及び／又は機能の発揮のために重要である。そのような翻訳後の作用の ための特定の細胞装置及び特徴的な機構を有している異なる宿主細胞（例えばCH O、HeLa、MDCK、293、WI38）はAmerican Type Culture Collection（ATCC;Bethe sda,MD）より市販されており、導入される外来タンパク質の正しい修飾やプロセ シングが確実に行われるようにするために、これを選択することができる。 長期間にわたって組換えタンパク質の高収率の産生を確保するためには安定し た発現が望ましい。例えば、ウイルスの複製起源及び／または内在性発現エレメ ント及び選択マーカー遺伝子を、同一のベクター上、或いは別のベクター上に含 む発現ベクターを用いて、ＰＰＴ−Ｂを安定的に発現する株細胞を形質転換する ことができる。ベクターの導入の後、細胞を、選択培地に切り替える前に濃縮培 地内で１〜２日間増殖させる。選択マーカーの目的は、選択のための耐性を与え 、その存在によって導入された配列をうまく発現する細胞を増殖、回収できるよ うにすることである。安定的に形質転換された細胞の耐性クローンは、その細胞 の型に適した組織培養技術を用いて増殖することができる。 形質転換された株細胞を回収するために任意の数の選択系を用いることができ る。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペス ウイルスチミジンキナーゼ（tk）（Wigler,M.等（1977）Cell 11:223-32）及び アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（aprt）（Lowy,I.等（1980）Cell 22:817-23）遺伝子が含まれ、それぞれtk^-及びaprt^-細胞において用いられる。 また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の基礎として用いるこ とができる。例えばdhfrはメトトレキセートに対する耐性を与え（Wigler,M.等( 1980)Natl Acad Sci 77:3567）、nptはアミノ配糖体のネオマイシン及びG-418に 対する耐性を与え（Colberre-Garapin,F.等（1981）J Mol Biol 150:1）、als或 いはpatはクロルスルフロン（chlorsulfuron）、ホスフィノトリシンアセチルト ランスフェラーゼ（phosphinotricin acetyltransferase）に対する耐性を与え る（Murry，前出）。さらに選択に利用できる遺伝子として、例えば細胞がトリ プトファンの代わりにインドールを利用できるようにするtrpB、細胞がヒスチジ ンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるようにするhisDが文献に記 載されている（Hartman,S.C.及びR.C.Mulligan（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.85: 8047-51)。最近になって、形質転換体を特定するためばかりではなく、特定ベク ター系による一過性の或いは安定的なタンパク質発現の量を定量するために広く 用いられる、例えばアントシアニン、β−グルクロニダーゼ及びその基質、GUS 、及びルシフェラーゼ及びその基質、ルシフェリンのような可視マーカーがよく 利用されるようになった（Rhodes,C.A.等（1995）Methods Mol.Biol.55:121-131 ）。 マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在も示唆される が、その存在及び発現は確認すべきである。例えばＰＰＴ−Ｂをコードする配列 がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合は、ＰＰＴ−Ｂをコードする配列を含 む組換え体細胞をマーカー遺伝子の機能の存在により確認できる。或いは、マー カー遺伝子をＰＰＴ−Ｂをコードす る配列と直列に配置して、両者が単一のプロモータの制御下となるようにするこ とができる。誘導に応じてのマーカー遺伝子の発現、つまり選択は、通常直列に 配置された配列の発現をも同時に示すことになる。 或いは、当業者には周知の様々な方法により、ＰＰＴ−Ｂをコードする核酸配 列を含みＰＰＴ−Ｂを発現する宿主細胞を識別できる。このような方法には、以 下のものに限定はしないが、DNA-DNA或いはDNA-RNAハイブリダイゼーション及び 、核酸及びタンパク質を検出及び／又は定量するための膜ベース、溶液ベース或 いはチップベースの技術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイ が含まれる。 ＰＰＴ−Ｂをコードする配列のプローブ、一部分、或いは断片を用いるDNA-DN A又はDNA-RNAハイブリダイゼーショまたは増幅により、ＰＰＴ−Ｂポリヌクレオ チド配列の存在を検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイでは、ＰＰ Ｔ−ＢをコードするＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形質転換体を検出するために、核 酸配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーを用いる。 ＰＰＴ−Ｂポリペプチドの発現を検出し、測定するための、このタンパク質に 特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれかを用いる種々の プロトコルが当業者には周知である。このようなプロトコルの例には、酵素結合 免疫検定法（ELISA）、ラジオイムノアッセイ（RIA）及び蛍光表示式細胞分取器 法（FACS）を含まれる。ＰＰＴ−Ｂポリペプチド上で２つの非干渉なエピトープ に対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナルベースイ ムノアッセイ（two-site,monoclonal-based immunoassay）が好適であるが、競 合的結合アッセイも用いられる。これらアッセイの並びに他のアッセイは、他の 文献、Hampton,R.等（1990;Serological Methods,a Laboratory Manual,APS Pre ss,St.Paul MN）及びMaddox,D.E.等(1983,J.Exp. Med.158:1211-1216)に記載されている。 さらに多くの標識及び結合技術が当業者には周知であり、種々の核酸及びアミ ノ酸のアッセイにおいて用いることができる。近縁な配列を検出するための、標 識されたハイブリダイゼーションプローブやＰＣＲプローブを作成するための手 段には、オリゴ標識、ニックトランスレーション法、末端標識、或いは標識ヌク レオチドを用いるＰＣＲ増幅などが含まれる。或いは、ＰＰＴ−Ｂコーディング 配列、或いはその任意の部分を、ｍＲＮＡプローブの作成のためのベクターにク ローン化する。そのようなベクターは当分野では周知で、市販されており、これ を用いて、例えばT7、T3、或いはSP6のような適切なＲＮＡポリメラーゼ及び標 識されたヌクレオチドを加えることによってin vitroでＲＮＡプローブを合成す ることができる。これらの方法は、種々の市販のキット（Pharmacia Upjohn（Ka lamazoo,MI）；Promega（Madison WI）；及びU.S.Biochemical Corp.（Clevelan d OH））を用いて実施することができる。適切なリポーター分子、すなわち標識 には、放射性核種、酵素、フルオレセント（蛍光剤）、化学発光剤或いは色素剤 や、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子等が含まれる。 ＰＰＴ−Ｂをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、コー ドされたタンパク質を細胞培地で発現させ、そこから回収するのに適した条件下 で培養することができる。組換え体細胞により生成されるタンパク質は、用いら れる配列及び／またはベクターに応じて、細胞内に分泌、つまり細胞内に含まれ るようにすることができる。当業者には理解されるように、ＰＰＴ−Ｂをコード するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞か真核細胞の細胞膜を通 してのＰＰＴ−Ｂ分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計することができ る。また他の作製物を用いて、ＰＰＴ−Ｂをコードする配列を、可溶性タンパク 質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結 合することができる。そのような精製を容易にするドメインには、以下のものに 限定はしないが、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファン モジュールのような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上での精製を 可能にするプロテインＡドメイン、並びにFLAGS延長／アフィニティ精製システ ムにおいて用いられるドメイン（Immunex Corp.,Seattle WA）が含まれる。精製 ドメインとＰＰＴ−Ｂの間にＸＡ因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen,San Diego CA）に対して特異的な配列のような切断可能なリンカー配列を含めるの は精製を促進するのに役立つ。ＰＰＴ−Ｂをコードする配列とともに、６個のヒ スチジン残基、それに続くチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位をコー ドする核酸配列を含むこのような発現ベクターの１つは、融合タンパク質を発現 する。ヒスチジン残基がIMIAC(Porath,J等（1992;Protein Exp.Purif.3:263-281 ）に記載のような固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー)での精製 を促進するとともに、エンテロキナーゼ切断部位が融台タンパク質からのＰＰＴ −Ｂの精製のための手段となる。融合タンパク質を含むベクターについての解説 は、Kroll,D.J.等（1993;DNA Cell Biol.12:441-453）に記載されている。 組換え体の産生に加えて、ＰＰＴ−Ｂの断片を、固相技術を用いた直接的なペ プチド合成で作り出すこともできる（Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85:21 49-2154参照）。タンパク質合成は手作業で行えるが、自動化することもできる 。自動的な合成は、例えば、Applied Biosystem 431Aペプチドシンセサイザ（Pe rkin Elmer）を用いて行うことができる。ＰＰＴ−Ｂの種々の断片を個別に化学 的に合成し、化学的方法を用いて結合して完全長分子を作り出しすことも可能で ある。 治療 ヒトＰＰＴ−Ｂ、ウシＰＰＴ−Ｂ（GI 163590）、及びラットＰＰＴ−Ｂ（GI 205725）の間に化学的及び構造的相同性が存在する。更に、ＰＰＴ−Ｂは、神経 組織、胃腸組織、副腎組織、増殖中の組織、及び急速に分裂している組織におい て発現される。従って、ＰＰＴ−Ｂは、神経性疾患及び腫瘍性疾患、特にＰＰＴ −Ｂが過剰発現されるか、交感神経系による調節が関連する疾患において一定の 役割を果たすと考えられる。 従って、或る実施例では、神経性疾患の治療のために、ＰＰＴ−Ｂまたはその 断片若しくは誘導体を患者に投与し得る。このような疾患には、以下に限定され ないが、静座不能、アルツハイマー病、健忘症、筋萎縮性側索硬化症、双極性障 害、緊張病、脳腫瘍、痴呆、うつ病、ダウン症候群、遅発性ジスキネジア、ジス トニー、てんかん、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、神経線維腫症、パーキ ンソン病、妄想性精神病、精神分裂病、トゥーレット症候群、口峡炎、アナフィ ラキシーショック、不整脈、喘息、心血管ショック、クッシング症候群、高血圧 症、低血糖症、心筋梗塞症、片頭痛、及びクロム親和性細胞腫が含まれる。 別の実施例では、限定されないが、上に列挙したものを含む神経性疾患の治療 のために、ＰＰＴ−Ｂまたはその断片若しくは誘導体を発現し得るベクターを患 者に投与することもできる。 更に別の実施例では、限定されないが、上に列挙したものを含む神経性疾患の 治療のために、ＰＰＴ−Ｂのアゴニストを患者に投与することもできる。 或る実施例では、腫瘍性疾患の予防または治療のために、ＰＰＴ−Ｂのアンタ ゴニストを患者に投与し得る。このような疾患には、以下に限定されないが、腺 癌、白血病、リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び 奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節 、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺 、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、及び子宮の癌が含まれる。或る実 施態様では、ＰＰＴ−Ｂに特異的に結合する抗体を、アンタゴニストとして直接 的に用いたり、或いはＰＰＴ−Ｂを発現する細胞または組織に薬物を送達するた めのターゲティングまたはデリバリー機構として間接的に用いることができる。 他の実施例では、限定されないが、上に列挙したものを含む腫瘍性疾患の治療 または予防のために、ＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチドの相補配列を発 現するベクターを患者に投与することができる。 他の実施例では、本発明の治療用タンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニ スト、相補的配列（アンチセンス配列）、又はベクターの何れかを、他の適切な 治療薬と組み合わせて投与し得る。当業者は、併用療法で使用するための適切な 薬剤を、従来の医薬上の原理に基づいて選択することができよう。治療薬を組み 合わせることにより、上述の種々の疾患の治療又は予防に効果のある相乗作用を 与え得る。この方法を用いることにより、低い用量の各薬剤で同じ治療効果を上 げることができ、従って副作用の可能性を低下させることができる。 ＰＰＴ−Ｂのアンタゴニスト又はインヒビターは、当分野において周知の方法 を用いて製造することができる。詳述すると、精製されたＰＰＴ−Ｂを用いて、 抗体を製造したり、或いはＰＰＴ−Ｂに特異的に結合するものを同定するべく治 療薬のライブラリーをスクリーニングすることができる。 ＰＰＴ−Ｂに対する抗体は、従来より周知の方法を用いて製造することができ る。このような抗体には、以下に限定されないが、ポリクローナル抗体、モノク ローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグ メント、及びFab発現ライブラリーから作られたフラグメントが含まれる。中和 抗体（即ち二量体形成を阻害するもの）は治療の用途に特に好適である。 抗体を産生するため、ＰＰＴ−Ｂか、免疫学的特性を有するその任意の一部分 、断片或いはオリゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、 マウス等を含む種々の宿主を免疫化することができる。免疫学的反応を増強する ために、ホストの種に応じた種々のアジュバントを用いることができる。そのよ うなアジュバントには、限定するものではないが、フロイントのアジュバント、 水酸化アルミニウムのような無機質ゲルアジュバント、リゾレシチンのような界 面活性剤アジュバント、プルロニックポリオールアジュバント、ポリアニオンア ジュバント、ペプチドアジュバント、油性乳剤アジュバント、キーホールリンペ ットヘモシニアンアジュバント並びにジニトロフェノールアジュバントが含まれ る。ヒトで使用するアジュバントのなかでは、ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌 ）及びコリネバクテリウム−パルヴム（Corynebacterium parvum）は特に好適で ある。 ＰＰＴ−Ｂに対する特異的抗体を誘発するために用いられるオリゴペプチド、 ペプチド、またはその断片は、好ましくは５個以上のアミノ酸、より好ましくは １０個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。またこれらの配列は、自 然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小形の自然発生の分子の全ア ミノ酸配列を含んでいるのが好ましい。ＰＰＴ−Ｂアミノ酸の短いストレッチを 、キーホールリンペットヘモシアニンやキメラ分子に対して産生された抗体のよ うな他のタンパク質の配列に融合してもよい。 ＰＰＴ−Ｂのモノクローナル抗体は、培地内の連続株細胞に抗体分子を産生さ せる任意の技術を用いて作製できる。このような技術には、以 下のものに限定はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技 術、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Kohler,G.等(1975)Nature 256:495-497 ；Kozbor,D.等(1983)Immunol Methods 81:31-42；Cote,R.J.等(1983)Proc.Natl. Acad.Sci.80:2026-2030；Cole,S.P.等(1984)Mol.Cell Biol.62:109-120）が含ま れる。 さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための「キメラ 抗体」の産生、即ちヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子の結合のために開発さ れた技術が用いられる（Morrison,S.L.等(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.81:6851-68 55；Neuberger,M.S.等（1984）Nature 312:604-608；Takeda,S.等（1985）Natur e 314:452-454）。或いは、一本鎖抗体の生成のための周知技術を適用して、Ｐ ＰＴ−Ｂ特異的一本鎖抗体を作り出すことができる。関連する特異性を有するが イディオタイプの構成が異なる抗体は、無作為の免疫グロブリン組み合わせライ ブラリーからの鎖再編成（chain shuffing）によって作り出すことができる（Bu rton D.R.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88:11120-3）。 また抗体は、文献（Orlandi,R.等(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.86:3833-3837； Winter,G.等1991,Nature 349:293-299）に開示されているように高度に特異的な 結合試薬のパネルや組換え免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングするこ とにより、或いはリンパ球集団でのin vivo産生を誘導することにより作り出す こともできる。 ＰＰＴ−Ｂに対する特異結合部位を含む抗体フラグメントも生成することがで きる。このようなフラグメントには例えば、限定はしないが、抗体分子のペプシ ンによる消化で生成することができるF(ab')₂フラグメントや、F(ab')₂フラグメ ントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるFabフラグメ ントが含まれる。別法として、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグ メントを迅速かつ容易に 同定できるように、Fab発現ライブラリーを作製してもよい(Huse,W.D.等（1989 ）Science 256:1275-1281)。 種々のイムノアッセイを、所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリ ーニングに利用することができる。確立された特異性を有するモノクローナル抗 体或いはポリクローナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫 放射線測定法の種々のプロトコルが当分野ではよく知られている。このようなイ ムノアッセイでは、ＰＰＴ−Ｂとその特異的抗体との複合体の形成、並びに複合 体形成の測定が行われる。特定のＰＰＴ−Ｂタンパク質上の２つの互いに非干渉 なエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を用いる二部位モノクローナ ル抗体ベースイムノアッセイ（two sites monoclonal based immunoassay）が好 適であるが、競合的結合アッセイも用いられる（Maddox，前出）。 本発明の別の実施例では、ＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチド、または その任意の断片やアンチセンス配列を、治療上の目的で用いることができる。或 る実施態様では、ｍＲＮＡの転写を阻害することが望ましいような状況において 、ＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチドに対する相補配列を用いることがで きる。詳述すると、ＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチドに相補的な配列で 細胞を形質転換することができる。従って、相補分子または断片を用いて、ＰＰ Ｔ−Ｂの活性を変調したり、遺伝子機能を調節することができる。このような技 術は現在周知となっており、センス又はアンチセンスオリゴマー、若しくはより 大きな断片を、ＰＰＴ−Ｂコーディング配列のコード領域や調節領域の様々な位 置から設計することができる。 レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルス由来の 発現ベクター、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的 の器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の 送達のために用いられる。当業者によく知られた方法を用いて、ＰＰＴ−Ｂをコ ードする遺伝子のポリヌクレオチドに相補的な核酸配列を発現するベクターを作 製することができる。これらの技術はSambrook等(前出)及びAusubel等（前出） に記載されている。 ＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチドまたはその断片を高レベルで発現す る発現ベクターで細胞または組織を形質転換させることにより、ＰＰＴ−Ｂをコ ードする遺伝子の機能を停止させることができる。このような作製物は、翻訳不 可能なセンス配列或いはアンチセンス配列を細胞に導入するために用いることが できいる。このようなベクターは、ＤＮＡへ組み込みがなされない場合ですら、 そのベクターが内在性ヌクレアーゼにより機能停止状態となるまで、ＲＮＡ分子 を転写し続ける。このような一過性の発現は、非複製ベクターでも１ヶ月以上、 適当な複製エレメントがベクター系の一部である場合には更に長い期間継続し得 る。 上述のように、ＰＰＴ−Ｂをコードする遺伝子の制御５’領域、つまり調節領 域（シグナル配列、プロモーター、エンハンサー、及びイントロン）に対する相 補配列、つまりアンチセンス分子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡ）を設計するこ とにより遺伝子発現を変化させることができる。転写開始部位、例えばリーダー 配列の＋１０〜−１０領域の間に由来するオリゴヌクレオチドが好適である。同 様に、「三重らせん」塩基対合法を用いて阻害を達成することができる。三重ら せん対合が有用なのは、それが、ポリメラーゼ、転写因子、或いは調節分子が結 合するために二重らせんが十分にほどける能力を阻害するからである。三重らせ んＤＮＡを用いた最近の治療上の進歩については、文献（Gee,J.E.等(1994)In:H uber,B.E.及びB.I.Carr,Molecular and Immunologic Approaches,Futura Publis hing Co,MtKisco NY）に記載されている。転写物がリボソームへ結合しないよう にすることによって、ｍＲＮＡの 転写を阻害するために、相補的配列、つまりアンチセンス分子を設計することも できる。 リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子で ある。リボザイムの作用機構では、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列 特異的ハイブリダイゼーションが行われ、その後エンドヌクレアーゼによる切断 （endonucleolytic cleavage）がなされる。使用され得る実施例には、ＰＰＴ− Ｂをコードする配列のエンドヌクレアーゼによる切断を特異的かつ効果的に触媒 し得る人工合成のハンマーヘッド型リボザイム分子も含まれている。 任意の標的可能ＲＮＡ内の特異的なリボザイム切断部位を、初めに、配列GUA 、GUU並びにGUCが後続するリボザイム切断部位に対する標的分子を調べることに よって同定する。ひとたびその同定がなされると、切断部位を含む標的遺伝子の 領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列を、その オリゴヌクレオチドの機能を停止させる２次構造の特徴について評価することが 可能となる。候補の標的部分の適切性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用い て相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に対する接触性（accessib ility）をアッセイすることにより評価することもできる。 本発明の相補的リボ核酸分子及びリボザイムは、ＲＮＡ分子を合成するのため の当分野で周知の方法により作製することができる。これらの技術には、固相ホ スホラミダイト（phosphoramidite）化学合成法のようなオリゴヌクレオチドの 化学的合成技術が含まれる。或いは、ＲＮＡ分子を、ＰＰＴ−ＢをコードするＤ ＮＡ配列のin vivo及びin vitroでの転写により作り出すことができる。このよ うなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモ ーターを有する多種のベクターに組み込むことができる。或いは、構成的に或い は誘導的 にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ作製物を、株細胞、細胞 或いは組織内に導入することができる。 ＲＮＡ分子はその細胞内安定性を高め及び半減期を長くするために修飾するこ とができる。可能な修飾には、限定はしないが、その分子の５’末端か３’末端 、或いはその両方へのフランキング配列の付加や、分子のバックボーン内におい てホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート（phosphorothioate） 或いは２’Ｏ−メチルを使用することが含まれる。このコンセプトは、ＰＮＡ生 成固有のものであり、内在性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデ ニン、グアニン、シチジン、チミン、及びウリジンの、アセチル−、メチル−、 チオ−形態、及び類似の改変形態とともに、イノシン、キュエオシン（queosine ）、及びワイブトシン（Wybutosine）のような従来あまり用いられなかった塩基 を含めることによって、これら全ての分子に拡張することができる。 細胞或いは組織内にベクターを導入するための多くの方法が利用可能であり、in vivo 、in vitro、及びex vivoの使用に対しても同様に適切なものである。ex vivo治療法の場合には、患者から採取された幹細胞にベクターを導入し、自家 移植用のクローンとして増殖して同じ患者に戻す方法がある。またトランスフェ クションによるデリバリー、リポソーム注入またはポリカチオンアミノポリマー によるデリバリー（Goldman,C.K.等(1997)Nature Biotechnology 15:462-66;こ こで引用することにより本明細書と一体にされたものとする）は、当分野でよく 知られた方法を用いて実施することができる。 上述の治療法の何れも、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及び 最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む、任意の適切な被験体に適用すること ができる。 本発明の更に別の実施例では、上述の治療効果のいずれかをあげるた めに、医薬品組成物を医薬上に許容される担体とともに投与する。このような医 薬品組成物は、ＰＰＴ−Ｂ、ＰＰＴ−Ｂに対する抗体、ＰＰＴ−Ｂの擬似物、ア ゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターからなるものであり得る。この医 薬品組成物は、単体で、或いは例えば安定剤のような１種以上の他の薬剤と組み 合わせて、任意の滅菌した生体適合性の医薬用担体に含めて投与される。このよ うな担体には、限定はしないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水が 含まれる。これらの分子は、患者に対して、単体で、或いは他の薬品やホルモン と結合して投与され得る。 本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路には、以下の経路に限定されない が、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下内投 与、心室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局 所投与、舌下投与、或いは直腸内投与が含まれ得る。 これらの医薬品組成物は、活性成分に加えて、医薬上使用可能な製剤内への活 性化合物の処理を容易にし、賦形剤及び補助剤を含む適切な医薬上許容される担 体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、“Remington's Pharmace utical Sciences”（Maack Publishing Co,Easton PA）の最新版において見るこ とができる。 経口投与用の医薬品組成物は、当分野でよく知られる製薬学的に許容される担 体を用いて適切な剤形に製剤される。このような担体により、医薬品組成物は、 治療を受ける患者による経口及び鼻腔摂取のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、 液体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液或いは類似の製剤として処方 される。 経口投与するための製剤は、活性化合物と固形の賦形剤とを結合することによ って作製できるが、所望に応じて、必要なら適切な補助剤を添 加した後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して錠剤或いは糖衣剤 コアを作ることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニト ール或いはソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク質充填剤、とう もろこし、小麦、米、じやがいも等からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロ キシプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウム のようなセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントのようなゴム、並びにゼ ラチン或いはコラーゲンのようなタンパク質である。必要ならば、架橋結合した ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸或いは アルギン酸ナトリウムや、その塩のような、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられる 。 糖衣剤コア（dragee core）は、濃縮砂糖溶液のような適切な錠皮を与えられ るが、溶液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤 、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有 機溶剤或いは溶剤混合物が含み得る。錠剤の識別のため、すなわち活性化合物の 量、すなわち投与量を特徴付けるために染料或いは色素が錠剤或いは糖衣錠皮に 加えられてもよい。 経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル及びゼラ チンからなる柔らかい、密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビ トールのような錠皮を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはで んぷんのような充填剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムの ような潤滑剤、並びに付加的には安定剤と混合された活性処方組成物を含み得る 。柔らかいカプセルでは、活性化合物は、安定剤とともに或いは安定剤なしで、 脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶 解或いは懸濁される。 非経口投与用の製剤は、水溶性の活性化合物の水溶液を含む。注射用として、 本発明の薬品組成物を水溶液、好適にはハンクの溶液、リンゲル溶液或いは生理 緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液に入れて製剤することができる。 水性の注入懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール 或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性 成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁剤として調製される。適切な親油性の溶媒 或いは媒介物は、胡麻油のような脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド 或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。また懸濁剤は、所望に応 じて、溶解度を増加し濃縮度の高い溶液の調製を可能にする適切な安定剤或いは 薬剤を含んでもよい。 局所的投与または経鼻粘膜投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な 浸透剤を用いて調合が行われる。このような浸透剤は、当技術分野において周知 である。 本発明の医薬品組成物は周知の方法、例えば従来の混合処理、溶解処理、顆粒 化処理、糖衣形成処理、研和処理、乳化処理、封入処理（entrapping）処理或い は凍結乾燥処理により製造される。 この医薬品組成物は塩類として提供されることもあり、限定はしないが、塩酸 、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む、多くの酸とともに 形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性或いはプロトニ ック溶剤において、より可溶性が高くなる傾向がある。他の場合には、好適な製 剤は、１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のショ糖、使用前に緩衝 剤と結合させたｐＨ４．５〜５．５の範囲にある２％〜７％のマンニトールにお ける凍結乾燥粉末である。 製薬学的に許容される担体内に製剤された本発明の化合物を含む組成 物は、調製された後、適切な容器内に入れて、さらに提示した疾病状態の治療の ためにラベル付けすることができる。ＰＰＴ−Ｂの投与の場合、このようなラベ ルには、投与の量、頻度、方法が表示される。 本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、活性成分を所望の目的 を達成するための有効量含む組成物である。有効量の決定は、当業者の能力の範 囲内で十分行うことができる。 任意の化合物について、治療上有効な量は、初めに、新生物細胞、或いは通常 マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のアッセイ から推定される。次に、このような情報を利用して、ヒトにおける有効な量や投 与経路を決定することができる。 治療上有効な量とは、症状や状態を改善するタンパク質、その抗体、アンタゴ ニスト、またはインヒビターの量である。そのような化合物の毒性及び治療上の 有効性は、例えばＬＤ５０（個体群の５０％の致死投与量）及びＥＤ５０（個体 群の５０％における治療上の有効量、５０％有効量）を決定するための、細胞培 地或いは実験動物における標準的な製薬学的方法により決定することができる。 毒性と治療有効性との間の投与量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比 として表すことができる。 大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい。これらの細胞培地のアッセイ 及び付加的な動物研究から得られるデータは、ヒトへの使用に対する投与量の範 囲を決める際に用いることができる。そのような化合物の投与量は、毒性がほと んど或いは全くなく、ＥＤ５０を達成する循環濃度の範囲内にあることが望まし い。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並びに投与経路に応じてこの範囲 内で変化する。 正確な投与量は、治療が必要な患者に関連する要因群を考慮して担当医師が選 択する。投与量及び投薬量は、十分なレベルの活性成分を与え、 かつ所定の効果を維持するために調節される。考慮すべき付加的な要因は、疾患 状態の重症度、または患者の年齢、体重並びに性別、食事、投与の時間及び頻度 、併用する薬剤、反応感受性、並びに治療への耐性／反応を含む。長期的に作用 する薬品組成物は３〜４日毎に、１週間毎に、或いは半減期及び特定の処方のク リアランス速度に応じて２週間に１度投与してもよい。 通常の投与量は0.1〜100,000μgの範囲にあって、全投与量は最大約1gであり 、投与経路に応じて変わってくる。特定の投与量或いは送達の方法に関する手引 きは、当分野の実施者が通常入手できる文献において見出すことができる。当業 者なれば、ヌクレオチドに対しては、タンパク質やインヒビター用の剤形とは異 なる剤形を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの 送達方式は、特定の細胞、状態、位置等によって決まってくる。 診断 別の実施例において、ＰＰＴ−Ｂに特異的に結合する抗体を、ＰＰＴ−Ｂの発 現を特徴とする状態や疾病の診断や、ＰＰＴ−Ｂで治療を受けている患者のモニ タリングのためのアッセイにおいて用いることができる。診断目的で有用な抗体 は、上述の治療用のものと同一の方法で調製することができる。ＰＰＴ−Ｂの診 断検査法には、ヒトの体液、細胞或いは組織の抽出物においてＰＰＴ−Ｂを検出 するために抗体或いは標識を利用する方法が含まれる。本発明のポリペプチド及 び抗体は、修飾したものでも、修飾なしでも用いることができ、共有結合、或い は非共有結合かのいずれかでリポーター分子と結合することにより標識すること ができる。種々のリポーター分子が周知となっており、その幾つかについては上 記した。 例えばELISA（酵素結合免疫測定法）、RIA（ラジオイムノアッセイ）並びにFA CS（蛍光表示式細胞分取器法）を含む、ＰＰＴ−Ｂを測定するための種々のプロ トコルが当分野では周知であり、これによってＰＰＴ−Ｂ発現の変化や異常を診 断するための基礎が得られる。ＰＰＴ−Ｂの発現の正常値、つまり標準値は、哺 乳類、好ましくはヒトの正常被験者から得られる体液或いは細胞抽出物とＰＰＴ −Ｂに対する抗体とを、複合体形成に適した条件の下で結合することによって得 ることができる。標準の複合体形成量は、種々の方法、好ましくは測光手段を用 いることにより定量することができる。被験者、対照標準、及び生検組織からの 患部組織サンプルにおいて発現されたＰＰＴ−Ｂの量を、標準値と比較する。標 準値と被験者の値との偏差で、疾病診断のパラメータが確立される。 本発明の別の実施例では、ＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチドを、診断 目的で用いることができる。使用できるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオ チド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が 含まれる。このポリヌクレオチドは、ＰＰＴ−Ｂの発現が疾病と相関性を有する 生検組織における遺伝子発現を検出し、定量するために用いられる。診断アッセ イは、ＰＰＴ−Ｂが存在、不存在、及び過剰発現の何れの状態にあるかを区別し たり、治療的介入の際にＰＰＴ−Ｂレベルの調節をモニタリングするのに役立つ 。 或る実施態様では、ＰＰＴ−Ｂまたは近縁な分子をコードする、ゲノム配列を 含むポリヌクレオチド配列を検出できるハイブリダイゼーションプローブ或いは ＰＣＲプローブを用いて、ＰＰＴ−Ｂをコードする核酸配列を同定することがで きる。そして、そのプローブの特異性、即ち、そのプローブが非常に高度な保存 領域（例えば５’調節領域における１０個の独特のヌクレオチド）と、保存的で ある度合いの低い領域（例え ば特に３’領域におけるシステイン残基の間の領域）の何れに由来するのかとい うこと、及びハイブリダイゼーション或いは増幅の（高い、中程度の或いは低い ）厳密性によって、そのプローブが自然発生ＰＰＴ−Ｂのみを同定するものであ るか、或いはアレル配列や近縁な配列も同定するものであるかということが決ま ってくる。 プローブは、近縁なインヒビターをコードする配列を検出するためにも用いる ことができ、好ましくは、これらのＰＰＴ−Ｂをコードする任意の配列から得ら れるヌクレオチドを少なくとも５０％含むべきである。本発明のハイブリダイゼ ーションプローブは、配列番号：２のヌクレオチド配列か、自然発生ＰＰＴ−Ｂ のイントロン、プロモータ、及びエンハンサーエレメントを含むゲノムの配列に 由来するものであり得る。 ＰＰＴ−ＢをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプロ ーブの作製のための他の手段には、ＰＰＴ−ＢやＰＰＴ−Ｂ誘導体をコードする 核酸配列を、ｍＲＮＡプローブ生成のためのベクターにクローン化する方法があ る。このようなベクターは周知で市販されており、適切なＲＮＡポリメラーゼや 適切な放射性標識ヌクレオチドを付加することにより、in vitroでのＲＮＡプロ ーブを合成のために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは種 々のリポータ分子により標識することができ、この標識には、³²Ｐや³⁵Ｓのよう な放射性核種、アビジン／ビオチン結合系によりプローブに結合するアルカリホ スファターゼのような酵素標識等が含まれる。 ＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチド配列を、ＰＰＴ−Ｂの発現が関連す る状態、疾患、または疾病の診断のために用いることができる。このような状態 または疾病の例には、以下に限定されないが、静座不能、アルツハイマー病、健 忘症、筋萎縮性側索硬化症、双極性障害、緊張病、脳腫瘍、痴呆、うつ病、ダウ ン症候群、遅発性ジスキネジア、ジストニ ー、てんかん、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、神経線維腫症、パーキンソ ン病、妄想性精神病、精神分裂病、及びトゥーレット症候群；口峡炎、アナフィ ラキシーショック、不整脈、喘息、心血管ショック、クッシング症候群、高血圧 症、低血糖症、心筋梗塞症、片頭痛、及びクロム親和性細胞腫；腺癌、白血病、 リンパ腫、黒色腫、骨髄腫、肉腫、及び奇形癌、具体的には、副腎、膀胱、骨、 骨髄、脳、乳房、子宮頚、胆嚢、神経節、胃腸管、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉 、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲 状腺、及び子宮の癌が含まれる。ＰＰＴ−Ｂをコードするポリヌクレオチド配列 は、ＰＰＴ−Ｂ発現の変化を検出するための生検組織や体液を試験するための、 サザンブロット法或いはノーザンブロット法、ドットブロット法或いは他の膜ベ ース技術、ＰＣＲ技術、ディップスティック試験法（試験紙法）、ピン或いはチ ップ技術及びELISAアッセイにおいて用いることができる。このような定性的或 いは定量的試験方法は当分野では周知である。 特定の実施態様では、種々の癌、特に上述の癌の活性化または誘導を検出する アッセイにおいてＰＰＴ−Ｂをコードするヌクレオチド配列が役立ち得る。ＰＰ Ｔ−Ｂをコードするヌクレオチド配列を標準的な方法で標識し、ハイブリダイゼ ーション複合体の形成に適した条件の下で患者の体液や組織サンプルに加える。 適切なインキュベーション時間の経過後、このサンプルを洗浄しシグナルを定量 して、標準値を比較する。生検サンプルまたは抽出サンプルにおけるシグナルの 量が、比較できる対照サンプルのシグナル量と有意に異なっている場合、このヌ クレオチド配列はサンプルのヌクレオチド配列とハイブリダイズしており、サン プルにおけるＰＰＴ−Ｂをコードするヌクレオチド配列のレベルの変化が存在す ることは、関連疾患の存在を示している。このようなアッセイ は、動物実験、臨床試験、または個々の患者の治療のモニタリングにおける特定 の治療措置の効果を評価するために用いることもできる。 ＰＰＴ−Ｂの発現が関係する疾病の診断の基礎を得るために、正常な、或いは 標準の発現プロフィールを確立する。この標準プロフィールは、動物或いはヒト 何れかの正常な被験者から得られる体液或いは細胞抽出物を、ハイブリダイゼー ション或いは増幅に適切な条件下で、ＰＰＴ−Ｂをコードする配列又はその一部 分と結合することにより確立される。標準のハイブリッド形成量は、既知の量の 実質的に精製されたＰＰＴ−Ｂが用いられる同一の実験で得られる値と、正常被 験者に対して得られる値とを比較することにより定量することができる。正常な サンプルから得られた標準値は、疾病の症状を示す患者からのサンプルから得ら れる値と比較することができる。標準値と被験者値との偏差を用いて疾病の存在 を確認する。 ひとたび疾患が確認され、治療プロトコルが開始されると、患者での発現レベ ルが正常な患者において観察されるレベルに近づき始めたか否かを評価するため に、このようなアッセイが定期的に繰り返される。継続的なアッセイから得られ る結果を用いて、数日間或いは数ヶ月の期間にわたる治療効果を知ることができ る。 癌については、患者の生検組織において転写物が比較的少ない量存在すること が疾病の発生の素因を示し、つまり実際の臨床的症状が現れる前に疾病を検出す る手段となり得る。この型の一層確定的な診断により、医療従事者が予防的処置 を講じたり、より早期に積極的な治療を開始することが可能となり、癌の発生や 更なる進行を予防することができるようになり得る。 ＰＰＴ−Ｂをコードするオリゴヌクレオチドの別の診断目的の使用では、ＰＣ Ｒを利用することがある。このようなオリゴマーは一般には化 学的に合成するが、酵素を用いて作製したり、或いはin vitroで作り出すことも できる。オリゴマーは、特定の遺伝子或いは状態を識別するために最適な条件下 で用いられる２つのヌクレオチド配列、即ちセンス方向（５’→３’）のヌクレ オチド及びアンチセンス方向（３’←５’）のヌクレオチドからなる。同一の２ つのオリゴマー、入れ子オリゴマーの組、或いはオリゴマーの縮重プールでさえ 、近縁なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出や定量のためのより厳密性の低い条件の 下であっても用いることができる。 さらにＰＰＴ−Ｂの発現を定量するための方法には、放射性標識（radiolabel ing）或いはビオチン標識ヌクレオチドの利用、コントロールの核酸の同時増幅 （coamplification）の利用、並びに実験結果を補完して引かれた標準的なグラ フ曲線の利用も含まれる（Melby,P.C.等1993 J.Immunol Methods,159:235-44；D uplaa,C.等(1993)Anal.Biochem.229-236）。多数のサンプルの定量は、ELISA形 式の連続アッセイを実行することにより一層迅速に行うことができる。このアッ セイでは目的のオリゴマーが様々な希釈溶液中に存在し、分光光度計を用いる分 析或いは比色分析反応により迅速に定量することができる。 別の実施例では、ここに開示する任意のポリヌクレオチド配列を起源とするオ リゴヌクレオチドをマイクロアレイにおける標的として用い得る。マイクロアレ イを用いることにより、多くの遺伝子の発現レベルを同時にモニタし（転写物イ メージを生成する）、また遺伝子の変異体、変異及び多形性を同定することがで きる。この情報は、遺伝子の機能の決定や、疾病の遺伝的な基礎の理解、疾病の 診断、及び治療薬の開発や活性のモニタリングにおいて役立つ（Heller,R.等.(1 997)Proc.Natl.Acad.Sci.94:2150-55）。 或る実施例では、ＰＣＴ出願WO95/11995(Chee等.)、Lockhart,D. J.等.(1996;Nat.Biotech.14:1675-1680)及びSchena,M.等.(1996;Proc.Natl.Acad .Sci.93:10614-10619に記載の方法によりマイクロアレイを準備し、利用する。 上記の文献はここに引用することにより本明細書と一体にされたものとする。 マイクロアレイは、好ましくは、固形支持体に固定された、通常は合成アンチ センスオリゴヌクレオチドかｃＤＮＡの断片の何れかである、数多くの独特で一 本鎖の核酸配列からなる。マイクロアレイは、既知の５’又は３’配列をカバー するオリゴヌクレオチド、完全長配列をカバーする連続的なオリゴヌクレオチド 、又は配列の長さに沿った特定の領域から選択された独特のオリゴヌクレオチド を含み得る。マイクロアレイにおいて用いられるポリヌクレオチドは、特定の細 胞の型、発達又は疾病の状態について共通な１又は２以上の未同定ｃＤＮＡに特 異的な、或いは少なくとも配列の断片が既知である標的の遺伝子又は遺伝子群に 特異的なオリゴヌクレオチドであり得る。 マイクロアレイ用に既知の配列に対するオリゴヌクレオチドを製造するために 、ヌクレオチド配列の５’又は又はより好ましくは３’末端からコンピュータア ルゴリズムを用いて目的の遺伝子を検定する。このアルゴリズムは、その遺伝子 に独特な、ハイブリダイゼーションに適した範囲内のＧＣ含量を有し、且つハイ ブリダイゼーションを妨げ得る推定２次構造を有していない決まった長さのオリ ゴマーを同定する。このオリゴヌクレオチドは、光照射化学プロセスを用いて基 板上の所定の領域において合成される。この基板は、紙、ナイロン、又は他のタ イプのメンブラン、濾紙、チップ、スライドガラス、又は他の任意の適切な固形 支持体であり得る。 別の態様では、オリゴヌクレオチドが、ＰＣＴ出願WO95/251116（Baldeschwei ler等.）に記載のように化学結合プロシージャ及びイン クジェット装置を用いることによって基板の表面上で合成され得る。上記ＰＣＴ 出願はここに引用することにより本明細書と一体にされたものとする。別の態様 では、ドットブロット（又はスロットブロット）に類似した「格子型」アレイを 用いて、真空システム、熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合プロシージャを用いて ｃＤＮＡ断片又はオリゴヌクレオチドを基板の表面上に配置し結合することがで きる。上述のようなアレイは、手で製造するか、或いは市販の装置（スロットブ ロット又はドットブロット装置）、材料（任意の適切な固形支持体）、及び機械 （ロボット装置を含む）を用いることにより製造することができ、8、24、96、3 84、1536、又は6144のオリゴヌクレオチド、若しくは市販の器具を効果的に使用 できる２〜１００万の間の任意の数のオリゴヌクレオチドを含み得る。 マイクロアレイを用いたサンプル解析を行うために、生物学的サンプルからの ＲＮＡ又はＤＮＡをハイブリダイゼーションプローブにする。このｍＲＮＡは単 離され、ｃＤＮＡが作られて、アンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）を作るためのテ ンプレートとして用いられる。ａＲＮＡは蛍光ヌクレオチドの存在の下で増幅さ れ、標識されたプローブはマイクロアレイと共にインキュベートされて、プロー ブ配列がマイクロアレイの相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。 インキュベーション条件は、ハイブリダイゼーションが正確な相補的な一致又は 様様なレベルのより低い相補性をもってハイブリダイゼーションが発生するよう に調節される。ハイブリダイズしたプローブを除去した後、スキャナーを用いて 、蛍光のレベル及びパターンを求める。スキャンされたイメージを調べて、マイ クロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の相補性の程度及び相対的な量を求め る。生物学的サンプルは、体液（例えば血液、尿、唾液、痰、胃液等）、培養さ れた細胞、生検組織、又は他の組織調 製物から得ることができる。検出システムを用いることにより、全ての個別の配 列について同時にハイブリダイゼーションの不存在、存在、及び量を測定するこ とができる。このデータは、サンプルにおける配列、突然変異、変異、又は多形 体についてのラージスケールの相関性の研究のために用いることができる。 本発明の別の実施例では、ＰＰＴ−Ｂをコードする核酸配列を用いて、自然発 生のゲノム配列マッピングのためのハイブリダイゼーションプローブを作り出す こともできる。この配列を、特定の染色体、染色体の特定の領域、又は人工染色 体作成物にマッピングすることができる。前記人工染色体作成物には、例えばヒ ト人工染色体（ＨＡＣ）、酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡ Ｃ）、細菌性Ｐ１作成物又は一本鎖染色体ｃＤＮＡライブラリーがあり、Price, C.M.(1993)Blood Rev.7:127-134，及びTrask,B.J.(1991)Trends Genet.7:149-15 4にその概要が記載されている。 蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH、Verma等(1988)Human Chromosomes :A Manual of Basic Technioue ,Pergamon Press,New York,NY”に記載)は、他の 染色体マッピング技術及び遺伝子地図データと関係を有し得る。遺伝子地図デー タの例は、種々の科学誌や、Online Mendelian Inheritance in Man（OMIM）に 見ることができる。物理的染色体地図上でのＰＰＴ−Ｂをコードする配列の位置 と、特定の疾病(または特定の疾病の素因)との相関関係を助けとして、ある遺伝 病が関係するＤＮＡの領域の限界決定ができる。本発明のヌクレオチド配列を用 いて、正常者とキャリアまたは患者との遺伝子配列の違いを検出することができ る。 染色体調製物のin situハイブリダイゼーション及び確定された染色体マーカ ーを用いる連鎖解析のような物理的地図作成技術は、遺伝子地 図を延長するために大変重要である。多くの場合、特定のヒト染色体の数或いは 腕が未知であっても、マウスのような別の哺乳類種の染色体上の遺伝子配置から 、関連するマーカーがわかる。新しい配列は、物理的マッピングにより染色体の アーム、或いはその一部へ割当てることができる。これは位置クローニング或い は他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を調査する研究者に貴重な情報を提供 する。ひとたび毛細血管拡張性運動失調（AT）のような疾患或いは症候群が、特 定のゲノム領域へ、例えばATならば11q22-23(Gatti,R.A.等(1988)Nature 336:57 7-580)へ、遺伝子連鎖によって粗い局所化がなされれば、その領域にマッピング される任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは調節遺伝子 ということになる。本発明のヌクレオチド配列は、正常者とキャリアまたは患者 との間の、転座、逆位等による染色体位置の違いを検出するために用いることも できる。 本発明の別の実施例では、ＰＰＴ−Ｂや、その触媒作用性または免疫原性フラ グメント或いはオリゴペプチドを、種々の薬物スクリーニング技術において治療 用化合物のスクリーニングのために用いることができる。そのような試験におい て用いられるフラグメントは、溶液に遊離した形態か、固体支持体へ付着したも のか、細胞表面へ付着したものか、或いは細胞内に存在するものであり得る。Ｐ ＰＴ−Ｂと試験される薬剤との結合複合体形成を測定することができる。 ＰＰＴ−Ｂポリペプチドへの適切な結合親和性を有する化合物の高スループッ トスクリーニングのために用いることができる別の薬物スクリーニング技術が、 公開されたPCT出願WO84/03564に詳細に記載されている。この方法をＰＰＴ−Ｂ に適用する場合には、多数の異なる小形ペプチドの試験用化合物を、プラスチッ クピン或いは他の表面のような固体基質上で合成する。ポリペプチド試験用化合 物をＰＰＴ−Ｂ又はそ の断片と反応させ、洗浄する。次いで結合ＰＰＴ−Ｂを当分野で周知の方法によ り検出する。また、前述の薬物スクリーニング技術において使用するために、精 製ＰＰＴ−Ｂをプレート上に直接コーティングすることもできる。この他、ペプ チドを捕捉し固体支持体上にペプチドを固定するために非中和抗体を用いること ができる。 別の実施例では、ＰＰＴ−Ｂに結合し得る中和抗体が、ＰＰＴ−Ｂとの結合に ついて試験化合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイを使用 することができる。このように、抗体を用いて、１または２以上のＰＰＴ−Ｂと 共通のエピトープを有する任意のペプチドの存在を検出することができる。 更に別の実施例では、ここに開示するＰＰＴ−Ｂをコードするヌクレオチド配 列は、その新技術が、以下に限らないが、例えばトリプレット遺伝暗号及び特異 的塩基対合相互作用のような特性を含む、現在周知のヌクレオチド配列の特性に 基づく技術であれば、まだ開発されていない分子生物学的技術においても用いる ことができる。 以下に示す本発明の実施例は、単なる例示であって、本発明をこの実施例に限 定しようとするものではない。実施例 １ BRAITUT03 ｃＤＮＡライブラリーの作製 BRAITUT03 ｃＤＮＡライブラリーを、年齢１７歳の白人女性から脳髄膜病巣 の切除によって採取された星状細胞腫組織（左前葉）から作製した。病状報告に よれば、グレード４の原繊維性大形及び小形星状細胞腫が認められた。この患者 の既往症には良性高血圧症があった。脳組織の炎症を軽減させるためにデキサメ タゾン(Merck & Co..West Point.PA)が処方されていた。 冷凍組織を、Brinkmann Homogenizer Polytron PT-3000（Brinkmann Instrume nts,Inc.,Westbury,NY）を用いて、グアニジウムイソチオシアネート溶液の中で ホモジナイズし溶解した。この溶解産物を、Stratagene社（Stratagene Inc.San Diego,CA）のＲＮＡ単離プロトコルに従って酸性フェノールpH4.0で一回抽出し た。このＲＮＡを等量の酸性フェノールで二回抽出し、0.3Mの酢酸ナトリウム及 び2.5倍量のエタノールを用いて沈殿させ、DEPC処理した水に再度懸濁し、37℃ で25分間ＤＮアーゼ処理した。Qiagen Oligotex kit(QIAGEN,Inc.,Chatsworth,C A)を用いてＲＮＡを単離し、それを用いてｃＤＮＡライブラリーを作製した。 このＲＮＡは、SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmi d Cloning（Cat.# 18248-013,Gibco/BRL,Gaithersburg,MD）の推奨プロトコルに 従って取り扱った。ｃＤＮＡをSepharose CL4Bカラム（Cat.#275105,Pharmacia ）で分画化し、400bpを越えるｃＤＮＡをインサイト社製のベクターpSport Iに リゲートした。次にこのプラスミドpSport IをDH5a^TMコンピテント細胞（Cat.#1 8258-012,Gibco/BRL）に入れて形質転換させた。 ２ ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定 プラスミドＤＮＡはこの細胞から放出されるが、これをREAL Prep 96 Plasmid Kit（Catalog#26173,QIAGEN,Inc.）を用いる。推奨プロトコルを利用したが、 以下の点を変更した。（１）25mg/Lのカルベニシリン及び0.4％のグリセロール と共に1mlの滅菌Terrific Broth（Catalog#22711,G1bco/BRL）において細菌を培 養した。（２）植菌の後、培地を19時間インキュベートし、次に0.3mlの溶解バ ッファに溶解した。（３）イソプロパノール沈殿の後、プラスミドＤＮＡペレッ トを0.1mlの蒸留水に再懸濁した。プロトコルの最終ステップの後、サン プルを96穴ブロックに移し４℃で保管した。 このｃＤＮＡの配列決定は、Peltier Thermal Cyclers（MJ Research社（Wate rtown,MA）製のPTC200）及びApplied Biosystems社製の377 DNA Sequencing Sys temsと組み合わせてHamilton Micro Lab 2200（Hamilton,Reno,NV）を用いてSan ger F.及びA.R.Coulsonの方法（1975,J.Mol.Biol.94:441f）により行い、読み枠 を決定した。 ３ ｃＤＮＡクローン及びそれらの類推されるタンパク質の相同性検索 配列表のヌクレオチド配列及び、それらから類推されるアミノ酸配列を問い合 わせ配列として用いて、例えばGenBank、SwissProt、BLOCKS、及びPima IIのよ うなデータベースを検索した。これらのデータベースには既に同定された配列が 注釈付きで含められており、BLAST（Basic Local Alignment Toolを表す）を用 いて相同性（類似性）を有する領域をこのデータベースのなかから検索した（Al tschul.S.F.(1993)J.Mol.Evol.36:290-300;Altschulら(1990)J.Mol.Biol.215:40 3-410）。 BLASTは、ヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを作成して配 列の類似性を決定する。そのアライメントの局所性のために、BLASTは厳密な一 致、すなわち原核生物（細菌）や真核生物（動物、菌類、又は植物）を起源とす るホモログを求める際に特に有効である。一次配列パターンや二次構造ギャップ ペナルティを処理する際には、本明細書に一体に引用されたSmithR.F.及びT.F.S mith(1992,Protein Engineering 5:35-51)に記載のもののような他のアルゴリズ ムを用いることができる。本明細書に開示された配列の長さは少なくとも49ヌク レオチドであり、不必要な塩基は12％以下である（ここで、ＮはＡ、Ｃ、Ｇ、又 はＴ以外と記録されたものである）。 BLAST法は、本明細書に一体に引用されたKarlin.S.及びS.F.Altschul（1993:P roc.Nat.Acad.Sci.90:5873-7）に詳細に記載されて いるように、問い合わせ配列とデータベースの配列の一致を検索する。BLASTは 発見したあらゆる配列の一致の統計的有意性を評価して、ユーザが選択した有意 性の閾値を満たす一致のみを報告する。本出願での閾値は、ヌクレオチドで１０^-25 、ペプチドで１０^-14に設定した。 インサイト社のヌクレオチド配列を、霊長類（pri）、げっ歯類（rod）、及び 他の哺乳類配列（mam）のGenBankデータベースで検索した。次に同じクローンか ら類推されたアミノ酸配列を、GenBankの機能性タンパク質データベース、哺乳 類（mamp）、脊椎動物（vrtp）、及び真核生物（eukp）で、相同性について検索 した。特定の一致について関連するデータベースが、表１に示すようにGixxx±p という形式で報告された(ここでxxxはpri;rod等であり、存在の場合はp=ペプチ ドである)。 ４ ノーザン法による解析 ノーザン解析は、標識されたヌクレオチド配列と特定の細胞型または組織に由 来するＲＮＡが結合したメンブランとのハイブリッド形成を行う、遺伝子の転写 物の存在を検出するために用いられる実験技術である（Sambrook等、前出）。 BLAST（Altschul,S.F.1993及び1990,上述）を用いる類似のコンピュータ技術 で、GenBankまたはLIFESEQ^TMデータベース（Incyte Pharmaceuticals）のような データベースにおける同一のまたは近縁な分子を検索した。この解析は、多くの 膜ベースのハイブリダイゼーションより非常に短時間で行うことができる。更に 、コンピュータ検索の感度を変更して、ある一致が正確な一致か、相同的である かの分類を決定することができる。 検索の基準値は、積スコア（product score）であり、これは以下の式で定義 されるものである。 （配列の一致（％）×最大BLASTスコア（％））／１００ この積スコアでは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致の双方 が考慮されている。例えば、積スコアが４０の場合は、一致は誤差が１〜２％の 範囲で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相同な分子は、 通常積スコアとして１５〜４０を示すものを選択することにより同定されるが、 スコアの低いものは近縁関係にある分子として同定される。 ノーザン解析の検索の結果は、ＰＰＴ−Ｂをコードする転写物が発生するライ ブラリーのリストとして報告される。配列の存在量（abundance）、及びパーセ ント存在率（percent abundance）のリストも報告される。存在量は、特定の転 写物の検出回数を直接反映し、パーセント存在率は、存在量をｃＤＮＡライブラ リ一内で検出された配列の総数で除したものである。 ５ ＰＰＴ−Ｂをコードする配列の延長 インサイト社クローンNo.2109906の核酸配列を用いて、部分的ヌクレオチド配 列を完全長まで伸長させるためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。一 方のプライマーはアンチセンス方向の延長を開始するために合成し、他方のプラ イマーはセンス方向に配列を延長するために合成した。これらのプライマーを用 いて、周知のＰＰＴ−Ｂ配列を「外側に」延長し、対象の領域の新しい未知のヌ クレオチド配列を含むアンプリコンを生成した。初めのプライマーは、OLIGO 4. 06（National Biosciences社）、或いは他の適切なプログラムを用いて、長さが ２２〜３０ヌクレオチドで５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の 温度で標的配列にアニールするように設計した。ヘアピン構造及びプライマー− プライマー二量体化を生じるような任意のヌクレオチドのストレッチは避けた。 選択されたヒトｃＤＮＡライブラリー（Gibco/BRL）を用いて配列を 延長した。２以上の延長が必要な場合は、既知領域をさらに延長するために追加 のプライマーの組を設計する。 XL-PCRキット（Perkin Elmer）の説明書の指示に従って、酵素と反応混合物と を完全に混合することにより、高い忠実度の増幅がなされる。４０pmolの各プラ イマーと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始する場合 、Peltier Thermal Cycler（PTC200；M.J.Reserch,Watertown MA）を用いて、以 下のパラメータでＰＣＲを行った。 ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性） ステップ２ ６５℃で１分間 ステップ３ ６８℃で６分間 ステップ４ ９４℃で１５秒間 ステップ５ ６５℃で１分間 ステップ６ ６８℃で７分間 ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復 ステップ８ ９４℃で１５秒間 ステップ９ ６５℃で１分間 ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間 ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復 ステップ１２ ７２℃で８分間 ステップ１３ ４℃（その温度を保持） 反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）ア ガロースミニゲル上での電気泳動で解析して、反応物が配列を延長することに成 功したか否かを決定した。最も大きな生成物或いはバンドを選択して、ゲルから 切り出し、QIAQuick^TM（QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA）を用いて精製し、クレノ ウ酵素を用いて一本鎖ヌクレ オチドの延び出し（overhang）を切り取って再結合及びクローニングを容易にす る平滑末端を作った。 エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌのライゲーション緩衝液内に再溶解し 、１μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチ ドキナーゼを加えて、その混合物を室温で２〜３時間、或いは１６℃で一昼夜イ ンキュベートした。コンピテント大腸菌細胞(４０μｌの適切な溶媒内にある)を 、３μｌのライゲーション混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培地（ Sembrook等、上記）で培養した。３７℃で１時間のインキュベーションの後、全 ての形質転換混合物を、2xCarbを含むLuria Bertani（LB）寒天（Sembrook等、 上記）上にのせた。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択し 、適切な市販の無菌の９６穴マイクロタイタープレートの個々のウェル内に入れ られた１５０μｌの液状LB/2xCarb培地で培養した。さらに後日、５μｌの各一 昼夜の培養物を非無菌９６穴プレート内に移し、水で１：１０に希釈した後、そ れぞれ５μｌのサンプルをＰＣＲアレイに移した。 ＰＣＲ増幅のため、４単位のｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを含む１８μｌの濃 縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加えた。増幅は以 下の条件に従って行った。 ステップ１ ９４℃で６０秒間 ステップ２ ９４℃で２０秒間 ステップ３ ５５℃で３０秒間 ステップ４ ７２℃で９０秒間 ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復 ステップ６ ７２℃で１８０秒間 ステップ７ ４℃（そのまま保持） ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動 させた。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクロ ーンを選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行った。 同様に配列番号：２のヌクレオチド配列を用いて、上述の手順を用いて５’調 節配列を得たり、５’延長のために設計されたオリゴヌクレオチドを得たり、及 び適切なゲノムライブラリーを得ることができる。 ６ ハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用 配列番号：２の配列に基づくハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤ ＮＡ、ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０の塩基対から なるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、大きなｃＤＮＡフラグメン トの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドをOLIGO4.06（Nationa l Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、５０pmolの 各オリゴマーと、２５０ｍＣｉの[γ‐³²Ｐ]アデノシン三リン酸（Amersham）及 びＴ４ポリヌ 用いて標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、SephadexG-25超精細樹脂カ ラム（Pharmacia）を用いて精製する。毎分１０⁷カウントのセンス及びアンチセ ンスオリゴヌクレオチドのそれぞれを含む部分を、エンドヌクレアーゼAseI，Bg l II，EcoRI，Pst I，Xba1或いはPvuII； ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。 各切断物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画化して、ナイロン 膜（Nytran Plus,Schleicher & Schuell,Durham NH）にトランスファーする。ハ イブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行 う。非特異的シグナルを取り除くため、ブロットを、０．１ｘクエン酸ナトリウ ム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまで段階的に厳密性が増す条件下 で、室温にて順次洗浄する。XOMAT AR^TMフィルム（Kodak,Rochester,NY）を、Ph osphoimager cassette（Molecular Dynamics,Sunnyvale,CA）においてブロット に数時間露光した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。 ７ マイクロアレイ マイクロアレイ用のオリゴヌクレオチドを作るために、ここに開示したヌクレ オチド配列を、ヌクレオチド配列の３’末端からコンピュータアルゴリズムを用 いて調べる。このアルゴリズムは、その遺伝子に独特な、ハイブリダイゼーショ ンに適した範囲内のＧＣ含量を有し、且つハイブリダイゼーションを妨げるよう な推定される２次構造が存在しない、決まった長さの各オリゴマーを同定する。 このアルゴリズムは、長さ20ヌクレオチドの20個の配列特異的オリゴヌクレオチ ド（20量体）を同定する。各配列の中央の１個のヌクレオチドだけが変化してい る点を除いて一致しているオリゴヌクレオチドの組が作り出される。このプロセ スはマイクロアレイにおける各遺伝子について反復され、20個の20量体の二重の 組が、光照射化学プロセスを用いてシリコンチップの表面上で合成され配列され る（Chee,M.等,PCT/WO95/11995、この引用により本明細書と一体にされたものと する）。 別形態では、化学結合プロシージャ及びインクジエット装置を用いて、基板の 表面上でオリゴマーを合成する（Baldeschweiler,J.D.等,PCT/WO95/25116、この 引用により本明細書と一体にされたものとする）。更に別の形態では、ドットブ ロット法（スロットブロット法）に類似した「格子型」アレイを用いて、真空シ ステム、熱、ＵＶ、機械的又は化学的結合プロシージャを利用してｃＤＮＡ断片 又はオリゴヌクレ オチドを基板の表面に配置し結合させる。アレイは、手を用いることにより、又 は市販の材料及び機械を用いることによって製造され得、８ドット、24ドット、 94ドット、384ドット、1536ドット、又は6144ドットの格子を有している。ハイ ブリダイゼーションの後、マイクロアレイを洗浄してハイブリダイズしていない プローブを取り除き、スキャナーを用いて蛍光のレベル及びパターンを求める。 スキャンされた画像を調べて、マイクロアレイ上の各オリゴヌクレオチド配列の 相補性の程度及び相対的な量を求める。 ８ 相補的ポリヌクレオチド ＰＰＴ−Ｂをコードする配列或いはその任意の一部分に対して相補的な配列は 、自然発生のＰＰＴ−Ｂの発現を低下又は阻害するために用られる。約１５〜約 ３０塩基対からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用について特に記すが 、より小さな或いはより大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ方法を 用いることができる。Oligo4.06ソフトウェア及びＰＰＴ−Ｂのコーディング配 列（配列番号：１）を用いて、適切なオリゴヌクレオチドを設計することができ る。転写を抑制するためには、最も独特な５’配列から相補的なオリゴヌクレオ チドを設計し、これを用いてプロモーターが結合するのを阻害する。翻訳を阻害 するためには、相補的なオリゴヌクレオチドを設計して、リボソームがＰＰＴ− Ｂをコードする転写物に結合するのを阻害する。 ９ ＰＰＴ−Ｂの発現 ＰＰＴ−Ｂの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクター内にサブクローニングし、そ のベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって行われる。この場合 、前にｃＤＮＡライブラリーの作製の際に用いたクローニングベクターを用いて 、大腸菌においてＰＰＴ−Ｂを発現させる。クローニング部位の上流には、β− ガラクトシダーゼに対するプロモー タが存在し、その後ろにはアミノ基末端Met及びβ−ガラクトシダーゼの７残基 が存在する。後続のこれら８つの残基は、転写に役立つバクテリオファージプロ モーターであり、多くの独特の切断部位を含むリンカーである。 単離されたトランスフエクト菌株を、IPTGを用いて標準的な方法で誘導し、初 めのβガラクトシダーゼの７残基、約５〜１５残基のリンカー、及び完全長ＰＰ Ｔ−Ｂからなる融合タンパク質を作り出す。このシグナル配列は菌培地へのＰＰ Ｔ−Ｂの分泌を誘導し、この培地は後の活性のアッセイにおいて直接用いること ができる。 １０ ＰＰＴ−Ｂ活性の確認 このアッセイは、ＰＰＴ−Ｂのタンパク分解産物、ＮＫＢで処理した後にヒト ニューロキニン受容体NK-3のｃＤＮＡを安定的にトランスフェクトした受容体細 胞系A20/NK3-17/3におけるホタル・ルシフェラーゼ活性の上昇に基づくアッセイ である（Stratowa,C.等(1995)J.Recept.Signal Transduct.Res．15:617-630）。 ルシフェラーゼ活性は、ホスファターゼＣ−NK-3受容体複合体による内生ホスフ ァチジルイノシトールの加水分解により誘導される。ウェル一個あたり約10,000 個の細胞を、不透明な96穴マイクロタイタープレート（Microlite^TM.Dynatech L aboratories.Burlington,MA)に播き、37℃で18時間インキュベートする。細胞を ＰＰＴ−Ｂ（1μM）で７時間かけて誘導し、活性を検出する。インキュベーショ ンの後、細胞をリン酸緩衝食塩水で２回洗浄し、５μＭのルシフェリンを含むア ッセイ用バッファー(270μMのコエンザイムA、20mMのTris HCl、pH7.8における5 30μMのATP、1.07mMの(MgCO₃)₄Mg(OH)₂5H₂O、2.67mMのMgSO₄、0.1mMのEDTA二ナ トリウム二水和物、及び33mMのジチオスレイトール）に溶解した。ルシフェラー ゼの活性は、ルミノメーター（ML-1000,Dynatech Laboratories）で測定する。この活性はNKBが10nMから0.1mMの範囲で直線的であ る（Stratowa.C.等（1995）前出）。 １１ ＰＰＴ−Ｂ特異的抗体の産生 標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化及び抗体の産生には、ＰＡＧＥ電 気泳動法（Sambrook前出）を用いて実質的に精製されたＰＰＴ−Ｂを用いる。配 列番号：２から類推されるアミノ酸配列をDNAStarソフトウエア（DNASTAR社）を 用いて解析して免疫抗原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを当業 者には周知の手段により合成して、当業者に周知の方法で抗体を産生するために 用いる。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープのような、適 切なエピトープを選択するための解析法は、Ausubel等（上記）の論文他に記載 されている。 通常、約１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペ プチドシンセサイザModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し、 Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ： Ausubel等、上記）を用いた反応によりキーホールリンペットヘモシニアン（Ｋ ＬＨ、Sigma,St.Louis,MO）に結合する。フロイントの完全アジュバントにおい てオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫する。得られた抗血清の 抗ペプチド活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、１％ BSAを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ 素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。 １２ 特異的抗体を用いる自然発生ＰＰＴ−Ｂの精製 自然発生ＰＰＴ−Ｂ或いは組換えＰＰＴ−Ｂは、ＰＰＴ−Ｂに特異的な抗体を 用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより精製することができる。イ ムノアフィニティーカラムは、CnBr-activated Sepharose（Pharmacia Biotech社）のような活性化クロマトグラフレジンとＰＰ Ｔ−Ｂ抗体とを共有結合させることにより構築される。結合後、そのレジンを使 用説明書の指示に従って、ブロックし洗浄する。 ＰＰＴ−Ｂを含む培地をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをＰ ＰＴ−Ｂを優先的に吸着できる条件下で（例えば界面活性剤の存在下において高 イオン強度バッファで）洗浄する。このカラムを、抗体／ＰＰＴ−Ｂ結合を切る ような条件下（例えばｐＨ２〜３のバッファー、或いは高濃度の尿素またはチオ シアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオン）で溶出させ、ＰＰＴ−Ｂを回 収する。 １３ ＰＰＴ−Ｂと相互作用する分子の同定 ＰＰＴ−Ｂ又は生物学的に活性なその断片を、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬（B olton,A.E.及びW.M.Hunter(1973)Biochem.J.133:529-38）で標識する。マルチウ ェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＰＰＴ−Ｂとともに インキュベートし、洗浄して、標識ＰＰＴ−Ｂ複合体を有する任意のウェルをア ッセイする。異なる濃度のＰＰＴ−Ｂを用いて得られたデータを用いて、候補の 分子とＰＰＴ−Ｂの会合、親和性、数の数値を計算する。 上記のすべての刊行物及び特許明細書は、本明細書と一体に参照されたい。本 発明の記載した方法及びシステムの種々の改変は、本発明の範囲及び精神から逸 脱しないことは当業者には明らかであろう。本発明は特に好適な実施例に関連し て記載されているが、本発明の請求の範囲は、そのような特定の実施例に不当に 制限されるべきではないことを理解されたい。実際には、本発明を実施するため に記載された方法の種々の改変は、分子生物学或いは関連する分野の専門家には 明らかなように、請求の範囲内に含まれるものである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ， ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，Ｌ Ｓ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ ，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ， ＦＩ，ＧＢ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｒ Ｕ，ＳＥ，ＳＧ，ＵＳ (72)発明者 カイザー、マシュー・アール アメリカ合衆国カリフォルニア州94546― 1017・カストロバレー・ユーイングロード 4793

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．配列番号：１のアミノ酸配列を含む実質的に精製されたヒト・プレプロタキ キニンＢ、またはその断片。 ２．請求項１のプレプロタキキニンＢをコードする単離され精製されたポリヌク レオチド配列、または前記ポリヌクレオチド配列の断片若しくは変異配列。 ３．請求項２のポリヌクレオチド配列を含む組成物。 ４．請求項２のポリヌクレオチド配列と厳密な条件の下でハイブリダイズするポ リヌクレオチド配列。 ５．請求項２のポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列またはそ の断片若しくは変異配列。 ６．配列番号：２の配列を含む単離され精製されたポリヌクレオチド配列または その断片若しくは変異配列。 ７．請求項６のポリヌクレオチド配列を含む組成物。 ８．請求項６のポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列。 ９．請求項２のポリヌクレオチド配列の少なくとも断片を含む発現ベクター。 １０．請求項９のベクターを含む宿主細胞。 １１．配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片の製造方 法であって、 （ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件の下で請求項１０の宿主細胞を培 養する過程と、 （ｂ）前記宿主細胞の培地から前記ポリペプチドを回収する過程とを含むこと を特徴とする配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドまたはその断片の 製造方法。 １２．配列番号：１のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたヒト・ プレプロタキキニンＢを、適切な医薬用担体と共に含む医薬品組成物。 １３．請求項１のポリペプチドに特異的に結合する精製された抗体。 １４．請求項１のポリペプチドの精製されたアゴニスト。 １５．請求項１のポリペプチドの精製されたアンタゴニスト。 １６．神経性疾患の治療方法であって、 そのような治療が必要な患者に、請求項１２の医薬品組成物を有効な量投与す る過程を含む神経性疾患の治療方法。 １７．腫瘍性疾患の治療方法であって、 そのような治療が必要な患者に、請求項１５のアンタゴニストを有効な量投与 する過程を含む腫瘍性疾患の治療方法。 １８．生物学的サンプルにおけるヒト・プレプロタキキニンＢをコードするポリ ヌクレオチドの検出方法であって、 （ａ）請求項５のポリヌクレオチドと、生物学的サンプルの核酸材料とをハイ ブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、 （ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程であって、前記複合 体の存在が、前記生物学的サンプルにおけるプレプロタキキニンＢをコードする ポリヌクレオチドの存在と相関性を有する、該過程とを含むことを特徴とする生 物学的サンプルにおけるヒト・プレプロタキキニンＢをコードするポリヌクレオ チドの検出方法。 １９．前記核酸材料を、ＰＣＲ法により増幅することを特徴とする請求項１８に 記載の方法。