JP2002527028A

JP2002527028A - ヒトアポトーシス調節タンパク質

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Publication number: JP2002527028A
Application number: JP53006598A
Authority: JP
Inventors: バンドマン、オルガ; ゴリ、スリヤ・ケイ; ヒルマン、ジェニファー・エル
Original assignee: インサイト・ファーマスーティカルズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1996-12-27
Filing date: 1997-12-11
Publication date: 2002-08-20
Also published as: AU5526398A; US20020102710A1; WO1998029447A1; US6307021B1; US5847093A; CA2278340A1; EP0954532A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、ヒトアポトーシス調節タンパク質（ＡＰＲＧ）、及びＡＰＲＧを同定しコードするポリヌクレオチドを提供する。また本発明は、ＡＰＲＧをコードする核酸配列を含む遺伝子組換え発現ベクター及び宿主細胞と、ＡＰＲＧの製造方法とを提供する。また本発明は、ＡＰＲＧに特異的に結合するアゴニスト、抗体、又はアンタゴニストと、ＡＰＲＧの発現が関係する疾病の予防及び治療におけるそれらの使用法を提供する。更に本発明は、ＡＰＲＧの発現が関係する疾病の治療のための、ＡＰＲＧをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子の使用法を提供する。また本発明は、該ポリヌクレオチド又はその断片若しくは相補配列及びＡＰＲＧに特異的に結合する抗体を利用する診断検査法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は、新規なヒトアポトーシス調節タンパク質の核酸及びアミノ酸配列、及びアポトーシスの増減が関係する疾病の診断、予防、及び治療におけるこれらの配列の使用に関するものである。背景技術多細胞生物における正常な発達、成長、及びホメオスタシスには、生物体の体全体の組織における細胞の生成と破壊の絶妙なバランスが必要である。細胞分割は、多数のチェックポイント及び調節機構を備えた精密な協調プロセスである。これらの機構は、ＤＮＡ複製を調節し、不適切な又は過剰な増殖を防止するように設計されている。対照的にプログラムされた細胞死は、遺伝子によって調節されるプロセスであり、このプロセスによって、不要な又は損傷した細胞が、多くの場合急性の損傷や壊死と結びついている組織破壊や炎症反応を引き起こすことなく除去され得る。用語「アポトーシス」は、プログラムされた細胞死を受ける細胞を特徴づける形態学的変化について説明するためにKerr,J.F．等により初めに用いられた用語である(1972;Br.J.Cancer 26:239-257)。アポトーシス細胞は、膜脂質成分の変化や核の高度な凝血を伴う収縮した外観を呈する。アポトーシス細胞は、隣接した細胞又はマクロファージらよって速やかに貪食され、それらの損傷を与え得る成分が周囲の組織に漏れ出したり、炎症反応を誘発することはない。アポトーシスを調節するプロセス及び機構は、系統樹全体にわたって高いレベルで保存される。実際、アポトーシスについて現在知られていることの多くは、線虫Caenorhabditis elegans及びショウジョウバエDrosophila melanogasterの研究から得られたものである（例えばSteller,H.(19 95)Science 267:1445-1449及びその中の引用文献を参照）。最近になって、アポトーシスの調節不全は、ヒトの疾病の病原における有意な因子として認識されてきた。例えば、細胞の生存度が不適切になることは、癌、自己免疫疾患、及び炎症性疾患のような多くの疾病を引き起こす、つまりそれらの疾病の原因となり得る。逆にアポトーシスが増加すると、例えばＡＩＤＳ、神経変性疾患、脊髄形成異常症候群のような免疫不全疾患を引き起こし得る（Thompson，C.B.(1995)Scie nce 267:1456-1462）。種々のリガンド及びその細胞受容体、酵素、癌抑制因子、ウイルス遺伝子産物、薬剤、及び無機イオンが、細胞のアポトーシスによる破壊の調節及び実現において正又は負の重要な役割を有する。アポトーシス経路の幾つかの特定の構成要素が同定され、特性化されてきたが、多くの関与するタンパク質間の相互作用は未知であり、この経路の主要な部分は分かっていないままである（Steller,H.，前出； Thompson,C.B.，前出）。アデノウイルスE1B 19K遺伝子産物及び細胞性癌遺伝子Bcl-2タンパク質はアポトーシスによる細胞死を防止することが分かってきた。E1B 19Kタンパク質は、アデノウイルス、腫瘍壊死因子α、紫外線放射、及びp53の過剰発現のような物質に曝された細胞におけるアポトーシスを抑制する。Bcl-2タンパク質は、アデノウイルスが感染した細胞においてE1B 19Kに代わって、種々の刺激によるアポトーシスに対する類似した防御を与え得る。この防御が発生する仕組みは分かっていないが、種々の報告（Boyd,J.M.(1994)Cell 79:341-351,Farrow,S.N．ら(19 95)Nature 374:731-739及びSentman,C.L.(1991)Cell 67:879-888）は、E1B 19K 及びBcl-2が、細胞性タンパク質の一定のサブセットと相互作用することにより細胞の製造を媒介し得るということを示唆している。酵母菌において２ハイブリッドスクリーニングを利用することにより、E1B 19 K及びBcl-2と相互作用する３つのヒトタンパク質が単離されてきた。このスクリーニングシステムは、３つの構成要素、即ち酵母菌のGAL4 DNA結合ドメイン及び E1B 19Kタンパク質からなる融合タンパク質を発現するキメラベクター、GAL4活性化ドメインで標識されたヒトｃＤＮＡ発現ライブラリー、及びGALl UASリポーター作成物を有する。同時形質転換の時、ｃＤＮＡライブラリーを起源とするタンパク質とE1B 19Kタンパク質との結合によりGAL4の機能が再構成される。次にG AL4がGALl UASと結合し、リポータ遺伝子の転写が生ずる。このシステムを用いて、Boyd（前出）は、E1B 19Kタンパク質と特異的に相互作用するNip1、Nip2、及びNip3を単離した。更なる解析を行うと、これらの３つのタンパク質が、E1B 19Kにおけるモチーフと相同なBcl-2における配列と結合することが分かった。In vitro結合及び免疫沈降アッセイによって、Nipタンパク質が、アポトーシスの抑制に必要なBcl-2 及びE1B 19Kにおけるドメインと結合することが確認された。免疫局在化の研究により、Nipタンパク質が、細胞の核膜においてBcl-2又はE1B 19Kと共存することが分かる。更に、アポトーシスの抑制を欠いたE1B 19K突然変異体もNipタンパク質との相互作用を欠いている。これらの研究結果が示唆することは、Nipタンパク質とE1B 19Kタンパク質との相互作用とアポトーシスの抑制との相関関係である（Boyd,J.M．前出）。ヒトアポトーシス調節タンパク質をコードするポリヌクレオチド、及びその分子自体の発見により、プログラムされた細胞死、アポトーシスの調節を研究するための手段が得られる。ヒトNipタンパク質に関連する分子の発見は、癌、自己免疫疾患、リンパ球増殖性疾患、アテローム性動脈硬化症、ＡＩＤＳ、免疫不全疾患、虚血性障害、神経変性疾患、骨粗鬆症、脊髄形成異常症候群、毒素性疾患、及びウイルス感染症の検出、予防、及び治療において役立つ新たな診断用又は治療用物質を提供することにより、当分野における必要性を満たすものである。発明の開示本発明は、ヒトNip3（GI 558845）と類似性を有することを特徴とする、新規なヒトアポトーシス調節タンパク質（以下ＡＰＲＧと表記する）を提供する。従って本発明は、配列番号：１に示すアミノ酸配列を有する実質的に精製されたＡＰＲＧを提供する。本発明の或る態様は、ＡＰＲＧをコードする単離され実質的に精製されたポリヌクレオチドを提供する。特定の態様では、このポリヌクレオチドは配列番号：２のヌクレオチド配列である。また本発明は、配列番号：２の配列又はその変異体に対して相補的な配列を含むポリヌクレオチド配列に関連するものである。更に本発明は、配列番号：２の配列と厳密な条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を提供する。更に本発明は、ポリペプチドをコードする核酸配列、オリゴヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、その断片、一部分、又はアンチセンス分子、及びＡＰＲＧをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター及び宿主細胞を提供する。また本発明は、ＡＰＲＧに特異的に結合する抗体、及び実質的に精製されたＡＰＲＧを含む医薬品組成物を提供する。また本発明は、ＡＰＲＧのアゴニスト及びアンタゴニストの使用法を提供する。図面の簡単な説明第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図は、ＡＰＲＧ（1715374）のアミノ酸配列（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）を示す。配列のアライメントは、MacDNASISPRO^TMソフトウェア(Hitachi Software Engineering Co.,Ltd.,San B runo,CA)を用いて作成した。第２図は、ＡＰＲＧ(1715374；配列番号：１)とNip3(GI 558845；配列番号：３)との間のアミノ酸配列アライメントを示す。この配列アライメントは、DNAST AR^TMソフトウェアのマルチシーケンスアライメントプログラム（DNASTAR Inc,Ma dison）を用いて作成した。第３Ａ図及び第３Ｂ図はそれぞれ、ＡＰＲＧ（配列番号：１）とNip3（GI 558 845；配列番号：４）の疎水性プロットを示す。これらのプロットは、MacDNASIS PROソフトウェアを用いて作成したものであり、Ｘ軸は正の方向にアミノ酸の位置を表し、Ｙ軸は負の方向に疎水性のレベルを表す。発明の実施の形態本発明のタンパク質、核酸配列、及び方法について説明する前に、本発明は、ここに開示した特定の方法論、プロトコル、細胞系、ベクター、及び試薬に限定されず、実施形態を変更し得るものと理解されたい。また、ここで用いられる用語法は、特定の実施例のみを説明する目的で用いられたものであり、請求の範囲のみによって限定されるものである本発明の範囲を限定することを意図したものではないということも理解されたい。本明細書及び請求の範囲において、単数を表す「１つの」及び「その」と形容された表現（または数を表す表現を付していない場合）は、前後関係でそうでないことが明らかである場合以外は、複数の意味も含んでいることに注意しなければならない。従って、例えば「宿主細胞」なる表記が表すものには、複数のそのような宿主細胞が含まれ、「抗体」なる表記は、１またはそれ以上の抗体及び当業者に周知のその等価物等も表している。本明細書における全ての科学技術専門用語は、別の意味で定義されていない場合には、本発明の属する技術分野の専門家に一般に理解されるのと同じ意味を有する。ここに説明したものと類似のまたは等価な方法や材料を本発明の実施や試験において用いることができるが、好適な方法、装置、及び材料はここに説明されている。本明細書に記載された全ての文献は、本発明の関連において用いられ得る文献で報告された細胞系、ベクター、及び方法論を説明し開示する目的で引用されたものであり、この引用により本明細書と一体にされる。定義本明細書において「核酸配列」は、一本鎖か二本鎖の、センス鎖又はアンチセンス鎖である、ゲノム起源又は合成起源のＤＮＡ、ＲＮＡや、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びその断片又は一部分である。同様に、本明細書において「アミノ酸配列」は、自然発生の分子または合成分子の、オリゴペプチド、ペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質配列及びその断片又は一部分である。ここでは「アミノ酸配列」は、自然発生タンパク質分子のアミノ酸配列を指すものとして説明されているが、「アミノ酸配列」や類似の用語、例えば「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、アミノ酸配列を、説明されるタンパク質分子に関連する完全で元のままのアミノ酸配列に限定する意味で用いられてるのではない。本明細書において「ペプチド核酸」は、リジンのようなアミノ酸残基及びアミノ基が加えられたオリゴマーを含む分子である。これらの小分子は抗遺伝子剤とも称され、それに対して相補的な核酸の鎖に結合することにより転写物の伸長を停止させる（Nielsen,P.E.等(1993)Anticancer Drug Des.8:53-63）。本明細書において、ＡＰＲＧは、任意の種、特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマ、及び好ましくはヒトを含む哺乳類から得られる、天然の、合成の、半合成の、又は組換え体の何れかを起源とする実質的に精製されたＡＰＲＧのアミノ酸配列である。本明細書において「コンセンサス」は、再度シークエンシングされて不要な塩基が分離された核酸配列か、XL-PCR^TM(Perkin Elmer,Norwalk,CT)を用いて５′ 方向及び／または３′方向に延長されて、再度シークエンシングされた核酸配列か、GELVIEW^TMFragment Assembly system（GCG,Madison WI）を用いて２以上のインサイト社クローンの重複した配列を元に組み合わせて構成された核酸配列か、若しくは延長と組み合わせの双方によって形成された核酸配列の何れかである。本明細書においてＡＰＲＧの「変異体」は、１又は２箇所以上のアミノ酸が変異したアミノ酸配列である。この変異体は「保存的」変化を含むものであり得、この保存的変化においては、例えばロイシンをイソロイシンで置き換える場合のように置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性を有する。稀に、変異体が「非保存的」に変化する場合もあり、この非保存的変化では例えばグリシンがトリプトファンで置換される。類似した小変化には、アミノ酸の欠失か挿入、若しくはその両方も含まれる。例えばＤＮＡＳＴＡＲソフトウエアのような良く知られたコンピュータプログラムを用いて、生物学的或いは免疫学的活性を損なわずに置換、挿入、又は除去できるアミノ酸が何れかということ、及びそのようなアミノ酸がいくつかということを決定することができる。本明細書において「欠失」は、１または２以上のヌクレオチド若しくはアミノ酸残基が欠ける、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化である。本明細書において「挿入」或いは「付加」は、自然発生の分子と比較して、それぞれ１または２以上のヌクレオチド、アミノ酸残基が加わるような、ヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。本明細書において「置換」は、それぞれ１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ酸を、異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置換することによって生ずる変化である。本明細書において、用語「生物学的に活性」は、自然発生の分子の構造的機能、調節機能、又は生化学的機能を有するタンパク質である。同様に「免疫学的に活性」は、天然の、組換え体の、又は合成のＡＰＲＧ、若しくはその任意のオリゴペプチドが適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定の抗体に結合する能力である。本明細書において、用語「アゴニスト」は、ＡＰＲＧに結合したとき、ＡＰＲＧの活性を変調するようなＡＰＲＧの変化を生じさせる分子である。アゴニストには、ＡＰＲＧに結合するタンパク質、核酸、糖質や、任意の他の分子が含まれ得る。本明細書において、用語「アンタゴニスト」または「インヒビター」は、ＡＰＲＧに結合したとき、ＡＰＲＧの活性を阻害する分子である。アンタゴニスト及びインヒビターには、ＡＰＲＧに結合するタンパク質、核酸、糖質や、任意の他の分子が含まれ得る。本明細書において、用語「変調」は、ＡＰＲＧの生物学的活性の変化又は変質である。変調は、タンパク質活性の上昇や低下、結合特性の変化、又はＡＰＲＧの生物学的、機能的、免疫学的特性の他の変化であり得る。本明細書において、用語「擬似物」は、ＡＰＲＧまたはその一部分の構造の知識からその構造を知ることができ、そのようなものとして、アポトーシス調節タンパク質様分子の作用の一部または全てに影響を与え得る分子である。本明細書において、用語「誘導体」は、ＡＰＲＧをコードする核酸又はコードされたＡＰＲＧを化学的に修飾したものを意味する。このような修飾の例には、水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換がある。核酸誘導体は、未修飾ＡＰＲＧの必須の生物学的特性を保持しているポリペプチドをコードする。本明細書において、用語「実質的に精製」は、天然の環境から取り除かれ、天然にはそれが結合して存在する他の構成要素から単離又は分離されて、その構成要素が６０％以上、好ましくは７５％以上、最も好ましくは９０％以上除去された核酸配列又はアミノ酸配列である。本明細書において「増幅」は、核酸配列の更なる複製物を生成することであり、通常は当業者に周知のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を用いて行われる（D ieffenbach,C.W.及びG.S.Dveksler(1995)PCR Primer.a Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press,Plainview,NY）。本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）」は、核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する過程である。本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション複合体」は、相補的なＧ塩基とＣ塩基の間及び相補的なＡ塩基とＴ塩基の間での水素結合の形成によって、２つの核酸配列で形成された複合体である。これらの水素結合は、塩基スタッキング相互作用（base stacking interaction）により更に安定化され得る。この２つの相補的核酸配列は水素結合して、逆平行構造をなす。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中で形成されるか（例えばＣ₀ｔ又はＲ₀ｔ解析）、或いは核酸は溶液中に存在する一方の核酸と、固定支持体（例えばin situハイブリダイゼーションのために細胞が固定されるメンブラン、フィルタ、ピン、またはスライドガラス）に固定化された他方の核酸との間で形成され得る。本明細書において、用語「相補的」または「相補性」は、許容的な塩及び温度の条件の下での塩基対によるポリヌクレオチド同士の自然の結合である。例えば、配列「Ａ−Ｇ−Ｔ」は相補的配列「Ｔ−Ｃ−Ａ」に結合する。２つの二本鎖分子間の相補性は、核酸の幾つかのみが結合している「部分的」なものであるか、若しくは一本鎖分子間に完全な相補性が存在する場合は完全に相補的であり得る。核酸鎖同士の相補性の程度は、核酸鎖同士のハイブリダイゼーションの効率及び強度に有意な影響を与える。このことは、核酸鎖同士の結合によって左右される増幅反応において特に重要である。本明細書において、用語「相同性」は、相補性の程度である。部分的な相同性と、完全な相同性（即ち同一性）の場合があり得る。部分的に相補的な配列は、同一の配列が標的の核酸とハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害するものであり、これを機能的な用語「実質的に相同な」を用いて表す。完全に相補的な配列と標的配列とのハイブリダイゼーションの阻害は、低い厳密性の条件の下で、ハイブリダイゼーションアッセイ（サザンブロット法またはノーザンブロット法、溶液ハイブリダイゼーション等）を用いて検定することができる。実質的に相同な配列またはプローブは、低い厳密性の条件の下で標的の配列と、完全に相同な配列またはプローブとの結合（即ちハイブリッド形成）について競合し、それを阻害する。これは、低い厳密性の条件が、非特異的な結合を許容するようなものであると言っているのではない。低い厳密性の条件では、２つの配列の相互の結合が特異的（即ち選択的）相互作用であることが必要である。非特異的結合が存在しないことは、部分的な程度の相補性（即ち約３０％未満の同一性）を有していない第２の標的配列を用いることにより試験できる。非特異的結合が存在しない場合、プローブは第２の非相補的標的配列とハイブリダイズしない。周知のように、多数の等価な条件を用いて、低い厳密性条件か高い厳密性条件の何れかを含むようにすることができる。例えば配列の長さ及び性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基構成）、標的の性質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、塩基構成、溶液中に存在するか或いは固定化されているか等）、及び塩や他の成分の濃度（例えばホルムアミド、デキストラン硫酸、及び／またはポリエチレングリコールの有無）のような要素を考慮してハイブリダイゼーション溶液を変え、上に列挙した条件とは異なるが等価である低い厳密性または高い厳密性の何れかの条件を作り出すことができる。本明細書において、用語「厳密な条件」は、約（Ｔｍ−５）℃（プローブの融解温度（Ｔｍ）より５℃下）からＴｍの約２０〜２５℃下まで範囲で生ずる「厳密性」である。当業者には理解されるように、ハイブリダイゼーションの厳密性は、同一のポリヌクレオチド配列の同定や検出のためであるか、或いは近縁なポリヌクレオチド配列の同定や検出のためであるかによって変えることができる。本明細書において用語「アンチセンス」は、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列に対して相補的なヌクレオチド配列である。「アンチセンス鎖」は、「センス」鎖に対して相補的な核酸鎖の意味で用いられる。アンチセンス分子は、相補的鎖の合成が可能なウイルスプロモータに、目的の遺伝子を逆方向に結合することによる合成を含む任意の方法で作り出すことができる。この転写された鎖は、一度細胞内に導入されると、細胞によって作られた天然の配列と結合して二重鎖を形成する。次にこれらの二重鎖は更なる転写や翻訳を阻害する。このようにして、変異体の表現型を作り出すことができる。「ネガティブ」なる表現はアンチセンス鎖の意味で時折用いられ、「ポジティブ」はセンス鎖の意味で用いられることがある。本明細書において、（「所与のタンパク質の一部分」と用いられるような）タンパク質に関連する用語「一部分」は、そのタンパク質の断片である。この断片のサイズは４つのアミノ酸残基から、（全アミノ酸配列−１）個のアミノ酸の範囲に亘る。従って、「配列番号：１のアミノ酸配列の少なくとも一部分を含む」タンパク質は、完全長ヒトＡＰＲＧとその断片を含む。本明細書の定義では、「形質転換」は、外来ＤＮＡが入り込みレシピエント細胞を変化させるプロセスを意味する。このプロセスは、よく知られた種々の方法を用いた天然または人工の条件の下で生じ得る。形質転換は、外来核酸配列を原核細胞または真核細胞の宿主細胞に導入するための任意の既知の方法に基づいている。この方法は形質転換される宿主細胞によって選択され、以下のものに限定されないが、ウイルス感染、電気穿孔法、リポフェクション、及び微粒子銃を用いる方法が含まれ得る。このように「形質転換された」細胞は、その中で挿入されたＤＮＡが自律的に複製するプラスミドとして、或いは宿主の染色体の一部として複製が可能な安定的に形質転換された細胞を含む。またこのような細胞は、限られた時間だけ導入されたＤＮＡの一過性の発現をする細胞も含む。本明細書において、用語「抗原決定基」は、特定の抗体と接触する分子の一部分（即ちエピトープ）である。タンパク質またはタンパク質の断片を用いてホストの動物を免疫すると、このタンパク質の種々の領域が、該タンパク質上の所定の領域または三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘発し得る。これらの領域または構造を抗原決定基と称する。抗原決定基は、抗体への結合について、そのままの抗原（即ち免疫応答を引き出すために用いられる免疫原）と競合し得る。本明細書において、用語「特異的結合」または「特異的に結合する」は、抗体及びタンパク質またはペプチドの相互作用が、タンパク質上の特定の構造（即ち抗原決定基またはエピトープ）の存在に左右されることを意味している。つまり、この抗体はタンパク質全体ではなく、特定のタンパク質構造を認識して結合する。例えば、抗体がエピトープ「Ａ」に対して特異的である場合、標識した「Ａ」及びその抗体を含む反応において、エピトープＡ（つまり結合していない、無標識のＡ）を含むタンパク質が存在すると、抗体に結合した標識Ａの量が低下する。本明細書において、用語「サンプル」は、その最も広い意味で用いられる。ＡＰＲＧをコードする核酸またはその断片を含む疑いのある生物学的サンプルは、細胞、細胞から単離された染色体（例えば中期染色体の展開物）、（溶液中の、または例えばサザンブロット解析用に固体支持体に結合した）ゲノムのＤＮＡ、（溶液中の、または例えばノーザンブロット解析用に固体支持体に結合した）ＲＮＡ、（溶液中の、または固体支持体に結合した）ｃＤＮＡ、細胞や組織からの抽出物、その他を含み得る。本明細書において、「ポリヌクレオチドの発現と相関性を有する」なる表現は、ノーザン解析ハイブリダイゼーションアッセイにより、配列番号：２に類似なリボ核酸の存在が検出されることが、サンプル内のＡＰＲＧをコードするｍＲＮＡの存在を表しており、従って該タンパク質をコードする遺伝子からの転写物の発現と相関性を有しているということを表している。本明細書において、配列番号：２のポリヌクレオチドにおける「変異」は、ハイブリダイゼーションアッセイを用いて検出され得る欠失、挿入、及び点変異を含む、ＡＰＲＧをコードするポリヌクレオチドの配列における変化を含む。この定義に含まれる変異は、（例えば、配列番号：２とハイブリダイズし得る制限断片長の多形性のパターンの変化による）ＡＰＲＧをコードするゲノムのＤＮＡ配列に対する変異の検出、（例えばアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブを用いる）ゲノムＤＮＡのサンプルと配列番号：２の選択された断片とがハイブリダイズ不可能であること、及び（例えば中期染色体展開物との蛍光in situハイブリダイゼーション（FISH）を用いた）ＡＰＲＧをコードするポリヌクレオチド配列に対する正常な遺伝子座以外の遺伝子座とのハイブリッド形成のような、不適当な或いは予期していないハイブリダイゼーションによって検出される。本明細書において、用語「抗体」は、そのままの抗体分子及び、例えば抗原決定基と結合し得るFa、F(ab')₂、及びFvのようなその断片である。ＡＰＲＧポリペプチドに結合する抗体は、そのままのポリペプチド、或いは免疫化する抗原としての目的の小型のペプチドを含む断片を用いて調製することができる。動物を免疫するのに用いられるポリペプチドまたはペプチドは、翻訳されたｃＤＮＡまたは化学的合成物を起源とするものであり得、必要ならば担体タンパク質と結合することができる。ペプチドに化学的に結合する通常用いられる担体には、ウシ血清アルブミン及びサイログロブリンが含まれる。次にこの結合したペプチドを用いて動物（例えばマウス、ラット、またはウサギ）を免疫する。本明細書において、用語「ヒト化抗体」は、元の結合能力をそのまま保持しつつ、ヒトの抗体により近づけるために非抗体結合領域においてアミノ酸を置換した抗体分子である。発明本発明は、新規なヒトアポトーシス調節タンパク質（ＡＰＲＧ）の発見、ＡＰＲＧをコードするポリヌクレオチド、及び癌、自己免疫疾患、リンパ球増殖性疾患、アテローム性動脈硬化症、ＡＩＤＳ、免疫不全疾患、虚血性障害、神経変性疾患、骨粗鬆症、脊髄形成異常症候群、毒素性疾患、及びウイルス感染症の診断、予防、又は治療のためのこれらの物質の使用に基づくものである。本発明のヒトＡＰＲＧをコードする核酸は、プールされた臍帯単核細胞ｃＤＮＡライブラリーUCMCNOT02を起源とするインサイト社クローンＮｏ．1715374において、アミノ酸配列アライメントのコンピュータ検索によって初めに同定された。コンセンサス配列の配列番号：２は、以下の重複及び／又は延長された核酸配列、インサイト社クローンＮｏ．1715374（UCMCNOT02を起源）、1398550（BRAIT UT08を起源）、1858605（PROSNOT18を起源）、2071785（ISOLNOT01を起源）、及び440262（THYRNOT01を起源）から作られた。或る実施例では、本発明は、第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図に示すような、配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドを包含する。ＡＰＲＧは２３２個のアミノ酸からなる長さを有し、独特な５’アミノ酸配列（Ｓ（３番）〜Ｇ（３１番））を有する。ＡＰＲＧは、Nip3タンパク質（GI 558845；配列番号：３）と化学的及び構造的相同性を有する。詳述すると、ＡＰＲＧとNip3は５９％の同一性を共有し、ＡＰＲＧにおいては残基Ｖ（１８８番）〜Ｇ（２０８番）、及びNip3においては残基Ｖ（１６４番）〜Ｇ（１８４番）にてＣ末端膜貫通ドメインを共有している。第３Ａ図及び第３Ｂ図に示すように、ＡＰＲＧとNip3はかなり類似した疎水性プロットを示す。また本発明はＡＰＲＧ変異体を包含する。好適なＡＰＲＧ変異体は、ＡＰＲＧアミノ酸配列（配列番号：１）と８０％以上、より好ましくは９０％以上のアミノ酸配列類似性を有するものである。最も好適なＡＰＲＧ変異体は、配列番号：１の配列と９５％以上のアミノ酸配列類似性を有するものである。また本発明は、ＡＰＲＧをコードするポリヌクレオチドを包含する。従って、ＡＰＲＧのアミノ酸配列をコードする核酸配列を用いて、ＡＰＲＧを発現する組換え分子を作りだすことができる。特定の実施例では、本発明は、第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図に示すような配列番号：２の核酸配列を含むポリヌクレオチドを包含する。当業者には理解されるように、遺伝暗号の縮重の結果、任意の既知の自然発生遺伝子のヌクレオチド配列と最小限の相同性しか有していないものも含めて、多種のＡＰＲＧコーディングヌクレオチド配列が作り出され得る。本発明は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することにより作り出され得る、全ての可能な核酸配列の変異をその範囲に含んでいる。それらの組み合わせは、自然発生のＡＰＲＧのヌクレオチド配列に適用されるような標準的なトリプレット遺伝暗号に基づいて作り出されるものであり、このような全ての変異は、ここに具体的に示されたものと考えられたい。ＡＰＲＧ及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は、適切に選択された厳密性の条件の下で自然発生配列のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能なものであるのが好ましいが、実質的に異なるコドンの使用頻度を有するＡＰＲＧ又はその変異体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。コドン選択は、特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従って、特定の原核細胞又は真核細胞の発現宿主におけるペプチド発現の発生率を高めるように選択することができる。ＡＰＲＧ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を、コードされるアミノ酸配列を変えないように実質的に変更する理由は、例えば自然発生配列から作り出される転写物より長い半減期のような、より望ましい特性を有するＲＮＡ転写物を作り出すためである。本発明の範囲には、ＡＰＲＧ又はその誘導体をコードするＤＮＡ配列又はその一部の、完全な合成ケミストリによる作製も含まれる。作製したこの合成遺伝子を、この出願時点において周知の試薬を用いて任意の入手可能なＤＮＡベクター及び細胞系に挿入することができる。更に、合成ケミストリを用いてＡＰＲＧをコードする配列又はその任意の一部分に突然変異を誘発させることができる。また本発明の範囲に含まれるものとして、種々の厳密性の条件の下で請求項に記載のヌクレオチド配列、特に配列番号：２のヌクレオチド配列とハイブリダイズし得るポリヌクレオチド配列がある。ハイブリダイゼーション条件は、Wahl,G .M．及びS.L.Berger(1987;Methods Enzymol.152:399-407)及びKimmel,A.R.(1987 ;Methods in Enzymol.152:507-511)に記載されているように、核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づいており、規定の厳密性において用いられ得る。本発明の範囲に含まれるＡＰＲＧをコードする変異核酸配列は、異なるヌクレオチド残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に同一の、または機能的に等価のＡＰＲＧポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとなるものである。コードされたタンパク質も、サイレント変化を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に機能的に等価なＡＰＲＧとなる。意図的な（delibera te）アミノ酸置換は、ＡＰＲＧの生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性並びにまた両親媒性についての類似性に基づいてなされ得る。例えば負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、近い親水性値を持つ荷電していない極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、フェニルアラニン並びにチロシンが含まれる。更に本発明の範囲に含まれるものとして、ＡＰＲＧのアレルがある。ここで用いる「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＡＰＲＧの対立形である。アレルは変異、すなわち核酸配列の変化によって生じ、一般に変異したｍＲＮＡ或いはポリペプチドを生成するが、そのｍＲＮＡ或いはポリペプチドの構造或いは機能は、変わる場合もあれば変わらない場合もある。遺伝子によっては、アレル形が存在しないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するものがある。一般にアレルを生じる変異はアミノ酸の自然な欠失、付加並びに置換に起因する。このタイプの変化はそれぞれ単独で、或いは他の変化と同時に、与えられた配列内で１又は２回以上生じ得る。当業者が一般に利用可能な周知のＤＮＡ配列決定のための方法が、本発明の実施において用いられ得る。この方法では酵素、例えばＤＮＡポ Cleveland OH）、Taqポリメラーゼ（Perkin Elmer）、熱安定性T7ポリメラーゼ（Amersham,Chicago IL）、或いはGibco BRL(Gaithersburg MD)Methods社から市販されているELONGASE増幅システムのような校正エキソヌクレアーゼと組換え体ポリメラーゼとの組み合わせのような酵素を使用する。この処理は、Hamilton M icro Lab2200（Hamilton,Reno,NV）、Peltier Thermal Cycler(PTC200;MJ Reser ch,Watertown MA)並びにABI377 DNAシーケンサ(Perkin Elmer)のような装置を用いて自動化するのが好ましい。ＡＰＲＧをコードする核酸配列は、部分的なヌクレオチド配列と、プロモーター及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当業者には周知の様々な方法とを用いて伸長させることができる。例えば、用いることができる或る方法、即ち「制限部位」ＰＣＲ法では、汎用プライマーを用いて既知の座位に隣接する未知の配列を得る（Sarkar,G.(1993)PCR Methods Applic 2:318-322）。詳述すると、まずゲノムＤＮＡを、既知の領域に対して特異的なプライマー及びリンカー配列に対するプライマーの存在下で増幅する。増幅された配列を、その同じリンカープライマー及び最初のプライマーの内部に含まれる別の特異的プライマーを用いてＰＣＲの２巡目にかける。ＰＣＲの各回の生成物を、適切なＲＮＡポリメラーゼを用いて転写させ、逆転写酵素を用いて配列決定する。逆ＰＣＲ法を用いて、既知領域に基づく多様なプライマーを利用した配列の増幅、または伸長を行うことができる（Triglia,T.等(1988)Nucleic Acids Res 16 :8186）。プライマーは、OLIGO 4.06（National Biosciences社,Plymouth MN）や別の適切なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチドで、５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計される。この方法ではいくつかの制限酵素を用いて遺伝子の既知領域の適当な断片を作り出す。次にこの断片を分子内ライゲーションにより環状にし、ＰＣＲ用の鋳型として使用する。使用できる別の方法はキャプチャＰＣＲ法であり、この方法ではヒト及び酵母菌人工染色体ＤＮＡ内の既知の配列に隣接するＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅する（La gerstrom,M.等（1991）PCR Methods Applic 1:111-119）。この方法では、ＰＣＲ処理の前に、ＤＮＡ分子の未知の部分に、複数の制限酵素による消化及びライゲーションによって組換え二本鎖配列を配置しておいてもよい。未知の配列を得るために用いることができる別の方法は、Parker,J.D. 等の方法（1991;Nucleic Acids Res 19:3055-3060）である。更に、ＰＣＲ、ネスト化プライマー、Promoter Finder^TMライブラリーを用いて、ゲノムＤＮＡ内歩行を行うことができる（Clontech,Palo Alto CA）。このプロセスは、ライブラリーをスクリーニングする必要がなく、イントロン／エクソン接合部を探し出すのに有用である。完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするときに好適なライブラリーは、サイズ選択された、より大きなｃＤＮＡを含むライブラリーである。またランダムプライミングした（rondom primed）ライブラリーは、遺伝子の５′ 及び上流領域を含む配列をより多く含むという点で好適である。ランダムプライミングしたライブラリーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーで完全長ｃＤＮＡが得られない場合に特に有用である。またゲノムライブラリーは、５′及び３′非翻訳領域への配列の伸長のために役立ち得る。配列決定やＰＣＲの産物のヌクレオチド配列をサイズ分析したり確認するためには、市販のキャピラリー電気泳動システムを用いることができる。詳述すると、キャピラリーシークエンシングでは、電気泳動による分離のための流動性ポリマー、レーザーで活性化される４つの異なる蛍光色素（各ヌクレオチドに対して１つ）を使用し、ＣＣＤカメラにより放射線の波長の検出を行う。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えばPerkin elmer製のGenotyper^TM及びSequence Navi gator^TM）を用いて電気信号に変換され、サンプルの負荷からコンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコンピュータ制御される。キャピラリー電気泳動法は、特定のサンプル内に限られた量だけ存在するＤＮＡ小片の配列決定に特に適している。本発明の別の実施例では、ＡＰＲＧ、融合タンパク質或いはその機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列を、適切な宿主細胞内でのＡＰＲＧの発現を誘導する組換えＤＮＡ分子において用いることができる。遺伝暗号固有の縮重のために、同一か機能的に等価なアミノ酸配列を実質的にコードする他のＤＮＡ配列も、ＡＰＲＧのクローニングや発現のために用いることができる。当業者には理解できるように、非自然発生コドンを有するＡＰＲＧコードディングヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。特定の原核細胞或いは真核細胞の宿主において選好されるコドンを選択して、例えば、ＡＰＲＧ発現率を増大させたり、或いは自然発生配列から生成された転写物より長い半減期のような望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写物を生成することができる。本発明のヌクレオチド配列は、様々な目的、例えば、以下のものに限定はしないが遺伝子産物のクローニング、プロセシング及び／又は発現を変えるようにＡＰＲＧをコードする配列を改変するために既知の方法を用いて組換えることができる。無作為断片によるＤＮＡ再編成や遺伝子断片のＰＣＲ再会合及び合成オリゴヌクレオチドを用いて、ヌクレオチド配列を組換えることができる。例えば、特定部位突然変異誘発のような当業者には周知の技術を用いて突然変異を誘発させることによって、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変更、コドン選好の変化、スプライスバリアントの生成等をもたらすことができる。本発明の別の実施例では、そのままのＡＰＲＧコーディング配列、変異ＡＰＲＧコーディング配列、又は組換えＡＰＲＧコーディング配列を異種の配列に結合して、融合タンパク質をコードする配列にする。例えば、ＡＰＲＧ活性のインヒビターをペプチドライブラリーからスクリーニングする場合、市販の抗体により認識される異なるペプチドを発現するキメラＡＰＲＧタンパク質をコードすることが役立つ。融合タンパク質はＡＰＲＧ配列と異種のタンパク質配列との間の位置に切断部位を有するように設計することもでき、これによってＡＰＲＧを切断して、ヘテロの部分から分けて精製することが可能となる。本発明の別の実施例では、当業者によく知られた化学的方法（Caruthers.M.H. 等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223;Horn,T.等（1980）Nucl.Acids Res Symp.Ser.225-232参照）を用いて、ＡＰＲＧコーディング配列の全体、或いはその一部を合成することができる。別法では、化学的方法を用いてタンパク質自体を作り出して、ＡＰＲＧアミノ酸配列の全体或いはその一部を合成することができる。例えば、種々の固相技術（Roberge,J.Y.等(1995)Science 269:202-204 ）でペプチド合成を行うことができ、合成の自動化は、例えばABI 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いることにより達成することができる。この新たに合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィにより実質的に精製することができる（例えばCreighton T.(1983)Proteins Structure A nd Molecular Principles ，WH Freeman and Co.,NY参照）。合成されたペプチドの構成は、アミノ酸解析或いはシークエンシングにより確認することができる（例えばエドマン分解法；Creighton，上述）。さらにＡＰＲＧのアミノ酸配列或いはその任意の部分を、その直接の合成の際の改変することにより、及び／又は化学的方法を用いた他のタンパク質或いはその任意の部分に由来する配列との結合することによって変異体ポリペプチドを作ることができる。生物学的に活性なＡＰＲＧを発現させるために、ＡＰＲＧコーディングヌクレオチド配列或いはその機能的等価物を、適切な発現ベクター、すなわち挿入されたコーディング配列の転写及び翻訳に必要な要素を含むベクターに挿入する。ＡＰＲＧコーディング配列及び適切な転写や翻訳の調節領域を含む発現ベクターを作製するために当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法には、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo組換え技術、又は遺伝子組換え技術が含まれる。このような技術は、Sambrook,J.等(1989)M olecular Cloning,A Laboratory Manual ,Cold Spring Harbor Press,Planview N Y及びAusubel,F.M.等Current Protocol in Molecular Biology,John Wiley &Son s,New York NYに記載されている。種々の発現ベクター／宿主系を、ＡＰＲＧコーディング配列を保持し、かつ発現するために利用することができる。このようなものには、以下のものに限定はされないが、組換えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌のような微生物や、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌や、ウイルス発現ベクター(例えばバキュロウイルス)を感染させた昆虫細胞系や、ウイルス発現ベクター（例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMV 、タバコモザイクウイルスTMV）をトランスフェクトした、或いは細菌の発現ベクター（例えばTi、或いはpBR322プラスミド）で形質転換した植物細胞系や、或いは動物細胞系が含まれる。これらの系の「調節領域」或いは「制御配列」は、転写及び翻訳を実行するために宿主細胞のタンパク質と相互作用するベクターの非翻訳領域、即ちエンハンサー、プロモーター及び３′非翻訳領域である。このようなエレメントの、強さ及び特異性は様々であり得る。利用されるベクター及び宿主に応じて、構成的及び誘導的プロモーターを含む任意の数の適切な転写及び翻訳エレメントを用いることができる。例えば、細（Stratagene,LaJolla CA）のハイブリッドlacZプロモーター及びptrp-lacハイブリッド等のような誘導的プロモーターを用いることができる。バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターは昆虫細胞において用いることができる。植物細胞のゲノムに由来するプロモーター或いはエンハンサ（例えば熱ショック遺伝子,RUBISCO及び貯蔵タンパク質遺伝子）、若しくは植物ウイルスに由来するプロモーター或いはエンハンサ（例えばウイルス性プロモータ或いはリーダー配列）を、ベクターにクローン化してもよい。哺乳動物細胞では、哺乳類遺伝子或いは哺乳類ウイルス由来のプロモーターが最適である。ＡＰＲＧをコードする配列の多数の複製を含む株細胞を作る必要がある場合には、 SV40或いはEBVに基づくベクターを適切な選択マーカーと共に用いる。細菌系では、ＡＰＲＧの用途に応じて多数の発現ベクターを選択することができる。例えば抗体誘発のために大量のＡＰＲＧが必要とされる場合は、容易に精製される融合タンパク質を高レベルで発現できるベクターが望ましい。そのようなベクターには、以下のものに限定はしない（Stratagene）（このベクターでは、ＡＰＲＧをコードする配列を、アミノ末端メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列を備えたフレーム内においてベクターに結合してハイブリッドタンパク質を生成できる）や、pINベクター（Van Heeke,G.及びS.M.Schuster（1989）J.Biol.Chem.264:5503-5509）等が含まれる。またpGEXベクター（Promage、Madison WI）も、グルタチオンＳ −トランスファーゼ（GST）を有する融合タンパク質として異種ポリペプチドを発現するため用いることができる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへ吸着させた後、遊離グルタチオンの存在下で溶出させることにより溶解した細胞から容易に精製できる。その系において生成されたタンパク質は、ヘパリン、トロンビン或いはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含めて、目的のクローン化ポリペプチドをGST部分から随意に放出させることができるように設計される。酵母菌、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因子、アルコールオキシダーゼ及びPGHのような構成的或いは誘導的プロモーターを含む多数のベクターを用いることができる。その概要を知るには、Ausubel等（前出）及びGrant等（1987）Methods Enzymol 153:516-544を参照されたい。植物発現ベクターを用いる場合には、ＡＰＲＧをコードする配列の発現は、多数のプロモーターの何れかで促進される。例えばCaMVの35S及び19Sプロモーターのようなウイルスのプロモーターを、単独で、或いはTMV（Takamatsu,N.等（198 7）EMBO J 6:307-311）由来のオメガリーダー配列と共に用いることができる。別法として、RUBISCOの小サブユニット、或いは熱ショックプロモーターのような植物プロモーターが用いてもよい（Coruzzi,G.等（1984）EMBO J 3:1671-1680 ）；Broglie,R.等（1984）Science 224:838-843; 及びWinter,J.等（1991）Resu lts Probl.Cell Differ.17:85-105）。これらの構成は、直接のＤＮＡ形質転換或いは病原体によるトランスフェクションにより植物細胞内に導入できる。このような技術の種々の一般に入手可能な文献に記載されている(Hobbs,S.又はMurry ,L.E.McGraw Hill Yearbook of Science and Technology(1992)McGraw Hill NY, pp191-196を参照されたい）。ＡＰＲＧの発現のために用いることができる別の発現系は昆虫系である。そのような系の一つでは、Spodoptera frugiperda細胞或いはTrichoplusiaの幼虫において外来遺伝子を発現するためのベクターとして、Autographa californica核多角体病ウイルス（AcNPV）が用いられる。ＡＰＲＧをコードする配列は、ポリヘドリン遺伝子のようなウイルスの非必須領域にクローニングされ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置かれ得る。ＡＰＲＧコーディング配列の挿入が成功すると、ポリヘドリン遺伝子が不活性になり、コートタンパク質膜が欠如した変異体ウイルスが生成される。次に、この変異体ウイルスを用いて、S.frugiperda細胞或いはTr ichoplusia の幼虫へ感染させ、その中でＡＰＲＧが発現される（Engelhard,E.K. 等（1994）Proc.Natl.Acad.Sci.91:3224-3227）。哺乳類宿主細胞では、多数のウイルス性発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、ＡＰＲＧをコードする配列は、後期プロモータ及び三連リーダー配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳物複合体内に結合され得る。ウイルスのゲノムの非必須E1又はE3領域へ挿入することにより、感染した宿主細胞でＡＰＲＧを発現できる生ウイルスになる（Lo gan,J.及びShenk,T.（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.81:3655-3659）。さらに、哺乳類宿主細胞内の発現を増加させるためにラウス肉腫ウイルス（RSV）エンハンサのような転写エンハンサを用いることができる。また、ＡＰＲＧ配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要である。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接する配列が含まれる。ＡＰＲＧ及びその開始コドン及び上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される場合には、翻訳制御シグナルを加える必要はない。しかしながらコーディング配列又はその一部のみが挿入される場合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制御シグナルを与えなければならない。さらに、全インサートの転写が確実に行われるようにするために、開始コドンは正しい読み枠に存在しなければならない。外来転写エレメント及び開始コドンは、自然及び合成両方の様々な起源に由来するものであり得る。発現の効率は、その細胞系に適切なエンハンサーを含めることにより高めることができる(Scharf,D.等(1994)Results Probl.Cell Differ.20:1 25-162)。さらに宿主細胞株は、挿入された配列の発現を調節したり、発現したタンパク質を望ましい形にプロセシングする能力で選択される。このようなポリペプチドの修飾には、以下のものに限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化（lipidation）並びにアシル化が含まれる。またタンパク質の「プレプロ」部分を切り離す翻訳後プロセシングも、正しい挿入、折り畳み、及び／又は機能の発揮のために重要である。CHO、HeLa、MDCK、293、WI 38等のような異なる宿主細胞は、そのような翻訳後の活動のための特定の細胞装置及び特徴的な機構を有しており、導入される異種タンパク質の修飾やプロセシングが確実に行われるように選択され得る。長期間にわたって変異体タンパク質の高収率の産生を確保するためには安定した発現が望ましい。例えば、ウイルスの複製起源や内在性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を含む発現ベクターを用いて、ＡＰＲＧを安定的に発現する株細胞を形質転換し得る。ベクターの導入の後、細胞を、選択培地に切り替える前に濃縮培地内で１〜２日間増殖させる。選択マーカーの目的は、選択のための耐性を与え、その存在によって導入された配列をうまく発現する細胞を増殖、回収できるようにすることである。安定的に形質転換された細胞の耐性凝集塊は、その細胞型に適した組織培養技術を用いて増殖することができる。形質転換された株細胞を回収するために任意の数の選択系を用いることができる。選択系には、以下のものに限定はしないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（tk）（Wigler,M.等（1977）Cell 11:223-32）及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(aprt)（Lowy,I.等（1980）Cell 22:817-23）遺伝子が含まれ、それぞれtk及びaprt細胞において用いられる。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤への耐性を選択の基礎として用いることができる。例えばdh frはメトトレキセートに対する耐性を与え(Wigler,M.等(1980)Natl Acad Sci 77:3567)、nptはアミノ配糖体のネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え（Colberre-Garapin, F.等（1981）J Mol Biol 150:1）、als或いはpatはクロルスルフロン（chlorsul furon）、ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinotricin a cetyltransferase）に対する耐性を与える（Murry，前出）。さらに選択に利用できる遺伝子として、例えば細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるようにするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用できるようにするhisDが文献に記載されている（Hartman,S.C.及びR.C.Mu lligan（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.85:8047-51）。最近になって、形質転換体を特定するためばかりではなく、特定ベクター系による一過性の或いは安定的なタンパク質発現の量を定量するために広く用いられる、例えばアントシアニン、 β−グルクロニダーゼ及びその基質、GUS、及びルシフェラーゼ及びその基質、ルシフェリンのような可視マーカーがよく利用されるようになった(Rhodes,C.A. 等(1995)Methods Mol.Biol.55:121-131)。マーカー遺伝子発現の存在／不存在によって目的の遺伝子の存在も示されるが、その存在及び発現は確認すべきである。例えばＡＰＲＧをコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入された場合は、ＡＰＲＧをコードする配列を含む組換え体細胞をマーカー遺伝子の機能の存在により確認できる。別法では、マーカー遺伝子をＡＰＲＧをコードする配列と直列に配置して、両者が単一プロモータの制御下となるようにすることができる。誘導に応じてのマーカー遺伝子の発現、つまり選択は、通常直列に配置された配列の発現をも同時に示すことになる。この他当業者には周知の様々な方法により、ＡＰＲＧのコーディング配列を含みＡＰＲＧを発現する宿主細胞を識別できる。このような方法には、以下のものに限定はしないが、DNA-DNA或いはDNA-RNAハイブリダイゼーション及び、核酸及びタンパク質を検出及び／又は定量するための膜ベース、溶液ベース或いはチップベースの技術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイが含まれる。ＡＰＲＧをコードする配列のプローブ、一部、或いは断片を用いるDNA-DNA又はDNA-RNAハイブリダイゼーション若しくは増幅により、ＡＰＲＧポリヌクレオチド配列の存在を検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイでは、ＡＰＲＧをコードするDNA或いはRNAを含む形質転換体を検出するために、核酸配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーを用いる。本明細書において「オリゴヌクレオチド」或いは「オリゴマー」とは、プローブ或いは、ＰＣＲで増幅されるセグメントであるアンプリマーとして用いることができる核酸配列であって、長さが約１０ヌクレオチド以上、最大６０ヌクレオチド程度、好適には１５〜３０ヌクレオチド、より好適には２０〜２５ヌクレオチドであるものを指す。このタンパク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいずれかを用いてＡＰＲＧポリペプチドの発現を検出し、測定するための種々のプロトコルが当業者には周知である。このようなプロトコルの例には、酵素結合免疫検定法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ(RIA)及び蛍光表示式細胞分取器法（FACS ）を含まれる。ＡＰＲＧポリペプチド上で２つの非干渉なエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナルベースイムノアッセイ（two-site,monoclonal-based immunoassay）が好適であるが、競合的結合アッセイも用いられる。これらアッセイの並びに他のアッセイは、他の文献、Hamp ton,R.等（1990;Serological Methods,a Laboratory Manual,APS Press,St.Paul MN）及びMaddox,D.E.等（1983,J.Exp.Med. 158:1211-1216）に記載されている。さらに多くの標識及び結合技術が当業者には周知であり、種々の核酸及びアミノ酸のアッセイにおいて用いることができる。近縁な配列を検出するための、標識されたハイブリダイゼーションプローブやＰＣＲプローブを作成するための手段には、オリゴ標識、ニックトランスレーション法、末端標識、或いは標識ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅などが含まれる。別法としては、ＡＰＲＧコーディング配列、或いはその任意の部分を、ｍＲＮＡプローブの作成のためのベクターにクローン化する。そのようなベクターは当分野では周知で、市販されており、例えばT7、T3、或いはSP6のような適切なＲＮＡポリメラーゼ及び標識されたヌクレオチドを加えることにより、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用いることができる。これらの方法は、種々の市販のキット（Pharmacia Upjohn（ Kalamazoo,MI）；Promega（Madison WI）；及びU.S.Biochemical Corp.(Clevela nd OH)）を用いて実行することができる。適切なリポーター分子、すなわち標識には、放射性核種、酵素、フルオレセント（蛍光剤）、化学発光剤或いは色素剤や、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子等が含まれる。ＡＰＲＧをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、コードされたタンパク質を細胞培地で発現させ、そこから回収するのに適した条件下で培養することができる。組換え体細胞により生成されるタンパク質は、用いられる配列及び／またはベクターに応じて、細胞内に分泌、つまり細胞内に含まれるようにすることができる。当業者には理解されるように、ＡＰＲＧをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを、原核細胞か真核細胞の細胞膜を通してのＡＰＲＧ分泌を誘導するシグナル配列を含むように設計することができる。他の組換え体作製物では、ＡＰＲＧをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に結合することができる。そのような精製を容易にするドメインには、以下のものに限定はしないが、固定化金属上での精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド、固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、並びにFLAGS伸長／アフィニティ精製システムにおいて用いられるドメイン（Immunex Corp.,Seattle WA）が含まれる。精製ドメインとＡＰＲＧの間にＸＡ因子或いはエンテロキナーゼ（Invitrogen,San Diego CA）に対して特異的な配列のような切断可能なリンカー配列を含めるのは精製を促進するのに役立つ。ＡＰＲＧをコードする配列とともに、６個のヒスチジン残基、それに続くチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位をコードする核酸配列を含むこのような発現ベクターの１つは、融合タンパク質を発現する。ヒスチジン残基がIMIAC(Porath,J等(1992;Protein Exp.Purif.3:263-281)に記載のような固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー)精製を促進するとともに、エンテロキナーゼ切断部位が融合タンパク質からのＡＰＲＧの精製のための手段となる。融合タンパク質を含むベクターについての解説は、Kroll,D.J.等（1993 ;DNA Cell Biol.12:441-453）に記載されている。組換え体の産生に加えて、ＡＰＲＧの断片を、固層技術を用いた直接のペプチド合成で形成することもできる（Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85:2149-2 154参照）。in vitroタンパク質合成は手作業で行えるが、自動化することもできる。自動的な合成は、例えば、Applied Biosystem 431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を用いて行うことができる。ＡＰＲＧの種々の断片を個別に化学的に合成し、化学的方法を用いて結合して完全長分子を作り出してもよい。治療ＡＰＲＧ（配列番号：１）とNip3（配列番号：３）との間の化学的及び構造的相同性に基づき、ＡＰＲＧは、アポトーシスの調節不全が関係する疾病及び疾患において或る役割を果たしていると考えられる。このような疾病及び疾患には、癌、自己免疫疾患、リンパ球増殖性疾患、アテローム性動脈硬化症、ＡＩＤＳ、免疫不全疾患、虚血性障害、神経変性疾患、骨粗鬆症、脊髄形成異常症候群、毒素性疾患、及びウイルス感染症の発症が含まれる。従って或る実施例では、アポトーシスの増加が関係する疾患を治療するために、ＡＰＲＧ又はその断片若しくは誘導体を患者に投与し得る。このような状態及び疾病には、以下に限定されないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症を含む神経変性疾患；再生不良性貧血のような脊髄形成異常疾患、脳卒中、外傷、及び心発作、及びＡＩＤＳに起因する虚血性障害が含まれ得る。別の実施例では、上述のような疾病を治療するために、ＡＰＲＧ又はその断片若しくは誘導体を発現し得るベクターを患者に投与することもできる。別の実施例では、例えば癌、自己免疫疾患、及びウイルス感染症のようなアポトーシスの減少が関係する疾病の治療のために、ＡＰＲＧをコードする核酸配列のアンチセンスを発現するベクターを患者に投与することができる。このような疾患には、以下に限定されないが、脳及び腎臓の癌；乳房、前立腺、精巣、及び卵巣癌を含むホルモン依存性癌；リンパ腫、白血病；全身性エリテマトーデス、強皮症、及び関節炎を含む自己免疫疾患；及びヘルペス、ＨＩＶ、アデノウイルス、及びＨＴＬＶ−１関連悪性疾患のようなウイルス感染症が含まれ得る。或る実施例では、上述のような癌、自己免疫疾患及びウイルス感染症を治療又は予防するためにＡＰＲＧのアンタゴニスト又はインヒビターを患者に投与することができる。或る態様では、ＡＰＲＧに特異的な抗体をアンタゴニストとして直接的に用いるか、或いはＡＰＲＧを発現する細胞又は組織に薬物を送達するためのターゲティング又はデリバリー機構として間接的に用いることができる。他の実施例では、上述のような治療用のタンパク質、アンタゴニスト、抗体、アゴニスト、アンチセンス配列又はベクターのいずれかを、他の適切な薬物と組み合わせて投与することができる。当業者であれば、併用療法において使用するための適切な薬剤を、従来の薬学の原理に基づいて選択することができよう。治療薬を組み合わせることにより、上述の種々の疾患の治療又は予防についての相乗作用を与え得る。この方法を用いることにより、より低い投与量の各薬剤で同じ治療効果を達成することができ、これにより副作用を低下させることができる。ＡＰＲＧのアンタゴニスト又はインヒビターは、周知の方法を用いて製造することができる。詳述すると、精製されたＡＰＲＧを用いて、抗体を製造したり、薬物のライブラリーからＡＰＲＧに特異的に結合するものを選別することができる。抗体は当分野において周知の方法を用いて生成することができる。このような抗体には、以下のものに限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、Fabフラグメント、及びFab発現ライブラリーにより生成されたフラグメントが含まれる。中和抗体（即ち二量体形成を阻害する抗体）は治療的使用には特に好適である。抗体を産生するため、ＡＰＲＧ或いは免疫学的特性を保持するその任意の一部、断片或いはオリゴペプチドを注射することによって、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む種々の宿主を免疫することができる。宿主の種に応じて、種々のアジュバントを免疫学的反応を増強するために用いることができる。そのようなアジュバントには、以下のものに限定はしないが、フロイントのアジュバント、水酸化アルミニウムのような無機質ゲルアジュバント、リゾレシチンのような界面活性物質アジュバント、プルロニックポリオールアジュバント、ポリアニオンアジュバント、ペプチドアジュバント、油性乳剤アジュバント、キーホールリンペットヘモシニアンアジュバント並びにジニトロフェノールアジュバントが含まれる。ＢＣＧ（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウム−パルヴム（Corynebacterium parvum）は有用なヒトアジュバントである。好ましくは、ＡＰＲＧに対する特異的抗体を誘発するために用いられるペプチドは、５個以上のアミノ酸、より好ましくは１０個以上のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有し得る。また好ましくは、これらの配列は、自然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一であり、小形の自然発生の分子の全アミノ酸配列を含んでいてもよい。ＡＰＲＧアミノ酸の短いストレッチを、キーホールリンペットヘモシアニン及びキメラ分子に対して産生された抗体のような他のタンパク質の配列に融合してもよい。ＡＰＲＧのモノクローナル抗体は、培地内の連続株細胞によって抗体分子を産生する任意の技術を用いて調製できる。このような技術には、以下のものに限定はしないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、及びＥＢＶ −ハイブリドーマ技術（Kohler,G.等(1975)Nature 256:495-497；Kozbor,D.等(1 983)Immunol Methods 81:31-42；Cote,R.J.等(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.80:202 6-2030；Cole,S.P.等(1984)Mol.Cell Biol.62:109-120）が含まれる。さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための「キメラ抗体」の産生、即ちヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子の結合のために開発された技術が用いられる（Morrison,S.L.等(1984)Proc.Natl.Aca d.Sci.81:6851-6855；Neuberger,M.S.等（1984）Nature 312:604-608；Takeda,S .等（1985）Nature 314:452-454）。別法として、一本鎖抗体の生成のための周知技術を適用して、ＡＰＲＧ特異的一本鎖抗体を作り出すことができる。近縁な特異性を有するが、イディオタイプの構成が異なる抗体は、無作為の免疫グロブリン組み合わせライブラリーからの鎖再編成（chain shuffling）により生成することができる（Burton D.R.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.88:11120-3）。また抗体は、リンパ球集団でのin vivo産生を誘導することにより、或いは文献（Orlandi,R.等(1989),Proc.Natl.Acad.Sci.86:3833-3837；Winter,G.等1991, Nature 349:293-299）に開示されているような高度に特異的な結合試薬のパネルや組換え免疫グロブリンライブラリーをスクリーニングすることによっても生成することができる。ＡＰＲＧに対する特異結合部位を含む抗体フラグメントも生成することができる。このようなフラグメントには例えば、限定はしないが、抗体分子のペプシンによる消化で生成することができるF(ab′)₂フラグメントや、F(ab′)₂フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成することができるFabフラグメントが含まれる。別法として、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントを迅速かつ容易に同定できるように、Fab発現ライブラリーを作製してもよい（Huse,W.D.等（1989）Science 256:1275-1281）。所望の特異性を有する抗体を同定するための選別のために種々のイムノアッセイを用いることができる。確立された特異性を有するモノクローナル抗体或いはポリクローナル抗体のいずれかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射線測定法の種々のプロトコルが当分野ではよく知られている。このようなイムノアッセイでは、ＡＰＲＧとその特異的抗体との複合体の形成、並びに複合体形成の測定が行われる。特定のＡＰＲＧタンパク質上の２つの互いに非干渉なエピトープに対して反応するモノクローナル抗体を用いる二部位モノクローナルベースイムノアッセイが好適であるが、競合的結合アッセイも用いられる(Maddox，前出)。本発明の別の実施例では、ＡＰＲＧをコードするポリヌクレオチド、またはその任意の断片やアンチセンス配列を、治療目的で用いることができる。或る態様では、このタンパク質の合成を阻害することが望ましいような状況において、ＡＰＲＧをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンスを用いることができる。詳述すると、ＡＰＲＧをコードするポリヌクレオチドに対するアンチセンス配列で細胞を形質転換することができる。従って、アンチセンス配列を用いて、ＡＰＲＧ関連の組織損傷を予防したり、遺伝子機能の調節を達成することができる。このような技術は現在周知となっており、センス又はアンチセンスオリゴマー、若しくはより大きな断片を、ＡＰＲＧコーディング配列のコード領域や調節領域の種々の位置から設計することができる。レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルスに由来する発現ベクター、或いは種々の細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられる。当業者によく知られた方法を用いて、ＡＰＲＧをコードする配列のアンチセンスを発現する組換えベクターを作り出すことができる。これらの技術はSambro ok等(上記)及びAusubel等（上記）に記載されている。所望のＡＰＲＧ断片を高レベルで発現する発現ベクターを細胞または組織にトランスフェクトすることにより、ＡＰＲＧをコードする遺伝子の機能を停止させることができる。このような作製物は、翻訳不可能なセンス配列或いはアンチセンス配列で細胞に導入するために用いることができいる。このようなベクターは、ＤＮＡへ組み込まれない場合ですら、全ての複製物が内在性ヌクレアーゼにより分解されるまで、ＲＮＡ分子を転写し続ける。このような一過性の発現は、非複製ベクターでも１ヶ月以上、適当な複製エレメントがベクター系の一部である場合には更に長い期間継続し得る。上述のように、ＡＰＲＧをコードする配列の制御領域、即ちプロモータ、エンハンサ或いはイントロンに対するアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを設計することにより遺伝子発現を改変することができる。転写開始部位、例えばリーダー配列の＋１０〜−１０領域の間に由来するオリゴヌクレオチドが好適である。また、転写産物がリボソームへの結合するのを防止することによりｍＲＮＡの翻訳を阻止するアンチセンス分子も設計される。同様に、「三重らせん」塩基対合法を用いて阻害を達成することができる。三重らせん対合は、二重らせんが十分にほどけないことでポリメラーゼ、転写因子、或いは調節分子が結合できないようにする。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療法は、文献（Gee,J. E.等(1994)於Huber,B.E.及びB.I.Carr,Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co,Mt Kisco NY）に記載されている。リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子である。リボザイムの作用機序では、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションが行われ、その後エンドヌクレアーゼによる切断（endonucleolytic cleavage）がなされる。発明の範囲内には、ＡＰＲＧのエンドヌクレアーゼによる切断を特異的かつ効果的に触媒し得る人工合成のハンマーヘッド型リボザイム分子も含まれている。任意のＲＮＡ標的可能部分内の特異的なリボザイム切断部位を、初めに、配列GUA、GUU並びにGUCが後続するリボザイム切断部位に対する標的分子を調べることによって同定する。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列を、そのオリゴヌクレオチドの機能を停止させる２次構造の特徴について評価することが可能となる。候補の標的部分の適切性も、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレオチドとのハイブリッド形成に対する接触性をアッセイすることにより評価することができる。本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、ＲＮＡ分子を合成するのための当分野で周知の方法により調製することができる。これらの技術には、固相ホスホラミダイト（phosphoramidite）化学合成のようなオリゴヌクレオチドの化学的合成技術が含まれる。この他、ＲＮＡ分子を、ＡＰＲＧをコードするＤＮＡ配列のin vivo及びin vitro転写により生成することができる。このようなＤＮＡ配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーターを有する多種のベクターに組み込むことができる。更に別の方法として、構成的に或いは誘導的にアンチセンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ作成物を、株細胞、細胞或いは組織内に導入することができる。ＲＮＡ分子は細胞内安定性を高め及び半減期を長くするために修飾することができる。可能な修飾には、限定はしないが、その分子の５′末端か３′末端、或いはその両方へのフランキング配列の付加や、分子のバックボーン内においてホスホジエステラーゼ結合ではなくホスホロチオネート（phosphorothioate）或いは２′Ｏ−メチルを使用することが含まれる。このコンセプトは、ＰＮＡ生成固有のものであり、内在性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデニン、グアニン、シチジン、チミン、及びウリジンの、アセチル−、メチル−、チオ −形態、及び類似の改変形態とともに、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブトシン（Wybutosine）のような従来あまり用いられなかった塩基を含めることによって、これら全ての分子に拡張することができる。細胞或いは組織内にベクターを導入するための方法には、上述の方法が含まれ、これらの方法は、in vivo、in vitro、及びex vivoの使用に対しても同様に適切なものである。ex vivo治療法の場合には、患者から採取された幹細胞にベクターを導入し、自家移植用のクローンとして増殖して同じ患者に戻す方法がある。またトランスフェクションによるデリバリー、リポソームによるデリバリーは、当分野でよく知られている。上述の治療法の任意のものは、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、サル、及び最も好ましくはヒトのような哺乳類を含む、任意の適切な被験体に適用することができる。本発明の更に別の実施例は、上述の治療効果のいずれかを発揮させるべく、薬学的に許容される担体とともに医薬品組成物を投与することに関連する。このような医薬品組成物は、ＡＰＲＧ、ＡＰＲＧに対する抗体、ＡＰＲＧの擬似物、アゴニスト、アンタゴニスト、又はインヒビターからなるものであり得る。この医薬品組成物は、単体で、或いは例えば安定剤のような１種以上の他の薬剤と組み合わせて、任意の無菌の生体適合性製薬用担体に含めて投与される。このような担体には、限定はしないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水が含まれる。これらの分子は、患者に対して、単体で、或いは他の薬品やホルモンと結合して、賦形剤或いは製薬学的に許容される担体と混合される他の医薬品組成物に含めて投与され得る。本発明の或る実施例では、製薬学的に許容される担体とは、製薬学的に不活性なものである。本発明で用いられる医薬品組成物の投与経路には、以下の経路に限定されないが、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、動脈内投与、髄内投与、くも膜下内投与、心室内投与、経皮投与、皮下投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、経腸投与、局所投与、舌下投与、或いは直腸内投与が含まれ得る。活性成分に加えて、これらの薬品組成物は、薬学的に用いられ得る調合物内への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び補助剤を含む適切な製薬学的に許容される担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、“Remington's Pharmaceutical Sciences”(Maack Publishing Co,Easton PA)の最新版において見ることができる。経口投与用の医薬品組成物は、当分野でよく知られる製薬学的に許容される担体を用いて適切な剤形に製剤される。このような担体により、薬品組成物は、治療を受ける患者による経口及び鼻腔摂取のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、液体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液或いは類似の製剤として処方される。経口投与するための製剤は、活性化合物と固形の賦形剤とを結合することによって得ることができるが、所望に応じて、必要なら適切な補助剤を添加した後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、錠剤或いは糖衣剤核を得ることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール或いはソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク質充填剤、とうもろこし、小麦、米、じゃがいも等からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムのようなセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントのようなゴム、並びにゼラチン或いはコラーゲンのようなタンパク質である。必要ならば、架橋結合したポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸或いはアルギン酸ナトリウムや、その塩のような、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられる。糖衣剤核は、濃縮砂糖溶液のような適切な錠皮を与えられるが、溶液はアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤、ポリエチレングリコール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混合物が含み得る。錠剤の識別のため、すなわち活性化合物の量、すなわち投与量を特徴付けるために染料或いは色素が錠剤或いは糖衣錠皮に加えられてもよい。経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル及びゼラチンからなる柔らかい、密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビトールのような錠皮を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはでんぷんのような充填剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、並びに付加的には安定剤と混合された活性処方組成物を含み得る。柔らかいカプセルでは、活性化合物は、安定剤があるなしにかかわらず、脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或いは懸濁される。非経口投与用の製剤は、水溶性の活性化合物の水溶液を含む。注射用として、本発明の薬品組成物を水溶液、好適にはハンクの溶液、リンゲル溶液或いは生理緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液に入れて製剤することができる。水性の注入懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を高める物質を含み得る。更に、活性成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁剤として調製される。適切な親油性の溶媒或いは媒介物は、胡麻油のような脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリド或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。また懸濁剤は、所望に応じて、それにより溶解度を増加し、非常に濃縮された溶液の調製ができるようになる適切な安定剤或いは薬剤を含んでもよい。局所的投与または経鼻粘膜投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸透剤を用いて調合が行われる。このような浸透剤は、一般に周知である。本発明の薬品組成物は周知の方法、例えば従来の混合処理、溶解処理、顆粒化処理、糖衣形成処理、研和処理、乳化処理、封入処理(entrapping)処理或いは凍結乾燥処理により製造される。この医薬品組成物は塩類として提供されることもあり、限定はしないが、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む、多くの酸とともに形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性或いはプロトニック溶剤において、より可溶性が高くなる傾向がある。他の場合には、好適な製剤は、１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１％〜２％のショ糖、使用前に緩衝剤と結合させたｐＨ範囲４．５〜５．５にある２％〜７％のマンニトールにおける凍結乾燥粉末である。製薬学的に許容される担体内に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調製された後、適切な容器内に入れて、さらに提示した疾病状態の治療のためにラベル付けすることができる。ＡＰＲＧの投与の場合、このようなラベルには、投与の量、頻度、方法が表示される。本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、活性成分を所望の目的を達成するための有効量含む組成物である。有効量の決定は、当業者の能力の範囲内で十分行うことができる。任意の化合物について、治療的有効量は、初めに、新生物細胞、或いは通常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のアッセイから推定される。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおける有効量や投与経路を決定することができる。治療的有効量とは、症状や状態を改善するタンパク質、その抗体、アンタゴニスト、またはインヒビターの量である。そのような化合物の毒性及び治療的有効性は、例えばＬＤ５０（個体群の５０％の致死投与量）及びＥＤ５０（個体群の５０％における治療的有効量、５０％有効量）を決定するための、細胞培地或いは実験動物における標準的な製薬学的方法により決定することができる。毒性と治療有効性との間の投与量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい。これらの細胞培地のアッセイ及び付加的な動物研究から得られるデータは、ヒトへの使用に対する投与量の範囲を決める際に用いることができる。そのような化合物の投与量は、毒性がほとんど或いは全くなく、ＥＤ５０を達成する循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、用いられる剤形、患者の感受性並びに投与経路に応じてこの範囲内で変化する。正確な投与量は治療されるべき患者を考慮して個々の医師により選択される。投与量及び投薬量は、十分なレベルの活性成分を与え、かつ所定の効果を維持するために調節される。考慮すべき付加的な要因は、疾患状態の重症度、または患者の年齢、体重並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感受性、並びに治療への耐性／反応を含む。長期的に作用する薬品組成物は３〜４日毎に、１週間毎に、或いは半減期及び特定の処方のクリアランス速度に応じて２週間に１度投与してもよい。通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲にあって、全投与量は最大約１ｇであり、投与経路に応じて変わってくる。特定の投与量或いは送達の方法に関する手引きは、当分野の実施者が通常入手できる文献において見出すことができる。当業者なれば、ヌクレオチドに対しては、タンパク質やインヒビター用の剤形とは異なる剤形を採用するであろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達方式は、特定の細胞、状態、位置等によって決まってくる。診断別の実施例において、ＡＰＲＧに特異的な抗体は、ＡＰＲＧの発現を特徴とする状態や疾病の診断や、ＡＰＲＧで治療を受けている患者のモニタリングのためのアッセイにおいて役立つ。診断目的で有用な抗体は、上述の治療用のものと同じように調製することができる。ＡＰＲＧの診断的測定法には、ヒトの体液、細胞或いは組織の抽出物においてＡＰＲＧを検出するために抗体或いは標識を利用する方法が含まれる。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾したものでも、修飾なしでも用いることができ、共有結合、或いは非共有結合かのいずれかでリポーター分子と結合することにより標識することができる。種々のリポーター分子が周知となっており、その幾つかについては上記した。例えばELISA（酵素結合免疫測定法）、RIA（ラジオイムノアッセイ）並びにFA CS（蛍光表示式細胞分取器法）を含む、ＡＰＲＧを測定するための種々のプロトコルが当分野では周知であり、これによってＡＰＲＧ発現の変化や異常を診断するための基礎が得られる。ＡＰＲＧの発現の正常値、つまり標準値は、哺乳類、好ましくはヒトの正常被験者から得られる体液或いは細胞抽出物とＡＰＲＧに対する抗体とを、複合体形成に適した条件の下で結合することによって得ることができる。標準の複合体形成量は、種々の方法、好ましくは測光手段を用いることにより定量することができる。被験者、対照標準、及び生検組織からの患部組織サンプルにおいて発現されたＡＰＲＧの量を、標準値と比較する。標準値と被験者の値との偏差で、疾病診断のパラメータが確立される。本発明の別の実施例では、ＡＰＲＧをコードするポリヌクレオチドを、診断目的で用いることができる。使用できるポリヌクレオチドには、オリゴヌクレオチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。このポリヌクレオチドは、ＡＰＲＧの発現が疾病と相関性を有する生検組織における遺伝子発現を検出し、定量するために用いられる。診断的測定は、ＡＰＲＧが存在、不存在、及び過剰発現の何れの状態にあるかを区別したり、治療的介入の際にＡＰＲＧレベルの調節をモニタリングするのに役立つ。或る態様では、ＡＰＲＧまたは近縁な分子をコードする、ゲノム配列を含むポリヌクレオチド配列を検出できるハイブリダイゼーションプローブ或いはＰＣＲプローブを用いて、ＡＰＲＧをコードする核酸配列を同定することができる。そして、そのプローブの特異性、即ち、そのプローブが非常に高度な保存領域（例えば５′調節領域における１０個の独特のヌクレオチド）と、保存的である度合いの低い領域（例えば特に３′領域におけるシステイン残基の間の領域）の何れに由来するのかということ、及びハイブリダイゼーション或いは増幅の（高い、中程度の或いは低い）厳密性によって、そのプローブが自然発生ＡＰＲＧのみを同定するものであるか、或いはアレル配列や近縁な配列も同定するものであるかということが決まってくる。プローブは、近縁なインヒビターをコードする配列を検出するためにも用いることができ、好ましくは、これらのＡＰＲＧをコードする任意の配列から得られるヌクレオチドを少なくとも５０％含むべきである。本発明のハイブリダイゼーションプローブは、配列番号：２のヌクレオチド配列か、自然発生ＡＰＲＧのイントロン、プロモータ、及びエンハンサーエレメントを含むゲノムの配列に由来するものであり得る。ＡＰＲＧをコードするＤＮＡに対して特異的なハイブリダイゼーションプローブの作製のための他の手段には、ＡＰＲＧやＡＰＲＧ誘導体をコードする核酸配列を、ｍＲＮＡプローブ生成のためのベクターにクローン化する方法がある。このようなベクターは周知で市販されており、適切なＲＮＡポリメラーゼや適切な放射性標識ヌクレオチドを付加することにより、in v itroでのＲＮＡプローブを合成のために用いることができる。ハイブリダイゼーションプローブは種々のリポータ分子により標識することができ、この標識には、³²Ｐや³⁵Ｓのような放射性核種、アビジン／ビオチン結合系によりプローブに結合するアルカリホスファターゼのような酵素標識等が含まれる。ＡＰＲＧをコードするポリヌクレオチド配列をＡＰＲＧの発現が関係する状態又は疾病の診断のために用いることができる。このような状態又は疾病の例には、脳及び腎臓の癌；乳房、前立腺、精巣、及び卵巣の癌を含むホルモン依存性癌；リンパ腫、白血病；全身性エリテマトーデス、強皮症及び関節炎を含む自己免疫疾患；及びヘルペス、ＨＩＶ、アデノウイルス、ＨＴＬＶ−１関連悪性疾患のようなウイルス感染症；アルツハイマー病、パーキンソン病、及び筋萎縮性側索硬化症を含む神経変性疾患；再生不良性貧血のような脊髄形成異常疾患；脳卒中、外傷、及び心発作に起因する虚血性障害；及びＡＩＤＳが含まれる。ＡＰＲＧをコードするポリヌクレオチド配列は、ＡＰＲＧ発現の変化を検出するための生検組織や体液を試験するための、サザンブロット法或いはノーザンブロット法、ドットブロット法或いは他の膜ベース技術、ＰＣＲ技術、ディップスティック試験法（試験紙法）、ピン或いはチップ技術及びELISAアッセイにおいて用いることができる。このような定性的或いは定量的試験方法は当分野ではよく知られている。特定の態様では、種々の癌、特に上述の癌の活性化または誘導を検出するアッセイにおいてＡＰＲＧをコードするヌクレオチド配列が役立ち得る。ＡＰＲＧをコードするヌクレオチド配列を標準的な方法で標識し、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した条件の下で患者の体液や組織サンプルに加える。適切なインキュベーション時間の経過後、このサンプルを洗浄しシグナルを定量して、標準値を比較する。生検サンプルまたは抽出サンプルにおけるシグナルの量が、比較できる対照サンプルのシグナル量と有意に異なっている場合、このヌクレオチド配列はサンプルのヌクレオチド配列とハイブリダイズしており、サンプルにおけるＡＰＲＧをコードするヌクレオチド配列のレベルの変化が存在することは、関連疾患の存在を示している。このようなアッセイは、動物実験、臨床試験、または個々の患者の治療のモニタリングにおける特定の治療措置の効果を評価するために用いることもできる。ＡＰＲＧの発現が関係する疾病の診断の基礎を得るために、正常な、或いは標準の発現プロフィールを確立する。この標準プロフィールは、動物或いはヒト何れかの正常な被験者から得られる体液或いは細胞抽出物を、ハイブリダイゼーション或いは増幅に適切な条件下で、ＡＰＲＧをコードする配列又はその一部分と結合することにより確立される。標準のハイブリッド形成量は、既知の量の実質的に精製されたＡＰＲＧが用いられる同一の実験で得られる値と、正常被験者に対して得られる値とを比較することにより定量することができる。正常なサンプルから得られた標準値は、疾病の症状を示す患者からのサンプルから得られる値と比較することができる。標準値と被験者値との偏差を用いて疾病の存在を確認する。ひとたび疾患が確認され、治療プロトコルが開始されると、患者での発現レベルが正常な患者において観察されるレベルに近づき始めたか否かを評価するために、このようなアッセイが定期的に繰り返される。継続的なアッセイから得られる結果を用いて、数日間或いは数ヶ月の期間にわたる治療効果を知ることができる。癌については、患者の生検組織において転写物が比較的少ない量存在することが疾病の発生の素因を示し、つまり実際の臨床的症状が現れる前に疾病を検出する手段となり得る。この型のより確定的な診断により、医療従事者が予防的処置を講じたり、より早期に積極的な治療を開始することが可能となり、疾病の発生や更なる進行を予防することができるようになり得る。ＡＰＲＧをコードするオリゴヌクレオチドの別の診断目的の使用では、ＰＣＲを使用することがある。このようなオリゴマーは一般には化学的に合成するが、酵素を用いて作製したり、或いは組換え体を起源として作り出すこともできる。オリゴマーは、特定の遺伝子或いは状態を識別するために最適な条件下で用いられる２つのヌクレオチド配列、即ちセンス方向（５′→３′）のヌクレオチド及びアンチセンス方向（３′←５′）のヌクレオチドからなる。同一の２つのオリゴマー、入れ子オリゴマーの組、或いはオリゴマーの縮重プールでさえ、近縁なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出や定量のためのより厳密性の低い条件の下であっても用いることができる。さらにＡＰＲＧの発現を定量するための方法には、放射性標識（radiolabelin g）或いはビオチン標識ヌクレオチドの利用、コントロールの核酸の同時増幅（c oamplification）の利用、並びに実験結果を補完して引かれた標準的なグラフ曲線の利用も含まれる（Melby,P.C.等1993 J.Immunol Methods,159:235-44；Dupla a,C.等(1993)Anal.Biochem.229-236）。多数のサンプルの定量は、ELISA形式の連続アッセイを実行することにより一層迅速に行うことができる。このアッセイでは目的のオリゴマーが様々な希釈溶液中に存在し、分光光度計を用いる分析或いは比色分析反応により迅速に定量することができる。本発明の別の実施例では、ＡＰＲＧをコードする核酸配列を用いて、自然発生のゲノム配列マッピングのためのハイブリダイゼーションプローブを生成することができる。この配列を、よく知られた技術を用いて特定の染色体或いはその染色体の特定領域に対してマッピングすることができる。このような技術には、FISH、FACSや人工染色体作製物の使用、例えば酵母菌人工染色体、細菌性人工染色体の細菌性Ｐ１作製物、Price,C.M.(1993)Blood Rev.7:127-34 及びTrask,B.J.(1991)Trends Ganet 7:149-154に概要が示されている単染色体ｃＤＮＡライブラリーの使用が含まれる。 FISH（Verma等（1988）Human Chromosomes:A Manual of Basic Technique,Per gamon Press,New York,NY”に記載）は、他の染色体マッピング技術及び遺伝子地図データと関係を有し得る。遺伝子地図データの例は、1994 Genome Issue of Science(265:1981f)に見ることができる。物理的染色体地図上でのＡＰＲＧをコードする配列の位置と、特定の疾病（または特定の疾病の素因）との相関関係を助けとして、ある遺伝病が関係するＤＮＡの領域の限界決定ができる。本発明のヌクレオチド配列を用いて、正常者とキャリアまたは患者との遺伝子配列の違いを検出することができる。染色体調製物のin situハイブリダイゼーション及び確定された染色体マーカーを用いる連鎖解析のような物理的地図作成技術は、遺伝子地図を延長するために大変重要である。多くの場合、特定のヒト染色体の数或いは腕が未知であっても、マウスのような別の哺乳類種の染色体上の遺伝子配置から、関連するマーカーがわかる。新しい配列は、物理的マッピングにより染色体のアーム、或いはその一部へ割当てることができる。これは位置クローニング或いは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を調査する研究者に貴重な情報を提供する。ひとたび毛細血管拡張性運動失調（AT）のような疾患或いは症候群が、特定のゲノム領域へ、例えばATならば11q22-23(Gatti,R.A.等(1988)Nature 336:577-580) へ、遺伝子連鎖によって粗い局所化がなされれば、その領域にマッピングされる任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは調節遺伝子ということになる。本発明のヌクレオチド配列は、正常者とキャリアまたは患者との間の、転座、逆位等による染色体位置の違いを検出するために用いることもできる。本発明の別の実施例では、ＡＰＲＧや、その触媒作用性または免疫原性フラグメント或いはオリゴペプチドを、種々の薬物スクリーニング技術において治療用化合物のスクリーニングのために用いることができる。そのような試験において用いられるフラグメントは、溶液に遊離した形態か、固体支持体へ付着したものか、細胞表面へ付着したものか、或いは細胞内に存在するものであり得る。ＡＰＲＧと試験される薬剤との結合複合体形成が測定され得る。ＡＰＲＧポリペプチドへの適切な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングのために用いることができる別の薬物スクリーニング技術が、公開されたPCT出願WO84/03564に詳細に記載されている。この方法をＡＰＲＧに適用する場合には、多数の異なる小形ペプチドの試験用化合物を、プラスチックピン或いは他の表面のような固体基質上で合成する。ポリペプチド試験用化合物をＡＰＲＧ又はその断片と反応させ、洗浄する。次いで結合ＡＰＲＧを当分野で周知の方法により検出する。また、前述の薬物スクリーニング技術において使用するために、精製ＡＰＲＧをプレート上に直接コーティングすることもできる。この他、ペプチドを捕捉し固体支持体上にペプチドを固定するために非中和抗体を用いることができる。別の実施例では、ＡＰＲＧに結合し得る中和抗体が、ＡＰＲＧとの結合について試験化合物と特異的に競合する競合的薬物スクリーニングアッセイを使用することができる。このように、抗体を用いて、１または２以上のＡＰＲＧと共通のエピトープを有する任意のペプチドの存在を検出することができる。更に別の実施例では、ここに開示するＡＰＲＧをコードするヌクレオチド配列は、その新技術が、以下に限らないが、例えばトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対合相互作用のような特性を含む、現在周知のヌクレオチド配列の特性に基づく技術であれば、まだ開発されていない分子生物学的技術においても用いることができる。以下に示す本発明の実施例は、単なる例示であって、本発明をこの実施例に限定しようとするものではない。実施例１ UCMCNOT02 cDNAライブラリーの作製 UCMCNOT02 ｃＤＮＡライブラリーは、９人のドナーから提供されたものをプールした未処理の臍帯単核細胞から作製された。冷凍組織を、Brinkmann Homogeni zer Polytron PT-3000（Brinkmann Instruments,Westbury,NJ）を用いて、グアニジウムイソチオシアネート溶液の中でホモジナイズし溶解した。この溶解産物を、Beckman L81-70M UltracentrifugeにおいてBeckman SW28rotor（Beckman In struments）を用いて、５．７Ｍの塩化セシウムクッションを通して、外界温度で１８時間、２５,０００ｒｐｍで遠心分離した。ｐＨ４．７の酸性フェノールを用いてＲＮＡを抽出し、０．３Ｍの酢酸ナトリウム及び２．５倍量のエタノールを用いて沈殿させ、無ＲＮアーゼ水に再懸濁し、３７℃でＤＮアーゼ処理した。次にｍＲＮＡを、Qiagen Oligotex kit（QIAGEN,Inc.,Chatsworth,CA）を用いて単離し、ｃＤＮＡライブラリの作製に用いた。このｍＲＮＡは、SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning（Cat.＃18248-013,Gibco/BRL）の推奨プロトコルに従って取り扱った。市販のプラスミドpSPORT 1（Gibco/BRL）をEcoRI制限酵素（New En gland Biolabs,Beverley,MA）を用いて消化した。プラスミドの突出末端は、クレノウ酵素（New England Biolabs）及び2'-デオキシヌクレオチド5'-3リン酸（ dNTP）を用いて平滑化した。このプラスミドを自己連結させ、細菌宿主の大腸菌株JM 109に入れて形質転換した。次にこの中間体プラスミドを、Hind IIIを制限酵素（New England Biolabs）で消化し、突出末端はクレノウ酵素及びdNTPで平滑化した。十量体リンカーの配列5'...CGGAATTCCG...3'をリン酸化し、平滑末端にリゲートした。結合反応の産物をEcoR Iで消化し、自己結合させた。JM109宿主細胞に形質転換した後、消化されたプラスミドpINCYを単離し、Not I及びEcoR I制限酵素を用いて、ｃＤＮＡを組み込めるその能力について試験した。 UCMCNOT02 ｃＤＮＡはSepharose CL4Bカラム（Cat.＃275105-01,Pharmacia）で分画化し、４００ｂｐを越えるｃＤＮＡをpSport Iにリゲートした。次にこのプラスミドpSport IをDH5a^TMコンピテント細胞（Cat.＃18258-012,Gi bco/B RL ）に入れて形質転換させた。２ｃＤＮＡクローンの単離及び配列決定プラスミドＤＮＡは細胞から放出され、REAL Prep 96 Plasmid Kit（Catalog ＃26173,QIAGEN,Inc.）を用いて精製した。推奨プロトコルを用いたが、以下の点を変更した。（１）２５mg/Lのカルベニシリン及び０．４％のグリセロールと共に１mlの滅菌Terrific Broth（Catalog＃22711,Life Technologies^TM,Gaither sburg,MD）において細菌を培養した。（２）植菌の後、培地を１９時間インキュベートし、インキュベーションの終わりに、細胞を０．３mlの溶解バッファに溶解した。（３）イソプロパノール沈殿の後、プラスミドＤＮＡペレットを０．１ml の蒸留水に再懸濁した。プロトコルの最終ステップの後、サンプルを９６穴ブロックに移し４℃で保管した。このｃＤＮＡの配列決定は、Peltier Thermal Cyclers（PTC200 from MJ Rese arch,Watertown,MA）及びApplied Biosystems 377 DNA Sequencing Systemsと組み合わせてHamilton Micro Lab 2200（Hamilton,Reno,NV）を用いてSangerらの方法（1975,J.Mol.Biol.94:441f）により行い、読み枠を決定した。３ｃＤＮＡクローン及びそれらの類推されるタンパク質の相同性検索 Applied Biosystems社で開発された検索アルゴリズムを、INHERIT670^TM配列解析システムに組み込んで用いて、各ｃＤＮＡの配列をGenBankの配列と比較した。このアルゴリズムでは、Pattern Specification Language（TRW社、LosAngele s CA）を用いて相同な領域を決定した。配列の比較をどのように行うかを決定する３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセット、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの組を用いて、対象の配列と相同な領域を含む配列をＤＮＡデータベースから検索し、適切な配列には、初期値とともにスコアが付けられた。次に、これらの相同な領域をドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、相同な領域と偶然の一致とを区別した。相同性検索の結果は、Smith-Waterman alignmentsを用いて表示した。ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、INHERIT 670配列解析システムをＤＮＡ配列の相同性検索で用いたのと同様に用いて確かめた。Pattern Specificat ion Language及びパラメータウィンドウを用いて、タンパク質データベースから相同性領域を含む配列を検索し、その結果には初期値とともにスコアが付けられた。ドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、有意な相同性を有する領域と偶然の一致とを区別した。 BLASTは、Basic Local Alignment Search Tool(Altschul SF(1993)J Mol Evol 36:290-300;Altschul,SF等(1990)J Mol Biol215:403-410)の略称であり、これを用いて局部的な配列アライメントを検索した。BLASTはヌクレオチド及びアミノ酸配列の両方のアライメントを作成して配列類似性を求める。そのアライメントの局所性のために、BLASTは厳密な一致、すなわちホモログを求める際に特に有効である。BLASTは間隙を含まない一致を求めるのに役立つ。BLASTアルゴリズム出力の基本的な単位は、High-scoring Segment Pair（HSP）である。 HSPは２つの配列フラグメントからなり、両フラグメントは任意ではあるが、そのアライメントが局所的に最大となっている等しい長さものであり、そのアライメントスコアはユーザにより設定された閾値すなわちカットオフスコアを満足、即ち、カットオフスコアを超えている。BLASTアプローチは問い合わせ配列とデータベース配列との間のHSPを見つけ出すものであり、見出された任意の一致の統計的有意性を評価し、そのユーザが設定した有意性の閾値を満足する一致のみを報告するものである。パラメータＥはデータベース配列一致を知らせるための統計的に有意な閾値を確定するパラメータである。Ｅは全データベース検索の情況においてHSP（或いはHSPの組）生起の予測頻度の上限として解釈される。その一致がＥを満足する任意のデータベース配列がプログラム出力において報告される。４ノーザン法による解析ノーザン解析は、標識されたヌクレオチド配列と特定の細胞型または組織に由来するＲＮＡが結合したメンブランとのハイブリッド形成を伴う、遺伝子の転写物の存在を検出するために用いられる実験技術である（Sambrook等、上述）。 BLAST（Altschul,S.F.1993及び1990，上述）を用いる類似のコンピュータ技術で、GenBankまたはLIFESEQ^TMデータベース（Incyte,Palo Alto CA）のようなデータベースにおける同一のまたは近縁な分子を検索した。この解析は、多くの膜ベースのハイブリダイゼーションより非常に短時間で行うことができる。更に、コンピュータ検索の感度を変更して、ある一致が正確な一致か、相同的であるかの分類を決定することができる。検索の基準値は、積スコアであり、これは以下の式で定義されるもの、である。（配列の一致（％）×最大BLASTスコア（％））／１００この積スコアでは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致の双方が考慮されている。例えば、積スコアが４０の場合は、一致は誤差が１〜２％の範囲で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相同な分子は、通常積スコアとして１５〜４０を示すものを選択することにより同定されるが、スコアの低いものは近縁関係にある分子として同定される。検索の結果は、完全長配列、又はその部分が存在するライブラリー、配列の存在量（abundance）、及びパーセント存在量（percent abundance）のリストとして報告される。存在量は、特定の転写物の検出回数を直接反映し、パーセント存在量は、存在量をライブラリー内で検出された配列の総数で除したものである。５ＡＰＲＧをコードする配列の完全長又は調節エレメントを回復するまでの伸長完全長ＡＰＲＧコード化核酸配列（配列番号：２）を用いて、部分的ヌクレオチド配列を完全長まで伸長させるための、或いはゲノムライブラリーから５′または３′配列を得るためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計することができる。一方のプライマーはアンチセンス方向(ＸＬＲ)の延長を開始するために合成され、他方のプライマーはセンス方向（ＸＬＦ）に配列を延長するために合成される。これらのプライマーにより、周知のＡＰＲＧ配列を「外側に」延長し、対象の制御領域の新しい未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成できるようにな Plymouth MN）、或いは他の適切なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオチドで５０％以上のＧＣ含量を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列にアニールするように設計することができる。アピン構造及びプライマー−プライマー二量体化を生じるような任意のヌクレオチドのストレッチの延長は回避される。元の選択されたｃＤＮＡライブラリーか、ヒトゲノムライブラリーを用いて配列を延長する。後者のライブラリーは、５′上流配列を得るために最も役立つ。必要なら、既知領域をさらに延長するために追加のプライマーの組が設計される。 XL-PCRキット（Perkin Elmer）の説明書の指示に従って、酵素と反応混合物とを完全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られる。４０pmolの各プライマーと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始する場合、ＰＣＲはPeltier Thermal Cycler（PTC200；M.J.Reserch,Watertown MA）を用いて、以下のパラメータで実行される。ステップ１９４℃で１分間（初期変性）ステップ２６５℃で１分間ステップ３６８℃で６分間ステップ４９４℃で１５秒間ステップ５６５℃で１分間ステップ６６８℃で７分間ステップ７ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復ステップ８９４℃で１５秒間ステップ９６５℃で１分間ステップ１０６８℃で７分１５秒間ステップ１１ステップ８〜１０を１２サイクル反復ステップ１２７２℃で８分間ステップ１３４℃（その温度を保持）反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）アガロースミニゲル上での電気泳動で解析して、反応物が配列を延長することに成功したか否かを決定する。最も大きな生成物或いはバンドを選択して、ゲルから切り出した。さらなる精製には、QIAQuick^TM（QIAGEN Inc.,Chatsworth,CA）のような市販のゲル抽出法を用いる。ＤＮＡ回収の後、クレノウ酵素を用いて一本鎖ヌクレオチドの延び出しを切り取り、再結合及びクローニングを容易にする平滑末端を作った。エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌのリゲーション緩衝液内に再溶解し、１μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを加えて、その混合物を室温で２〜３時間、或いは１６℃で一昼夜インキュベートする。コンピテントな大腸菌細胞（４０μｌの適切な溶媒内にある）を、３μｌのリゲーション混合物を用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培地（ Sembrook等、上記）で培養する。３７℃で１時間のインキュベーションの後、全ての形質転換混合物を、2xCarbを含むLuria Bertani(LB)寒天（Sembrook等、上記）上にのせる。後日、いくつかのコロニーを各プレートから無作為に選択し、適切な市販の無菌の９６穴マイクロタイタープレートの個々のウェル内に入れられた１５０μｌの液状LB/2xCarb培地で培養する。さらに後日、５ μｌの各一昼夜の培養物を非無菌９６穴プレート内に移し、水で１：１０に希釈した後、それぞれ５μｌのサンプルをＰＣＲアレイに移す。ＰＣＲ増幅のため、４単位のｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼを含む１８μｌの濃縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用いられる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以下の条件に従って行う。ステップ１９４℃で６０秒間ステップ２９４℃で２０秒間ステップ３５５℃で３０秒間ステップ４７２℃で９０秒間ステップ５ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復ステップ６７２℃で１８０秒間ステップ７４℃（そのまま保持）ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動させる。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクローンを選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行う。６ハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用配列番号：２の配列に基づくハイブリダイゼーションプローブを用いて、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングする。約２０の塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが、大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレオチドをOLIGO4.06（Nationa l Bioscience）のような最新式のソフトウェアを用いてデザインし、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０ｍＣｉの[γ‐³²Ｐ]アデノシン三リン酸（Amersham）及びＴ４ポせて用いて標識する。標識されたオリゴヌクレオチドを、SephadexG-25超精細樹脂カラム（Pharmacia）を用いて精製する。毎分１０⁷カウントのセンス及びアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれを含む部分を、エンドヌクレアーゼAseI ，BglII，EcoRI，PstI，Xba1或いは的な膜ベースのハイブリダイゼーション解析において用いる。各消化物からのＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画化して、ナイロン膜（Nytran Plus,Schleicher & Schuell,Durham NH）にトランスファーする。ハイブリダイゼーションは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くため、ブロットを、０．１ｘクエン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまで段階的に厳密性が増す条件下で、室温にて順次洗浄する。 XOMAT AR^TMフィルム（Kodak,Rochester,NY）を、Phosphoimager cassette（Mole cular Dynamics,Sunnyvale,CA）においてブロットに数時間露光した後、ハイブリダイゼーションパターンを視覚的に比較する。７アンチセンス分子ＡＰＲＧをコードする配列或いはその任意の一部分は、自然発生の配列のin v ivoまたはin vitro発現を阻害するために用られる。約２０塩基対からなるアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用について特に記すが、より大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ方法を用いることができる。第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図に示すようなＡＰＲＧをコードする配列に基づくオリゴヌクレオチド用いて、自然発生ＡＰＲＧの発現を阻害することができる。相補的なオリゴヌクレオチドを、第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図に示す最も独特な５′配列から設計し、これを用いてプロモーターが結合するのを阻害することにより転写を抑制したり、リボソームが転写物に結合するのを阻害してＡＰＲＧ転写物の翻訳を抑制することができる。配列番号：２の５′配列の適切な部分を用いることにより、効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが、第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図に示すポリペプチドのシグナル配列または５′コーディング配列に翻訳される領域全体にわたる１５〜２０個のヌクレオチドを含むようになる。８ＡＰＲＧの発現ＡＰＲＧの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクター内にサブクローニングし、そのベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって行われる。この場合、前にｃＤＮＡライブラリーの作製の際に用いたクローニング用のpSportベクターを用いて、大腸菌においてＡＰＲＧを発現させる。クローニング部位の上流には、β−ガラクトシダーゼに対するプロモータが存在し、その後ろにはアミノ基末端Met及びβ−ガラクトシダーゼの７残基が存在する。後続のこれら８つの残基は、転写に役立つバクテリオファージプロモーターであり、多くの独特の切断部位を含むリンカーである。単離されたトランスフェクト菌株を、IPTGを用いて標準的な方法で誘導し、初めのβガラクトシダーゼの７残基、約５〜１５残基のリンカー、及び完全長ＡＰＲＧからなる融合タンパク質を作り出す。このシグナル配列は菌培地へのＡＰＲＧの分泌を誘導し、この培地は後の活性のアッセイにおいて直接用いることができる。９ＡＰＲＧ活性の確認ＡＰＲＧ活性は、顕微鏡のスライドガラスに播かれた以下のプラスミドを一時的にトランスフェクトしたＢＨＫ細胞においてアッセイすることができる。そのプラスミドは、ＡＰＲＧをコードする核酸配列を含むプラスミド及び腫瘍壊死因子α(アポトーシスを引き起こすＴＮＦ−α)及びＢ− ガラクトシダーゼをコードする配列が直列に配置されたものを含むプラスミドである。この細胞を１２時間後に固定し、X-galを含むバッファにおいてインキュベートしてＢガラクトシターゼ活性を可視化する。位相差顕微鏡又は干渉顕微鏡を用いてこのスライドガラスを調べる。ＴＮＦ−αを有するプラスミドのみを発現する細胞は、核の収縮を示し、濃青で染色され、膜の小疱形成が見られる。両プラスミドを発現する細胞は、ほぼ正常な核を示し、濃青で染色され、且つほぼ正常な膜を示し、小疱形成は見られない。この技術はStanger BZ （1995;Cell 8 1:513-523）に記載のものを採用した。１０ＡＰＲＧ特異的抗体の産生標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化及び抗体の産生には、ＰＡＧＥ電気泳動法（Sambrook前出）を用いて実質的に精製されたＡＰＲＧを用いる。配列番号：２から類推されるアミノ酸配列をDNAStarソフトウエア（DNASTAR社）を用いて解析して免疫抗原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを当業者には周知の手段により合成して、当業者に周知の方法で抗体を産生するために用いる。Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープのような、適切なエピトープを選択するための解析法は、Ausubel等（上記）の論文他に記載されている。通常、約１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、Applied BiosystemsのペプチドシンセサイザModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法のケミストリにより合成し、Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ： Ausubel等、上記）を用いた反応によりキーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ、Sigma,St.Louis,MO）に結合する。フロイントの完全アジュバントにおいてオリゴペプチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫する。得られた抗血清の抗ペプチド活性を検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、１％BSAを用いてブロックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ抗ウサギＩｇＧと反応させる。１１特異的抗体を用いる自然発生ＡＰＲＧの精製自然発生ＡＰＲＧ或いは組換えＡＰＲＧは、ＡＰＲＧに特異的な抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより精製することができる。イムノアフィニティーカラムは、CnBr-activated Sepharose（Pharmacia Biotech社）のような活性化クロマトグラフレジンとＡＰＲＧ抗体とを共有結合させることにより構築される。結合後、そのレジンを使用説明書の指示に従って、ブロックし洗浄する。ＡＰＲＧを含む培地をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをＡＰＲＧを優先的に吸着できる条件下で（例えば界面活性剤の存在下において高イオン強度バッファで）洗浄する。このカラムを、抗体／ＡＰＲＧ結合を切るような条件下（例えばｐＨ２〜３のバッファ、或いは高濃度の尿素またはチオシアン酸塩イオンのようなカオトロピックイオン）で溶出させ、ＡＰＲＧを回収する。１２ＡＰＲＧと相互作用する分子の同定ＡＰＲＧ又は生物学的に活性なその断片を、¹²⁵Ｉボルトンハンター試薬（Bol ton,A.E.及びW.M.Hunter(1973)Biochem.J.133:529-38）で標識する。マルチウェルプレートに予め配列しておいた候補の分子を、標識したＡＰＲＧとともにインキュベートし、洗浄して、標識ＡＰＲＧ複合体を有する任意のウェルをアッセイする。異なる濃度のＡＰＲＧを用いて得られたデータを用いて、候補の分子とＡＰＲＧの会合、親和性、数の数値を計算する。上記のすべての刊行物及び特許明細書は、本明細書と一体に参照されたい。本発明の記載した方法及びシステムの種々の改変は、本発明の範囲及び精神から逸脱しないことは当業者には明らかであろう。本発明は特に好適な実施例に関連して記載されているが、本発明の請求の範囲は、そのような特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際には、本発明を実施するために記載された方法の種々の改変は、分子生物学或いは関連する分野の専門家には明らかなように、請求の範囲内に含まれるものである。配列表配列番号：１配列の長さ：232 配列の型：アミノ酸起源：GenBank(クローン名1715374) 配列配列番号：２配列の長さ：845 配列の型：核酸起源：GenBank(クローン名1715374) 配列配列番号：３配列の長さ：194 配列の型：アミノ酸起源：GenBank(クローン名1558845) 配列

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 19/10 Ａ６１Ｐ 25/00 21/04 25/16 25/00 25/28 25/16 43/00 １０７ 25/28 Ｃ０７Ｋ 14/47 43/00 １０７ 16/18 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 16/18 Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＣ１２Ｑ 1/68 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，ＳＧ，ＵＳ (72)発明者ヒルマン、ジェニファー・エルアメリカ合衆国カリフォルニア州94040・マウンテンビュー・＃12・モンロードライブ 230

Claims

【特許請求の範囲】１．配列番号：１のアミノ酸配列又はその断片を含む実質的に精製されたヒトアポトーシス調節タンパク質（ＡＰＲＧ）。２．請求項１のヒトアポトーシス調節タンパク質をコードする単離され精製されたポリヌクレオチド配列。３．請求項２のポリヌクレオチド配列と厳密な条件の下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列。４．請求項２のポリヌクレオチド配列を含むハイブリダイゼーションプローブ。５．配列番号：２の配列又はその変異体を含む単離され精製されたポリヌクレオチド配列。６．請求項２のポリヌクレオチド配列又はその変異体に対して相補的なポリヌクレオチド配列。７．請求項６のポリヌクレオチド配列を含むハイブリダイゼーションプローブ。８．請求項２のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。９．請求項８のベクターを含む宿主細胞。１０．配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法であって、（ａ）該ポリペプチドの発現に適した条件の下で請求項９の宿主細胞を培養する過程と、（ｂ）前記宿主細胞の培地から該ポリペプチドを回収する過程とを含むことを特徴とする配列番号：１のアミノ酸配列を含むポリペプチドの製造方法。１１．配列番号：１のアミノ酸配列を有する実質的に精製されたヒトアポトーシス調節タンパク質を適切な製薬用担体と共に含む医薬品組成物。１２．請求項１のポリペプチドに特異的に結合する精製された抗体。１３．請求項１のポリペプチドに特異的に結合し、その活性を変調する精製されたアゴニスト。１４．アポトーシスの増加に関係する疾病の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に、請求項１３の医薬品組成物を有効量投与する過程を含むアポトーシスの増加に関係する疾病の治療方法。１５．請求項１のポリペプチドに特異的に結合し、その活性を変調する精製されたアンタゴニスト。１６．アポトーシスの低下に関係する疾病の治療方法であって、そのような治療が必要な患者に、請求項１５の医薬品組成物を有効量投与する過程を含むアポトーシスの減少が関係する疾病の治療方法。１７．生物学的サンプルにおけるヒトアポトーシス調節タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出方法であって、（ａ）請求項６のポリヌクレオチドと、生物学的サンプルの核酸材料とをハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション複合体を形成する過程と、（ｂ）前記ハイブリダイゼーション複合体を検出する過程とを含むことを特徴とし、前記複合体の存在が、前記生物学的サンプルにおけるヒトアポトーシス調節タンパク質をコードするポリヌクレオチドの存在と相関性を有することを特徴とする生物学的サンプルにおけるヒトアポトーシス調節タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出方法。