【発明の詳細な説明】
二つのヒトＮＳＰ様タンパク質技術分野
本発明は、新規なヒトＮＳＰ様タンパク質の核酸及びアミノ酸配列、及び疾病
の診断、研究、予防、及び治療におけるこれらの配列の利用に関するものである
。背景技術
神経内分泌特異的タンパク質（ＮＳＰ−Ａ、ＮＳＰ−Ｂ及びＮＳＰ−Ｃ）は、
同一のカルボキシ末端アミノ酸配列を共通に有する膜結合小胞体（ＥＲ）タンパ
ク質のグループに最近特性化された（van de Velde HJ等(1994)J Cell Sci 107:
2403-2416）。ＮＳＰ−Ａ及びＮＳＰ−Ｃの発現は、神経性及び内分泌細胞集団
に限定されていることを示唆する証拠も見つかった（van de Velde，前出）。免
疫組織化学的な研究により、ラットのＮＳＰ−Ａはラットの脳全体にわたって発
現されることが分かった（van de Velde HJ等(1994)Mol Brain Res 23:81-92）
。しかしＮＳＰ−Ｂは、小細胞肺癌の株細胞のみにおいて見いだされ、これはお
そらく異常ＮＳＰ遺伝子産物を表している（Roebroak AJ等(1993)J Biol Chem 2
68:13439-13447）。以前に報告された神経細胞が発現されるラットの遺伝子CI-1
3及び２つの部分的に配列決定されたヒトｃＤＮＡ（GI 391043及びGI 894620）
は、ＮＳＰと高度な相同性を有し、このことはＮＳＰがタンパク質のより大きな
ファミリーに属していることを示唆している（Wieczorek DF等(1991)Mol Brain
Res 10:33-41：Bell GI等(1993)Hum Mol Genet 2:1793-798：Martin-Galla A等(
1992)Nat Genet 1:34-39）。
２つの大きな疎水性領域が、ＮＳＰ及び相同なタンパク質を特徴付けており、
またこれは膜の会合を示唆している。実際、免疫蛍光法を用い
た、生化学的研究により、ＮＳＰとＥＲの膜との間の会合が確認された（Senden
NH等(1994)Eur J Cell Biol 65:341-353）。ＮＳＰ−Ａ欠失変異体の解析によ
り、カルボキシ末端の疎水性領域が、膜結合に必要であることが分かった（van
de Velde等，前出）。ＮＳＰのカルボキシ末端アミノ酸配列は高度な相同性を有
するが、ＥＲにおける膜貫通タンパク質を保持するのに十分なだけのコンセンサ
スモチーフとの完全な一致を示すわけではない（van de Velde，前出;Jackson M
R等(1993)J Cell Biol 121:317-333）。従って、ＮＳＰ及び関連タンパク質は、
保存的カルボキシ末端アミノ酸によりＥＲを標的としていると考えられる。
抗ＮＳＰ−Ａ抗体を用いた免疫染色により、ＮＳＰ−Ａが、神経細胞の粗面Ｅ
Ｒ及び滑面ＥＲの双方と会合し得ることが推定される。この証拠及び神経細胞に
おけるＥＲの機能に基づき、van de Velde等（1994;前出）は、タンパク質輸送
プロセス、又は神経細胞における細胞内カルシウム濃度の調節にＮＳＰが関与し
得ると結論した。
ＮＳＰ様タンパク質及び疾病
ＥＲ媒介神経タンパク質輸送の機能障害は、神経変性疾患の原因となり得る。
例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、運動ニューロンの変性疾患において、
神経の軸索の神経細繊維の位置が、種々のタンパク質のＥＲ媒介軸索輸送の著し
い欠損をもたらす（Collard JF等（1995）Nature 375:61-64）。タンパク質輸送
における障害は更に、ＡＬＳがスーパーオキシドジスム（ＳＯＤ）における突然
変異によってモデル化される遺伝子組換えマウスの研究によって、ＡＬＳの病因
に関与することが分かった。ＳＯＤによる変異動物は、ヒトＡＬＳの臨床的及び
病理学的特徴を示し、ＥＲの拡大に関与する軸索輸送の欠損を示した（Mourelat
os Z等(1996)Proc Natl Acad Sci 93:5472-5477）。
種々の原発性ヒト腫瘍の標本の解析により、ＮＳＰ−Ａ及びＮＳＰ−
Ｃが小細胞肺癌、肺の類癌腫においては発現されるが、非細胞内分泌非小細胞肺
癌においては発現されないことが分かった（van de Velde等(1994)Cancer Res 5
4:4769-4776）。更に、小細胞肺癌表面の抗原に対して産生される抗体は、ＮＳ
Ｐ−Ａ、ＮＳＰ−Ｂ及びＮＳＰ−Ｃを認識する。従って、ＮＳＰはヒト肺癌の診
断においてマーカーとしての役目を果たし得、矯正治療への道を開くものである
（Senden NH等（1994）Int J Cancer Supp 18:84-88）。
新たなＮＳＰ様タンパク質は、癌及びＡＬＳのような神経変性疾患の診断及び
治療の新しい手段を提供することにより、この技術分野における必要を満たし得
るものである。発明の開示
本発明は、ヒトＮＳＰ−Ａ（GI 307307）、ＮＳＰ−Ｂ（GI 307309）、ＮＳＰ
−Ｃ（GI 307311）、及びラットのCI-13（GI 281046）に対して相同性を有する
ことで特性化された、２つの新規なヒトＮＳＰ様タンパク質（以下それぞれＮＳ
ＰＬＰＡ及びＮＳＰＬＰＢと表記し、集合的にＮＳＰＬＰと表記する）を開示す
る。従って、本発明は、配列番号：１及び配列番号：３のアミノ酸配列に示すよ
うな、ＮＳＰの特性を有する、２つの実質的に精製されたＮＳＰ様タンパク質を
提供する。
本発明の一実施例は、ＮＳＰＬＰをコードする単離され、実質的に精製された
ポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例では、このポリヌクレオチドは配列
番号：２又は配列番号：４のヌクレオチド配列である。更に、本発明は、厳密な
条件の下で、配列番号：２又は配列番号：４の配列にハイブリッド形成するポリ
ヌクレオチド配列を提供する。
本発明は更に、ＮＳＰＬＰをコードする核酸配列、そのオリゴヌクレオチド、
ペプチド核酸（ＰＮＡ）、断片、一部分、又はそのアンチセンス分子、及びＮＳ
ＰＬＰをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベク
ター及び宿主細胞に関するものである。本発明はまた、ＮＳＰＬＰに特異的に結
合する抗体、実質的に精製されたＮＳＰＬＰ、その断片、又はＮＳＰＬＰのアン
タゴニストを、適切な医薬品用担体と共に含む医薬品組成物にも関連する。本発
明はまた、ＮＳＰＬＰ、その断片、又はＮＳＰＬＰのアンタゴニストの製造方法
にも関連する。図面の簡単な説明
第１Ａ図、第１Ｂ図、及び第１Ｃ図は、新規なＮＳＰ様タンパク質ＮＳＰＬＰ
Ａのアミノ酸配列（配列番号：１）及び核酸配列（配列番号：２）を示す図であ
る。配列のアライメントは、MacDNAsisソフトウエア（日立ソフトウエアエンジ
ニアリング社）を用いて作製した。
第２Ａ図、第２Ｂ図、及び第２Ｃ図は、新規なＮＳＰ様タンパク質ＮＳＰＬＰ
Ｂのアミノ酸配列（配列番号：３）及び核酸配列（配列番号：４）を示す図であ
る（MacDNAsisソフトウエア、日立ソフトウエアエンジニアリング社）。
第３Ａ図、第３Ｂ図、第３Ｃ図、第３Ｄ図、及び第３Ｅ図は、コンセンサス配
列（配列番号：４）のノーザン解析の結果を示した図である。このノーザン解析
結果は、LIFESEQ（商標）データベース（Incyte Pharmaceuticals,Palo Alto CA
）を用いて電子的に作製した。
第４Ａ図、第４Ｂ図、及び第４Ｃ図は、インサイト社クローンＮｏ．３１８７
０（配列番号：２）のノーザン解析の結果を示す図である（LIFESEQ(商標)デー
タベース、（Incyte Pharmaceuticals,Palo Alto CA））。
第５図は、コンセンサス配列（配列番号：２）の集合配列（assembly）を示す
図である。
第６Ａ図、第６Ｂ図、第６Ｃ図、第６Ｄ図、第６Ｅ図、及び第６Ｆ図は、DNAS
tarソフトウエアのmultisequence alignment program
（DNAStar Inc,Madison WI）を用いて作製した、ＮＳＰＬＰＡ（配列番号:１）
、ＮＳＰＬＰＢ（配列番号：３）、ＮＳＰ−Ａ（GI 307307；配列番号：５）、
ＮＳＰ−Ｂ（GI 307309；配列番号：６）、ＮＳＰ−Ｃ（GI 307311；配列番号：
７）及びラットのCI-13（GI 281046；配列番号：８）の間のアミノ酸配列アライ
メントを示した図である。
第７図は、ＮＳＰＬＰＡ（配列番号：１）に対する疎水性プロットグラフ（３
MacDNAsisソフトウエアを用いて作製）を示す図であり、Ｘ軸はアミノ酸の位置
を表し、Ｙ軸は負の方向に疎水性のレベルを示す（第７図、第８図、及び第９図
も）。
第８図は、ＮＳＰＬＰＢ（配列番号：３）に対する疎水性プロットグラフを示
す図である。
第９図は、ＮＳＰ−Ｃ（配列番号：７）に対する疎水性プロットグラフを示す
図である。発明の実施の形態
定義
本明細書において、「核酸配列」とは、一本鎖若しくは二本鎖の、センス鎖、
又はアンチセンス鎖であるゲノムの若しくは合成起源のＤＮＡ若しくはＲＮＡや
、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、又はポリヌクレオチド、及びその断片又
は一部分を意味する。同様に、本明細書において「アミノ酸配列」とは、ペプチ
ド若しくはタンパク質配列を意味する。
本明細書において「ペプチド核酸」とは、リジンのようなアミノ酸残基及びア
ミノ基が加えられたオリゴマーを含む分子を意味する。これらの小分子は、抗遺
伝子剤とも称され、核酸のこれらの相補的な（鋳型の）鎖に結合することにより
転写物の伸張を停止させる（Nielsen PE等(1993)Anticancer Drug Des 8:53-63
）。
本明細書で用いられるとき、ＮＳＰＬＰとは、任意の種、特にウシ、ヒツジ、
ブタ、マウス、ウマ、及び好ましくはヒトを含む哺乳類に由来する、天然の、合
成の、半合成の、又は組換え体を起源とする実質的に精製されたＮＳＰＬＰのア
ミノ酸配列を意味する。
ＮＳＰＬＰの「変異体」は、１又は２箇所以上のアミノ酸の「置換」により異
なるものとなったアミノ酸配列を有するものである。この変異体は「保存的」変
化を含むものであり得、この保存的変化においては例えばロイシンをイソロイシ
ンで置き換える場合のように置換されるアミノ酸が類似な構造的及び化学的特性
を有する。稀に、変異体が「非保存的」に変化する場合もあり、この非保存的変
化では例えばグリシンがトリプトファンで置換される。類似した小変化には、ア
ミノ酸の欠失、挿入、若しくはその両方も含まれ得る。例えばDNAStarソフトウ
エアのような従来より周知のコンピュータプログラムを用いて、生物学的或いは
免疫学的活性を損なわずに、置換、挿入、又は除去できるアミノ酸及びそのアミ
ノ酸の数を決定することができる。
本明細書において「欠失」とは、１または２以上のヌクレオチド若しくはアミ
ノ酸残基が欠ける、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列における変化として定
義される。
本明細書において「挿入」或いは「付加」とは、自然発生のＮＳＰＬＰと比較
して、結果的に１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ酸残基の加わるよう
なヌクレオチド配列或いはアミノ酸配列の変化を指す。
本明細書において「置換」とは、１または２以上のヌクレオチド或いはアミノ
酸を異なるヌクレオチド或いはアミノ酸に置換することによって生ずる変化を指
す。
用語「生物学的に活性」とは、自然発生のＮＳＰＬＰの構造的機能、調節機能
、又は生化学的機能を有するＮＳＰＬＰを意味する。同様に「免
疫学的活性」とは、天然の、組換えの、又は合成のＮＳＰＬＰ、若しくはその任
意のオリゴペプチドが適当な動物や細胞における特定の免疫応答を誘発し、特定
の抗体に結合する能力として定義される。
本明細書において、「誘導体」なる用語は、化学的に修飾されたＮＳＰＬＰを
コードする核酸、又はコードされたＮＳＰＬＰを意味する。このような修飾の例
には、水素からアルキル基、アシル基、又はアミノ基への置換がある。核酸誘導
体は、天然ＮＳＰＬＰの必須の生物学的特性を保持しているポリペプチドをコー
ドする。
本明細書において、「実質的に精製」なる用語は、この天然の環境から取り除
かれ、天然にはそれが結合して存在する少なくとも１つの他の成分から単離又は
分離されて、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは
少なくとも９０％遊離した核酸配列又はアミノ酸配列を有する分子を意味する。
「厳密性（stringency）」とは、典型的には、概ね（Ｔｍ−５）℃（プローブ
のＴｍより５℃下）からＴｍの約２０〜２５℃下の範囲で発生する。当業者には
理解できるように、厳密性のあるハイブリダイゼーションでは、同一のポリヌク
レオチド配列を同定、つまり検出したり、或いは類似の、すなわち近縁なポリヌ
クレオチド配列を同定、つまり検出するために用いることができる。
本明細書において、用語「ハイブリダイゼーション（ハイブリッド形成）」は
「核酸の鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合する過程」（Coombs J（1994）Dict ionary of Biotechnology
,Stockton Press社,New York）を含む概念である。増
幅とは、核酸配列の複製を作り出すこととして定義され、通常周知のポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法により実行される（Dieffenbach CW and GS Dveksler(1
995),PCR Primer,a Laboratory Mnual,Cold Spring Harbor Press社,New york）
。
好適な実施例
本発明は、新規なＮＳＰＬＰ及び疾病の研究、診断、予防、及び治療における
その核酸及びアミノ酸配列の利用に関するものである。ＮＳＰＬＰの一部分をコ
ードするｃＤＮＡは、神経及び内分泌組織由来ｃＤＮＡライブラリーや、多くの
タイプの脛瘍を含む他の種々の組織（第３Ａ図〜第３Ｅ図、及び第４Ａ図〜第４
Ｃ図参照）において見いだされた。
本発明はまたＮＳＰＬＰ変異体もその範囲に含む。好適なＮＳＰＬＰ変異体は
、ＮＳＰＬＰアミノ酸配列（配列番号：１）と少なくとも８０％のアミノ酸配列
類似性を有するものであり、より好適なＮＳＰＬＰ変異体は、配列番号：１と少
なくとも９０％のアミノ酸配列類似性を有するものであり、最も好適なＮＳＰＬ
Ｐ変異体は、配列番号：１と少なくとも９５％のアミノ酸配列類似性を有するも
のである。
本発明の、ヒトＮＳＰＬＰをコードする核酸は、ｃＤＮＡインサイト社クロー
ンＮｏ．３１８７Ｏ（配列番号：４；THP-1細胞ｃＤＮＡライブラリーTHP1NOB01
）及び２８７４２（配列番号：９；胎児脾臓ｃＤＮＡライブラリーSPLNFET01）
において、アミノ酸配列アライメントのコンピュータ検索によって初めに同定さ
れた。コンセンサス配列（配列番号：２）は、以下の重複核酸配列を起源とする
。即ち、インサイト社クローンＮｏ．２８７４２（ｃＤＮＡライブラリーSPLNFE
T01に由来）；４５０２２、４５０７４、及び４５５０９（CORNNOT01）；１２１
５８１（MUSCNOT01）；５７０１２２（MMLR3DT01）；及び７５４１５０（BRATUT
02；第５図）である。配列番号：２の核酸配列は、ＮＳＰＬＰＡアミノ酸配列（
配列番号：１）をコードする。配列番号：４の核酸配列は、ＮＳＰＬＰＢアミノ
酸配列（配列番号：３）をコードする。残基Ｃ496乃至Ｔ708からの配列番号：４
の核酸配列は、クローンhbc043の部分的ｃＤＮＡ配列と９７％の同一性を有する
（GI
39104；Bell等，前出）。
本発明は、ＮＳＰＬＰＡ、ＮＳＰＬＰＢ、ＮＳＰ−Ａ（GI 30730；Roebroak等
，前出）、ＮＳＰ−Ｂ（GI 307309；Roebroak等，前出）、ＮＳＰ−Ｃ（GI 3073
11；Roebroak等，前出）、及びラツトのCI-13（GI 281046；Wieczorek等，前出
；第６Ａ図〜第６Ｄ図）の間の化学的及び構造的相同性にその部分的な基礎を有
する。ＮＳＰＬＰＡとＮＳＰ−Ｃとは、６６％の同一性を共有しており、ＮＳＰ
ＬＰＢとＮＳＰ−Ｃとは４８％の同一性を共有しており、ＮＳＰＬＰＡとＮＳＰ
ＬＰＢとは５０％の同一性を共有している。第７図、第８図、及び第９図に示す
ように、ＮＳＰＬＰＡ、ＮＳＰＬＰＢ、及びＮＳＰ−Ｃは、類似な疎水性プロッ
トを有しており、このことは類似の構造であることを示唆している。ＮＳＰＬＰ
Ａ及びＮＳＰＬＰＢは、ＮＳＰのように膜付着のために使用され得る２つの大き
な疎水性領域を有している。ＮＳＰＬＰＡのカルボキシ末端の１９５番目のLys
から１９７番目のLysは、その位置とともに配列が、Jackson等（1993;前出）に
よって定義されたＥＲ保持モチーフと正確に一致している。この新規なＮＳＰＬ
ＰＡは、１９９個のアミノ酸からなる長さを有し、１つの潜在性Ｎグリコシル化
部位を有する。新規なＮＳＰＬＰＢは２４１個のアミノ酸からなる長さを有する
。
ＮＳＰＬＰコーディング配列
ＮＳＰＬＰの核酸及び推定アミノ酸配列は、第１Ａ図、第１Ｂ図、第１Ｃ図、
第２Ａ図、第２Ｂ図、及び第２Ｃ図に示されている。本発明によれば、ＮＳＰＬ
Ｐのアミノ酸配列をコードする任意の核酸配列を用いて、ＮＳＰＬＰを発現する
組換え体分子を作り出すことができる。ここに開示する特定の実施例では、ＮＳ
ＰＬＰの一部分をコードするヌクレオチド配列は、THP-1細胞ｃＤＮＡライブラ
リー（THP1NOB01）から
インサイト社クローンＮｏ．３１８７０として初めに単離された。また、インサ
イト社クローンＮｏ．２８７４２は、胎児の脾臓ｃＤＮＡライブラリー（SPLNFE
T01）から初めに単離された。
遺伝暗号の縮重の結果、既知の又は自然発生の遺伝子のヌクレオチド配列に対
して最小限の相同性しか有していないものも含まれる多数のＮＳＰＬＰコード化
ヌクレオチド配列が作り出され得る、ということは当業者には明らかであろう。
本発明は、特に、可能なコドン選択に基づく組み合わせの選択によりなされ得る
全ての可能な核酸配列の変化をその範囲に含んでいる。それらの組み合わせは、
自然発生のＮＳＰＬＰのヌクレオチド配列に当てはまる標準的なトリプレット遺
伝暗号に基づいて作り出されるものであり、このような全ての変異は、ここに具
体的に示されたものと考えられたい。
ＮＳＰＬＰ及びその変異体をコードするヌクレオチド配列は適切に選択された
厳密性の条件の下で、自然発生配列のヌクレオチド配列とハイブリッド形成可能
なものであるのが好ましいが、概ね異なるコドン使用を有するＮＳＰＬＰ又はそ
の変異体をコードするヌクレオチド配列を作り出すことは有益であり得る。コド
ン選択は、特定のコドンが宿主によって使用される頻度に従って、特定の原核細
胞の、或いは真核細胞の発現宿主においてペプチドが発現する速度を高めるよう
に選択され得る。ＮＳＰＬＰ及びその誘導体をコードするヌクレオチド配列を、
コードされるアミノ酸配列を変更することなく実質的に変更する理由は、例えば
天然配列から作り出される転写物よりより長い半減期のようなより望ましい特性
を有するＲＮＡ転写物の産生のためである。
現在では、ＮＳＰＬＰ又はその誘導体をコードするＤＮＡ配列、若しくはその
一部分を、完全に合成ケミストリにより作製して、その後、その合成遺伝子を任
意の入手可能なＤＮＡベクター及び細胞系に、この出
願時点において周知の試薬を用いて挿入することができる。更に、合成ケミスト
リを用いてＮＳＰＬＰをコードする配列又はその任意の部分に突然変異を誘発さ
せることができる。
また本発明の範囲に含まれるものとして、種々の厳密性の条件の下で、第１Ａ
図、第１Ｂ図、第１Ｃ図、第２Ａ図、第２Ｂ図、及び第２Ｃ図のヌクレオチド配
列とハイブリッド形成可能なポリヌクレオチド配列がある。ハイブリダイゼーシ
ョン条件は、Berger及びKimmel(1987,Guide to Molecular Cloning Tehniques M ethods in Enzymology
,Vol 152,Academic Press,San Diego CA）に記載されてい
るように、核酸結合複合体またはプローブの融点（Ｔｍ）に基づいており、定義
された「厳密性」で用いられる基準を与える。上記文献は本明細書と一体に引用
されたものである。
本発明において用いられ得るＮＳＰＬＰをコードする変異核酸配列は、異なる
ヌクレオチド残基の欠失、挿入並びに置換を含み、結果的に同一の、または機能
的に等価のＮＳＰＬＰポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとなるもので
ある。そのタンパク質も、サイレント変化を生ずるアミノ酸残基の欠失、挿入並
びに置換を含み、結果的に機能的に等価なＮＳＰＬＰとなる。慎重なアミノ酸置
換は、ＮＳＰＬＰの生物学的活性が保持される限りにおいて、残基の極性、電荷
、溶解度、疎水性、親水性並びにまた両親媒性についての類似性に基づいてなさ
れ得る。例えば負に荷電したアミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸が含
まれ、正に荷電したアミノ酸にはリジン及びアルギニンが含まれ、同じ親水値を
持つ荷電していない極性頭基を有するアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、
バリン、グリシン、アラニン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン
、フェニルアラニン並びにチロシンが含まれる。
本発明の範囲に含まれるものとして、ＮＳＰＬＰのアレルがある。こ
こで用いる「アレル」或いは「アレル配列」とは、ＮＳＰＬＰの別形態である。
アレルは変異、すなわち核酸配列の変化によって生じ、一般に変化したｍＲＮＡ
或いはポリペプチドを生成するが、そのｍＲＮＡ或いはポリペプチドの構造或い
は機能は変更される場合もあれば、されない場合もある。遺伝子によっては、ア
レル形態が存在しないもの、１つ存在するもの、或いは多数存在するものがある
。アレルを生じる変異は一般に、アミノ酸の自然な欠失、付加並びに置換に起因
する。このタイプの変化はそれぞれ単独で、或いは他の遺伝子の組み合わせて、
与えられた配列内の１又は２以上の位置で生じ得る。
ＤＮＡ配列決定のための方法は周知であり、例えばＤＮＡポリメラーゼＩ，Se
quenase（商標）のクラノウフラグメント（US Biochemical社,Cleveland OH）、
Ｔａｑポリメラーゼ（Perkin Elmer社,Norwalk CT）、熱安定性Ｔ７ポリメラー
ゼ（Amersham社,Chicago IL）、或いはGlbco BRL（Gaithersburg MD）Methods社
から市販されているELONGASE増幅システムのような組換えポリメラーゼとプルー
フリーディングエキソヌクレアーゼとの組み合わせのような酵素を使用する。好
ましくは、この処理は、Hamilton Micro Lab2200(Hamilton社,Reno NV)、Peltie
r Thermal Cycler（PTC200；MJ Reserch社,Watertown MA）並びにABI377DNAシー
ケンサ（Perkin Elmer社）のような装置を用いて自動化される。
ボリヌクレオチド配列の延長
ＮＳＰＬＰをコードするポリヌクレオチド配列は、部分的なヌクレオチド配列
と、プロモータ及び調節エレメントのような上流配列を検出するための当業者に
は周知の様々な方法とを用いて延長することができる。Gobinda等（1993;PCR Me
thods Applic 2:318-22）は既知の部位に隣接する未知の配列を検索するために
汎用プライマーを用いる直接的な方
法として「制限部位」ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法を開示している。ここ
では、まずゲノムＤＮＡが、既知の領域に対して特異的なプライマー及びリンカ
ー配列に対するプライマーの存在下で増幅される。増幅された配列は、その同じ
リンカープライマー及び最初のプライマーの内部に含まれる別の特異的プライマ
ーを用いてＰＣＲの２巡目にかけられる。ＰＣＲの各回の生成物は、適切なＲＮ
Ａポリメラーゼを用いて転写され、逆転写酵素を用いて配列決定される。
逆ＰＣＲ法を用いて、既知領域に基づく多様なプライマーを利用した配列の増
幅、または延長を行うことができる（Triglia等（1988）Nucleic Acids Res 16:
8186）。プライマーは、OLIGO（登録商標）4.06(National Biosciences社,Plymo
uth MN)或いは別の適切なプログラムを用いて設計され、長さが２０〜３０ヌク
レオチドで、５０％以上のＧＣ含有率を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的
配列にアニールする。この方法ではいくつかの制限酵素を用いて、遺伝子の既知
領域の適当なフラグメントを生成する。次いでこのフラグメントは分子内ライゲ
ーションにより環状にされ、ＰＣＲ用の鋳型として使用される。
キャプチャＰＣＲ法（Lagerstrom M等（1991）PCR Methods Applic 1:111-19
）は、ヒト及び酵母菌人工染色体（ＹＡＣ）ＤＮＡ内の既知の配列に隣接するＤ
ＮＡフラグメントのＰＣＲ増幅を行うための方法である。またキャプチャＰＣＲ
では、多重制限酵素消化及びライゲーションによってＰＣＲ前にＤＮＡ分子の未
知の部分に、組換え二本鎖配列を配置する必要がある。
未知の配列を検索するために用いることができる別の方法は、標的遺伝子歩行
のための方法である歩行ＰＣＲ法（Parker JD等1991;Nucleic Acids Res 19:305
5-60）である。更に、PromoterFinder（登録商標）なる、Clontech社（Palo Alt
o CA）から市販されている新しいキットでは、
ＰＣＲ、入れ子プライマー並びにPromoterFinderのライブラリーを用いて、ゲノ
ムＤＮＡ内を歩行させることができる。この過程は、ライブラリーをスクリーニ
ングする必要がなく、イントロン／エクソン接合部を探し出すのに有用である。
完全長ｃＤＮＡをスクリーニングするための好適なライブラリーは、サイズ選
択された、より大きなｃＤＮＡを含むライブラリーである。またランダムプライ
ムされた（rondom primed）ライブラリーは、遺伝子の５’及び上流領域を含む
より多くの配列を含むという点で好適である。ランダムプライムされたライブラ
リーは、オリゴｄ（Ｔ）ライブラリーが完全長ｃＤＮＡを生成しない場合、特に
有用である。またゲノムライブラリーは、プロモータ結合領域の５’まで延長す
るために有用である。
サイズを分析したり、或いは配列決定やＰＣＲ処理の産物のヌクレオチド配列
を確認するための新しい方法はキャピラリー電気泳動法である。迅速な配列決定
のためのシステムは、Perkin elmer社、Beckman Instruments社（Fullerton CA
）並びに他の企業から入手できる・キャピラリー電気泳動法では、電気泳動分離
のための流動性ポリマー、レーザで活性化される４つの異なる蛍光色素(各ヌク
レオチドに対して１つ)を使用し、ＣＣＤカメラにより放射線の波長の検出を行
う。出力／光強度は適切なソフトウエア（例えばPerkin elmer社製のGenotyper
（登録商標）及びSequence Navigator（登録商標））を用いて電気信号に変換さ
れ、サンプルの負荷からコンピュータ解析及び電子データ表示までの全過程がコ
ンピュータ制御される。キャピラリー電気泳動法は特定のサンプルの限定された
量の中に存在するＤＮＡの小片の配列決定に特に適している。この方法により３
０分間でＭ１３ファージＤＮＡの３５０ｂｐを再現可能な形で配列決定できたこ
とが報告されている（Ruiz-Martinez MC等（1993）Anal Chem 65:2851-8）。
ヌクレオチド配列の発現
本発明に従って、ＮＳＰＬＰ、そのポリペプチドの断片、融合タンパク質或い
はその機能的等価物をコードするポリヌクレオチド配列を、適切な宿主細胞内で
のＮＳＰＬＰの発現を誘導する組換えＤＮＡ分子を生成するために用いることが
できる。遺伝暗号固有の縮重のために、概ね同一か或いは機能的に等価なアミノ
酸配列をコードする他のＤＮＡ配列も、ＮＳＰＬＰのクローニングや発現のため
に用いることができる。当業者には理解できるように、非自然発生コドンを有す
るＮＳＰＬＰコード化ヌクレオチド配列を生成することは有益であり得る。特定
の原核細胞或いは真核細胞の宿主において好適なコドン（Murray E等（1989）;N
ucleic Acids Res 17:477-508）を選択して、例えば、ＮＳＰＬＰ発現率を増大
させたり、或いは自然発生配列から生成された転写産物より長い半減期のような
望ましい特性を有する組換えＲＮＡ転写産物を生成することができる。
本発明のヌクレオチド配列は、様々な目的でＮＳＰＬＰコード配列を変更する
ために組換えられ得るが、このような変更には、限定はしないが遺伝子生成物の
クローニング、プロセシング並びにまた発現を修飾するための変更が含まれる。
例えば、特定部位突然変異誘発のような当業者には周知の技術を用いて突然変異
を誘発させることによって、新しい制限部位の挿入、グリコシル化パターンの変
更、コドン選好の変化等をもたらすことができる。
本発明の別の実施例では、天然ＮＳＰＬＰコーディング配列、修飾ＮＳＰＬＰ
コーディング配列或いは組換えＮＳＰＬＰコーディング配列を異種の配列に結合
して、融合タンパク質をコードする配列にする。例えば、ＮＳＰＬＰ活性のイン
ヒビターを選別すべくペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販
の抗体により認識される異種のペプ
チドを発現するキメラＮＳＰＬＰタンパク質をコード化することが役立ち得る。
融合タンパク質はＮＳＰＬＰ配列と異種のタンパク質配列との間の位置に切断部
位を包含するように設計することもでき、これによってＮＳＰＬＰを切断して、
異種の部分から分けて実質的に精製することが可能となる。
本発明の別の実施例では、ＮＳＰＬＰコーディング配列は、当業者によく知ら
れた化学的方法(Caruthers等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser 7:215-223、Crea,H
orn（1980）Nuc Acids Res 9:2331、Matteucci,Caruthers（1980）Tetrahedron
Lett 21:719、Chow,Kempe（1981）Nuc Acids Res 9:2807-2817参照)を用いて、
全体的に、或いは部分的に合成することができる。別法では、ＮＳＰＬＰアミノ
酸配列を、全体的に或いは部分的に合成する化学的方法を用いてタンパク質自体
を生成することができる。例えば、種々の固相技術（Roberge JY等(1995)Scienc
e 269:202-204）でペプチド合成を行うことができ、合成の自動化は、例えばABI
431Aペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer）を製造者の指示に従って用いること
により達成することができる。
この新たに合成されたペプチドは、分離用高速液体クロマトグラフィにより精
製することができる（例えばCreighton（1983）ProteinsStructure And Molecul ar Principles
,WH Freeman and Co,New York参照）。合成されたペプチドの組成
は、アミノ酸解析或いはシークエンシングにより確認することができる（例えば
the Edman degradation procedure;Creighton，上述）。さらにＮＳＰＬＰのア
ミノ酸配列、或いはその任意の部分を、その直接の合成の際に改変したり、また
他の細胞内メディエータ或いはその任意の部分に由来する配列と化学的方法を用
いて結合して、変異体ポリペプチドを生成することができる。
発現系
生物学的に活性のＮＳＰＬＰを発現するために、ＮＳＰＬＰコーディングヌク
レオチド配列或いは機能的等価物は、適切な発現ベクター、すなわち挿入された
コード化配列の転写及び翻訳に必要不可欠な要素を含むベクターに挿入される。
ＮＳＰＬＰコーディング配列及び適切な転写や翻訳の制御エレメントを含む発
現ベクターを構成するために当業者に周知の方法が用いられる。これらの方法に
は、in vitro組換えＤＮＡ技術、合成技術、並びにin vivo組換え、即ち遺伝子
組換え技術が含まれる。このような技術は、Sambrook等（1989）Molecular Clon ing,A Laboratory Manual
,Cold Spring Harbor Press,Planview NY及びAusubel
FM等Current Protocol in Molecular Biology,John Wilky & Sons,New Yorkに記
載されている。
種々の発現ベクター／宿主系を、ＮＳＰＬＰコード化配列を保持し、かつ発現
するために利用することができる。このようなものには、限定はされないが、組
換えバクテリオファージ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質
転換した細菌、酵母菌発現ベクターで形質転換した酵母菌、ウイルス発現ベクタ
ー（例えばバキュロウイルス）を感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター
（例えばカリフラワーモザイクウイルスCaMV、タバコモザイクウイルスTMV）を
トランスフェクトした、或いはバクテリア発現ベクター（例えばTi、或いはpBR3
22プラスミド）で形質転換した植物細胞系、或いは動物細胞系が含まれる。
これらの系の「制御エレメント」或いは「調節配列」は、その力及び特異性は
様々で、ベクターの非翻訳領域、エンハンサー、プロモータ及び３’非翻訳領域
であり、これらは転写及び翻訳を実行するために宿主細胞のタンパク質と相互作
用する。利用されるベクター及び宿主に応じて、構成的及び誘導性プロモータを
含む任意の数の適切な転写及び翻訳
エレメントが用いられ得る。例えば、バクテリア系においてクローニングする際
には、Bluescript（登録商標）ファージミド（Stratagene社，LaJolla CA）のハ
イブリッドlacZプロモータ及びptrp-lacハイブリッド並びに同様の誘導性プロモ
ータが用いられる。バキュロウイルスポリヘドリンプロモータは昆虫細胞におい
て用いられる。植物細胞のゲノム（例えば熱ショック,RUBISCO及びストレージタ
ンパク質遺伝子）に由来する、或いは植物ウイルス（例えばウイルス性プロモー
タ或いはリーダー配列）に由来するプロモータ或いはエンハンサはベクターにク
ローン化され得る。哺乳動物細胞では、哺乳動物遺伝子或いは哺乳動物ウイルス
由来のプロモータが最適である。ＮＳＰＬＰの多数の複製を含む株細胞を生成す
る必要がある場合には、SV40或いはEBVに基づくベクターを、適切な選択マーカ
ーと共に用いる。
細菌系では、ＮＳＰＬＰの発現の用途に応じて多数の発現ベクターが選択され
得る。例えば抗体を誘発するために大量のＮＳＰＬＰが必要とされる場合は、容
易に精製される融合タンパク質を高濃度で発現できるベクターが望まれる。その
ようなベクターには、限定はしないが、大腸菌クローニングベクター及び発現ベ
クターBluescript（Stratagene社）（このベクターでは、ＮＳＰＬＰコード化配
列が、アミノ基末端メチオニン及び後続のβ−ガラクトシダーゼの７残基の配列
を備えたフレーム内においてベクターに結合されてハイブリッドタンパク質が生
成される）や、pINベクター（Van Heeke & Schuster（1989）J Biol Chem 264:5
503-5509）等が含まれる。またpGEXベクター（Promage社、Madison WI）も、グ
ルタチオンＳ−トランスファーゼ（GST）を有する融合タンパク質として異種ポ
リペプチドを発現するため用いられる。一般に、そのような融合タンパク質は可
溶性であり、グルタチオンアガロースビーズへの吸着に続き、遊離グルタチオン
の存在下における溶出に
より溶解した細胞から容易に精製できる。その系において生成されたタンパク質
はヘパリン、トロンビン或いはＸＡ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計
され、対象となるクローン化ポリペプチドは随意にGST部分から放出され得る。
酵母菌、サッカロミセスセレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）では、α因
子、アルコールオキシダーゼ及びPGHのような構成的或いは誘導性プロモータを
含む多数のベクターが用いられる。再検討する場合には、Ausubel等（前出）及
びGrant等（1987）Methods Enzymol 153:516-544を参照されたい。
植物発現ベクターを用いる場合には、ＮＳＰＬＰをコードする配列の発現は、
多数の任意のプロモータにより促進される。例えばCaMVの35S及び19Sプロモータ
（Brisson等（1984）Nature 310:511-514）のようなウイルス性プロモータは、
単独で、或いはTMV（Takamatsu等（1987）EMBO J 6:307-311）からのオメガーリ
ーダー配列と共に用いられる。別法では、RUBISCO(Coruzzi等(1984)EMBO J 3:16
71-1680)、Broglie等（1984）Science 224:838-843）の小サブユニット、或いは
熱ショックプロモータ（Winter J及びSinibaldi RM(1991)Results Probl Cell D
iffer 17:85-105）のような植物プロモータが用いられる。これらの構成は直接
ＤＮＡ形質転換或いは病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞内に導入
される。そのような技術を再検討する場合には、Hobbs S 及びMurry LE、McGraw
Hill Yearbook of Science and Technolgy（1992）McGraw Hill NY,pp191-196
及びWeissbach and Weissbach（1988）Methods for Plant Molecular Biology,A
cademic Press NY,pp421-463を参照されたい。
ＮＳＰＬＰを発現するために用いることができる別の発現系は昆虫系である。
そのような系の一つでは、Autographa californica核多角体病
ウイルス（AcNPV）がベクターとして用いられ、Spodoptera frugiperda細胞或い
はTrichoplusiaの幼虫において外来遺伝子を発現する。ＮＳＰＬＰコード化配列
は、ポリヘドリン遺伝子のような、ウイルスの非必須領域にクローニングされ、
ポリヘドリンプロモータの制御下に置かれる。ＮＳＰＬＰの挿入が成功した場合
には、ポリヘドリン遺伝子が不活性にされ、コートタンパク質膜が欠如した変異
体ウイルスが生成される。次いで、この変異体ウイルスは、S.frugiperda細胞或
いはTrichoplusiaの幼虫への感染させるために用いられ、その中でＮＳＰＬＰが
発現される（Smith等（1983）J Virol 46:584、Engelhard EK等（1994）Proc Na
t Acad Sci 91:3224-7）。
哺乳類宿主細胞では、多数のウイルス性発現系を利用することができる。発現
ベクターとしてアデノウイルスが用いられる場合には、ＮＳＰＬＰのコード化配
列は、後期プロモータ及び三連リーダ配列からなるアデノウイルス転写物／翻訳
物複合体内に結合される。ウイルス性ゲノムの非必須領域への挿入により、感染
した宿主細胞でＮＳＰＬＰを発現することができる生存可能なウイルスになる（
Logan及びShenk（1984）Proc Nat Acad Sci 81:3655-3659）。さらにラウス肉腫
ウイルス（RSV）エンハンサのような転写エンハンサを哺乳類宿主細胞内の発現
を増加させるために用いることができる。
また、ＮＳＰＬＰ配列の効率的な翻訳のためには、特定の開始シグナルも必要
である。これらのシグナルには、ATG開始コドン及び隣接の配列が含まれる。Ｎ
ＳＰＬＰ及びその開始コドン及び上流配列が適切な発現ベクター内に挿入される
場合には、追加の翻訳制御シグナルは不要である。しかしながらコード化配列、
或いはその一部のみが挿入される場合には、ATG開始コドンを含む外来の翻訳制
御シグナルが与えられなければならない。さらに、開始コドンは正しい読み枠内
にある必要があり、
全インサートの転写を確実に行わなければならない。外来転写エレメント及び開
始コドンは、自然及び合成両方の様々な起源に由来するものであり得る。発現の
効果は、その細胞系に適切なエンハンサを含めることにより強化される(Scharf
等(1994)Results Probl Cell Differ 20:125-62、Bitter等（1987）Methods Enz
ymol 153:516-544)。
さらに宿主細胞株は、挿入された配列を望ましい形に改変したり、発現したタ
ンパク質のプロセシングを行う能力で選択される。このようなポリペプチドの修
飾は、限定はしないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化
、脂質化（lipidation）並びにアシル化を含む。またタンパク質の「プレプロ」
形態を切り離す、翻訳後プロセシングは、正しい挿入、折り畳み、並びにまた機
能の発揮のために重要である。CHO,HeLa,MDCK,293,WI38等のような異なる宿主細
胞は、そのような翻訳後活性のための特定の細胞機構及び特徴的な機構を有して
おり、導入される外来タンパク質の修飾やプロセシングを確実に実行するべく選
択される。
長期間にわたって高収率の変異体タンパク質の生産を確保するためには、安定
した発現が望ましい。例えばＮＳＰＬＰを安定的に発現する株細胞は、ウイルス
由来の複製物、或いは内在性発現エレメント及び選択マーカー遺伝子を含む発現
ベクターを用いて形質転換される。ベクターの導入に続いて、細胞は、選択培地
に切り替えられる前に、濃縮培地内で１〜２日間成長させられる。選択マーカー
は選択物への耐性を与え、導入された配列をＤＮＡ内に安定的に結合する細胞を
同定できるようにする。安定的に形質転換された細胞の耐性凝集塊はその細胞型
に適切な組織培養技術を用いて増殖することができる。
形質転換された株細胞を回収するために任意の数の選択系を用いることができ
る。限定はしないが、選択系は単純ヘルペスウイルスチミジン
キナーゼ（Wigler等（1977）Cell 11:223-32）及びアデニン ホスホリボシルト
ランスフェラーゼ（Lowy等（1980）Cell 22:817-23）遺伝子を含み、それぞれtk
-及びaprt-細胞において用いられる。また代謝拮抗物質、抗生物質或いは除草剤
への耐性を選択の基礎として用いることができる。例えばdhfrはメトトレキセー
トに対する耐性を与え（Wigler等(1980)Natl Acad Sci 77:3567）、nptはアミノ
グリコシッド剤、ネオマイシン及びG-418に対する耐性を与え（Colberre-Garapi
n等（1981）J Mol Biol 150:1）、als或いはpatはクロルスルフロン（chlorsulf
uron）、フォスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（phosphinotricina
cetyltransferase）に対する耐性を与える（上記Murry）。さらに選択可能な遺
伝子として、例えば細胞がトリプトファンの代わりにインドールを利用できるよ
うにするtrpB、細胞がヒスチジンの代わりにヒスチノール（histinol）を利用で
きるようにするhisDが記載されている（Hartman及びMulligan（1988）Proc Nalt
Acad Sci 85:8047）。最近になって、形質転換体を同定するためばかりではな
く、特定ベクター系による一過性の或いは安定なタンパク質発現の量を定量する
ために広く用いられるβ−グルクロニダーゼ、アントシアニン及びルシフェリン
のような標識による可視標識が非常によく用いられるようになった（Rhodes CA
等（1995）Methods Mol Biol 55:121-131）。
本発明のポリヌクレオチド配列を含む形質転換体の同定
マーカー遺伝子発現の存在／不存在は、対象の遺伝子も存在することを示唆す
るが、その存在及び発現は確認されるべきである。例えばＮＳＰＬＰがマーカー
遺伝子配列内に挿入されるなら、ＮＳＰＬＰを含む組換え細胞がマーカー遺伝子
の機能の存在により同定できる。別法ではマーカー遺伝子は、単一プロモータの
制御下でＮＳＰＬＰ配列と直列に配置することができる。誘導または選択に応じ
てのマーカー遺伝子の発現
は、通常さらにＮＳＰＬＰの発現をも示す。
この他、ＮＳＰＬＰのコーディング配列を含み、さらにＮＳＰＬＰを発現する
宿主細胞が、当業者には周知の様々な手順により同定できる。これらの手順は、
限定はしないが、ＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション
及び、核酸及びタンパク質の検出並びにまた定量するための膜、溶液或いは破片
ベースの技術を含むタンパク質バイオアッセイ或いはイムノアッセイを含む。
ＮＳＰＬＰポリヌクレオチド配列の存在は、ＮＳＰＬＰのプローブ、一部、或
いはフラグメントを用いるＤＮＡ−ＤＮＡ或いはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼ
ーション或いは、増幅により検出することができる。核酸増幅に基づくアッセイ
では、ＮＳＰＬＰ配列に基づくオリゴヌクレオチド或いはオリゴマーを使用し、
ＮＳＰＬＰのＤＮＡ或いはＲＮＡを含む形質転換体を検出する。本明細書におい
て「オリゴヌクレオチド」或いは「オリゴマー」とは、プローブ或いは、ＰＣＲ
で増幅されるセグメントであるアンプリマーとして用いることができる、少なく
とも１０ヌクレオチド、多い場合には６０ヌクレオチド、好適には１５〜３０ヌ
クレオチド、より好適には２０〜２５ヌクレオチドの核酸配列を指す。
目的タンパク質に特異的なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体のいず
れかを用いてＮＳＰＬＰポリペプチドの発現を検出し、測定するための種々のプ
ロトコルが当業者には周知である。このようなプロトコルの例としては、酵素結
合免疫検定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）及び蛍光表示式
細胞分取器法（ＦＡＣＳ）を含む。ＮＳＰＬＰポリペプチド上で２つの非干渉な
エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用する二部位モノクローナ
ルベースイムノアッセイ（two-site,monoclonal-based immunoassay）は好適で
はあるが、競合的結合アッセイも用いられる。これらアッセイの並びに他のアッ
セ
イは、Hampton R等(1990,Serologivcal Methods,a Laboratory Manual,APS Pres
s,St Paul MN)及びMaddox DE等(1983,I Exp Med 158:1211)等に記載されている
。
さらに多くの標識及び結合技術は当業者には周知であり、種々の核酸及びアミ
ノ酸検査法において用いることができる。ＮＳＰＬＰに関連する配列を検出する
ための標識されたハイブリダイゼーション或いはＰＣＲプローブを生成するため
の手段には、オリゴ標識化、ニックトランスレーション法、末端標識化或いは標
識化ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅などがある。別法では、ＮＳＰＬＰ配列、
或いはその任意の部分が、ｍＲＮＡプローブの生成のためにベクターにクローニ
ングされる。そのようなベクターは当分野では周知であり、市販されており、Ｔ
７，Ｔ３或いはＳＰ６並びに標識されたヌクレオチドのような適切なＲＮＡポリ
メラーゼの付加により、in vitroでのＲＮＡプローブ合成のために用いることが
できる。
Pharmacia Biotech社（Piscataway NJ）、Promega社（Madison WI）並びにUS
Biochemical社（Cleveland OH）のようないくつかの企業がこれらの手順に対す
る商用のキット及びプロトコルを提供している。適切なリポーター分子、すなわ
ち標識には、放射性核種、酵素、蛍光性剤、化学ルミネセンス剤或いは色素生成
剤や、基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子或いはそれに類似のものが含ま
れる。そのような標識の使用について記載している特許には、米国特許第3,817,
837号、第3,850,752号、第3,939,350号、第3,996,345号、第4,277,437号、第4,2
75,149号並びに第4,336,241号がある。また、組換え免疫グロブリンの製造につ
いては米国特許第4,816,567号に記載の方法を用いることができ、本明細書とと
もに参照されたい。
ＮＳＰＬＰの精製
ＮＳＰＬＰをコードするヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞は、細胞
培地からコード化タンパク質を発現及び回収するために適切な条件下で培養され
る。組換え細胞により生成されるタンパク質は、用いられる配列並びにまたベク
ターに応じて、細胞内に分泌、つまり含有されるようにすることができる。当業
者には理解されるように、ＮＳＰＬＰをコードするポリヌクレオチドを含む発現
ベクターは、原核細胞か、真核細胞の細胞膜を通してのＮＳＰＬＰの分泌を誘導
するシグナル配列を含むように設計される。他の組換え体作製物では、ＮＳＰＬ
Ｐを、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードする
ヌクレオチド配列に結合することができる（Kroll DJ等（1993）DNA Cell Biol
12:441-53、融合タンパク質を含むベクターに関する上記論議も参照されたい）
。
またＮＳＰＬＰは、タンパク質精製を容易にするために加えられた１または２
以上の付加的なポリペプチドドメインを備えた組換えタンパク質として発現され
る。そのような精製を容易にするドメインには、限定はしないが、固定化金属上
での精製を可能にするヒスチジントリプトファンモジュールのような金属キレー
トペプチド（Porath J（1992）Protain Expr Purif 3:263-281）、固定化免疫グ
ロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、並びにＦＬＡＧＳ延長
／アフィニティ精製システムにおいて用いられるドメイン（Immunex社、Seattle
WA）が含まれる。精製ドメイン及びＮＳＰＬＰ間に第ＸＡ因子或いはエンテロ
キナーゼ（Invitrogen,San Diego CA）のような切断可能なリンカー配列を含め
るのは精製を促進するのに役立つ。このような発現ベクターの１つは、ＮＳＰＬ
Ｐを含む融合タンパク質の発現を提供し、かつ６個のヒシチジン残基、それに続
くチオレドキシン及びエンテロキナーゼ切断部位をコードする核酸を含む。ヒシ
チジン残基によりＩＭＩＡＣ（固
定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、Porathら（1992）Protein
Expression and Purification 3:263-281に記載）上での精製を促進すると共に
エンテロキナーゼ切断部位は、融合タンパク質からの目的タンパク質の精製のた
めの手段となる。
組換え体の産生に加えて、ＮＳＰＬＰのフラグメントは、固層技術を用いた直
接のペプチド合成で形成することもできる。（Stewartら(1969)Solid-Phase Pet ide Svnthesis,WH Freeman Co,San Francisco;Merrifield J(1963)J Am Chem So
c 85:2149-2154を参照されたい）。in vitroタンパク質合成は手作業で行えるが
、自動化することもできる。自動的な合成は、例えば、Applied Biosystem 431A
ペプチドシンセサイザ（Perkin Elmer，Foster City CA）を製造者の指示に従っ
て用いて行うことができる。ＮＳＰＬＰの種々のフラグメントを個別に化学的に
合成し、化学的方法を用いて結合して完全長分子を作り出すことができる。
ＮＳＰＬＰの使用
ここに開示するヌクレオチド及びポリヌクレオチド配列の利用の原理は、ここ
に開示する新規なＮＳＰＬＰタンパク質、ＮＳＰ−Ａ（GI30730；Roebroak等，
前出）、ＮＳＰ−Ｂ（GI 307309；Roebroak等，前出）、ＮＳＰ−Ｃ（GI 307311
；Roebroak等，前出）、及びラットのCI-13（GI 281046；Wieczorek等，前出）
の間の化学的及び構造的相同性に部分的な基礎をおいている。
従って、ＮＳＰＬＰ又はＮＳＰＬＰ誘導体を、癌や、例えばＡＬＳのような神
経変性疾患の治療に用いることができる。ＮＳＰＬＰタンパク質活性が望ましく
ないような病気の場合は、ＮＳＰＬＰをコードするポリヌクレオチドのアンチセ
ンス配列を細胞にトランスフェクトしたり、或いはＮＳＰＬＰのアンタゴニスト
を細胞に供給することができる。
ＮＳＰＬＰの抗体
ＮＳＰＬＰ特異的抗体は、ＮＳＰＬＰの発現が関係する病気や疾病の診断のた
めに役立つ。このような抗体には、限定はしないが、ポリクローナル抗体、モノ
クローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖、Ｆａｂフラグメント並びにＦａｂ発現ラ
イブラリにより生成されるフラグメントが含まれる。中和抗体、すなわちＮＳＰ
ＬＰポリペプチドの生物活性を抑制する抗体は、特に診断及び治療に好適である
。
抗体誘発のためのＮＳＰＬＰは生物学的活性を有している必要はないが、その
タンパク質断片、つまりオリゴペプチドは抗原性でなければならない。特異的抗
体を誘発するために用いられるペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸、好まし
くは少なくとも１０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を有する。これらの配列
は、天然タンパク質のアミノ酸配列の一部と同一のものであり、小さい自然発生
の分子の全アミノ酸配列を含み得る。ＮＳＰＬＰアミノ酸の短いストレッチを、
キーホールリンペットヘモシアニン及びキメラ分子に対して産生された抗体のよ
うな他のタンパク質の配列に融合することができる。ＮＳＰＬＰに対する抗体の
生成のために、当分野においてよく知られる手順が用いられる。
抗体を産生するために、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス等を含む種々の宿主は
、免疫学的特性を保持するＮＳＰＬＰ或いはその任意の部分、フラグメント或い
はオリゴペプチドを注入することにより免疫することができる。宿主の種に応じ
て、種々のアジュバントが免疫学的反応を促進するために用いられる。そのよう
なアジュバントには、限定はしないが、フロイントのアジュバント、水酸化アル
ミニウムのような無機質ゲルアジュバント、リゾレシチンのような表面活性物質
アジュバント、プルロニックポリオルアジュバント、ポリアニオンアジュバント
、ペプチドアジュバント、油性乳剤アジュバント、キーホールリンペットヘモシ
ニアンアジュバント並びにジニトロフェノールアジュバントが含まれる。ＢＣＧ
（カルメット‐ゲラン杆菌）及びコリネバクテリウムパルヴム（Corynebacteriu
m parvum）は有用なヒトアジュバントである。
ＮＳＰＬＰに対するモノクローナル抗体は、培地中の連続株細胞による抗体分
子の産生を行うための任意の技術を用いて調製される。これらは、限定はしない
が、Koehler及びMilstein(1975,Nature 256:495-497)に当初掲載されたハイブリ
ドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor等（1983）Immunol Today
4:72、Cote等（1983）Proc Natl Acad Sci 80:2026-2030）及びＥＢＶ−ハイブ
リドーマ技術（Cote等（1985）Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy,Ala
n R Liss Inc,pp77-96）を含む。
さらに、適切な抗原特異性並びに生物活性を有する分子を得るための「キメラ
抗体」の生成、即ちヒト抗体遺伝子へのマウス抗体遺伝子のスプライシングのた
めに開発された技術が用いられる（Morrison等（1984）Proc Natl Acad Sci 81:
6851-6855）、Neuberger等（1984）Nature 312:604-608、Takeda等（1985）Natu
re 314:452-454）。別法では、一本鎖抗体の生成のための周知技術（米国特許第
4,946,778号）を、ＮＳＰＬＰ特異的一本鎖抗体を生成するために適用する。
また抗体は、リンパ球集団におけるin vivo産生を誘導することにより、或い
はOrlandi等（1989,Proc Natl Acad Sci 86:3833-3837）並びにWinter G及びMil
stein C（1991,Nature 349:293-299）に開示されているような組換え免疫グロブ
リンライブラリー、または高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングす
ることによっても生成することができる。
ＮＳＰＬＰに対する特異結合部位を含む抗体フラグメントも生成することがで
きる。例えばこのようなフラグメントには、限定はしないが、
抗体分子のペプシン消化により生成することができるＦ（ａｂ’）2フラグメン
ト及びＦ（ａｂ’）2フラグメントのジスルフィド架橋を減らすことにより生成
することができるＦａｂフラグメントが含まれる。別法では、所望の特異性を有
するモノクローナルＦａｂフラグメントを迅速に、しかも容易に同定できるよう
に、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築する（Huse WD等（1989）Science 256:1275-
1281）。
確立された特異性を有するポリクローナル抗体或いはモノクローナル抗体のい
ずれかを用いる競合的結合アッセイ或いは免疫放射定量測定法のための種々のプ
ロトコルが当分野ではよく知られている。そのようなイムノアッセイでは、一般
に、ＮＳＰＬＰとその特異的抗体（或いは類似のＮＳＰＬＰ結合分子）との間の
複合体の形成、並びに複合体形成の測定が行われる。特異的ＮＳＰＬＰタンパク
質上の２つの非干渉性エピトープに対して反応するモノクローナル抗体を利用す
る二部位モノクローナル用イムノアッセイが好適ではあるが、競合結合アッセイ
も用いられる。これらの検査法はMaddox DE等（1983,J Exp Med 158:1211）に記
載されている。
ＮＳＰＬＰ特異的抗体を用いる診断検査法
特定のＮＳＰＬＰ抗体は、ＮＳＰＬＰの発現の誘発によって特性化される病気
或いは疾病の診断や、ＮＳＰＬＰで治療されている患者のモニタリングのための
アッセイにおいて役立つ。ＮＳＰＬＰについての診断アッセイは、ヒトの体液、
細胞或いは組織の抽出物において、ＮＳＰＬＰを検出するための抗体或いは標識
を利用する方法を含む。本発明のポリペプチド及び抗体は、修飾の有無に拘わら
ず用いることができる。多くの場合、ポリペプチド及び抗体は、共有結合、或い
は非共有結合かのいずれかでそれらをリポーター分子と結合することにより標識
される。種々のリポーター分子が周知となっており、その幾つかについては上記
した。
それぞれのタンパク質に対して特異的なポリクローナル抗体或いはモノクロー
ナル抗体を用いて、ＮＳＰＬＰポリペプチドを測定するための種々のプロトコル
が当分野では周知である。その例として、酵素結合免疫測定法（ELISA）、ラジ
オイムノアッセイ（RIA）並びに蛍光表示式細胞分取器法（FACS）がある。ＮＳ
ＰＬＰポリペプチド上の２つの非干渉性エピトープに対して反応するモノクロー
ナル抗体を利用する二部位モノクローナル用イムノアッセイは好適ではあるが、
競合的結合アッセイも用いられる。これらのアッセイは、他にもあるが、Maddox
DE等（1983,I Exp Med 158:1211）に記載されている。
疾病の診断の基礎を提供するために、ＮＳＰＬＰ発現についての通常の値、す
なわち標準値が確立されなければならない。これは複合体形成のために適切な条
件下で、ヒト或いは動物どちらでもよいが、正常の被験者から得られる体液或い
は細胞抽出物と、ＮＳＰＬＰに対する抗体とを結合することにより得ることがで
きるが、これは当分野ではよく知られた技術である。標準的な複合体形成量は、
一連のポジティブコントロールの希釈系とそれを比較することにより定量され、
抗体の既知の量が既知の濃度の精製ＮＳＰＬＰと結合される。その後正常サンプ
ルから得られた標準値を、ＮＳＰＬＰが関係する疾患を潜在的に患う被験者から
のサンプルから得られた値と比較する。標準値と対象値との偏差によって疾病の
存在を確認できる。
薬物スクリーニング
ＮＳＰＬＰ、その触媒作用性または免疫原性断片或いはオリゴペプチドは、種
々の任意の薬物スクリーニング技術において治療用化合物のスクリーニングのた
めに用いることができる。そのような試験において用いられる断片は、溶液に遊
離したもの、固体支持体への付着したもの、
細胞表面に結合したもの、或いは細胞内への局在化したものであり得る。ＮＳＰ
ＬＰと試験される薬剤との間の触媒活性、すなわち結合複合体形成が測定される
。
薬物スクリーニングのための別の方法は、ＮＳＰＬＰポリペプチドへの安定的
な結合親和性を有する化合物の高スループットスクリーニングを可能にするもの
であり、１９８４年９月１３日公告の欧州特許出願第84/03564号（Guysen）に詳
細に記載されている。この文献を本明細書に一体に参照されたい。概要としては
、多数の別々の小ペプチド試験用化合物をプラスチックピン或いはいくつかの他
の表面のような、固体基質上で合成する。ポリペプチド試験化合物をＮＳＰＬＰ
フラグメントと反応させ、洗浄する。次いで結合ＮＳＰＬＰを当分野で周知の方
法により検出する。また精製ＮＳＰＬＰを前述の薬物スクリーニング技術におい
て使用するために、プレート上に直接コーティングすることもできる。別法では
、ペプチドを捕捉し、固形支持体上にペプチドを固定するために非中和抗体を用
いる。
また本発明は、ＮＳＰＬＰに結合し得る中和抗体特性が、ＮＳＰＬＰとの結合
について特に試験化合物と競合する競合的薬物スクリーニングアッセイの使用も
意図している。このようにして、抗体を用いて１または２以上の抗原性決定基を
ＮＳＰＬＰと共通に有する任意のペプチドの存在を検出することができる。
ＮＳＰＬＰコーディングポリヌクレオチドの使用
ＮＳＰＬＰポリヌクレオチド、或いはその一部が診断並びにまた治療目的で用
いられる。診断目的の場合、本発明のＮＳＰＬＰは、ＮＳＰＬＰの発現が関与す
る生検組織における遺伝子発現を検出し、かつ定量するために用いられる。診断
試験は、ＮＳＰＬＰが存在、不存在、及び過剰発現の何れの状態にあるかを区別
したり、治療的介入の際にＮＳＰＬ
Ｐ濃度の調節をモニタリングするのに役立つ。本発明の範囲には、オリゴヌクレ
オチド配列、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子、及びＰＮＡが含まれる。
本発明の別の側面は、ＮＳＰＬＰまたは近縁な分子をコードするゲノム配列を
含むポリヌクレオチド配列を検出できるハイブリダイゼーションプローブ或いは
ＰＣＲプローブを提供することである。そして、そのプローブの特異性、すなわ
ち非常に高度な保存領域（例えば５’調節領域における１０個の独特のヌクレオ
チド）か、低度に保存的な領域（例えば特に３’領域におけるシステイン残基の
間の領域）の何れに由来するのかということや、ハイブリダイゼーション或いは
増幅の（高度の、中程度の或いは低度の）厳密性によって、そのプローブが自然
発生ＮＳＰＬＰのみを同定するものであるか、或いはアレル配列や近縁な配列も
同定するものであるかが決まってくる。
プローブは近縁なインヒビターをコードする配列を検出するためにも用いるこ
とができ、好ましくは、これらのＮＳＰＬＰの任意のものをコードする配列から
得られるヌクレオチドを少なくとも５０％含むべきである。本発明のハイブリダ
イゼーションプローブは、配列番号：２のヌクレオチド配列か、プロモータ、エ
ンハンサエレメント及び自然発生ＮＳＰＬＰのイントロンを含むゲノムの配列に
由来するものであり得る。ハイブリダイゼーションプローブは種々のリポータ分
子により標識することができ、この標識には、32Ｐや35Ｓのような放射性核種、
アビジン／ビオチン結合系によりプローブに結合するアルカリホスファターゼの
ような酵素標識等が含まれる。
ＮＳＰＬＰのＤＮＡに対する特異的ハイブリダイゼーションプローブの生成の
ための他の手段は、ｍＲＮＡプローブ産生用のベクターにＮＳＰＬＰやＮＳＰＬ
Ｐ誘導体をコードする核酸配列をクローン化すること
である。このようなベクターは周知であって市販されており、Ｔ７やＳＰ６ Ｒ
ＮＡポリメラーゼのような適切なＲＮＡポリメラーゼや適切な放射性標識ヌクレ
オチドを付加することにより、in vitroでＲＮＡプローブを合成するために用い
ることができる。
ＮＳＰＬＰをコードするポリヌクレオチド配列を、ＮＳＰＬＰの発現が関与す
る病気や疾病の診断のために用いることができる。例えば、ＮＳＰＬＰをコード
するポリヌクレオチド配列を、ＮＳＰＬＰ発現を検出するための生検組織や体液
の、ハイブリダイゼーションアッセイ或いはＰＣＲアッセイにおいて用いること
ができる。そのような定性的及び定量的方法の形態には、サザンブロット法或い
はノーザンブロット法、ドットブロット法或いは他の膜用技術、ＰＣＲ技術、デ
ィップスティック試験法（試験紙法）、ピン或いはチップ技術及びELISA技術が
含まれる。これらの技術は全て、当分野ではよく知られており、実際に市販され
ている多くの診断キットの基礎となっている。
ここに開示したＮＳＰＬＰをコードするヌクレオチド配列は、ＡＬＳのような
神経変性疾患や癌が関係する活性化や誘導を検出するためのアッセイの基礎を提
供する。ＮＳＰＬＰコード化ヌクレオチド配列は、既知の方法により標識され得
、ハイブリダイゼーション複合体の形成に適した条件の下で、患者の体液や組織
のサンプルに加えられる。インキュベーション時間の経過後、このサンプルを、
ヌクレオチドが酵素で標識されている場合には所望に応じて色素(または他の展
開剤を要する標識)を含む適合性の液体で洗浄する。この適合性の液体をリンス
した後、色素を定量して標準値と比較する。生検サンプルや抽出サンプルにおけ
る色素の量が、比較用対照サンプルの色素量を著しく上回っている場合には、こ
のヌクレオチド配列はサンプルのヌクレオチド配列とハイブリッド形成しており
、サンプル内に著しく高い濃度のＮＳＰＬＰコード化ヌ
クレオチド配列が存在していることは、関連する疾患が存在していることを示し
ている。
このようなアッセイは、特定の治療行為の有効性を評価するため、動物実験、
臨床試験、或いは個々の患者の治療をモニタリングする際に用いることができる
。疾患を診断するための基礎を与えるために、ＮＳＰＬＰ発現に対する正常な或
いは標準的なプロフィールが確立されなければならない。この標準プロフィール
は、正常な被験者、すなわち動物或いはヒトから得られる体液或いは細胞抽出物
を、ハイブリダイゼーション或いは増幅に適切な条件下で、ＮＳＰＬＰ或いはそ
の一部と結合することにより確立される。標準的なハイブリッド形成は、正常被
験者に対して得られる値と、既知の実質的に精製されたＮＳＰＬＰの量が用いら
れる同一の実験におけるポジティブコントロール希釈系列で得られる値とを比較
することにより定量することができる。正常なサンプルから得られた標準値は、
ＮＳＰＬＰ発現に関連する障害或いは疾患を潜在的に患っている被験者からのサ
ンプルから得られる値と比較される。標準値と被験者値との偏差から疾病の存在
が確認される。
ひとたび疾患が確認されると、現存する治療用薬剤が投与され、治療プロファ
イルが作成される。このようなアッセイは、その数値が正常すなわち標準パター
ンに向かって回復しているか否かを評価するために規則的に繰り返される。継続
的な治療プロファイルを用いて数日間或いは数ヶ月の期間にわたる治療効果を示
すことができる。
米国特許第4,683,195号、第4,800,195号並びに第4,965,188号に記載のような
ＰＣＲ法により、ＮＳＰＬＰ配列に基づくオリゴヌクレオチドの追加の使用法が
提供される。このようなオリゴマーは一般には化学的に合成されるが、酵素を用
いて発生させたり、或いは組換えソースから生成することもできる。一般にオリ
ゴマーは、通常特定の遺伝子或い
は状態を同定するために最適な条件下で用いられる２つのヌクレオチド配列、即
ちセンス方向（５’→３’）のヌクレオチド及びアンチセンス方向（３’←５’
）のヌクレオチドからなる。同一の２つのオリゴマー、入れ子オリゴマーの組、
或いはオリゴマーの縮重プールでさえ、近縁なＤＮＡまたはＲＮＡ配列の検出や
定量のためのより低い厳密性の条件下であっても用いることができる。
さらに特定の分子の発現を定量するための方法には、放射性標識（radiolabel
ing）（MelbyPC等1993JImmunolMethods159:235-44）或いはビオチン標識（Dupla
a C 等1993AnalBiochem229-36）ヌクレオチドの利用、制御核酸の同時増幅（coa
mplification）の利用、並びに実験結果を補完して書かれた標準的なグラフ曲線
の利用が含まれる。多数のサンプルの定量は、ＥＬＩＳＡ形式のアッセイを実行
することにより迅速に行うことができ、対象のオリゴマーが様々な希釈溶液中に
現れ、分光光度分析或いは比色分析反応により迅速に定量することができる。例
えば、生検組織の抽出物においてＮＳＰＬＰが比較的高いレベルで存在すること
は、筋肉るいそうの発症を示している。このタイプの確定診断により、健康の専
門家が患者の積極的治療を開始したり、病状の悪化を防ぐことが可能となる。同
様に、当業者に周知のアッセイを用いて、患者の治療の際に、その病状の進行を
モニタリングすることができる。また、まだ開発されていない分子生物学的技術
でも、その新技術が既知のヌクレオチド配列の性質、例えばトリプレット遺伝暗
号、特異的塩基対形成等に基づくものであれば、ここに開示したヌクレオチド配
列をそれに利用することができる。
治療的利用
ＮＳＰ様タンパク質をコードする遺伝子へのその相同性及びその発現プロファ
イルに基づき、ここに開示するＮＳＰＬＰをコードするポリヌ
クレオチド配列は、ＡＬＳのような神経変性疾患や癌のような病気の治療におい
て役立ち得る。
レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペス或いはワクシニアウイルスに由来
する発現ベクター、或いは細菌性プラスミドに由来する発現ベクターは、標的の
器官、組織、または細胞群へのヌクレオチド配列の送達のために用いられる。当
業者によく知られた方法は、アンチＮＳＰＬＰを発現する組換えベクターを構築
するために用いることができる。例えばManiatis等（上記）及びAusubel等（上
記）に記載された技術を参照されたい。
完全長ｃＤＮＡ配列、並びにまたその調節エレメントを含むポリヌクレオチド
により、研究者は遺伝子機能のセンス調節（YoussoufianＨ及びHF Lodish1993Mo
l Cell Biol 13:98-104）、或いはアンチセンス調節（Eguchi等（1991）Annu Re
v Biochem 60:631-652）の調査用のツールとしてＮＳＰＬＰを用いることができ
る。このような技術は、現在当分野ではよく知られており、センス或いはアンチ
センスオリゴヌクレオチド、或いはより大きなフラグメントを、コーディング領
域或いは制御領域に沿った様々な位置から設計することができる。
所望のＮＳＰＬＰコーディング断片を高度に発現する発現ベクターを細胞また
は組織にトランスフェクトすることにより、ＮＳＰＬＰをコードする遺伝子の機
能を停止させることができる。このような作製物は、翻訳不可能なセンス或いは
アンチセンス配列とともに細胞から溢れ出し得る。ＤＮＡへの組み込みがない場
合ですら、このようなベクターは、全ての複製物が内在性ヌクレアーゼにより分
解されるまで、ＲＮＡ分子を転写し続ける。このような一過性の発現は、非複製
ベクター（MettlerI,personal communication）でも１ヶ月以上、適当な複製エ
レメントがベクター系の一部である場合には更に長い期間継続し得る。
上述のように、ＮＳＰＬＰの制御領域、例えばプロモータ、エンハンサ或いは
イントロンに対するアンチセンス分子、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを設計する
ことにより遺伝子発現を修飾することができる。転写開始部位、例えばリーダー
配列の＋１０〜−１０領域の間に由来するオリゴヌクレオチドが好適である。ま
たアンチセンス分子は、転写産物がリボソームへの結合するのを防止することに
より、ｍＲＮＡの翻訳を阻止するように設計される。同様に、抑制は、「三重ら
せん」塩基対合法を用いて達成することができる。三重らせん対合は、二重らせ
んが、ポリメラーゼ、転写因子、或いは調節分子を結合するべく十分に開かない
ようにする。三重らせんＤＮＡを用いた最近の治療法は、Gee JEら（Huber BE a
nd BICarr(1994)Molecular and Immunologic Aporoaches,Futura Publishing Co
,MtKisco NY）により記載されている。
リボザイムはＲＮＡの特異的切断を触媒することができる酵素性ＲＮＡ分子で
ある。リボザイムの作用の仕組みでは、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の
配列特異的ハイブリダイゼーションが行われ、その後エンドヌクレアーゼによる
切断（endonucleolytic cleavage）がなされる。発明の範囲内には、ＮＳＰＬＰ
のエンドヌクレアーゼによる切断を、特異的に及び効果的に触媒し得る、人工合
成のハンマーヘッド型リボザイム分子も含まれている。
任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的なリボザイム切断部位の最初の同定は、
配列ＧＵＡ、ＧＵＵ並びにＧＵＣが後続するリボザイム切断部位に対する標的分
子を走査することにより行われる。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝
予の領域に対応する１５〜２０個のリボヌクレオチドの間の短いＲＮＡ配列は、
そのオリゴヌクレオチドの機能を停止させる２次構造の特徴について評価される
。また候補の標的の適切性の
評価は、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて相補的なオリゴヌクレオチドと
のハイブリッド形成に対する接触性を試験することにより行われる。
本発明のアンチセンス分子及びリボザイムは、ＲＮＡ分子を合成するのための
当分野で周知の方法により調製することができる。これらの技術には、固相ホス
ホラミダイト（phosphoramidite）化学合成のような化学合成オリゴヌクレオチ
ドの技術が含まれる。別法では、ＲＮＡ分子を、ＮＳＰＬＰをコードするＤＮＡ
配列のinvivo及びin itro転写により生成することができる。このようなＤＮＡ
配列は、Ｔ７或いはＳＰ６のような適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータを有す
る多種のベクターに組み込まれる。別法では、構造的に或いは誘導的にアンチセ
ンスＲＮＡを合成するアンチセンスｃＤＮＡ構成物が、株細胞、細胞或いは組織
内に導入される。
ＲＮＡ分子は細胞内安定性を高め及び半減期を長くするために修飾することが
できる。実行可能な修飾には、限定はしないが、その分子の５’並びにまた３’
末端のフランキング配列の付加、或いは分子のバックボーン内にホスホジエステ
ラーゼ連鎖ではなくホスホロチオネート（phosphorothioate）或いは２’Ｏ−メ
チルを使用することを含む。このコンセプトは、ＰＮＡの産生において固有のも
のであり、内在性エンドヌクレアーゼにより容易に認識されないアデニン、グア
ニン、シチジン、チミン、及びウリジンのアセチル−、メチル−、チオ−、及び
類似の修飾形態とともに、イノシン、キュエオシン（queosine）、及びワイブト
シン（Wybutosine）のような従来あまり用いられなかった塩基を含めることによ
って、これら全ての分子に拡張することができる。
細胞或いは組織内にべクターを導入するための方法には、以下に議論される方
法が含まれ、これらの方法は、in vivo、in vitro、及びex vivo
治療法に対しても適切なものである。ex vivo治療法の場合には、患者から採取
された幹細胞にベクターを導入し、自家移植のためにクローンとして増殖して同
じ患者に戻す方法が、ここで引用されている米国特許第5,399,493号及び第5,437
,994号に記載されている。トランスフェクションによる送達、リポソームによる
送達は、当分野でよく知られているものである。
更に、ここに開示するＮＳＰＬＰのヌクレオチド配列は、新技術、即ち、限定
はしないが、それがトリプレット遺伝暗号及び特異的塩基対合相互作用のような
特性を含む、現在周知のヌクレオチド配列の特性に依存する技術であれば、まだ
開発されていない分子生物学的技術においても用いることができる。
近緑なポリヌクレオチド配列の検出及びマッピング
ＮＳＰＬＰの核酸配列は、自然発生のゲノム配列のマッピングのためのハイブ
リダイゼーションプローブを生成するために用いることができる。この配列は、
よく知られた技術を用いて、特定の染色体或いはその染色体の特定領域に対して
マッピングすることができる。このような技術には、染色体のスプレツド(chrom
osomal spreads)についてのin situハイブリダイゼーシヨン（Verma等（1988）H
uman Chromosomes:A Manual of Basic Technique,Pergamon Press，NewYork）、
フローソーティング(flow-sorted)染色体調製法、或いは酵母菌人工染色体(ＹＡ
Ｃｓ)、細菌性人工染色体（ＢＡＣｓ）、細菌性Ｐ１構造体或いはPrice CM（199
3;Blood Rev 7:127-34）及びTrask BJ(1991;Trends Ganet 7:149-54）に概要が
示されている単染色体ｃＤＮＡライブラリのような人工染色体構造が含まれる。
染色体のスプレッドについての蛍光in situハイブリダイゼーションの技術は
、“Verma等(1988)Human Chromosomes:A Manual of Basic Technique
,Pergamon Press，New York”に記載されている。染色体調製物の蛍光
in situハイブリダイゼーション及び他の染色体マッピング技術は、追加の遺伝
子地図データと関係を有する。遺伝子地図データの例は、1994 Genome Issue of
Science(265:1981f)に見ることができる。物理的染色体地図上でのＮＳＰＬＰ
の位置と、特定の失敗（または特定の疾病の素因）との相関関係を助けとして、
ある遺伝病が関係するＤＮＡの領域を限界決定することができる。本発明のヌク
レオチド配列を、健常者と、キャリアまたは患者との遺伝子配列の違いを検出す
るために用いることができる。
染色体調製物のin situハイブリダイゼーション及び確定された染色体マーカ
ーを用いる連鎖解析のような物理的地図作成技術は、遺伝子地図を延長する際に
大変重要である。ヒトゲノムのＳＴＳに基づく地図の最近の例は、Whitehead-MI
T Center for genomic Reserch（Hudson TJら(1995)Science270:1945-1954）か
ら最近出版されている。多くの場合、特定のヒト染色体の数或いは腕が知られて
いなくても、マウスのような別の哺乳動物種の染色体上の遺伝子の配置から、関
連する標識を明らかにすることができる。新しい配列は、染色体の腕、或いはそ
の一部への物理的マッピングにより割当てることができる。これは位置クロ−ニ
ング或いは他の遺伝子発見技術を用いて疾患遺伝子を調査する研究者に貴重な情
報を提供する。ひとたび毛細血管拡張性運動失調（ＡＴ）のような疾患或いは症
候群が、特定のゲノム領域、例えばＡＴ〜11q22-23（Gatti等(1988)Nature336:5
77-580）への遺伝子連鎖により粗く局所化されれば、その領域にマッピングされ
る任意の配列は、さらなる研究のための関連する遺伝子、或いは調節遺伝子を表
すことができる。本発明のヌクレオチド配列は、正常者とキャリアまたは患者と
の間の、転座、逆位等による染色体位置の違いを検出するために用いることもで
き
る。
医薬品組成物
本発明は、ヌクレオチド、タンパク質、抗体、アンタゴニスト、またはインヒ
ビターを、単独で、或いは安定化化合物のような少なくとも１つの他の薬剤とと
もに含んでいる医薬品組成物を、その範囲に含む。この医薬品組成物は、任意の
無菌の生体適合性製薬用担体に含めて投与されるが、このような担体には、限定
はしないが、生理食塩水、緩衝食塩水、ブドウ糖或いは水が含まれる。これらの
分子は、患者に対して、単体で、或いは他の薬品やホルモンと結合して、賦形剤
或いは製薬学的に許容される担体と混合される他の薬品組成物に入れて投与され
得る。本発明の一実施例では、製薬学的に許容される担体とは、製薬学的に不活
性なものである。医薬品組成物の投与
医薬品組成物は経口投与、或いは非経口投与される。非経口投与の方法には、
局所的投与、動脈内（腫瘍への直接の）投与、筋肉内投与、皮下投与、髄内投与
、くも膜下内投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与或いは鼻腔内投与が含
まれる。活性成分に加えて、これらの薬品組成物は、薬学的に用いられ得る調合
物内への活性化合物の処理を容易にする賦形剤及び補助剤を含む適切な製薬学的
に許容される担体を含み得る。調合或いは投与に関する技術の詳細は、“Reming
ton's Pharmaceutical Sciences”（Mack Publishing Co,Easton PA）の最新版
において見出すことができる。
経口投与用の医薬品組成物は、当分野でよく知られる製薬学的に許容される担
体を用いて適切な剤形に製剤される。このような担体により、薬品組成物は、治
療を受ける患者による経口及び鼻腔摂取のための、錠剤、丸剤、カプセル剤、液
体剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸
濁剤或いは類似の剤形として処方される。
経口投与するための医薬品調製物は、活性化合物と固形の賦形剤とを結合する
ことによって得ることができるが、所望に応じて、必要なら適切な補助剤を添加
した後、得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理して、錠剤或いは糖衣剤
核を得ることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、サクロース、マンニトー
ル或いはソルビトールを含む砂糖のような糖質或いはタンパク質充填剤、とうも
ろこし、小麦、米、じゃがいも等からのでんぷん、メチルセルロース、ヒドロキ
シプロピルメチルセルロース或いはカルボキシルメチルセルロースナトリウムの
ようなセルロース、アラビアゴム或いはトラガカントのようなゴム、並びにゼラ
チン或いはコラーゲンのようなタンパク質である。必要ならば、架橋結合したポ
リビニルピロリドン、寒天、アルギン酸ナトリウムのようなアルギン酸或いはア
ルギン酸ナトリウムのようなその塩のような、崩壊剤或いは可溶化剤が加えられ
る。
糖衣剤核は、濃縮砂糖溶液のような適切な錠皮を与えられるが、溶液はアラビ
アゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル剤、ポリエチレングリ
コール並びにまた二酸化チタン、ラッカー溶液及び適切な有機溶剤或いは溶剤混
合物が含み得る。錠剤の識別のため、すなわち活性化合物の量、すなわち投与量
を特徴付けるために染料或いは色素が錠剤或いは糖衣錠皮に加えられてもよい。
経口投与可能な製剤は、ゼラチンからなるプッシュフィットカプセル及びゼラ
チンからなる柔らかい、密封されたカプセル、並びにグリセロール或いはソルビ
トールのような錠皮を含む。プッシュフィットカプセルは、ラクトース或いはで
んぷんのような充填剤或いは結合剤、タルク或いはステアリン酸マグネシウムの
ような潤滑剤、並びに付加的には安定剤と混合された活性処方組成物を含み得る
。柔らかいカプセルでは、
活性化合物は、安定剤があるなしにかかわらず、脂肪油、液体パラフィン、液体
ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或いは懸濁される。
非経口投与用の剤形は、水溶性の活性化合物の水溶液を含む。注射用として、
本発明の薬品組成物を水溶液、好適にはハンクの溶液、リンガー溶液或いは生理
緩衝食塩水のような生理学的に適合性の緩衝液に入れて製剤することができる。
水性の注入懸濁剤は、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、ソルビトール
或いはデキストランのような懸濁剤の粘性を増加する物質が含み得る。更に、活
性成分の懸濁液は、適切な油性注入懸濁剤として調製される。適切な親油性の溶
媒或いは媒介物は、胡麻油のような脂肪油や、オレイン酸エチル、トリグリセリ
ド或いはリポソームのような合成脂肪酸エステルを含む。また懸濁剤は、所望に
応じて、それにより溶解度を増加し、非常に濃縮された溶液の調製ができるよう
になる適切な安定剤或いは薬剤を含んでもよい。
局所的投与または経鼻投与用には、浸透される特定の障壁に対して適切な浸透
剤を用いて調合が行われる。このような浸透剤は、一般的に周知である。製造と保管
本発明の薬品組成物は周知の方法、例えば従来の混合処理、溶解処理、顆粒化
処理、糖衣形成処理、研和処理、乳化処理、封入処理(entrapping)処理或いは凍
結乾燥処理により製造される。
この医薬品組成物は塩類として提供されることもあり、限定はしないが、塩酸
、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等を含む、多くの酸とともに
形成することができる。塩は、対応する遊離塩基形態である水性或いはプロトニ
ック溶剤において、より可溶性が高くなる傾向がある。他の場合には、好適な製
剤は、１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジ
ン、０．１％〜２％のショ糖、使用前に緩衝剤と結合させたｐＨ範囲４．５〜５
．５にある２％〜７％のマンニトールにおける凍結乾燥粉末である。
製薬学的に許容される担体内に製剤された本発明の化合物を含む組成物は、調
製された後、適切な容器内に入れられて、さらに提示した疾病状態の治療のため
にラベル付けされる。ＮＳＰＬＰの投与のため、このようなラベルには、投与の
量、頻度、方法が表示される。治療上効果的な投与量
本発明において使用するために適切な医薬品組成物は、活性成分を所望の目的
を達成するに効果的な量だけ含む組成物である。効果的な投与量の決定は、当業
者の能力の範囲内で行うことができる。
任意の化合物の場合、治療的に有効な投与量は、初めに、新生物細胞、或いは
通常マウス、ウサギ、イヌ、ブタのような動物モデルの何れかの細胞培地のアッ
セイから推定される。次いで、このような情報を用いて、ヒトにおいて効果的な
投与量や投与経路を決定することができる。
治療的に有効な投与量とは、疾病状態を寛解するタンパク質、その抗体、アン
タゴニスト、またはインヒビターの量である。そのような化合物の毒性及び治療
有効性は、例えばＬＤ５０（個体群の５０％の致死投与量）及びＥＤ５０（個体
群の５０％において治療的に有効な投与量、５０％有効量）を決定するための、
細胞培地或いは実験動物における標準的な製薬学的手順により決定することがで
きる。毒性と治療有効性との間の投与量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５
０の比として表すことができる。大きな治療指数を示す医薬品組成物が好ましい
。これらの細胞培地のアッセイ及び付加的な動物研究から得られるデータは、ヒ
トへの使用に対する投与量の範囲を決める際に用いることができる。そのような
化合物の投与量は、毒性がほとんど或いは全くなく、ＥＤ５０
を達成する循環濃度の範囲内にあることが望ましい。投与量は、用いられる剤形
、患者の感受性並びに投与経路に応じてこの範囲内で変化する。
正確な投与量は治療されるべき患者を考慮して個々の医師により選択される。
投与量及び投薬量は、十分なレベルの活性部分を与え、かつ所定の効果を維持す
るために調整される。考慮すべき付加的な要因は、疾患状態の重症度、または患
者の年齢、体重並びに性別、食事、投与の時間及び頻度、併用する薬剤、反応感
受性、並びに治療への耐性／反応を含む。長期的に作用する薬品組成物は３〜４
日毎に、１週間毎に、或いは半減期及び特定の処方のクリアランス速度に応じて
２週間に１度投与してもよい。
通常の投与量は０．１〜１００，０００μｇの範囲にあって、全投与量は最大
約１ｇであり、投与経路に応じて変化する。特定の投与量或いは供給の方法に関
するガイダンスは、文献において見出すことができる。米国特許第4,657,760号
、第5,206,344号或いは第5,225,212号を参照されたい。当業者は、ヌクレオチド
に対しては、タンパク質やインヒビター用の剤形とは異なる剤形を採用するであ
ろう。同様に、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの送達は、特定の細胞、状
態、位置等によって決まってくる。
例えば、ＮＳＰＬＰ又はＮＳＰＬＰ誘導体を適切な剤形で送達することにより
、癌細胞の増殖の進行や、神経変性をブロックすることができる。同様にＮＳＰ
ＬＰアンタゴニストの投与により、このタンパク質の活性を阻害したり、或いは
その寿命を短くしたりすることができる。
以下に本発明の実施例を示す。但し、以下の実施例は単なる例示であって、本
発明をこの実施例に限定しようとするものではない。
産業上の応用
１ ｃＤＮＡライブラリーの構築ＴＨＰ−１
THP-1は、急性単球白血病を患う１歳の男児の血液に由来するヒト白血病細胞
系である。THP-1細胞は単球のことを表す。THP-1ｃＤＮＡライブラリーは、以下
に概略を記述するようにStratagene社(Stratagene,11099M.Torrey Pines Rd.,La
Jolla,CA 92037）によりカスタムメードで作製された。
Stratagene社はオリゴｄ（Ｔ）プライミングを用いてｃＤＮＡライブラリーを
作製した。合成アダプターオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡ分子にリゲートし、こ
の分子がUni-ZAPTMベクターシステム（Stratagene）に挿入できるようにした。
これによって、高い効率の一方向性（センス方向）のラムダライブラリーの作製
が可能となり、ｃＤＮＡインサートを有するクローンを検出するためのブルー／
ホワイトカラーセレクションを有するプラスミド系の利便性を利用することが可
能となる。
ｃＤＮＡライブラリーの質について、ＤＮＡプローブを用いてスクリーニング
を行い、次にpBluescriptファージミド（Stratagene）を切除した。このファー
ジミドにより、インサートの特性化、配列決定、部位特異的突然変異誘発、一方
向性欠失の作製、及び融合ポリペプチドの発現を容易に行うためのプラスミド系
を利用できるようになる。次に、カスタムメイドで作製されたライブラリーファ
ージ粒子を大腸菌宿主株XL1-Blue（Stratagene）に感染させた。この細菌株の高
い形質転換効率により、このｃＤＮＡライブラリーが希な少数のクローンを含む
可能性を高めることができる。この他の一方向性ベクターには、限定はしないが
、pcDNA1（Invitrogen,San Diego CA）や、pSH1ox-1（Novagen,Madison WI）が
ある。胎児の脾臓
ヒト脾臓細胞ｃＤＮＡライブラリーは、Stratagene社（Catalogue＃
937205.Staratagene,La Jolla CA）によりカスタムメードで作製された。開始の
細胞集団は、多種多様な細胞集団を有する胎児の脾臓から得られた混合されたも
のである。更に、胎児の脾臓は、異なる起源からプールされたものである。ポリ
（Ａ＋）ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、脾臓細胞から精製された。ｃＤＮＡはｍＲＮＡ
から合成された。合成アダプターオリゴヌクレオチドをｃＤＮＡの末端にリゲー
トし、このｃＤＮＡがUni-ZAPTMベクターシステム（Stratagene）に挿入できる
ようにした。このベクターシステムによって高効率の一方向性（センス方向）の
ラムダライブラリーの作製が可能となり、ｃＤＮＡインサートを含むクローンを
検出するためのブルー／ホワイトカラーセレクションを備えたプラスミド系の利
便性を利用することが可能となる。別の一方向性ベクターにはpcDNA1（Invitrog
en,San Diego CA）及びpSH1ox-1（Novagen,Madison WI）がある。
２ ｃＤＮＡクローンの単離ＴＨＰ−１
個々のｃＤＮＡクローンのファージミド形態は、in vivo切除プロセスにより
得られた。このプロセスでは、ライブラリーファージとｆ１ヘルパーファージの
双方を、宿主細菌株に同時感染させる。ライブラリーを含むファージ及びヘルパ
ーファージの双方に由来するポリペプチド、つまり酵素がＤＮＡにニックを入れ
て、標的ＤＮＡ上の決まった配列から新たなＤＮＡ合成を開始させ、ｃＤＮＡイ
ンサート及びpBluescriptファージミドの全ての配列を含むより小形の一本鎖の
環状ファージミドが作り出された。このファージミドＤＮＡは、細胞から放出さ
れて精製され、新たな宿主細胞（SOLR,Stratagene）に再度感染させるのに用い
られ、そこで二本鎖のファージミドＤＮＡが生成された。このファージミドはβ
ラクタマーゼの遺伝子を含んでいるため、新たに形質転換された
細菌は、アンピシリン含有培地上で選択される。
別のファージミド精製方法が最近利用できるようになった。その方法では、市
販のミニプレップキット（Catalog No.77468,AdvancedGenetic Technologies Co
rp.,Gaithersburg MD）を用いる。このキットは、９６穴フォーマットのもので
、９６０回の精製に十分な量の試薬が付いている。各キットには推奨プロトコル
が備えられているが、以下の変更点を除いてこのプロトコルを採用した。第１に
、９６個のウエルはそれぞれ、２５ｍｇ／Ｌのカルベニシン及び０．４％のグリ
セロールを含む滅菌テリフィックブロスの１ｍｌのみで満たした。ウエルに播種
した後、細菌を２４時間培養し、６０μｌの溶解バッファに溶解した。遠心分離
処理（２９００ｒｐｍで５分間）を行った後に、ブロックの内容物を一次濾板に
添加した。トリスバッファにイソプロパノールを添加するオプションのステップ
は定例的には実施しなかった。プロトコルの最終ステップの後、サンプルを保管
のためにBeckman９６穴ブロックに移送した。
ファージミドＤＮＡの精製も、QIAGEN DNA Purification System（QIAGEN Inc
,Chatsworth CA）製のQIAWELL-8P lasmid Purification Systemを用いて行われ
た。この製品は、細菌細胞を溶解し、QIAGEN陰イオン交換樹脂粒子を、３ＭのEM
PORETMメンブランテクノロジーと共にマルチウエルフォーマットで使用して高度
に精製されたファージミドＤＮＡを単離するための便利で、高速で、高信頼性か
つ高スループットの方法を提供する。このＤＮＡは、精製レジンから溶出されて
、ＤＮＡシークエンシングや他の解析操作のために調製された。胎児の脾臓
個々のｃＤＮＡクローンのファージミド形態は、in vivo切除プロセスにより
得られた。このプロセスでは、ライブラリーファージとｆ１ヘル
パーファージの双方を、宿主細菌株に同時感染させる。ライブラリーを含むファ
ージ及びヘルパーファージの双方に由来するポリペプチド、つまり酵素がＤＮＡ
にニックを入れて、標的ＤＮＡ上の決まった配列から新たなＤＮＡ合成を開始さ
せ、ｃＤＮＡインサート及びpBluescriptファージミドの全ての配列を含むより
小形の一本鎖の環状ファージミドが作り出された。このファージミドＤＮＡは、
細胞から放出されて精製され、新たな宿主細胞（SOLR,Stratagene）に再度感染
させるのに用いられ、そこで二本鎖のファージミドＤＮＡが生成された。このフ
ァージミドはβラクタマーゼの遺伝子を含んでいるため、新たに形質転換された
細菌は、アンピシリン含有培地上で選択される。
ファージミドＤＮＡの精製も、QIAGEN DNA Purification System（QIAGEN Inc
,Chatsworth CA）製のQIAWELL-8 Plasmid Purification Systemを用いて行われ
た。この製品は、細菌細胞を溶解し、QIAGEN陰イオン交換樹脂粒子を、３ＭのEM
PORETMメンブランテクノロジーと共にマルチウエルフォーマットで使用して高度
に精製されたファージミドＤＮＡを単離するための便利で、高速で、高信頼性か
つ高スループットの方法を提供する。このＤＮＡは、精製レジンから溶出されて
、ＤＮＡシークエンシングや他の解析操作のために調製された。
３ ｃＤＮＡクローン及びそれらの推定タンパク質の相同性検索
Applied Biosystems社で開発された検索アルゴリズムを、INHERIT（商標）670
Sequence Analysis Systemに組み込んで用いて、各ｃＤＮＡの配列をGenBankの
配列と比較した。このアルゴリズムでは、Pattern Specification Language（TR
W社、LosAngeles CA）を用いて相同な領域を決定した。配列の比較をどのように
行うかを決定する３つのパラメータは、ウィンドウサイズ、ウィンドウオフセッ
ト、及び誤差許容度であった。これら３つのパラメータの組を用いて、対象の配
列に
対して相同な領域を含む配列をＤＮＡデータベースから検索し、適切な配列には
、初期値とともにスコアが付けられた。これによって、これらの相同な領域をド
ットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、相同な領域と偶然の一致
とを区別した。相同性検索の結果は、Smith-Watermanアライメントを用いて表示
した。
ペプチド及びタンパク質配列の相同性は、INHERIT（商標）670配列解析システ
ムをＤＮＡ配列の相同性検索で用いたのと同様に用いて確かめた。Pattern Spec
ification Language及びパラメータウインドウを用いて、タンパク質データベー
スから相同性領域を含む配列を検索し、その結果には初期値とともにスコアを付
けられた。ドットマトリクスホモロジーブロット法を用いて検定し、有意な相同
性を有する領域と偶然の一致とを区別した。
BLASTは、Basic Local Alignment Search Tool(Altschul SF(1993)JMol Evol3
6:290-300;Altschul,SF等(1990)J Mol Biol215:403-10）の略称であり、これを
用いて局部的な配列アライメントを検索した。BLASTはヌクレオチド及びアミノ
酸配列の両方のアライメントを生成して配列類似性を求める。そのアライメント
の局所性のために、BLASTは厳密な一致、すなわちホモログを求める際に特に有
効である。BLASTは間隙を含まない一致を求めるのに役立つ。BLASTアルゴリズム
出力の基本的な単位は、High-scoring Segment Pair(HSP)である。
HSPは２つの配列フラグメントからなり、両フラグメントは任意ではあるが、
そのアライメントが局所的に最大となっている等しい長さものであり、そのアラ
イメントスコアはユーザにより設定された閾値すなわちカットオフスコアを満足
、即ち、カットオフスコアを超えている。BLASTアプローチは問い合わせ配列と
データベース配列との間のHSPを見つけ出すものであり、見出された任意の一致
の統計的有意性を評価
し、そのユーザが設定した有意性の閾値を満足する一致のみを報告するものであ
る。パラメータＥはデータベース配列一致を知らせるための統計的に有意な閾値
を確定するパラメータである。Ｅは全データベース検索の情況においてHSP（或
いはHSPの組）の発生の機会の期待される頻度の上側の境界として解釈される。
その一致がＥを満足する任意のデータベース配列がプログラム出力において報告
される。
４ ノーザン法による解析
ノーザン解析は、標識されたヌクレオチド配列と特定の細胞型または組織に由
来するＲＮＡが結合したメンブランとのハイブリッド形成を伴う、遺伝子の転写
物の存在を検出するために用いられる実験技術である（Sambrookら、上述）。
類似の電子的ノーザン分析ではBLAST（Altschul SF 1993and1990,上述）を用
いて、GenBankまたはLIFESEQ（商標）データベース(Incyte,Palo Alto CA）のよ
うなデータベースにおける同一のまたは近縁な分子を検索した。この解析は、多
数の膜式ハイブリダイゼーションより非常に短時間で行うことができる。更に、
コンピュータ検索の感度を変更して、ある一致が正確な一致か、相同的であるか
の分類を決定することができる。
検索の基準値は、プロダクトスコアであり、これは以下の式で定義されるもの
である。
（配列の一致(％)×最大BLASTスコア（％））／１００
このプロダクトスコアは、２つの配列間の類似性の程度、及び配列の長さの一致
の双方を考慮している。例えば、プロダクトスコアが４０の場合は、一致は誤差
が１〜２％の範囲で正確であり、スコアが７０の場合は正確に一致している。相
同な分子は、通常プロダクトスコアとして１５〜４０を示すものを選択すること
により同定されるが、スコアの低い
ものは近縁関係にある分子として同定される。
５ 完全長まで、又は調節エレメントを回復するまでのＮＳＰＬＰの延長
完全長ＮＳＰＬＰの核酸配列（配列番号：２）は、部分的ヌクレオチド配列を
完全長まで延長するため、或いはゲノムライブラリから５’配列を得るためのオ
リゴヌクレオチドプライマーを設計するために用いることができる。一方のプラ
イマーはアンチセンス方向（ＸＬＲ）の延長を開始するために合成され、他方の
プライマーはセンス方向（ＸＬＦ）に配列を延長するために合成される。これら
のプライマーにより、周知のＮＳＰＬＰ配列を「外側に」延長し、対象の制御領
域の新しい未知のヌクレオチド配列を含むアンプリコンを生成できるようになっ
た。初期プライマーは、Oligo（登録商標）4.06（National Biosciences社、Ply
mouth MN）、或いは他の適切なプログラムを用いて、長さが２２〜３０ヌクレオ
チドで５０％以上のＧＣ含有率を有し、かつ約６８〜７２℃の温度で標的配列に
アニールするように設計することができる。結果的にヘアピン構造及びプライマ
ープライマ−二量体化を生じる任意のヌクレオチドのストレッチの延長はが回避
される。
元の選択されたｃＤＮＡライブラリーか、ヒトゲノムライブラリーを用いて、
配列を延長する。後者のライブラリーは、５’上流配列を得るために最も役立つ
。必要なら、既知領域をさらに延長するために追加のプライマーの組が設計され
る。
XL-PCRキット（Perkin Elmer社）のための指示に従って、酵素と反応混合物と
を完全に混合することにより、高い忠実度の増幅が得られる。４０pmolの各プラ
イマーと、推奨された濃度のキットの他の全ての成分とから増幅を開始する場合
、ＰＣＲはPeltier Thermal Cycler（PTC200;MJ Reserch社、Watertown MA）を
用いて、以下のパラメ
ータで実行される。
ステップ１ ９４℃で１分間（初期変性）
ステップ２ ６５℃で１分間
ステップ３ ６８℃で６分間
ステップ４ ９４℃で１５秒間
ステップ５ ６５℃で１分間
ステップ６ ６８℃で７分間
ステップ７ ステップ４〜６をさらに１５サイクル反復
ステップ８ ９４℃で１５秒間
ステップ９ ６５℃で１分間
ステップ１０ ６８℃で７分１５秒間
ステップ１１ ステップ８〜１０を１２サイクル反復
ステップ１２ ７２℃で８分間
ステップ１３ ４℃（その温度を保持）
反応混合物の５〜１０μｌのアリコットを、低濃度（約０．６〜０．８％）ア
ガロースミニゲルにおける電気泳動で解析して、反応物が配列を延長することに
成功したか否かを決定する。最も大きな生成物或いはバンドを選択して、ゲルか
ら切り出した。さらなる精製には、QIAQuick（登録商標）（QIAGEN社）のような
市販のゲル抽出法を用いる。ＤＮＡ回収の後、クレノウ酵素を用いて一本鎖ヌク
レオチドの延び出しを切り取り、再結合及びクローニングを容易にする平滑末端
を作った。
エタノール沈殿の後、生成物を１３μｌのリゲーション緩衝液内に再溶解し、
１μｌのＴ４−ＤＮＡリガーゼ（１５単位）及び１μｌのＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼを加えて、その混合物を、室温で２〜３時間、或いは１６℃で一昼夜イ
ンキュベートする。コンピテントな大腸菌細胞（４０μ１の適切な溶媒内にある
）を、３μｌのリゲーション混合物を
用いて形質転換し、８０μｌのＳＯＣ培地（SembrookＪ等、上記）で培養する。
３７℃で１時間のインキュベーションの後、全ての形質転換混合物を、２ｘＣａ
ｒｂを含むLuria Bertani（ＬＢ）寒天上にのせる。後日、いくつかのコロニー
を各プレートから無作為に選択し、適切な市販の無菌の９６穴マイクロタイター
プレートの個々のウェル内に入れられた１５０μｌの液状ＬＢ／２ｘＣａｒｂ培
地で培養する。さらに後日、５μｌの各オーバーナイト培養物を非無菌９６穴プ
レート内に移し、水で１：１０に希釈した後、各５μｌのサンプルをＰＣＲアレ
イ内に移す。
ＰＣＲ増幅の場合、ｒＴｔｈＤＮＡポリメラーゼの４単位を含む１８μｌの濃
縮ＰＣＲ反応混合物（３．３ｘ）、ベクタープライマー、並びに延長反応に用い
られる遺伝子特異的プライマーの一方或いは両方を各ウェルに加える。増幅は以
下の条件に従って行う。
ステップ１ ９４℃で６０秒間
ステップ２ ９４℃で２０秒間
ステップ３ ５５℃で３０秒間
ステップ４ ７２℃で９０秒間
ステップ５ ステップ２〜４をさらに２９サイクル反復
ステップ６ ７２℃で１８０秒間
ステップ７ ４℃（そのまま保持）
ＰＣＲ反応物のアリコットを、分子量マーカーと共にアガロースゲル上で移動
させる。ＰＣＲ生成物のサイズを元の部分的なｃＤＮＡと比較して、適切なクロ
ーンを選択し、プラスミドに結合して、配列決定を行う。
６ ハイブリダイゼーションプローブの標識及び使用
配列番号：２の配列に基づくハイブリダイゼーションプローブは、ｃＤＮＡ、
ｍＲＮＡ並びにゲノムＤＮＡをスクリーニングするために用い
られる。約２０の塩基対からなるオリゴヌクレオチドの標識について特に記すが
、大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる。オリゴヌクレ
オチドを、５０ｐｍｏｌの各オリゴマーと、２５０ｍＣｉの[γ-32Ｐ]アデノシ
ン三リン酸（Amersham社,Chicago IL）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（DuP
ont NEN（商標）、Boston MA）とを組み合わせて用いて標識する。標識されたオ
リゴヌクレオチドを、SephadexG-25超精細樹脂カラム（Pharmacia社）を用いて
精製する。それぞれ毎分１０7カウントを含む各部分を、以下のエンドヌクレア
ーゼ（AseI,BglII,EcoR I,PstI,Xba1或いはPvuII;DuPont NEN（商標））の１つ
を用いて消化されるヒトゲノムＤＮＡの典型的な膜ハイブリダイゼーション解析
において用いる。
各消化物のＤＮＡを、０．７％アガロースゲル上で分画化して、ナイロン膜（
Nytran Plus,Schleicher＆Schuell,Durham NH）に移す。ハイブリダイゼーショ
ンは４０℃で１６時間かけて行う。非特異的シグナルを取り除くために、ブロッ
トは、０．１エン酸ナトリウム食塩水及び０．５％ドデシル硫酸ナトリウムまで
段階的に厳密性が増す条件下で、室温にて順次洗浄される。XOMATAR（登録商標
）フィルム（Kodak,Rochester NY）を、数時間かけてPhosphoimagercassette（M
olecularDynamics,Sunnyvale CA）においてブロットに露光された後、ハイブリ
ダイゼーションパターンが視覚的に比較される。
７ アンチセンス分子
ＮＳＰＬＰコード化配列或いはその任意の一部分は、自然発生ＮＳＰＬＰのin
vivoまたはin vitro発現を抑制するために用られ得るアンチセンス分子の設計
のための基礎となる。約２０塩基対からなるアンチセンスオリゴマーの使用につ
いて特に記すが、大きなｃＤＮＡフラグメントの場合でも概ね同じ手順を用いる
ことができる。第１Ａ図、第１Ｂ図、
第２Ａ図、及び第２Ｂ図に示すようなＮＳＰＬＰのコード化配列に基づく相補的
なオリゴヌクレオチド用いて、自然発生ＮＳＰＬＰの発現を抑制することができ
る。この相補的なオリゴヌクレオチドを第１Ａ図、第１Ｂ図、第２Ａ図、及び第
２Ｂ図に示す最も一義的な５’配列から設計し、これを用いてプロモーターが結
合するのを阻害することにより転写を抑制したり、リボソームが転写物に結合す
るのを阻害することによりＮＳＰＬＰ転写物の翻訳を抑制することができる。配
列番号：２のリーダー配列及び５’配列の適切な部分を用いることにより、効果
的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、第１Ａ図、第１Ｂ図、第２Ａ図、及び
第２Ｂ図に示すヌクレオチドのなかの、ポリペプチドのシグナル配列または初め
の方のコーディング配列に翻訳される領域全体にわたる１５〜２０個のヌクレオ
チドを含むようになる。
８ ＮＳＰＬＰの発現
ＮＳＰＬＰの発現は、ｃＤＮＡを適切なベクター内にサブクローニングし、そ
のベクターを宿主細胞にトランスフェクトすることによって行われる。クローニ
ング用のpBluescriptベクターを、大腸菌株であるXL1-BlueMRF（商標）（Strata
gene）においてＮＳＰＬＰを発現するのに用いる。クローニング部位の上流には
、β−ガラクトシダーゼに対するプロモータが存在し、その後ろにはアミノ基末
端メチオニン及びβ−ガラクトシダーゼの７残基が存在する。直後に続くこれら
８つの残基は、転写に役立つバクテリオファージプロモーターあり、多くの一義
的な切断部位を含むリンカーである。
単離されたＩＰＴＧトランスフェクト菌株を標準的な方法を用いて誘導するこ
とにより、初めのβガラクトシダーゼの７残基、約５〜１５残基のリンカー、及
び完全長ＮＳＰＬＰからなる融合タンパク質を作り出す。このシグナル配列は、
以下に説明する活性のアッセイにおいて直接
用いることができる菌培地へのＮＳＰＬＰの分泌を誘導する。
９ ＮＳＰＬＰの活性
ＮＳＰＬＰのＥＲターゲティング活性は、vande Veide等（1994,前出）の方法
により評価することができる。Verboomen H等（1992 Biochem J 286:591-596）
に記載の方法において１００，０００ｇスピンにより、ＮＳＰＬＰを発現する細
胞からミクロソームを回収する。０．５ＭのＫＣｌで処理し、遠心分離処理した
後、ペレットを再懸濁し、電気泳動にかける。ＮＳＰＬＰに対する抗体を用いた
ウエスタンブロッド解析により、ＥＲ膜におけるＮＳＰＬＰの存在が分かる。
１０ ＮＳＰＬＰ特異的抗体の産生
標準的なプロトコルを用いたウサギの免疫化及び抗体の産生には、ＰＡＧＥ電
気泳動法（Sambrook前出）を用いて精製されたＮＳＰＬＰを用いる。ＮＳＰＬＰ
から翻訳されたアミノ酸配列をDNAStarソフトウエア（DNASTAR社）を用いて解析
して免疫抗原性の高い領域を決定し、対応するオリゴペプチドを当業者には周知
の手段により合成して、当業者に周知の方法で抗体をを産生するために用いる。
Ｃ末端付近の、或いは隣接する親水性領域内のエピトープのような、適切なエピ
トープを選択するための解析法は、Ausubel FM等（上記）の論文に記載されてお
り、第４図及び第５図に示されている。
通常、約１５残基の長さを有するオリゴペプチドを、Applied Biosystemsのペ
プチドシンセサイザーModel 431Aを用いてｆｍｏｃ法ケミストリにより合成し、
Ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ：
Ausubel FM等、上記）を用いた反応によりキーホールリンペットヘモシニアン（
ＫＬＨ、Sigma）に結合する。フロイントの完全アジュバントにおけるオリゴペ
プチド−ＫＬＨ複合体を用いてウサギを免疫する。得られた抗血清の抗ペプチド
活性を
検査するには、例えばペプチドをプラスチックに結合し、１％BSAを用いてブロ
ックし、ウサギ抗血清と反応させて洗浄し、さらに放射性ヨウ素標識されたヤギ
抗ウサギＩｇＧに反応させる。
１１ 特異的抗体を用いる自然発生ＮＳＰＬＰの精製
自然発生ＮＳＰＬＰ或いは組換えＮＳＰＬＰは、ＮＳＰＬＰに対する特異的な
抗体を用いるイムノアフィニティークロマトグラフィにより精製することができ
る。イムノアフィニティーカラムは、CnBr活性化Sepharose（Pharmacia Biotech
社）のような活性化クロマトグラフ樹脂とＮＳＰＬＰ抗体とを共有結合させるこ
とにより構成される。結合後、そのレジンを製造者の指示に従って、ブロックし
洗浄する。
ＮＳＰＬＰを含む培地をイムノアフィニティーカラムに通し、そのカラムをＮ
ＳＰＬＰを優先的に吸収できる条件下で（例えば界面活性剤の存在下において高
イオン強度緩衝剤で）洗浄する。このカラムを、抗体／ＮＳＰＬＰ結合を切るよ
うな条件下（例えばｐＨ２〜３の緩衝剤、或いは高濃度の尿素またはチオシアン
酸塩イオンのようなカオトロピックイオンで）で溶離させ、ＮＳＰＬＰを回収す
る。
１２ ＮＳＰＬＰと相互作用する分子の同定
ＮＳＰＬＰ、或いはその生物学的に活性なフラグメントを、125Ｉ ボルトン
ハンター試薬を用いて標識する（Bolton,AE及びHunter,WM（1973）Biochem J 13
3:529）。９６穴プレートのウェル内に前に入れておいた候補分子を、標識した
ＮＳＰＬＰとともに培養し、洗浄し、標識したＮＳＰＬＰ複合体を有する任意の
ウェルをアッセイする。異なる濃度のＮＳＰＬＰを用いて得られるデータを用い
て、候補分子とＮＳＰＬＰの数、アフィニティー並びに会合度の数値を計算する
。
上記のすべての刊行物及び特許明細書は、本明細書と一体に参照され
たい。本発明の記載した方法及びシステムの種々の変更例及び変形例は、本発明
の範囲及び精神から逸脱しないことは当業者には明らかであろう。本発明は特に
好適な実施例に関連して記載されているが、本発明の請求の範囲は、そのような
特定の実施例に不当に制限されるべきではないことを理解されたい。実際には、
本発明を実施するために記載された方法の種々の変更例は、分子生物学或いは関
連する分野の当業者には明らかなように、以下の請求項の範囲内に含まれるもの
である。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 25/28
Ａ６１Ｐ 25/28 35/00
35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47
Ｃ０７Ｋ 14/47 16/28
16/28 Ｃ１２Ｎ 1/21
Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/08
Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ
Ｇ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ
Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ
，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，
ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ
Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ
，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＲ
，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，
ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＲＵ，ＳＥ，Ｓ
Ｇ，ＵＳ
(72)発明者 ゴリ、スリヤ・ケイ
アメリカ合衆国カリフォルニア州94086・
サニーベイル・＃338・アイリスアベニュ
ー 620
(72)発明者 ヒルマン、ジェニファー
アメリカ合衆国カリフォルニア州94040・
マウンテンビュー・＃12・モンロードライ
ブ 230